CN111647615B - 一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用 - Google Patents

一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用，本发明通过构建不同比例和不同结构的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得大肠杆菌重组子；本发明发现不同比例的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得的大肠杆菌重组子对海藻糖的转化率有一定影响；相同比例、结构不同的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得的大肠杆菌重组子对海藻糖的转化率影响较大；为多酶体系发酵生产海藻糖的研究提供了理论依据。

Description

一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用
技术领域
本研究涉及一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
海藻糖(α,α-海藻糖，Trehalose)最早是1832年Wiggers在黑麦的麦角菌中发现的，自然界中的海藻糖是由两分子葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接而成，不易被酸水解，并且α-1,1-糖苷键不能被α-葡萄糖苷酶酶切。海藻糖因其对生物大分子生命体具有优良的抗逆保护特性，被称为“生命之糖”，在食品运输、医药保藏等方面具有较广的应用。
目前双酶法生产海藻糖成为国内外企业工业化生产的首选，这种生产方法产物得率较高，生产成本较低，适合工业化生产，由于双酶法是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)连续作用才会产生海藻糖，两个酶由两个菌株单独表达，会造成人力和物力的浪费。来源于CnaB2结构域的SpyTag-SpyCatcher体系，在蛋白质自组装领域占有重要的地位，并且有着广泛的应用，同时利用SpyTag-SpyCatcher在重组蛋白任何位置都不会影响重组蛋白活性的特性。但是现有技术中，并未报道利用自组装体系在重组大肠杆菌中构建不同比例、不同结构的MTSase-MTHase多酶复合体，对海藻糖转化率的影响。
中国专利文献申请号2020101068312，公开了一种一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，该专利中公开了随着MTSase的比例增加，海藻糖转化率逐渐提高，在枯草芽孢杆菌中形成MTSase:MTHase＝3:1的多酶复合体转化率最高为81.5％，但是当MTSase:MTHase＝4:1时比MTSase:MTHase＝3:1时的转化率略有降低，是由于多个酶之间的空间结构影响与底物的结合能力造成的；由对比例1、4、5、6的转化率结果可以看出，MTSase的比例决定了转化率的大小，是双酶法转化生产海藻糖过程中的限制性因素；该发明公开的多酶复合体重组菌是枯草芽孢杆菌，产生的多酶复合体为胞外酶，即发酵上清液对海藻糖的转化率，但是该专利文献并未涉及其它重组菌中，多酶复合体的不同比例对海藻糖转化率的影响，以及相同比例的多酶复合体，与结构域SpyTag-SpyCatcher不同的结合方式，对海藻糖转化率的影响，也并未涉及该多酶复合体作为胞内酶对海藻转化率的影响。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用。
本发明技术方案
一种构建自组装表达双酶菌株的方法，包括如下步骤：
(1)以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增得到MTSase的编码基因treY和MTHase的编码基因treZ，所述基因treY的基因序列为SEQ ID NO.1，所述基因treZ的基因序列为SEQ ID NO.2；以合成的SpyCatcher基因序列为模板，PCR扩增得到SpyCatcher基因，所述SpyCatcher基因序列为SEQ ID NO.3；将SpyTag基因序列直接合成在引物中，所述SpyTag基因序列为SEQ ID NO.4；
(2)将pET28a质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切；将pETDuet质粒用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切；
(3)利用无缝克隆技术将步骤(1)、(2)中得到的treY基因、SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY；将SpyTag、treZ基因和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ；并将得到的重组表达质粒共同转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ；
或者利用无缝克隆技术将SpyCatcher基因分别连接到treY基因的C端和N端，然后和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；将SpyTag、treZ基因和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ；并将得到的重组表达质粒共同转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ；
或者利用无缝克隆技术将SpyCatcher基因和SpyTag基因分别连接到treY基因的C端和N端，然后和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag；将SpyCatcher基因和SpyTag基因分别连接到treZ基因的C端和N端，然后和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher；并将得到的重组表达质粒共同转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher。
根据本发明优选的，步骤(1)中PCR扩增程序如下：
95℃预变形3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明优选的，步骤(1)中PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002531334640000021
Max Master Mix 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，基因模板2.5μL，ddH2O 17.5μL。
根据本发明优选的，步骤(2)中质粒酶切体系如下：
pET28a质粒17μL，ddH2O 3.5μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，BamH I 1μL，XhoⅠ1μL；
反应条件:37℃金属浴中反应2h；
pETDuet质粒17μL，ddH2O 3.5μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，BamH I 1μL，NotⅠ1μL；
反应条件：37℃金属浴中反应2h。
