JP5726499B2 - 環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、環状構造保有分岐状グルカンの製造方法に関する。

環状グルカンは、天然の未修飾澱粉と比較して、水に対する溶解度が高く、その溶液の粘度が低く、天然の未修飾澱粉では観察される老化が起きにくいという優れた性質を有している。環状グルカンは、澱粉の代替物質として有用な物質として開発され、利用されている。

特許文献１は、ワキシーコーンスターチなどの天然の澱粉にブランチングエンザイム（ＢＥ）を作用させることにより環状グルカンを製造できることを開示している。この方法は、ＢＥの環状化反応触媒作用によりアミロペクチンをクラスター単位に分解しつつ各クラスター単位の構造の一部を環状化する方法であり、この方法により、環状構造を有する分岐状グルカン（環状構造保有分岐状グルカンともいう）が製造される。特許文献１に開示された方法においては、ＢＥを用いて得られる分岐状グルカンの収率が非常に高い。しかしながらこの方法でＢＥを用いて製造された環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度は、アミロペクチンの分岐頻度と大差ない（このことは、例えば、非特許文献１に示されている）。すなわち、ＢＥを用いる方法においては、得られるグルカンの分岐頻度に限界があった。例えば、α−１，６結合の割合が１０％を超えるグルカンを製造することは困難であった。そのため、アミロペクチンよりも高い分岐頻度を有するグルカンが好ましいとされる用途、例えば、分岐頻度が高いことで消化酵素に分解されにくく生体内で緩やかに吸収されることを目的とした腹膜透析、経腸栄養材、糖尿病患者用の食事などの用途においては、この方法で製造されたグルカンを使用することが困難であった。

特許文献１はまた、アミロペクチンにアミロマルターゼ（ＭａｌＱ）を作用させることにより、環状構造を有する分岐状グルカンが合成できることを開示している。しかしながら、ＭａｌＱはα−１，４グルカンの不均化および環状化を触媒する酵素であり、この反応で生成されるグルカンは、グルコース残基がα−１，４結合のみで連結された環状グルカン（シクロアミロース）と環状構造保有分岐状グルカンとの混合物である（このことは、例えば、非特許文献２に示されている）。アミロマルターゼはα−１，６分岐の形成反応を触媒する酵素ではないため、環状構造保有分岐状グルカンの製造には適していない。そのため、特許文献１に記載された、アミロマルターゼを用いて分岐状グルカンを得る方法においては、その収率が非常に低い。

環状構造保有分岐状グルカンの製造方法として、ＢＥとβ−アミラーゼとを組み合わせる方法が開示されている（非特許文献１）。非特許文献１では、アミロペクチンにＢＥを作用させて製造した環状構造保有分岐状グルカンに、さらにβ‐アミラーゼを作用させ、環状グルカンの単位鎖を非還元性末端から約６０％まで分解している。このβ−アミラーゼ処理により、環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度は約１５％にまで上昇していると考えられる。しかしながら、β−アミラーゼ処理により多量のマルトースが副生するため、環状構造保有分岐状グルカンの収率は約４０％にまで低下するという欠点がある。

一方、特許文献２は、高度に分岐した高分子量グルカンの製造のためにＢＥとＭａｌＱとを利用する方法を開示している。特許文献２は、アミロース（あるいは澱粉を枝切りした単鎖アミロース）にＢＥとＭａｌＱを作用させることにより、非常に高分子量の分岐状グルカン（グリコーゲン）が合成されることを開示している。特許文献２は高分子量の分岐状グルカンを合成することを課題としており、この課題を、特定の特徴を有するＢＥを選択すること、及びこのＢＥとＭａｌＱを分岐を含まない直鎖状グルカンに作用させること、を組み合わせることにより達成している。特許文献２は環状構造を有するグルカンの製造を課題とするものではなく、またこの条件では環状グルカンは製造されない。なぜなら、ＢＥの反応の原理から考えて、非常に高分子量の分岐状グルカンを合成することと、環状グルカンを合成することは、両立し得ないからである。

特許文献２の図１および００２２段落には、ＢＥが触媒する３種類の反応、つまり分子間枝作り反応（図１Ａ）、環状化反応（図１Ｂ）、分子内枝作り反応（図１Ｃ）が記載されている。特許文献２の図１を以下に再掲する。

さらに特許文献２の図１から明らかなように、ＢＥによる分子間枝作り反応（図１Ａ）では元の分子よりも大きな分子が生じうるが、環状化反応（図１Ｂ）では元の分子よりも小さな分子が生じ、分子内枝作り反応（図１Ｃ）では反応前後で分子量は変化しないと記載している。さらに、高分子量の分岐状グルカンを得るためには、圧倒的な高頻度でＡの分子間枝作り反応が触媒される必要があると説明している。つまり特許文献２の発明者らは、高分子量の分岐状グルカンの製造に適した条件は、環状グルカンの製造に適した条件ではないことを認識している。つまり特許文献２は、環状グルカンが製造されないことを目的としている。このように、特許文献２と本発明は課題が全く逆であり、高分子量の分岐状グルカンが合成されるという事実は、環状構造を有するグルカンが合成されていないことを意味する。実際、特許文献２に記載される方法においては、環状構造を有するグルカンは合成されない。具体的には、特許文献２の方法では、基質が分岐を有さず、かつ比較的重合度の小さいアミロースをＢＥとＭａｌＱの基質として用いているために、分子間枝作り反応が圧倒的に優先し、環状化反応が実質的に起こらず、環状構造を有するグルカンが合成されない。分岐状グルカンにＢＥとＭａｌＱを作用させることにより、環状構造を有する顕著に高頻度に分岐した分岐状グルカンが合成できることは、示唆も開示もされていなかった。さらに、このような、環状構造を有する顕著に高頻度に分岐した分岐状グルカンは、分岐状グルカンにＢＥを単独で作用させる場合や、分岐状グルカンにＭａｌＱを単独で作用させる場合では達成できなかった。

このように環状構造保有分岐状グルカンであって分岐頻度が非常に高いグルカンを収率よく製造する方法は見出されておらず、その製造方法が期待されていた。

特許第３１０７３５８号公報 特開２００８−９５１１７号公報

Ｔａｋａｔａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９５、９１−１０１、１９９６ Ｔａｋａｈａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４７ ４９３−４９７ （１９９８）

本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、環状構造を保有するグルカンであって、分岐頻度が非常に高いグルカンを収率よく製造する方法を提供することを目的とする。具体的には例えば、分岐頻度が高いことで消化酵素に分解されにくく生体内で緩やかに吸収されることを目的とした腹膜透析、経腸栄養材、糖尿病患者用の食事などの用途に適したグルカンを提供することを目的とする。

なお、本発明は、分岐状グルカン構造の一部が環を形成している環状構造保有分岐状グルカンの製造法に関するが、ここで、「分岐状グルカン構造の一部が環を形成している」とは、グルカンにおける糖鎖が環状構造と、α−１，６結合およびα−１，４結合に基づく少なくとも１つの分岐状構造とを有し、かつその環状構造を構成する糖鎖中に少なくとも１つのα−１，６結合が存在している構造を意味する。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、澱粉などの分岐状グルカンにブランチングエンザイムと４−α−グルカノトランスフェラーゼとを作用させ、（４−α−グルカノトランスフェラーゼによるグルカン中のα−１，４グルカン鎖の不均化反応とブランチングエンザイムによる枝付け反応とを組み合わせることにより）、分岐頻度の高い環状構造保有分岐状グルカンを高収率で製造可能なことを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。

本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
分岐状グルカン構造の一部が環を形成している環状構造保有分岐状グルカンの製造法であって、
１）基質である分岐状グルカンにブランチングエンザイムを作用させ、次いで４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させるか；
２）基質である分岐状グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いでブランチングエンザイムを作用させるか；または
３）基質である分岐状グルカンにブランチングエンザイムおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時に作用させる
ことにより、該環状構造保有分岐状グルカンを得る工程を包含する、方法。
（項目２）
前記基質である分岐状グルカンに前記ブランチングエンザイムを作用させ、次いで前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記基質である分岐状グルカンに前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いで前記ブランチングエンザイムを作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記基質である分岐状グルカンに前記４−α−グルカノトランスフェラーゼおよび前記ブランチングエンザイムを同時に作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記基質である分岐状グルカンがデキストリン、アミロペクチンまたは澱粉である項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記基質である分岐状グルカンが澱粉粒である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、得られた環状構造保有分岐状グルカンにエキソ型アミラーゼを作用させる工程をさらに包含する、方法。
（項目８）
前記ブランチングエンザイムを前記基質である分岐状グルカンに作用させる際の温度は４５℃以上１３０℃以下であり、該温度において該ブランチングエンザイムは活性を有する項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ブランチングエンザイムがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のブランチングエンザイムもしくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のブランチングエンザイムである項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを前記基質である分岐状グルカンに作用させる際の温度が４５以上１３０℃以下であり、該温度において該４−α−グルカノトランスフェラーゼは活性を有する項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼである項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記環状構造保有分岐状グルカンの分子量が５万から５０万である項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度が８％以上である項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記基質である分岐状グルカンの分岐頻度が、３％以上１０％以下である、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。

