CN108707633A - 一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用 - Google Patents

一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。本发明利用角质酶、芽寡糖基海藻糖合成酶和芽寡糖基海藻糖水解酶进行多酶复配提高底物利用率，从而降低海藻糖的生产成本，利用本发明的方法以20wt％淀粉溶液为底物合成海藻糖的转化率达到55％，而普通双酶法以20wt％淀粉溶液为底物合成海藻糖转化率为50％左右。

Description

一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖通过1,1-糖苷键连结而成的一种非还原性二糖，是一种优质的甜味糖，其具有分子结构稳定、生物学功能良好等优势，因此被广泛应用于食品、医学、农业、化妆品等行业。自上世纪80年代后，各国对海藻糖的生理生化和分子生物学研究逐步展开。
目前，多以双酶法生产海藻糖，双酶法以淀粉为底物，通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生产海藻糖，此方法在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。
在工业生产中，海藻糖的底物主要选择玉米淀粉、木薯淀粉和大米淀粉，其中，大米淀粉具有生产成本低、副产物少、且方便后续产物的分离纯化的优势。
但是，大米淀粉不仅含有淀粉物质，还含有蛋白质和脂质等少量非淀粉物质，其含有的蛋白质与淀粉形成的紧密复合物会阻遏淀粉脱支酶与底物淀粉的有效碰撞；同时，与薯类淀粉相比，大米淀粉中脂质含量较高，一般是单甘油脂和真正的淀粉结合脂质，使得在海藻糖合成反应体系中的大米淀粉难以充分利用。
上述因素导致了海藻糖在工业生产中淀粉底物利用率低、生产成本高的问题。
鉴于以上缺点，开发一种能将大米淀粉中的非淀粉物质去除的方法或者开发出一种新的酶解的方法对有效提高淀粉底物利用率、降低生产海藻糖成本具有十分重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明利用角质酶、芽寡糖基海藻糖合成酶和芽寡糖基海藻糖水解酶进行多酶复配提高底物利用率，从而降低海藻糖的生产成本。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种多酶复配生产海藻糖的方法，所述方法为以淀粉为底物，经α-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、角质酶和糖化酶共同作用合成海藻糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的淀粉溶液，将淀粉溶液煮沸，加入α-淀粉酶搅拌，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液降温至一定的温度后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、角质酶进行酶催化反应，然后灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到合适pH，加入糖化酶糖化。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的淀粉溶液，将淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入α-淀粉酶搅拌25～30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于55～65℃水浴摇床中恒温至55～65℃后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶，调节pH为5～6，在120～180r/min的水浴摇床中进行酶催化反应30～40h，然后沸水浴灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到pH为4～5，加入糖化酶于55～60℃糖化18～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入α-淀粉酶搅拌30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于60℃水浴摇床中恒温至60℃后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、角质酶，调节pH为pH至5.5，在150r/min的水浴摇床中进行酶催化反应35h，然后沸水浴灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到pH为4.5，加入糖化酶于60℃糖化24h。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为大米淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度为18～22mM。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度为20mM。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为5～6。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为5.5。
在本发明的一种实施方式中，所述大米淀粉溶液的浓度为18～22wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述大米淀粉溶液的浓度为20wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的添加量为9～11U/mL；所述1U为在70℃，pH6.0条件下，1min液化可溶性淀粉生成1μmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的添加量为10U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的DE值为14～18。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的DE值为16。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的添加量为4～6U/g；所述1U为在60℃、pH4.5条件下，1min内转化普鲁兰多糖生成1μmol还原糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的添加量为5U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶为来源于地衣芽孢杆菌(Bacillusderamificans)的普鲁兰酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2～3U/mL；所述1U为在55℃、pH6.0条件下，1min内转化麦芽六糖生成1μmol麦芽四糖基海藻糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2.5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶为来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2～3U/mL；所述1U为在60℃、pH6.0条件下，1min内转化麦芽四糖基海藻糖生成1μmol海藻糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2.5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶为来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的添加量为0.2～0.3U/mL；所述1U为在37℃、pH8.0条件下，1min内将对硝基苯丁酸酯(pNPB)催化水解生成1μmol对硝基酚的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的添加量为0.24U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶为来源于嗜热单孢菌(Thermobifidafusca)的角质酶。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶的添加量为4～6U/g；
所述1U为在60℃、pH4.5条件下，1min内转化可溶性淀粉生成1umol葡萄糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶的添加量为5U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶为来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-淀粉酶。
本发明提供了应用上述一种多酶复配生产海藻糖的方法生产得到的海藻糖。
本发明提供了上述一种多酶复配生产海藻糖的方法或上述生产得到的海藻糖在制备食品、药品以及化妆品方面的应用。
有益效果：
(1)利用本发明的方法可高效合成海藻糖，以20wt％大米淀粉溶液为底物合成海藻糖的转化率达到55％，而普通双酶法以20wt％大米淀粉溶液为底物合成海藻糖转化率为50％左右；
(2)在大米淀粉底物浓度为20wt％的情况下，以本发明的方法生产海藻糖的产量高达110g/L，而同等条件下，普通双酶法的产量仅为100g/L。