根据本发明优选的，步骤(1)中treY基因的扩增引物序列如下所示：
treY-F:GCGATGCGCATATTGATGTGATATCAGCAACCTACAGATTACAGT SEQ ID NO.5；
treY-R:CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCTAGGTAGCTCA SEQ IDNO.6；
treY-SpyCacher-R：ACCCTGGAATTACACCACCACCACCACCAC SEQ ID NO.7；
treY-SpyTag-R：
CTCGAGGCACATATTGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCTAGGTAGCTCA SEQ ID NO.8；
步骤(1)中treZ基因的扩增引物序列如下所示：
treZ-F：
GGCCACGCGATCGCTGACGTCATGGCACATATTGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGGAAATATT SEQ ID NO.9；
treZ-R：
GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTAATTGATATACCCCAACACCSEQ ID NO.10；
treZ-SpyCather-R：ATAGCACCCTGGAATCACACCACCACCACCACCA SEQ ID NO.11；
步骤(1)中SpyCatcher基因的扩增引物序列如下所示
SpyCatcher-F：TTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.12；
SpyCatcher-treY-F：tggtggtgtaaTTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.13；
SpyCatcher-R：CACATCAATATGCGCATCGCCTT SEQ ID NO.14；
SpyCatcher-treZ-F：GTGTGATTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.15；
SpyCatcher-treZ-R：
CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCATCAATATGCGCATCGCCTT SEQ ID NO.16。
所述引物treY-SpyTag-R中含有SpyTag基因序列。
所述引物treZ-F中含有SpyTag基因序列。
进一步优选的，步骤(3)中将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-RPCR扩增得到的treY基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY；
同理，将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-SpyCacher-R PCR扩增得到的treY基因；以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR扩增得到的SpyCatcher基因；以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-treY-F和SpyCatcher-R PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-SpyTag-R PCR扩增得到的treY-SpyTag基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treZ-F和treZ-SpyCather-R PCR扩增得到的SpyTag-treZ基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-treZ-F和SpyCatcher-treZ-R PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pETDuet质粒，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treZ-F和treZ-R PCR扩增得到的SpyTag-treZ基因和双酶切的pETDuet质粒，利用单片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ。
根据本发明优选的，步骤(3)中得到的重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY和pETDuet-SpyTag-treZ用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；将重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher和pETDuet-SpyTag-treZ用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；将重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag和pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；筛选重组目的表达菌株，将上述转化子37℃200r/min培养1h，随后将转化细胞涂布在含有80μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落接种至含有80μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待菌液浑浊后通过菌落PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后送去上海生工生物科技有限公司测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。
上述构建的目的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ、E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ、E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher之一或二者以上在发酵生产MTSase-MTHase多酶复合体中的应用。
上述构建的目的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ、E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ、E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher之一或二者以上在发酵生产海藻糖中的应用。
根据本发明优选的，所述发酵生产海藻糖的应用，包括如下步骤：
将目的表达菌种接种于含有80μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h作为种子液；将种子液以体积比1:100的比例接种至含有80μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h，然后添加终浓度为6mg/L的乳糖作为诱导剂，将温度调至25℃继续发酵12h，发酵结束后，收集菌体，进行破壁制得粗酶液，然后在65℃、pH5.5条件下转化质量浓度为15％的麦芽糊精，并添加质量浓度为5％的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)，转化生产海藻糖。