本発明の特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（１）環状構造保有分岐状グルカンを高収率で製造する製造法であって、
分岐状グルカンにブランチングエンザイム（ＢＥ）および４−α−グルカノトランスフェラーゼを共存させて作用させることを含む、環状構造保有分岐状グルカンの製造法。
（２）上記分岐状グルカンが、３％以上１０％以下の分岐頻度を有するグルカンである、（１）に記載の方法。
（３）上記分岐状グルカンが澱粉粒である、（１）に記載の方法。
（４）上記ＢＥが４５℃以上において活性を有するＢＥである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記ＢＥがＡｑＢＥもしくはＲｈＢＥである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記ＭａｌＱが４５℃以上において活性を有するＭａｌＱである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）上記ＭａｌＱがＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＭａｌＱである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）上記環状構造保有分岐状グルカンの分子量が５万から５０万であり、好ましくは５万から３０万である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）上記環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度が、少なくとも８％以上であり、好ましくは１０％以上である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。

本願発明の方法により、分岐頻度の高い環状構造保有分岐状グルカンが高収率で生産され得る。本願発明の製造方法は、分岐状グルカンに、ブランチングエンザイムおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時にまたは別々に作用させる工程を包含すればよい。また、生成された環状構造保有分岐状グルカンに対してβ−アミラーゼを作用させない実施形態の本発明の方法では、グルコースおよび低分子量のマルトオリゴ糖が副生しないため、従来法と比較しても、収率が高い。従って、本発明では、非常に容易に、しかも、収率良く、環状構造保有分岐状グルカンを製造し得る。生成された環状構造保有分岐状グルカンに対してβ−アミラーゼを作用させる実施形態では、最終的に得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度が、β−アミラーゼを作用させない場合よりも高くなるため、非常に分岐頻度の高い環状構造保有分岐状グルカンを得ることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．材料
本発明の方法においては、基質である分岐状グルカンおよび少なくとも２種類の酵素を使用する。

１．１ 分岐状グルカン
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−Ｄ−グルカンを使用することが好ましい。α−Ｄ−グルカン中のグルコース残基を連結する結合は、主にα−１，４−グルコシド結合からなり、α−１，６−グルコシド結合を含んでもよい。α−１，６−グルコシド結合を含むα−Ｄ−グルカンは、分岐構造を有する。分子中に少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンを分岐状グルカンといい、分子中にまったくα−１，６−グルコシド結合を有さないグルカンを直鎖状グルカンという。本発明で使用されるグルカンは分岐状グルカンである。好ましくは、本願発明で使用されるグルカンは、イソアミラーゼ処理およびプルラナーゼ処理をされていない。本発明で使用されるグルカンは、直鎖状グルカンではない。

本明細書中では用語「分岐状グルカン」とは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合以外の結合により分岐しているグルカンをいう。好ましくは、分岐状グルカンは、分岐状α−Ｄ−グルカンである。分岐結合は、α−１，６−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合、またはα−１，２−グルコシド結合のいずれかであるが、最も好ましくはα−１，６−グルコシド結合である。本発明で使用する分岐状α−Ｄ−グルカンはα−１，３−グルコシド結合およびα−１，２−グルコシド結合を含まないことが好ましい。分岐状グルカンは、通常、分岐結合の数と同数の非還元末端を有する。α−１，６−グルコシド結合のみを選択的に分解する酵素（例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼなど）で分岐状グルカンを処理すると、直鎖状α−１，４−グルカンの混合物に分解できる。これらを分岐状グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。

本発明において使用される分岐状グルカンの分岐頻度の下限は、好ましくは３％以上、好ましくは４％以上、より好ましくは５％以上、最も好ましくは６％以上であり、そして、分岐頻度の上限は特にないが、天然の分岐状グルカンは通常、それほど分岐頻度が高くなく１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下などであり得る。

本発明において基質として使用される分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、特に好ましくは約４０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明において基質として使用される分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約１×１０^７以下であり、より好ましくは約３×１０^６以下であり、さらに好ましくは約１×１０^６以下であり、特に好ましくは約５×１０^５以下であり、最も好ましくは約３×１０^５以下である。

本発明に好適に利用される分岐状グルカンの例としては、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカンおよび高度分岐環状グルカンなどが挙げられる。

本明細書中では用語「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。本発明で使用する澱粉としては、アミロペクチン含量の高いものが最も好ましい。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。

天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉は、ハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）またはワキシー澱粉であってもよい。澱粉は可溶性澱粉であってもよい。可溶性澱粉とは、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉およびハイアミロース澱粉からなる群から選択され得る。澱粉は化工澱粉であってもよい。本発明においてはワキシー澱粉を使用することが好ましい。

本明細書中では、用語「澱粉粒」とは、結晶構造を有する澱粉分子をいう。澱粉粒は、未処理の澱粉粒であってもよく、未処理の澱粉粒を化学修飾または物理処理することによって得られる澱粉粒であってもよい。食品として分類される酵素処理澱粉を使用することが好ましい場合には、使用される澱粉粒は、代表的には、植物から得られた未処理の澱粉粒であり、例えば、糊化過程を経ていない澱粉粒が挙げられるがこれに限定されない。また、本発明において使用する澱粉粒としては、水中に懸濁した状態での加熱により澱粉粒が破裂することにより懸濁液が流動性を失うという特性を示すあらゆる澱粉粒が使用可能である。本発明において使用する澱粉粒は、好ましくは、アミロペクチン含量が高い。

植物は、アミロプラスト内に澱粉分子を顆粒として（すなわち、大きな結晶として）貯蔵する。この顆粒は澱粉粒と呼ばれる。澱粉粒内では、澱粉分子どうしが水素結合などによって結合している。そのため、澱粉粒はそのままでは水に溶けにくく、消化もされにくい。澱粉粒を水とともに加熱すると膨潤し、分子がほぐれてコロイド状になる。この変化は「糊化」と呼ばれる。澱粉粒の大きさおよび形態は、その澱粉粒が得られた植物によって異なる。例えば、トウモロコシの澱粉粒（コーンスターチ）の平均粒径は約１２μｍ〜約１５μｍであり、他の澱粉粒と比べて小さめで大きさはそろっている。コムギおよびオオムギの澱粉粒は、粒径約２０μｍ〜約４０μｍの大型の澱粉粒と粒径数μｍの小型の澱粉粒の２種の大きさに分かれる。コメではアミロプラスト内に直径数μｍの角ばった澱粉小粒が多数蓄積される複粒構造となる。バレイショの澱粉粒は平均粒径約４０μｍであり、澱粉原料として一般に利用されているものの中では最も大きい。本発明においては、市販されている各種の澱粉粒を使用することが可能である。植物などから澱粉粒を精製するなどの方法により澱粉粒を調製して本発明に使用してもよい。

澱粉粒の状態では澱粉分子どうしが強く結合しているため、酵素が作用しにくい。食品として扱われる酵素処理澱粉を得るための特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、植物から単離または精製されているが、酸処理、化学修飾処理および熱処理を受けていないものである。本明細書中では、用語「未処理」の澱粉粒とは、天然で生成される澱粉粒であって、自然状態で共存している他の成分（例えば、タンパク質、脂質など）から澱粉粒を分離するために必要な処理以外の処理が施されていない澱粉粒をいう。したがって、植物などから不純物を除去して澱粉を精製する工程などの、澱粉粒を調製する方法における各工程は、本明細書中においては、澱粉粒の処理には含まれない。澱粉粒としては、通常市販されている澱粉粒であればどのような澱粉粒でも使用され得る。

澱粉粒は、糊化処理を施されていない澱粉であることが好ましい。澱粉粒は、天然の結晶構造を少なくとも一部保持しており、酵素が作用しにくい。澱粉粒は、例えば、３０℃の水に澱粉粒を加えることにより４０重量％の水懸濁液を作製し、この懸濁液を１００℃にて１０分間加熱した後６０℃に冷却した場合に得られる溶液の流動性がないものであることが好ましい。なお、「溶液の流動性がない」とは、例えば容量１００ｍｌのガラスビーカーに１０分間加熱済みの５０ｇの溶液（６０℃）を入れ、そのビーカーを反転させて溶液サンプルの下側が開放された状態で６０℃にて１分間放置した場合に、入れた溶液の２０重量％以上（すなわち、１０ｇ以上）の溶液がビーカー中に残ることをいう。溶液の流動性がないと、溶液に酵素を均一に拡散させることが困難である。本明細書において、「溶液に流動性がある」とは、例えば容量１００ｍｌのガラスビーカーに溶液を入れ、そのビーカーを反転させたときに重力によって１分間以内に全体の８０％以上の溶液が流れ落ちる状態を指す。この状態の溶液であれば酵素を添加して攪拌することにより、澱粉を溶液中に均一に分散することができる。流動性がある溶液は通常のデキストリン製造工程中のラインを詰まらせることはない。