具体实施方式
下面以淀粉中产物利用率最低放入大米淀粉为例，结合各个实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法：
转化产物检测方法：高效液相色谱(HPLC)法
色谱柱：氨基柱(赛默飞APS-2HYPERSIL)
流动相为乙腈：水＝80：20。
标准品：称取海藻糖(纯度＝99.5％)标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50mL，摇匀。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
样品制备：将糖化结束的催化液于沸水中煮沸10分钟灭酶，用超纯水稀释10倍，12000r/min离心25分钟。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
试样的测定：首先用流动相以0.8mL/min的流速冲洗管路30分钟，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池40分钟，走基线，待基线走稳后,将标准溶液和制备好的试样分别进样10uL。根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以外标法计算糖组分的浓度。
结果计算：
式中：Cm—海藻糖浓度，单位为(g/L)；
Am—样品峰面积；
As—标准品峰面积；
Cs—标准品质量，g；
海藻糖转化率的计算：
式中：X1—海藻糖转化率，单位为(％)；
Cm—海藻糖浓度，单位为(g/L)；
C0—淀粉浓度，单位为(g/L)。
实施例1：多酶复配催化与普通双酶法合成海藻糖比较
1)普通双酶法合成海藻糖：将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制20wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液，将得到的麦芽糊精溶液于60℃水浴摇床中恒温至60℃后；加入5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(SulfolobusacidocaldariusATCC 33909)的MTHase，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应10h开始每隔4h取样，35h后沸水浴终止反应，调节pH4.5并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：海藻糖的产量为100g/L，其转化率为50％。。
2)多酶复配催化合成海藻糖：将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制20wt％浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL的α-淀粉酶搅拌30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液，将得到的麦芽糊精溶液于60℃水浴摇床中恒温至60℃后；分别加5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于Thermobifidafusca的角质酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应10h后每隔4h取样，35h后沸水浴终止反应，调节pH4.5并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：海藻糖的产量为110g/L，其转化率为55％。。
结果表明，以20wt％的大米淀粉溶液为底物，多酶复配催化合成海藻糖比普通双酶法更高效。角质酶将液化液中非淀粉物质降解，提高了底物麦芽糊精与普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的有效碰撞效率，从而提高麦芽糊精的利用率，反应35h，转化率从50％提高至55％。
实施例2：角质酶的添加量对海藻糖产率的影响
将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制20wt％浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL的α-淀粉酶搅拌30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g来源于Bacillusderamificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC33909)的MTHase、分别添加0.12、0.18、0.24、0.3、0.36U/mL的来源于Thermobifidafusca的角质酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应35h后终止反应并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：角质酶浓度为0.24U/mL时，海藻糖的产量最高为110g/L。
结果表明，角质酶的添加量为0.24U/mL时，海藻糖转化率最高，达到55％。
实施例3：反应温度对海藻糖产率的影响
将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制20wt％浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(SulfolobusacidocaldariusATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于Thermobifidafusca的角质酶，pH5.5，分别置于45、50、55、60、65℃恒温水浴摇床，150r/min，反应35h后终止反应并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：温度60℃时，海藻糖的产量最高为109.6g/L。
结果表明，恒温水浴温度为60℃时，海藻糖转化率最高，达到54.8％。
实施例4：pH对海藻糖产率的影响
将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制20wt％浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(SulfolobusacidocaldariusATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于Thermobifidafusca的角质酶，调节pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0，置于60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应35h后终止反应并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：pH为5.5时，海藻糖的产量最高为110g/L。
结果表明，催化反应pH为5.5时，海藻糖转化率最高，达到55％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为以淀粉为底物，经α-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、角质酶和糖化酶共同作用合成海藻糖。
2.如权利要求1所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为将淀粉配置一定浓度的淀粉溶液，将淀粉溶液煮沸，加入α-淀粉酶搅拌，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液降温至一定的温度后后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、角质酶进行酶催化反应，然后灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到合适pH，加入糖化酶糖化。
3.如权利要求1或2所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述α-淀粉酶的添加量为9～11U/mL。
4.如权利要求1-3任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶的添加量为4～6U/g。
5.如权利要求1-4任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2～3U/mL。
6.如权利要求1-5任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2～3U/mL。
7.如权利要求1-6任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述角质酶的添加量为0.2～0.3U/mL。
8.如权利要求1-7任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法，其特征在于，所述糖化酶的添加量为4～6U/g。
9.应用权利要求1-8任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法生产得到的海藻糖。
10.权利要求1-8任一所述的一种多酶复配生产海藻糖的方法或权利要求9生产得到的海藻糖在制备食品、药品以及化妆品方面的应用。
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