本发明技术方案的有益效果
1、获得了在胞内能够进行自组装的MTSase和MTHase双酶表达菌株。
2、本发明按照MTSase:MTHase＝1:2的比例构建自组装双酶系，获得的重组菌株，相较于MTSase:MTHase＝1:1的比例构建自组装双酶体系，具有较高的海藻糖转化率，即不同比例的MTSase-MTHase多酶复合体对海藻糖的转化率有一定影响，为多酶体系发酵生产海藻糖的研究提供了理论依据。
3、本发明通过结构域SpyTag-SpyCatcher与MTSase和MTHase多酶体系的构建发现，同样是MTSase:MTHase＝1:1的比例构建自组装双酶体系，与结构域SpyTag-SpyCatcher连接方式不同，即MTSase-MTHase多酶复合体的比例相同、结构不同，对海藻糖的转化率影响较大，为后期多酶体系的理论研究奠定了基础。
4、本文旨在构建一株能够使MTSase和MTHase成环形依次自组装的菌株，提供一种新型的构建自组装菌株的思路。
具体实施方式
通过下面实施例对本发明做进一步阐述，但保护范围不限于此。
材料来源：
菌种：E.coli BL21(DE3)超级感受态细胞为克隆表达宿主菌，购自Vazyme公司。
质粒：pET-28a、pETDuet质粒为本实验前期保藏，所述质粒为现有市售产品。
引物：实验所用引物利用Oligo7.0软件和无缝克隆软件设计，引物由上海生工生物科技有限公司负责合成。
实施例1
一种构建自组装表达双酶菌株的方法，包括如下步骤：
(1)目的基因的获取
以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，以无缝克隆软件设计引物，PCR扩增得到MTSase的编码基因treY和MTHase的编码基因treZ，所述基因treY的序列为SEQ ID NO.1，所述基因treZ的序列为SEQ ID NO.2；以人工合成的SpyCatcher基因序列为模板，用无缝克隆软件设计引物，PCR扩增得到SpyCatcher基因，所述SpyCatcher基因序列为SEQ ID NO.3；将SpyTag基因序列直接合成在引物中，经PCR扩增得到SpyTag基因，所述SpyTag基因序列为SEQ ID NO.4。
所述treY基因的扩增引物序列如下所示：
treY-F：GCGATGCGCATATTGATGTGATATCAGCAACCTACAGATTACAGT SEQ ID NO.5；
treY-R：CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCTAGGTAGCTCA SEQ IDNO.6；
treY-SpyCacher-R；ACCCTGGAATTACACCACCACCACCACCAC SEQ ID NO.7；
treY-SpyTag-R：CTCGAGGCACATATTGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCTAGGTAGCTCA SEQ ID NO.8。
所述引物treY-SpyTag-R序列中含有SpyTag基因序列。
PCR扩增程序为：95℃预变形3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min15s，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增体系(50μL)为：
Figure BDA0002531334640000061
Max Master Mix 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，嗜酸热硫化叶菌基因组2.5μL，ddH2O 17.5μL；
引物的组合方式为：treY-F和treY-R、treY-F和treY-SpyCacher-R、treY-F和treY-SpyTag-R。
所述treZ基因的扩增引物序列如下所示：
treZ-F：
GGCCACGCGATCGCTGACGTCATGGCACATATTGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGGAAATATT SEQ ID NO.9；
treZ-R：
GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTAATTGATATACCCCAACACCSEQ ID NO.10；
treZ-SpyCacher-R：ATAGCACCCTGGAATCACACCACCACCACCACCASEQ ID NO.11.
所述引物treZ-F序列中含有SpyTag基因序列。
PCR扩增程序为：95℃预变形3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增体系(50μL)为：
Figure BDA0002531334640000071
Max Master Mix 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，嗜酸热硫化叶菌基因组2.5μL，ddH2O 17.5μL；
引物的组合方式为：treZ-F和treZ-R、treZ-F和treZ-SpyCacher-R。
所述SpyCatcher基因的扩增引物序列如下所示：
SpyCatcher-F：TTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.12；
SpyCatcher-treY-F：tggtggtgtaaTTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.13；
SpyCatcher-R：CACATCAATATGCGCATCGCCTT SEQ ID NO.14；
SpyCatcher-treZ-F：GTGTGATTCCAGGGTGCTATGGTAGATACC SEQ ID NO.15；
SpyCatcher-treZ-R：CGACTTAAGCATTATGCGGCCGCATCAATATGCGCATCGCCTT SEQ IDNO.16。
PCR扩增程序为：95℃预变形3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增体系(50μL)为：
Figure BDA0002531334640000072
Max Master Mix 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，SpyCatcher基因2.5μL，ddH2O 17.5μL；
引物组合方式分别为SpyCatcher-F和SpyCatcher-R、SpyCatcher-treY-F和SpyCatcher-R、SpyCatcher-treZ-F和SpyCatcher-treZ-R。
(2)载体线性化
将pET28a质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切。
酶切体系为：pET28a质粒17μL，ddH2O 3.5μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，BamHI 1μL，XhoⅠ1μL。
反应条件：37℃金属浴中反应2h。