別の特定の実施形態では、澱粉粒は、未処理の澱粉粒に対して化学修飾または物理処理を行うことによって処理された澱粉粒であってもよい。化学修飾された澱粉粒の例としては、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉およびリン酸化モノエステル化リン酸架橋澱粉が挙げられる。「アセチル化アジピン酸架橋澱粉」とは、澱粉を無水酢酸および無水アジピン酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理した後、無水酢酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンおよび無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム」とは、澱粉を無水オクテニルコハク酸でエステル化して得られたものをいう。「酢酸澱粉」とは、澱粉を無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基（カルボキシル基ともいう）の分析を行った場合にカルボキシ基が１．１％以下であるものをいう。ただし、カルボキシ基の量がこの範囲にあっても「漂白澱粉」は「酸化澱粉」の定義には含まれない。「漂白澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基の分析を行った場合にカルボキシ基が０．１％以下であるものであって、厚生労働省告示４８５号記載の酸化澱粉の「確認試験（３）」による試験結果が陰性でかつ粘度等の澱粉の性質に生じた変化が酸化によるものでないことを合理的に説明できるものをいう。カルボキシ基の量が０．１％以下であっても粘度等の澱粉の性質が天然澱粉から変化しているものは酸化澱粉に分類され、日本では食品としては取り扱われず、食品添加物として取り扱われる。「ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化し、酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「ヒドロキシプロピル澱粉」とは、澱粉を酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。「リン酸化澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化して得られたものをいう。「リン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化し、トリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。

物理処理された澱粉粒の種類の例としては、湿熱処理澱粉および熱抑制澱粉が挙げられる。

本発明において使用される澱粉の平均重合度は、好ましくは約１×１０^３以上であり、より好ましくは約５×１０^３以上であり、さらに好ましくは約１×１０^４以上であり、最も好ましくは約２×１０^４以上である。本発明において使用される澱粉の平均重合度は、好ましくは約１×１０^７以下であり、より好ましくは約３×１０^６以下であり、さらに好ましくは約１×１０^６以下であり、最も好ましくは約３×１０^５以下である。

アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分岐状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。本発明において使用されるアミロペクチンの平均重合度は、好ましくは約１×１０^３以上であり、より好ましくは約５×１０^３以上であり、さらに好ましくは約１×１０^４以上であり、最も好ましくは約２×１０^４以上である。本発明において使用されるアミロペクチンの平均重合度は、好ましくは約１×１０^７以下であり、より好ましくは約３×１０^６以下であり、さらに好ましくは約１×１０^６以下であり、最も好ましくは約３×１０^５以下である。

グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。α−１，６−結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。グリコーゲンは酵素合成することも可能である。本発明において使用されるグリコーゲンの平均重合度は、好ましくは約５００以上であり、より好ましくは約１×１０^３以上であり、さらに好ましくは約２×１０^３以上であり、最も好ましくは約３×１０^３以上である。本発明において使用されるグリコーゲンの平均重合度は、好ましくは約１×１０^７以下であり、より好ましくは約３×１０^６以下であり、さらに好ましくは約１×１０^６以下であり、最も好ましくは約３×１０^５以下である。

デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、澱粉とマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、澱粉を酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得られる。本発明において使用されるデキストリンの平均重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明において使用されるデキストリンの平均重合度は、好ましくは約１×１０^４以下であり、より好ましくは約９×１０^３以下であり、さらに好ましくは約７×１０^３以下であり、最も好ましくは約５×１０^３以下である。

酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐グルカンをいう。ＳＰ−ＧＰ法でのアミロースの合成の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、生成物を分岐させることができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって調節され得る。酵素合成分岐グルカンは、天然の分岐グルカンと比較して均一な構造を有しているため、製薬材料として使用する際に非常に有利である。例えば、本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約２０以上であり、より好ましくは約５０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約２００以上である。本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約２×１０^５以下であり、より好ましくは約１×１０^５以下であり、さらに好ましくは約５×１０^４以下であり、最も好ましくは約３×１０^４以下である。

本明細書中の用語「高度分岐環状グルカン」とは、特許第３１０７３５８号に記載される方法によって製造される高度分岐環状グルカンをいう。特許第３１０７３５８号に記載される方法では、ＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼまたはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを単独で使用するため、高度分岐環状グルカンは、本願発明の環状構造保有分岐状グルカンよりも分岐頻度が低い。高度分岐環状グルカンとは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンをいう。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも１つの分岐を有すればよい。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約６０以上であり、さらに好ましくは約１００以上である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約１×１０^４以下であり、より好ましくは約７×１０^３以下であり、さらに好ましくは約５×１０^３以下である。

高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。

高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約３×１０^３以下であり、より好ましくは約１×１０^３以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、さらにより好ましくは約３００以下である。

高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。

高度分岐環状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、高度分岐環状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。

高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５×１０^３の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンである。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上であり、好ましくは約２０以下である。高度分岐環状グルカンおよびその製造方法は、特開平８−１３４１０４号（特許第３１０７３５８号）に詳細に記載されており、その記載に従って製造され得る。高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されている。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約７０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１５０以上である。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約１×１０^４以下であり、より好ましくは約７×１０^３以下であり、さらに好ましくは約５×１０^３以下であり、最も好ましくは約４×１０^３以下である。

原料としては、上記分岐状グルカンの誘導体も用いられ得る。例えば、上記分岐状グルカンのアルコール性の水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、またはリン酸化された誘導体なども用いられ得る。さらに、これらの２種以上の混合物も原料として用いられ得る。

１．２ 酵素
１．２．１ ブランチングエンザイム
ブランチングエンザイム（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカン：１，４−α−Ｄ−グルカン ６−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、ＥＣ ２．４．１．１８；本明細書中では、ＢＥとも記載する）は、α−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成する酵素である。ＢＥは当該分野において１，４−α−グルカン分枝酵素、枝作り酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。ＢＥは、動物、植物、糸状菌、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒している。

ＢＥは、好ましくは、耐熱性ＢＥである。耐熱性ＢＥとは、ＢＥ活性測定を、反応温度を変化させて行った場合の反応の至適温度が４５℃以上であるＢＥをいう。

ブランチングエンザイム活性とは、アミロースとヨウ素との複合体の６６０ｎｍにおける吸光度を減少させる活性であり、ＢＥがα−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成し、アミロースの直鎖状部分を減少させる作用に基づく。

ＢＥのブランチングエンザイム活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される。ＢＥのブランチングエンザイム活性は、例えば、以下のようにして測定される。まず、５０μＬの基質液（０．１２％（ｗ／ｖ）アミロース（ＴｙｐｅＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））に５０μＬの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、そのＢＥの反応至適温度で行う。１０分間ＢＥを作用させた後、１ｍＬの０．４ｍＭ塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、１ｍＬのヨウ素液を添加し、よく混合した後、６６０ｎｍの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に０．４ｍＭ塩酸溶液を添加したものを同時に調製する。基質液は、１００μＬの１．２％（ｗ／ｖ）アミロースＴｙｐｅＩＩＩ溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、さらに７００μＬの蒸留水を添加してよく混合することにより調製する。ただし、緩衝液のｐＨは、そのＢＥの反応至適ｐＨに合わせる。ヨウ素液は０．１２５ｍＬのストック溶液（２．６重量％Ｉ_２、２６重量％ＫＩ水溶液）に０．５ｍＬの１規定塩酸を混合し、蒸留水で６５ｍＬとすることにより調製する。酵素液のＢＥ活性は以下の計算式により求める。

また、このＢＥ活性から、基質１ｇあたりのＢＥ活性を計算することができる。

本明細書においては、ＢＥの活性としては、原則としてＢＥ活性を用いる。したがって、単に「活性」と呼ぶ場合は「ＢＥ活性」を表し、単に「単位」、あるいは「Ｕ」と示す場合は、ＢＥ活性で測定した「単位」、あるいは「Ｕ」を表す。

ＢＥの反応至適温度は、好ましくは、約４５℃以上であり、約９０℃以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＢＥ活性の測定を温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約４５℃以上であり、約５０℃以上であり、さらに好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上である。好ましい反応至適温度に上限はない。しかし、実際のＢＥの反応至適温度には上限があり、例えば、約９０℃以下、約８５℃以下、約８０℃以下、約７５℃以下などであり得る。