将pETDuet质粒用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切。
酶切体系为：pETDuet质粒17μL，ddH2O 3.5μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，BamHI 1μL，NotⅠ1μL。
反应条件：37℃金属浴中反应2h。
(3)重组表达质粒的构建
将步骤(1)、(2)中以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-R PCR扩增得到的treY基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切线性化后的pET28a质粒经超微量分光光度计MD2000测定DNA含量，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY。
多片段无缝克隆体系：pET28a质粒使用量＝[0.02×碱基数]ng＝107.38ng
SpyCatcher基因最适使用量＝[0.02×碱基数]ng＝6.96ng
treY基因最适使用量＝[0.02×碱基数]ng＝43.62ng
5×CE Multis Buffer：4μL，Exnase Multis：2μL，ddH2O：up to 20μL。
同理，将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-SpyCacher-R PCR扩增得到的treY基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR扩增得到的SpyCatcher基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-treY-F和SpyCatcher-R PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-SpyTag-R PCR扩增得到的treY-SpyTag基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-RPCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treZ-F和treZ-SpyCather-R PCR扩增得到的SpyTag-treZ基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-treZ-F和SpyCatcher-treZ-R PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher。
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treZ-F和treZ-R PCR扩增得到的SpyTag-treZ基因和双酶切线性化后的pETDuet质粒，利用单片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ。
单片段无缝克隆体系：pETDue质粒使用量＝[0.02×碱基数]ng＝108.4ng
SpyTag-treZ基因最适使用量＝[0.02×碱基数]ng＝34.38ng
5×CEⅡBuffer：4μL，ExnaseⅡ：2μL，ddH2O：up to 20μL。
(4)目的表达菌株的获取
将步骤(3)中得到的重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY和pETDuet-SpyTag-treZ用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；将重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher和pETDuet-SpyTag-treZ用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；将重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag和pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；筛选重组目的表达菌株，将上述转化子37℃200r/min培养1h，随后将转化细胞涂布在含有80μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落至含有80μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待菌液浑浊后通过菌落PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，送至上海生工生物科技有限公司测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株：
E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ；
E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ；
E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher。
对比例1
构建E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyTag，包括如下步骤：
以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treY-F和treY-R PCR扩增得到的treY基因、以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SpyCatcher-F和SpyCatcher-R PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切线性化后的pET28a质粒经超微量分光光度计MD2000测定DNA含量，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY。
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物treZ-F和treZ-SpyTag-R PCR扩增得到的SpyTag-treZ-SpyTag基因和双酶切的pETDuet质粒，利用单片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ-SpyTag。
treZ-SpyTag-R：
GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCACATATTGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATCTAATTGATATACCCCAACACC SEQ ID NO.17
将重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY和pETDuet-SpyTag-treZ-SpyTag用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyTag；其它条件与实施例1中涉及的相同。
实施例2
利用实施例1制备的3种目的表达菌株以及对比例1中涉及的1种目的表达菌株制备发酵液。
将目的表达菌株接种于添加卡那霉素抗性(卡那霉素终浓度为80μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h作为种子液。将种子液以体积比1:100的比例接种至带有卡那霉素抗性(卡那霉素终浓度为80μg/mL)的TB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h，添加乳糖作为诱导剂(乳糖的终浓度为6mg/L)，将温度调至25℃继续发酵12h，得到目的表达菌株发酵液。
实施例3
双酶复合酶进行底物转化，利用实施例2制备的4种目的表达菌株发酵液，各取100mL发酵液高速离心获取菌体沉淀，将菌体用10mL 10mM pH5.5.的PBS缓冲液重悬，利用超声破碎仪进行细胞破碎，破碎条件为：功率300w，破碎时间3s，间歇时间5s，时间15min，得到粗酶液，65℃、pH5.5条件下转化浓度为15％的麦芽糊精，并添加5％的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)，转化12h至完全转化，转化完成后，100℃煮沸10min灭活终止反应，经HPLC检测样品中海藻糖的含量。
Figure BDA0002531334640000101
菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ的海藻糖转化率最高，达到了75％，该菌对应的多酶体系的比例关系为MTSase:MTHase＝1:2；
菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyTag转化率为51％，该菌对应的多酶体系的比例关系为MTSase:MTHase＝2:1；
菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY/pETDuet-SpyTag-treZ转化率为67％，该菌对应的多酶体系的比例关系为MTSase:MTHase＝1:1；
菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyTag/pETDuet-SpyTag-treZ-SpyCatcher的转化率只有45％，该菌对应的多酶体系的比例关系为MTSase:MTHase＝1:1；可能是由于在自组装时，SpyCatcher-treY-SpyTag与SpyCatcher-treY-SpyTag成环形依次自组装连接在一起导致转化率降低。
综上可以得出，利用结构域SpyTag-SpyCatcher按照MTSase:MTHase＝1:2的比例构建自组装双酶系，获得的重组菌株，相较于MTSase:MTHase＝2:1、MTSase:MTHase＝1:1的比例构建自组装双酶体系，获得的重组菌株，具有较高的海藻糖转化率，即不同比例的MTSase-MTHase多酶复合体对海藻糖的转化率有一定影响；而都是按照MTSase:MTHase＝1:1的比例构建自组装双酶体系，获得的重组菌株，与结构域SpyTag-SpyCatcher连接方式不同，即MTSase-MTHase多酶复合体的比例相同、结构不同，对海藻糖的转化率影响较大。
本发明涉及的在大肠杆菌中表达的MTSase:MTHase＝1:2，对海藻糖的转化率为75％，在大肠杆菌中表达的多酶复合体MTSase:MTHase＝2:1，对海藻糖的转化率为51％；与中国专利文献申请号2020101068312，公开的一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，该文献中涉及的在枯草芽孢杆菌表达的多酶复合体MTSase:MTHase＝2:1对海藻糖的转化率为74％，而在枯草芽孢杆菌表达的多酶复合体MTSase:MTHase＝1:2，对海藻糖的转化率为62.7％；效果完全不同。
综上，结构域SpyTag-SpyCatcher与MTHase和MTSase构建多酶复合体对海藻糖转化率的影响，具有一定的菌种特异性，影响因素较多，即多酶复合体不同的比例组成、不同的宿主菌以及多酶复合体的分泌状态即胞内和胞外、以及相同比例但与结构域的连接方式不同，都对海藻糖的转化率有一定的影响，为后期多酶体系的理论研究奠定了基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2163
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgatatcag caacctacag attacagtta aataagaatt ttaattttgg tgacgtaatc 60
gataacctat ggtattttaa ggatttagga gtttcccatc tctacctctc tcctgtctta 120
atggcttcgc caggaagtaa ccatgggtac gatgtaatag atcattcaag gataaacgat 180
gaacttggag gagagaaaga atacaggaga ttaatagaga cagctcatac tattggatta 240
ggtattatac aggacatagt accaaatcac atggctgtaa attctctaaa ttggcgacta 300
atggatgtat taaaaatggg taaaaagagt aaatattata cgtactttga ctttttccca 360
gaagatgata agatacgatt acccatatta ggagaagatt tagatacagt gataagtaaa 420
ggtttattaa agatagtaaa agatggagat gaatatttcc tagaatattt caaatggaaa 480
cttcctctaa cagaggttgg aaatgatata tacgacactt tacaaaaaca gaattatacc 540
ctaatgtctt ggaaaaatcc tcctagctat agacgattct tcgatgttaa tactttaata 600
ggagtaaatg tcgaaaaaga tcacgtattt caagagtccc attcaaagat cttagattta 660
gatgttgatg gctatagaat tgatcatatt gatggattat atgatcctga gaaatatatt 720
aatgacctga ggtcaataat taaaaataaa ataattattg tagaaaaaat tctgggattt 780
caggaggaat taaaattaaa ttcagatgga actacaggat atgacttctt aaattactcc 840
aacttactgt ttaattttaa tcaagagata atggacagta tatatgagaa tttcacagcg 900
gagaaaatat ctataagtga aagtataaag aaaataaaag cgcaaataat tgatgagcta 960
tttagttatg aagttaaaag attagcatca caactaggaa ttagctacga tatattgaga 1020
gattaccttt cttgtataga tgtgtacaga acttatgcta atcagattgt aaaagagtgt 1080
gataagacca atgagataga ggaagcaacc aaaagaaatc cagaggctta tactaaatta 1140
caacaatata tgccagcagt atacgctaaa gcttatgaag atactttcct ctttagatac 1200