本発明の方法においては、ＢＥを分岐状グルカンに作用させる際の温度においてＢＥがブランチングエンザイム活性を有することが好ましい。この場合の特定の温度において「ブランチングエンザイム活性を有する」とは、そのＢＥの反応至適温度の代わりにその特定の温度においてＢＥを作用させること以外は上記のブランチングエンザイム活性の測定と同じ方法で測定を行った場合にＢＥ活性が検出されることをいう。この特定の温度でのＢＥ活性は好ましくは約１０Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約２０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約３０Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは約４０Ｕ／ｍＬ以上であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｍＬ以上である。この特定の温度でのＢＥ活性は高いほど好ましく、上限は特にないが、例えば、５００，０００Ｕ／ｍＬ以下、２００，０００Ｕ／ｍＬ以下、１００，０００Ｕ／ｍＬ以下、８０，０００Ｕ／ｍＬ以下、５０，０００Ｕ／ｍＬ以下などであり得る。

ＢＥは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号ＥＣ ２．４．１．１８に分類される酵素であれば特に限定しないが、好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来である。ＢＥは、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌由来である。

ＢＥは、より好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し、さらにより好ましくは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌に由来し、最も好ましくはＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓまたはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓに由来する。なお、最近では、好熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と記載されることも多い。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと同一の細菌を指す。

本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。

本明細書において配列（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。

本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｋ．およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ ４．５ Ｓ ＲＮＡ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。

Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書中では、「天然の」ＢＥは、もともとＢＥを産生する細菌から単離されたＢＥだけでなく、天然のＢＥと同じアミノ酸配列を有する、遺伝子組換えによって得られるＢＥをも包含する。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０およびｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ， Ｍ． Ｊ． Ｅ． Ｃ．ら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２００３、２１巻、ｐ１９９−２０７に記載される。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＢＥは、種々のＭｎの基質からグリコーゲンを極めて良好に製造するという特性を有する。

Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ．Ｌ．ら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１．５７（５−６）：ｐ．６５３−９および特表２００２−５３９８２２号公報に記載される。

これらの天然のＢＥの塩基配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明の方法においては、例示した配列を有するＢＥ以外にも、ＢＥ活性を有する限り、このような、天然に存在する改変体および天然のＢＥに対して人工的に変異を導入した改変体も用い得る。例えば、ＷＯ２０００／０５８４４５号公報および特許文献３には、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥの改変体が記載されている。改変体ＢＥは、改変を導入する前のＢＥと同等以上の活性を有することが好ましい。例えば、本発明で用いられるＢＥのアミノ酸配列は、ある実施形態では、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（好ましくは１または数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。当業者は、所望の性質を有するＢＥを容易に選択することができる。あるいは、目的とするＢＥをコードする遺伝子を直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。

特定の実施形態では、本発明で使用されるＢＥは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＢＥ活性を有する。本発明で使用されるＢＥは、特に好ましくは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＢＥ活性を有する。

本発明の方法において使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の分岐状グルカン（すなわち、基質）に対して、代表的には約１００Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約５００Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１，０００Ｕ／ｇ基質以上である。本発明の方法において使用されるＢＥの量は、反応開始時の溶液中の分岐状グルカンに対して、代表的には約５００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約８０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。ＢＥの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、目的の環状構造保有分岐状グルカンの収率が低下する場合がある。

１．２．２ ４−α−グルカノトランスフェラーゼ
本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基、あるいは、２個以上のグルコースからなるユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号ＥＣ ２．４．１．２５に分類される酵素を利用し得る。ＥＣ ２．４．１．２５に分類される酵素は、アミロマルターゼ、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、不均化酵素などとも呼ばれる酵素である（以下、ＭａｌＱと呼ぶ）。微生物由来の４−α−グルカノトランスフェラーゼはアミロマルターゼと呼ばれ、植物由来の４−α−グルカノトランスフェラーゼはＤ−酵素と呼ばれる。また本発明では、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅという、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性とアミロ１，６グルコシダーゼ活性を併せ持つ酵素（ＥＣ ３．２．１．３３＋ＥＣ ２．４．１．２５）も利用し得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９））に基づいて決定され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼの性質に従って、測定時の反応温度、反応ｐＨなどを調整し得る。本発明の方法においては、４−α−グルカノトランスフェラーゼを使用する。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、アミロマルターゼであってもよく、Ｄ−酵素であってもよい。

ＭａｌＱの反応至適温度は、好ましくは、約４５℃以上であり、約９０℃以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＭａｌＱ活性の測定を温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約４５℃以上であり、約５０℃以上であり、さらに好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上である。好ましい反応至適温度に上限はない。しかし、実際のＢＥの反応至適温度には上限があり、例えば、約９０℃以下、約８５℃以下、約８０℃以下、約７５℃以下などであり得る。

４−α−グルカノトランスフェラーゼの４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は、以下の方法によって測定される：
１０％マルトトリオース、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、酵素を含む反応液１２０μｌを７０℃で１０分間インキュベート、その後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止する。グルコースオキシダーゼ法によりグルコース量を測定する。４−α−グルカノトランスフェラーゼの単位量は、１分間に１μｍｏｌグルコースを生成する４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を１単位(Ｕ又はＵｎｉｔ)とする。

本発明の方法においては、４−α−グルカノトランスフェラーゼを分岐状グルカンに作用させる際の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼが４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有することが好ましい。この場合の特定の温度において「４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する」とは、７０℃で１０分間のインキュベーションの代わりにその特定の温度において１０分間のインキュベーションすること以外は上記の４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性の測定と同じ方法で測定を行った場合に４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性が検出されることをいう。この特定の温度での４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は好ましくは約１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約２Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約５Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは約１０Ｕ／ｍＬ以上であり、最も好ましくは約２０Ｕ／ｍＬ以上である。この特定の温度での４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は高いほど好ましく、上限は特にないが、例えば、約５，０００Ｕ／ｍＬ以下、約２，０００Ｕ／ｍＬ以下、約１，０００Ｕ／ｍＬ以下、約５００Ｕ／ｍＬ以下、約２５０Ｕ／ｍＬ以下などであり得る。

４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、市販のものであっても、当該分野で公知の方法によりこれらの生物から調製されてもよく、またはこれらの生物の枝切り酵素遺伝子を用いて遺伝子組換え法により調製されてもよい。当該分野で公知の任意の４−α−グルカノトランスフェラーゼが使用され得る。

Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＴａｑ ＭａｌＱ（Ｔａｑ ＭａｌＱは、アミロマルターゼであり、４−α−グルカノトランスフェラーゼの一種である）をコードする塩基配列を配列番号５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号６に示す。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＭａｌＱをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９）に記載される。

これらの天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明の方法においては、例示した配列を有する４−α−グルカノトランスフェラーゼ以外にも、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する限り、このような、天然に存在する改変体および天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼに対して人工的に変異を導入した改変体も用い得る。改変体４−α−グルカノトランスフェラーゼは、改変を導入する前の４−α−グルカノトランスフェラーゼと同等以上の活性を有することが好ましい。例えば、本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ある実施形態では、配列番号６のアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（好ましくは１または数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。当業者は、所望の性質を有する４−α−グルカノトランスフェラーゼを容易に選択することができる。あるいは、目的とする４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。

特定の実施形態では、本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する。本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、特に好ましくは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する。

本発明の方法において使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中の分岐状グルカン（すなわち、基質）に対して、代表的には約０．１Ｕ／ｇ基質以上であり、好ましくは約０．５Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約１Ｕ／ｇ基質以上である。本発明の方法において使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中の分岐状グルカンに対して、代表的には約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約１０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。４−α−グルカノトランスフェラーゼの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、目的の環状構造保有分岐状グルカンの収率が低下する場合がある。

４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ＢＥと同時に反応液に添加してもよく、別々に添加してもよい。分岐状グルカンに対してＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼの両方を作用させることにより、得られるグルカンの分岐頻度が高くなり、環状構造を有することになり、かつ高い収率が得られる。

１．２．３ エキソ型アミラーゼ
本発明の製造法では、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させて得られた環状構造保有分岐状グルカンに、エキソ型アミラーゼを作用させてもよい。

本発明に用いられ得るエキソ型アミラーゼの例としては、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼなどの、環状構造保有分岐状グルカンの非還元末端側から加水分解する酵素が挙げられる。本発明に用いられ得るエキソ型アミラーゼは、市販の酵素であってもよい。また、エキソ型アミラーゼは、植物、微生物、カビなどのエキソ型アミラーゼを産生するものから分離して用いても良く、エキソ型アミラーゼ遺伝子を利用して公知の方法で大腸菌などで生産して用いても良い。

本発明で使用され得るβ−アミラーゼの例としては、小麦、大麦、大豆、サツマイモなどの植物由来の酵素が挙げられる。例えば、市販のサツマイモ由来のβ−アミラーゼ（例えば、Ｔｙｐｅ Ｉ-Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）が用いられ得る。グルコアミラーゼとしては、カビ由来の酵素が用いられ得る。例えば、市販のＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ由来のグルコアミラーゼ（例えば、東洋紡績株式会社製）が用いられ得る。α−グルコシダーゼとしては、例えば市販の微生物由来のα−グルコシダーゼ（例えば、東洋紡績株式会社製）が用いられ得る。

酵素としてＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼのみを使用した場合に得られる環状構造保有分岐状グルカンよりも高い分岐頻度を有する環状構造保有分岐状グルカンを製造する場合には、上記のようにエキソ型アミラーゼを作用させることによって非還元末端の直鎖状部分を部分的に切断することにより、分子の分岐頻度を向上させる。しかしこの場合、直鎖状部分の一部が切り落とされるため、収率は低下する。

高い収率で環状構造保有分岐状グルカンを製造する必要がある場合には、本発明の方法においてはエキソ型アミラーゼを添加しない。さらにこの場合には、本発明で使用する酵素には、分岐状グルカン内のα−１，４−グルコシド結合またはα−１，６グルコシド結合を加水分解するエンド型のアミラーゼ類の酵素活性が検出されないかまたはその活性が極めて低いことが好ましく、検出されないことが最も好ましい。

本願発明に用いる酵素は、精製酵素、粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（たとえば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）等、当業者に周知の方法が使用され得る。

２．本発明の製造法
本発明の製造法は、分岐状グルカン構造の一部が環を形成している環状構造保有分岐状グルカンの製造法であって、
１）分岐状グルカンにブランチングエンザイムを作用させ、次いで４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させるか；
２）分岐状グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いでブランチングエンザイムを作用させるか；または
３）分岐状グルカンにブランチングエンザイムおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時に作用させる
ことにより、該環状構造保有分岐状グルカンを得る工程を包含する。

本発明の製造法においては、まず、反応液を調製する。反応液は、例えば、適切な溶媒に、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼの少なくとも一方と、基質（すなわち、分岐状グルカン）とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応液は、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼの少なくとも一方を含む溶液と、基質（すなわち、分岐状グルカン）を含む溶液または懸濁液とを混合することによって調製してもよい。反応液には、最初からＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼの両方を添加してもよく、あるいは、最初はＢＥと基質のみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で４−α−グルカノトランスフェラーゼを添加してもよく、あるいは、最初は４−α−グルカノトランスフェラーゼと基質のみを添加し、ある程度反応が進んだ時点でＢＥを添加してもよい。

基質として固体の澱粉を使用する場合には、澱粉の糊化の前にＢＥを添加し、その後、澱粉およびＢＥを含む混合液の温度を上昇させて澱粉を糊化させ、その後、酵素反応に適切な温度まで糊液の温度を下げてからＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを添加することが好ましい。また、基質として澱粉粒を使用する場合には、澱粉の糊化開始温度以下でＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼ澱粉粒を含む混合液を調製し、その温度のまま、あるいは、その後、澱粉の糊化温度内であり、調製時の温度よりも高い温度であって、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼが作用し得る温度に混合液の温度を上昇させてこれらの酵素を作用させることが好ましい。澱粉の糊化開始温度は、使用する澱粉粒を得た植物、その植物の収穫時期、その植物の栽培地などによって異なり得る。一般に、通常のトウモロコシ澱粉の糊化開始温度は約７０．７℃であり、ワキシーコーンスターチ（モチトウモロコシ）の糊化開始温度は約６７．５℃であり、コメ澱粉の糊化開始温度は約７３．５℃であり、馬鈴薯澱粉の糊化開始温度は約６２．６℃であり、タピオカ澱粉の糊化開始温度は約６８．４℃であり、そして緑豆澱粉の糊化開始温度は約７１．０℃である。

澱粉の糊化開始温度は、アミログラフによって測定され得る。糊化開始温度の測定方法については、「澱粉科学の事典」の１９４頁〜１９７頁に記載される。

糊化開始温度以下でＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを含む混合液を調製する場合にはこの混合液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変動し得るが、例えば、約０℃以上であり、好ましくは約１０℃以上であり、さらに好ましくは約１５℃以上であり、特に好ましくは約２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。５重量％以上５０重量％以下の濃度の澱粉粒が懸濁されており、かつ、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを含む混合液の調製時のこの混合液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変動し得るが、例えば、約６７．５℃以下であり、好ましくは約６０℃以下であり、さらに好ましくは約５０℃以下であり、特に好ましくは約４０℃以下であり、最も好ましくは約３５℃以下である。

反応を混合液調製時の温度よりも高い温度でかつ約７５℃以下の温度で反応を行う場合、この反応の際の温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、特に好ましくは約４５℃以上であり、最も好ましくは約５０℃以上である。この反応の際の温度は、約７５℃以下であればよく、例えば、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下などであり得る。また、この反応の際の温度は、一定の温度であってもよく、徐々に上昇してもよい。

分岐状グルカンにまずＢＥを作用させると、分岐状グルカンが分子量約３万〜５０万程度のクラスターに分断されると共に環状構造が形成されると考えられる。その後、４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、分岐状部分のグルカン鎖の転移が行われ、得られるグルカンの分岐頻度が高まると考えられる。

分岐状グルカンにまず４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させると、分岐状グルカンが分子量約３万〜５０万程度のクラスターに分断されると共に環状構造が形成されると考えられる。その後、ＢＥを作用させることにより、分岐状部分のグルカン鎖の転移が行われ、得られるグルカンの分岐頻度が高まると考えられる。

分岐状グルカンにＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼとを同時に作用させると、クラスターへの分断とグルカン鎖の転移とが同時に行われると考えられる。

上記いずれかの反応の結果として得られる産物は、下記の「４．本発明の方法により得られる環状構造保有分岐状グルカン」に記載のような分岐頻度および平均重合度を有するものとなる。

この反応液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。反応液のｐＨは、使用する酵素が活性を発揮し得るｐＨであれば任意に設定され得る。反応液のｐＨは、使用する酵素のいずれかの至適ｐＨ付近であることが好ましい。酵素を別々に作用させる場合は、ＢＥを作用させる段階ではＢＥに適切なｐＨに、４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させる段階では４−α−グルカノトランスフェラーゼに適切なｐＨに調整してもよい。反応液のｐＨは、代表的には約２以上であり、好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上であり、特に好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約６以上であり、最も好ましくは約７以上である。反応液のｐＨは、代表的には約１３以下であり、好ましくは約１２以下であり、さらに好ましくは約１１以下であり、特に好ましくは約１０以下であり、特に好ましくは約９以下であり、最も好ましくは約８以下である。１つの実施形態では、反応液のｐＨは、代表的には、使用する酵素の至適ｐＨの±３以内であり、好ましくは至適ｐＨの±２以内であり、さらに好ましくは至適ｐＨの±１以内であり、最も好ましくは至適ｐＨの±０．５以内である。

次いで、各酵素が反応しうる条件（例えば、温度）において、酵素反応を行なう。必要であれば、反応液を加熱する。反応温度は、使用する酵素が活性を有する限り、任意の温度であり得る。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上であり、さらにより好ましくは約５０℃以上であり、さらにより好ましくは約５５℃以上であり、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは６５℃以上である。反応温度は、好ましくは約１５０℃以下であり、好ましくは約１４０℃以下であり、より好ましくは約１３０℃以下であり、より好ましくは約１２０℃以下であり、より好ましくは約１１０℃以下であり、より好ましくは約１００℃以下であり、より好ましくは約９０℃以下、より好ましくは約８５℃以下であり、さらにより好ましくは約８０℃以下であり、なおさらに好ましくは約７５℃以下であり、特に好ましくは約７０℃以下である。

反応時間は、反応温度、反応により生産されるα−グルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約５時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、または約２４時間以上であり得る。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約１００時間以下、より好ましくは約７２時間以下、さらにより好ましくは約４８時間以下、最も好ましくは約３６時間以下である。

加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、反応液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。反応液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。

本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、ＢＥおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つを反応液に追加してもよい。

このようにして、環状構造保有分岐状グルカンを含有する溶液が生産される。反応終了後、反応液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させてもよい。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応液は、そのまま保存されてもよいし、生産された環状構造保有分岐状グルカンを単離するために処理されてもよい。

３．環状構造保有分岐状グルカンの精製
生産された環状構造保有分岐状グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、ＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、副生し得る低分子量グルカン、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。

有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。

有機溶媒を用いない精製方法の例としては、環状構造保有分岐状グルカン生産反応後、水に溶解している環状構造保有分岐状グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、副生し得る低分子量グルカン、無機塩類などを除去する方法がある。

精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１×１０^３〜約１×１０^４、好ましくは約５×１０^３〜約５×１０^４、より好ましくは約１×１０^４〜約３×１０^４の限外濾過膜（例えば、ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。

クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。

本願発明の方法で、原料の分岐状グルカンからの本願グルカンの収率は非常に高く、ほぼ１００％である。場合によっては、環状構造のみを有する低分子量グルカンも生産されるが、これらは、例えば、セファデックスなどを用いるゲル濾過により、容易に、目的の分岐構造を有する環状グルカンから分離され得る。

本明細書においては、収率は、以下の式によって求められる：
収率（重量％）＝｛（生成された環状構造保有分岐状グルカンの重量（ｇ））／（使用した分岐状グルカンの重量（ｇ））｝×１００