aatagattaa tatccataaa tgaggttgga agcgatttac gatattataa gatatcgcct 1260
gatcagtttc atgtatttaa tcaaaaacga agaggaaaaa tcacactaaa tgccactagc 1320
acacatgata ctaagtttag tgaagatgta aggatgaaaa taagtgtatt aagtgaattt 1380
cctgaagaat ggaaaaataa ggtcgaggaa tggcatagta tcataaatcc aaaggtatca 1440
agaaatgatg aatatagata ttatcaggtt ttagtgggaa gtttttatga gggattctct 1500
aatgatttta aggagagaat aaagcaacat atgataaaaa gtgtcagaga agctaagata 1560
aatacctcat ggagaaatca aataaaagaa tatgaaaata gagtaatgga attagtggaa 1620
gaaactttta ccaataagga tttcattaaa agtttcatga aatttgaaag taagataaga 1680
aggataggga tgattaagag cttatccttg gtcgcattaa aaattatgtc agccggtata 1740
cctgattttt atcagggaac agaaatatgg cgatatttac ttacagatcc agataacaga 1800
gtcccagtgg attttaagaa attacacgaa atattagaaa aatccaaaaa atttgaaaaa 1860
aatatgttag agtctatgga cgatggaaga attaagatgt atttaacata taagctttta 1920
tccctaagaa aacagttggc tgaggatttt ttaaagggcg agtataaggg attagatcta 1980
gaagaaggac tatgtgggtt tattaggttt aacaaaattt tggtaataat aaaaaccaag 2040
ggaagtgtta attacaaact gaaacttgaa gagggagcaa tttacacaga tgtattgaca 2100
ggagaagaaa ttaaaaaaga ggtacagatt aatgagctac ctaggatact agttagaatg 2160
taa 2163
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagggatttt tcgaagtaga aatagacgat atcgaggaaa atttaaccta ttcttatatt 180
atagaagata agagagagat acctgatccc gcatcacgat atcaaccttt aggagttcat 240
gacaaatcac aacttataag aacagattat cagattcttg accttggaaa agtaaaaata 300
gaagatctaa taatatatga actccacgtt ggtacttttt cccaagaagg aaatttcaaa 360
ggagtaatag aaaagttaga ttacctcaag gatctaggaa tcacaggaat tgaactgatg 420
cctgtggcac aatttccagg gaatagagat tggggatacg atggtgtttt tctatacgca 480
gttcaaaata cttatggcgg accatgggaa ttggctaagc tagtaaacga ggcacataaa 540
aggggaatag ccgtaatttt ggatgttgta tataatcata taggtcctga gggaaattac 600
cttttaggat taggtcctta tttttcagac agatataaaa ctccatgggg attaacattt 660
aattttgatg ataggggatg tgatcaagtt agaaaattca ttttagaaaa tgtcgagtat 720
tggtttaaga cctttaaaat cgatggtctg agactggatg cagttcatgc aatttttgat 780
aattcgccta agcatatcct ccaagagata gctgaaaaag cccatcaatt aggaaaattt 840
gttattgctg aaagtgattt aaatgatcca aaaatagtaa aagatgattg tggatataaa 900
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aaagattatt attaccagga ttttggaagg atagaagata tagagaaaac ttttaaagat 1020
gtttttgttt atgatggaaa gtattctaga tacagaggaa gaactcatgg tgctcctgta 1080
ggtgatcttc caccacgtaa atttgtagtc ttcatacaaa atcacgatca agtaggaaat 1140
agaggaaatg gggaaagact ttccatatta accgataaaa cgacatacct tatggcagcc 1200
acactatata tactctcacc gtatataccg ctaatattta tgggcgagga atattatgag 1260
acgaatcctt ttttcttctt ctctgatttc tcagatcccg tattaattaa gggtgttaga 1320
gaaggtagac taaaggaaaa taatcaaatg atagatccac aatctgagga agcgttctta 1380
aagagtaaac tttcatggaa aattgatgag gaagttttag attattataa acaactgata 1440
aatatcagaa agagatataa taattgtaaa agggtaaagg aagttaggag agaagggaac 1500
tgtattactt tgatcatgga aaaaatagga ataattgcat cgtttgatga tattgtaatt 1560
aattctaaaa ttacaggtaa tttacttata ggcataggat ttccgaaaaa attgaaaaaa 1620
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acttggatca gcgacggtca ggttaaagac ttctacctgt acccaggcaa atacaccttt 240
gtggaaaccg ctgccccgga tggctatgaa gtcgccacgg cgattacctt caccgttaac 300
gaacagggcc aggttaccgt gaatggtaaa gcgaccaaag gcgatgcgca tattgat 357
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 13