４．本発明の方法により得られる環状構造保有分岐状グルカン
本発明の方法によって製造されるグルカンは、高度に分岐した分岐状グルカンのうちの一部の鎖が環状構造を形成する構造を有していると考えられる。そのため、本発明のグルカンを、「環状構造保有分岐状グルカン」という。本発明の方法によって製造されるグルカンの分岐頻度は、特許第３１０７３５８号公報に記載されるような、ＢＥまたはアミロマルターゼを単独で作用させた場合に得られる高度分岐環状グルカンよりも高い。

本発明の環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度は、α−１，６分岐の割合によって示される。α−１，６分岐の割合は例えば約１０％以上、約１１％以上、約１２％以上、約１３％以上、約１４％以上、約１５％以上、約１６％以上、約１７％以上、約２０％以上などであり得る。α−１，６分岐の割合に上限はないが、例えば、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下などであり得る。

分岐頻度は、以下の式によって計算される：
分岐頻度（％）＝｛（分岐数）／（分子全体のグルコース単位数）}×１００

本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約３万以上であり、さらに好ましくは約５万以上であり、特に好ましくは約１０万以上である。本発明の環状構造保有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約５０万以下であり、さらに好ましくは約３０万以下であり、特に好ましくは約２０万以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中の環状構造部分の平均重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中の環状構造部分の平均重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐構造部分の平均重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐構造部分の平均重合度は、好ましくは約４×１０^３以下であり、より好ましくは約３×１０^３以下であり、さらに好ましくは約２×１０^３以下であり、さらにより好ましくは約１×１０^３以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、好ましくは、分岐グルカン構造の一部が環を形成している。ここで、環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして分岐構造部分とは、該環状構造部分に結合した非環状構造部分である。この分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約４以上であり、さらに好ましくは約６以上であり、好ましくは約２０以下であり、より好ましくは、１８以下であり、さらに好ましくは１５以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約７０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１５０以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの平均重合度は、好ましくは約５×１０^３以下であり、より好ましくは約４×１０^３以下であり、さらに好ましくは約３×１０^３以下であり、最も好ましくは約２×１０^３以下である。

本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約１０個以上であり、より好ましくは約１５個以上であり、さらに好ましくは約２０個以上である。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約１０００個以下であり、より好ましくは約８００個以下であり、さらに好ましくは約５００個以下である。

本発明で得られる環状構造保有分岐状グルカンにおいては、α−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比（「α−１，６−グルコシド結合の数」：「α−１，４−グルコシド結合の数」）は、好ましくは１：３〜１：１３であり、より好ましくは１：４〜１：１２であり、さらに好ましくは１：５〜１：１０であり、さらに好ましくは１：５〜１：９である。

α−１，６−グルコシド結合は、本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。

グルカンのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物であるため、その分子量は数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｎは、その系の全質量を、その系に含まれる分子の個数で割ったものである。すなわち数分率による平均である。一方、Ｍｗは重量分率による平均である。完全に均一な物質であれば、Ｍｗ＝Ｍｎとなるが、高分子は一般に分子量分布を有するためＭｗ＞Ｍｎとなる。したがって、Ｍｗ／Ｍｎが１より大きいほど、分子量の不均一度が大きい（分子量分布が広い）ということになる。

Ｍｎは、分子の個数を評価することにより、決定できる。すなわち、アミロースなどにおいては、還元性末端数を測定することにより決定できる。還元性末端数の測定は、例えばＴａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６．１７８：ｐ．１６００−１６０６に記載されるＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法により決定できる。Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲルろ過クロマトグラフィー（ＭＡＬＬＳ法）によっても、決定できる。Ｍｗは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。

本明細書においては、基質の分子量は主として数平均分子量（Ｍｎ）で評価し、生成物グルカンの分子量は主として重量平均分子量（Ｍｗ）で評価している。生成物においては、環状化反応が起こった場合、還元末端数評価法では、Ｍｎを正しく評価できないためである。非常に巨大な分子の分子量を評価する場合、相対的に還元末端数が少なく、正確なＭｎ評価が行いにくいためでもある。さらに、ＭＡＬＬＳ法によるＭｎ評価法は、ゲルろ過による分画が完全であることを前提としており、分画が不完全であると正確なＭｎ評価ができないためでもある。

（環状構造を有することの確認）
本発明の製造法により得られる環状構造保有分岐状グルカンが、環状構造を有することの確認は、エキソ型のグルコアミラーゼを用いて行い得る。

エキソ型グルコアミラーゼは、澱粉などのグルカンの非還元末端から順次α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素である。速度は遅いが、非還元末端からα−１，６−グルコシド結合を加水分解し得ることが知られている。環状構造を有しないアミロースおよびアミロペクチンは、エキソ型グルコアミラーゼによって完全にグルコースにまで分解される。しかし、分子内に環状構造を有するグルカンは、その非環状構造部分（すなわち、分岐状構造部分）のみがグルコアミラーゼにより分解され、環状構造部分は、グルコアミラーゼでは分解を受けない物質（以下、グルコアミラーゼ耐性成分という）として残る。

このグルコアミラーゼ耐性成分（環状構造部分）が、α−１，６−グルコシド結合を有するか否かは、α−１，６−結合を切断する枝切り酵素に対する感受性によって決定することができる。

α−１，６−グルコシド結合を有する環状グルカンは、枝きり酵素とグルコアミラーゼの併用で、グルコースにまで完全に分解される。

他方、α−１，６−グルコシド結合を有しない（α−１，４−グルコシド結合のみを有する）環状構造のグルカンは、枝切り酵素およびエキソ型グルコアミラーゼの併用によって分解されない。この環状グルカンは、エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼを併用することにより完全にグルコースまで分解され得る。

これらの性質を利用することにより、グルカンの環状構造部分、非環状（分岐状）構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量することが可能となる。

本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐状グルカンが、環状構造を有していることは、以下の（１）から（６）の性質で確認され得る。

（１）還元性末端数は、原料（澱粉など）と比較して増加しない。すなわち、還元末端を検出することができない。上記還元末端数の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ９４：２０５−２１３（１９８１）の改変パークジョンソン法により行い得る。

（２）エキソ型アミラーゼであるグルコアミラーゼを作用させると、グルコアミラーゼ耐性成分が残る。その成分は脱リン酸化酵素（シグマ社）を作用させた後にさらにグルコアミラーゼを作用させても分解されない。

（３）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。

（４）上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。

（５）（４）のエンド型α−アミラーゼによる加水分解により、イソマルトシルマルトース（ＩＭＭ）を生じる。α−１，６−グルコシド結合を有するグルカンにエンド型α−アミラーゼを作用させた場合の最小のリミットデキストリンは、ＩＭＭである（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｍｚｙｍｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ｐ４０−４５（１９８８））との記載と一致する。

（６）上記グルコアミラーゼ耐性成分の分子量をレーザーイオン化ＴＯＦ−ＭＳ装置（島津社製）で分析すると、得られた分子量の値は、環状グルカンの理論値に一致し、非環状のグルカンの理論値に一致しない。

環状構造部分の確認のために用いる、前記グルコアミラーゼ耐性成分の検出は、次のように行い得る。例えば、上記反応で生成したグルカンにグルコアミラーゼを添加し、例えば、約４０℃で一夜反応させる。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去した後、１０倍量のエタノールを添加し、残存する多糖を遠心分離による沈澱として回収する。この操作をもう一度繰り返して、グルコアミラーゼ耐性成分を得る。ただし、２回目のグルコアミラーゼの処理時間は、短時間（例えば、１から２時間）で十分である。

本願発明で使用する原料が一部リン酸基により修飾されている澱粉などの場合には、グルコアミラーゼ耐性成分の検出には前処理が必要である。例えば、反応生成物を１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．３ｍＭのＺｎＣ１_２を含む）に溶解し、脱リン酸化酵素を添加して反応させた後、１０倍量エタノールを添加し、沈澱を回収する。この沈殿に上記の方法を適用して、グルコアミラーゼ耐性成分を得ることができる。

グルコアミラーゼ耐性成分の平均重合度および構成成分は、上記（１）から（５）に記載のように、グルコアミラーゼ耐性成分と糖の加水分解酵素とを反応させて生じた糖を分析することによって、決定し得る。加水分解は、グルコアミラーゼ単独、グルコアミラーゼとイソアミラーゼとの組み合わせ、あるいはグルコアミラーゼとα−アミラーゼとの組み合わせが挙げられる。反応は、例えば、グルコアミラーゼ耐性成分を０．２％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、上記分解酵素をそれぞれ適当量加えて、３０−４５℃で適当な時間（例えば１時間）反応させる。このグルコアミラーゼ耐性成分分解物を、Ｄｉｏｎｅｘ社製の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ１００）にかけ、分析する。溶出は、例えば、流速：１ｍｌ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ、４５分−８５０ｍＭ、４７分−８５０ｍＭの条件で行う。この分析により、グルコアミラーゼ耐性成分の平均重合度、および分解により生じる糖が決定され得る。

５．本発明の方法により得られるグルカンの用途
本発明の方法によって得られる環状構造保有分岐状グルカンは、種々の澱粉の用途に使用され得、特に、腹膜透析、糖尿病患者用の食事、輸液、飲食用組成物、食品添加用組成物、接着用組成物において、および澱粉の老化防止剤として、使用され得る。これら用途において、本願発明のグルカンは、それぞれの用途に適した濃度となるように使用され得る。本発明の環状構造保有分岐状グルカンは、分子量が腹膜透析に適切な範囲にあり、還元糖をほとんどまたは全く含まないため、特に腹膜透析に適している。

本発明の方法においては、グルコースおよび低分子量のマルトオリゴ糖がほとんどまたは全く生成されないため、高度の精製をすることなく、グルコースおよびマルトオリゴ糖を含まない環状構造保有分岐状グルカンを得ることができる。グルコースおよびマルトオリゴ糖を含まない環状構造保有分岐状グルカンは、体液中に急激に吸収されることがなく、血糖値を急激に上昇させることがないため、腹膜透析、糖尿病患者用の食事および輸液において特に有用である。

環状構造保有分岐状グルカンは、既存の澱粉などの上記原料と比較して、水に対する溶解度が非常に高く、溶解した糊液の粘度が低く、通常の澱粉では観察される老化が起こらないという優れた性質を有する。さらに、環状構造保有分岐状グルカンまたはその誘導体は、反応性が低いため、タンパク質やアミノ酸と混合して加熱したとき、既存の水飴およびデキストリンと比較して、着色しにくいという優れた性質を有している。

このように、環状構造保有分岐状グルカンは、水に対する溶解度が非常に高いため、粉末化基剤、コーヒー、醤油、たれ、麺類のつゆ、ソース、ダシの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、ゼリー、キャラメル、ガム、チョコレート、クッキー、クラッカー、アイスクリーム、シャーベット、ジュース、粉末ジュース、入浴剤、飲み薬、粉末薬、塗料、接着剤、増粘剤、糊料などに、好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、老化が起こらないため、和生菓子、洋生菓子、冷凍食品、冷蔵食品、餅、おにぎりなどに好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンまたはその誘導体は、溶解した糊液の粘度が低いため、生物崩壊性プラスチックの原料や、澱粉からサイクロデキストリンなどを製造する際の中間物質、澱粉加工工業における原料などに好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、良好な接着性を有し、接着用組成物として好適に使用され得る。

環状構造保有分岐状グルカンは、環状構造を除けば、通常の澱粉と同じ基本的構造を持つことから、生体内の酵素により容易にグルコースに分解されることができるため、消化性に優れている。そのため、スポーツ飲料、スポーツ食品などにも使用され得る。

以下に実施例をあげて本願発明を説明するが、本願発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。

（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ（ＡｑＢＥ）の製造）
特開２００８−９５１１７の製造例１に記載された組換えプラスミドｐＡＱＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同特許文献に示された方法により配列番号２のアミノ酸配列を有するＡｑＢＥを含む酵素液を得た。

（製造例２：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼ（ＴａｑＭａｌＱ）の組換え生産）
Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５巻、９１０−９１５（１９９９））に示されたプラスミドｐＦＧＱ８を保持する大腸菌ＭＣ１０６１株より、同文献に示された方法により配列番号４のアミノ酸配列を有するＴａｑＭａｌＱを含む酵素液を得た。

（製造例３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥ（ＲｈＢＥ）の製造）
特開２００８−９５１１７の製造例５に記載された組換えプラスミドｐＲＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同特許文献に示された方法により配列番号６のアミノ酸配列を有するＲｈＢＥを含む酵素液を得た。

（実施例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＭａｌＱを用いた環状構造保有分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）５０ｇを１Ｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。本実施例においてはワキシーコーンスターチが基質である。このワキシーコーンスターチの分岐頻度は５．２％であり、平均重合度は約１×１０^５であり、重量平均分子量は約２×１０^７であった。約７０℃まで冷却した糊液に、上記製造例１で調製したＡｑＢＥ酵素液１．２５ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加して７０℃で１６時間反応させた。その後、製造例１で調製したＡｑＢＥ酵素液１．２５ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）および製造例２で調製したＴａｑＭａｌＱ酵素液１．４ｍＬ（１０Ｕ／ｇ基質）を添加し、さらに７０℃で１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加してグルカンを沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約４８ｇを得た。

グルカンの重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計（ワイアットテクノロジー社製、ＤＡＷＮ ＤＳＰ）と示差屈折計（昭和電工（株）製、Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工（株）製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０６ＭＨＱ）を用いて調べた。グルカンの粉末２０ｍｇを１０ｍｌの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径０．４５μｍの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。得られたグルカンの重量平均分子量は約２．２×１０^５であることが示された。この得られたグルカンが環状構造を有していることおよび還元末端を有さないことの確認は、特開２０００−３１６５８１の実施例４に記載された方法に従って行った。その結果、この分岐状グルカンが確かに環状構造を有し、還元末端を有さないことが確認された。

得られたグルカンの分岐頻度は、グルカンの非還元末端数を求めることにより求めた。非還元末端数は、得られたグルカンにイソアミラーゼを作用させた後の還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．，３５，ｐｐ．３４８−３５０， （１９８３））により調べることにより求めた。その結果、得られたグルカンが分岐状グルカンであることが確認され、そしてその分岐鎖部分の単位鎖長は平均９．７であり、分岐数は平均約１４０であることが示された。この環状構造を有する分岐状グルカンの分岐頻度は１０．３％であり、環状構造を保有する分岐状グルカンが製造できた。この結果を実施例２、比較例３、４、５とともに表１にまとめた。

（実施例２：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ、アミロマルターゼおよびβ−アミラーゼを用いた環状構造保有分岐状グルカンの製造）
実施例１と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカン１ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに溶かし、サツマイモ由来β-アミラーゼ（Ｔｙｐｅ Ｉ-Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）０．０１ｍＬ（４００Ｕ／ｇ基質）を添加し３７℃で１６時間反応させた。この反応液を、実施例１の１００℃で２０分間の加熱工程以後は実施例１と同じ方法で精製して粉末のグルカンを製造した。製造されたグルカンを、実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量は約１．４×１０^５であり、分岐頻度は１６．４％であり、収率は約４７％であった。この結果を実施例１、比較例３、４、５とともに表１にまとめた。

（比較例３：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥを用いた環状構造保有分岐状グルカンの製造）
市販のワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）１０ｇを１００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。約７０℃まで冷却した糊液に、製造例１で得られたＡｑＢＥ酵素液０．２５ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）添加し７０℃で１６時間反応させた。本比較例においてはワキシーコーンスターチが基質である。このワキシーコーンスターチの分岐頻度は５．２％であり、平均重合度は約１×１０^５であり、重量平均分子量は約２×１０^７であった。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、孔径０．８μｍの膜でろ過した。このろ液に２倍量のエタノールを添加してグルカンを沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約９．５ｇを得た。実施例１と同様に分析したところ、グルカンの重量平均分子量は約１．５×１０^５であり、分岐頻度は６．３％であった。さらに、得られたグルカンは環状構造を有していることが確認された。環状構造を有する分岐状グルカンが約９５％の高収率で製造できた。この結果を実施例１、実施例２、比較例４、５とともに表１にまとめた。

（比較例４：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥおよびβ−アミラーゼを用いた環状構造保有分岐状グルカンの製造）
比較例３で製造した環状構造を有する分岐状グルカン５ｇを１００ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、サツマイモ由来β−アミラーゼ（Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）０．０４ｍＬ（４００Ｕ／ｇ基質）を添加し３７℃で１６時間反応させた。本比較例においては比較例３で製造したグルカンを使用しているため、得られる生成物は、比較例３で基質として用いたワキシーコーンスターチにＢＥを作用させ、さらにβ−アミラーゼを作用させてできた産物である。１００℃で１０分間加熱した後、孔径０．８μｍの膜でろ過した。このろ液に４倍量のエタノールを添加してグルカンを沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末グルカン約２ｇを得た。得られたグルカンを実施例１と同様に分析したところ、グルカンの重量平均分子量は約６．０×１０^４であり、分岐頻度は１５．４％であった。さらに、得られたグルカンは環状構造を有していることが確認された。環状構造保有分岐状グルカンの収率は約４１％であった。この結果を実施例１、実施例２、比較例３、５とともに表１にまとめた。