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<400> 16
cgacttaagc attatgcggc cgcatcaata tgcgcatcgc ctt 43
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<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggtttcttta ccagactcga gtcagtggtg gtggtggtgg tgtgcacata ttgttatggt 60
tgatgcatat aaaccgacaa aatctaattg atatacccca acacc 105

Claims (10)

1.一种构建自组装表达双酶菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增得到MTSase的编码基因treY和MTHase的编码基因treZ，所述基因treY的基因序列为SEQID NO.1，所述基因treZ的基因序列为SEQ ID NO.2；以合成的SpyCatcher基因序列为模板，PCR扩增得到SpyCatcher基因，所述SpyCatcher基因序列为SEQ ID NO.3；将SpyTag基因序列直接合成在引物中，所述SpyTag基因序列为SEQ ID NO.4；
（2）将pET28a质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切；将pETDuet质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切；
（3）利用无缝克隆技术将SpyCatcher基因分别连接到treY基因的C端和N端，然后和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；将SpyTag、treZ基因和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ；并将得到的重组表达质粒共同转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中PCR扩增程序如下：
95℃预变形3 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30个循环；72℃延伸5 min。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中PCR扩增体系如下：
2×Phanta ® Max Master Mix 25μL，上游引物2.5 μL，下游引物2.5μL，基因模板2.5μL，ddH2O 17.5 μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中质粒酶切体系如下：
pET28a质粒 17μL，ddH2O 3.5 μL，10×QuickCutBuffer 2.5μL，BamHI 1μL，XhoⅠ1μL；
反应条件:37℃金属浴中反应2 h；
pETDuet质粒 17μL，ddH2O 3.5 μL，10×QuickCutBuffer 2.5μL，BamHI 1μL，NotⅠ1μL；
反应条件：37℃金属浴中反应2 h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中treY基因的扩增引物序列为SEQID NO.5、SEQ ID NO.7；
步骤（1）中treZ基因的扩增引物序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10；
步骤（1）中SpyCatcher基因的扩增引物序列为SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.14。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7 PCR扩增得到的treY基因；以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14 PCR扩增得到的SpyCatcher基因；以合成的SpyCatcher基因为模板，用引物SEQ ID NO.13和 SEQ ID NO.14 PCR扩增得到的SpyCatcher基因和双酶切的pET28a质粒，利用多片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30min，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；
将以嗜酸热硫化叶菌为模板，用引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10 PCR扩增得到的SpyTag-treZ基因和双酶切的pETDuet质粒，利用单片段无缝克隆试剂盒，37℃金属浴连接30 min，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中得到的重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher和pETDuet-SpyTag-treZ用化学转化法同时转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；筛选重组目的表达菌株，将转化子37℃ 200 r/min培养1h，随后将转化细胞涂布在含有80 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落接种至含有80 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待菌液浑浊后通过菌落PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。
8.权利要求1所述方法构建的目的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-
SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ在发酵生产MTSase-MTHase多酶复合体中的应用。
9.权利要求1所述方法构建的目的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-
SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ在发酵生产海藻糖中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将目的表达菌种接种于含有80 μg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养12 h作为种子液；将种子液以体积比1:100的比例接种至含有80 μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，37℃、200 rpm培养8 h，然后添加终浓度为6 mg/L的乳糖作为诱导剂，将温度调至25℃继续发酵12 h，发酵结束后，收集菌体，进行破壁制得粗酶液，然后在65℃、pH5.5条件下转化质量浓度为15％的麦芽糊精，并添加质量浓度为5％的环糊精葡萄糖基转移酶，转化生产海藻糖。
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