（比較例５：分岐状グルカン（グリコーゲン）の製造）
コーンスターチ（和光純薬工業（株）製）２ｇを水１００ｍｌに懸濁し、１００℃で３０分間加熱することによりコーンスターチを糊化した。本比較例においてはコーンスターチは出発物質である。４０℃まで冷まし、イソアミラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）０．１７ｍｌ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加して４０℃で２０時間反応させアミロースを生成させた。本比較例においてはアミロースが基質である。このアミロース含有溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に調製し、製造例１で製造したＡｑＢＥ酵素液０．２ｍＬ（２０，０００Ｕ／ｇ基質）および製造例２で製造したＴａｑＭａｌＱ酵素液０．１４ｍＬ（２０Ｕ／ｇ基質）を添加し、６５℃で２０時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。実施例１と同様に分析した結果、得られた分岐状グルカンの重量平均分子量は約２．４×１０^７であり、α１，６分岐含量が１１．２％であり、収率は約８０．２％（理論値）であった。さらに、得られたグルカンは環状構造を有さないことが確認された。この結果を実施例１、実施例２、比較例３、４とともに表１にまとめた。

（実施例６：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥを用いた環状構造を保有する分岐状グルカンの製造）
５ｇの市販のワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）を４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。約７０℃まで冷却した糊液に、製造例３で生産したＲｈＢＥ酵素液０.１２ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）を添加し７０℃で１６ｈｒ反応させた。本実施例においてはワキシーコーンスターチが基質である。このワキシーコーンスターチの分岐頻度は５．２％であり、平均重合度は約１×１０^５であり、重量平均分子量は約２×１０^７であった。さらに製造例３で生産したＲｈＢＥ酵素液０．１２ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）および製造例２で生産したＴａｑＭａｌＱ酵素液０．１８ｍＬ（１０Ｕ／ｇ基質）添加し７０℃で１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加してグルカンを沈殿させた。この沈殿を凍結乾燥し粉末のグルカン約４．７ｇを得た。実施例１と同様に分析したところ、グルカンの重量平均分子量は約２．１×１０^５であり、分岐頻度は１０％であった。さらに、得られたグルカンは環状構造を有していることが確認された。環状構造を有する分岐状グルカンが約９４％の高収率で製造できた。さらに、得られたグルカンが環状構造を有することが確認された。

（実施例７：澱粉粒を用いた環状構造保有分岐状グルカンの製造）
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）５０ｇを３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁し、この懸濁液に製造例１で生産したＡｑＢＥ酵素液１．５ｍＬ（６０００Ｕ／ｇ基質）添加し、攪拌しながら７０℃で６時間反応させた。ワキシーコーンスターチの糊化開始温度は通常約６７．５℃であるので、この反応の間中、コーンスターチの澱粉粒は結晶構造の大部分を保持した状態であった。本実施例においてはワキシーコーンスターチが基質である。このワキシーコーンスターチの分岐頻度は５．２％であり、平均重合度は約１×１０^５であり、重量平均分子量は約２×１０^７であった。その後、反応液を８５℃まで昇温し約３０分保持することによりＢＥをさらに作用させた。次いでこの反応液に、製造例１で生産したＡｑＢＥ酵素液１．２５ｍＬ（５０００Ｕ／ｇ基質）および製造例２で生産したＴａｑＭａｌＱ酵素液０．４ｍＬ（２．５Ｕ／ｇ基質）添加し７０℃で１８時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。ろ液に２倍量のエタノールを添加し沈殿させた。沈殿物を凍結乾燥し、約４５ｇの粉末グルカンを得た。

得られた粉末グルカンを実施例１と同様に分析したところ、得られたグルカンの重量平均分子量は約２．２×１０^５であり、分岐頻度は１０．３％であった。さらに、得られたグルカンが環状構造を有することが確認された。したがって、本実施例により、環状構造保有分岐状グルカンが約９０％の高収率で製造できた。

（比較例８：未処理のデキストリン）
デキストリン（江崎グリコ社製クラスターデキストリン）を実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約１．７×１０^５、分岐頻度６．３％であった。便宜上、収率を１００として記載する。

（比較例９：デキストリンのアミロマルターゼ処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用し、ブランチングエンザイムを使用しないこと以外は実施例１と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカンを実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約１．７×１０^５、分岐頻度６．３％、であり、収率は１００％であった。

（比較例１０：デキストリンのβ−アミラーゼ処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用し、ブランチングエンザイムを使用しないこと以外は比較例４と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカンを実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約７．３×１０^４、分岐頻度１４．２％であり、収率は４２％であった。

（比較例１１：デキストリンのブランチングエンザイム処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用したこと以外は比較例３と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカンを実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約８．０×１０^４、分岐頻度６．７％であり、収率は１００％であった。

（実施例１２：デキストリンのブランチングエンザイムおよびアミロマルターゼ処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用したこと以外は実施例１と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカンを実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約２．２×１０^５、分岐頻度１０．３％であり、収率は１００％であった。

さらに、実施例１と同様に構造を分析したところ、この分岐状グルカンが確かに環状構造を有し、還元末端を有さないことが確認された。

（実施例１３：デキストリンのブランチングエンザイム、アミロマルターゼおよびβ−アミラーゼ処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用したこと以外は実施例１と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカン１ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに溶かし、サツマイモ由来β-アミラーゼ（Ｔｙｐｅ Ｉ-Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）０．０１ｍＬ（４００Ｕ／ｇ基質）を添加し３７℃で１６時間反応させた。この反応液を実施例１と同じ方法で粉末のグルカンを製造し、実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約６．１×１０^４、分岐頻度１６．７％であり、収率は４７％であった。

（比較例１４：デキストリンのイソアミラーゼ、ブランチングエンザイムおよびアミロマルターゼ処理）
基質として澱粉の代わりに比較例８と同じデキストリンを使用したこと以外は比較例４と同じ方法で粉末のグルカンを製造した。この粉末のグルカンを実施例１と同じ方法で分析したところ、重量平均分子量約２．４×１０^７、分岐頻度８．３％であり、収率は６５％であった。

比較例８〜１１および１４、実施例１２および１３の結果を以下の表２にまとめて示す。

このように、デキストリンを使用した場合も、本願発明によれば、高い収率でα−１，６結合の割合が高く、重量平均分子量が約２２万の環状構造保有分岐構造グルカンが得られた。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明の方法では、非常に高い分岐頻度を有するグルカンを高い収率で製造することが可能になり、工業的製造プロセスの効率の点で有利である。

また、本発明の方法によって製造される環状構造保有分岐グルカンは、腹膜透析、糖尿病患者用の食事、輸液、飲食用組成物、食品添加用組成物、接着用組成物において、および澱粉の老化防止剤として有用である。具体的には、例えば、分岐頻度が非常に高いことにより、腹膜透析、経腸栄養材、糖尿病患者用の食事などの用途に用いた場合に、分岐頻度がそれほど高くないグルカンを用いた場合よりも生体内での分解性が改良され得る。

配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥをコードする塩基配列；
配列番号４：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ ＪＣＭ９７８５の天然のＢＥのアミノ酸配列；
配列番号５：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＭａｌＱをコードする塩基配列；
配列番号６：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＭａｌＱのアミノ酸配列。

Claims (14)

1. 分岐状グルカン構造の一部が環を形成している環状構造保有分岐状グルカンの製造法であって、
   １）基質である分岐状グルカンにブランチングエンザイムを作用させ、次いで４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させるか；
   ２）基質である分岐状グルカンに４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いでブランチングエンザイムを作用させるか；または
   ３）基質である分岐状グルカンにブランチングエンザイムおよび４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時に作用させる
   ことにより、該環状構造保有分岐状グルカンを得る工程を包含し、
   ここで、該基質はコーンスターチまたはコーンスターチを酵素によって部分的に分解することによって得られたデキストリンであり、そして
   得られる環状構造保有分岐状グルカンの分岐頻度が８％以上である、
   方法。
2. 前記基質である分岐状グルカンに前記ブランチングエンザイムを作用させ、次いで前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、請求項１に記載の方法。
3. 前記基質である分岐状グルカンに前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いで前記ブランチングエンザイムを作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、請求項１に記載の方法。
4. 前記基質である分岐状グルカンに前記４−α−グルカノトランスフェラーゼおよび前記ブランチングエンザイムを同時に作用させることにより前記環状構造保有分岐状グルカンを得る、請求項１に記載の方法。
5. 前記基質である分岐状グルカンがコーンスターチのアミロペクチンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記基質である分岐状グルカンがコーンスターチの澱粉粒である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、得られた環状構造保有分岐状グルカンにエキソ型アミラーゼを作用させる工程をさらに包含する、方法。
8. 前記ブランチングエンザイムを前記基質である分岐状グルカンに作用させる際の温度は４５℃以上１３０℃以下であり、該温度において該ブランチングエンザイムは活性を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ブランチングエンザイムがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のブランチングエンザイムもしくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来のブランチングエンザイムである請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを前記基質である分岐状グルカンに作用させる際の温度が４５℃以上１３０℃以下であり、該温度において該４−α−グルカノトランスフェラーゼは活性を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記４−α−グルカノトランスフェラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記環状構造保有分岐状グルカンの分子量が５万から５０万である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記基質である分岐状グルカンの分岐頻度が、３％以上１０％以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
14. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ブランチングエンザイムの使用量が５０００Ｕ／ｇ基質以上である、方法。