CN106591345A - 一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法 - Google Patents

一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法 Download PDF

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王金丹
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Abstract

本发明公开了一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，以两种不同酶为对象，类弹性蛋白多肽纯化标签为基础，结合SpyTag/SpyCatcher自主粘合性，通过非色谱法分离纯化获得三臂拓扑结构的重组双酶，并实现双酶的固定化集成。本发明的方法利用ELPs的特有的温度敏感性，通过简单的离心即可得到高纯度的蛋白酶，并实现双酶的固定化集成。本发明操作简单，耗材少，设备要求低，容易生产。

Description

一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法。
背景技术
多酶固定化技术是指将不同酶固定在同一载体上或将不同酶通过交联的方式形成多酶聚集体的一种技术。固定化多酶具有稳定性高、可重复利用、可提高反应的局部浓度从而提高产品收率的特点因而受到广泛关注。同时，固定化多酶在生物传感器、食品加工、生物医学等方面都具有很大的应用前景。传统的多酶固定化方法操作繁琐，过程不够温和，酶分离纯化及固定化需分步进行。传统的纯化程序相对复杂，耗时长，对设备要求较高，材料消耗大等直接导致了酶分离成本居高不下。据了解蛋白质的分离纯化的成本约占了总成本的60％～70％。如此高额的成本，严重影响蛋白酶固定化的广泛应用。过高的产品成本，使得产品市场竞争力不足。因此，寻找合适的材料，发展新型的分离纯化技术和固定化制备工艺是降低多酶固定化制备成本的必由之路。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，该方法以两种不同酶为对象，类弹性蛋白多肽(ELPs)纯化标签为基础，结合SpyTag/SpyCatcher自主粘合性，通过非色谱法分离纯化获得三臂拓扑结构的重组双酶，并实现双酶的固定化集成。具体包括：
1)选择一对待重组的酶A与酶B，将编码酶A的基因序列a与编码酶B的基因序列b分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后将得到的重组基因序列a-SpyTag-b克隆到第一表达载体上，构建得到第一重组蛋白表达载体；另构建带有SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列的第二重组蛋白表达载体；将该第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达；
2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher-ELPs；
3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher-ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。
其中，所述步骤1)中，构建第二重组蛋白表达载体可以通过拼接SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列，然后将得到的重组基因序列SpyCatcher-ELPs克隆到第二表达载体上来构建得到第二重组蛋白表达载体。或者也可以直接利用SpyCatcher基因序列和pET-22b-ELPs构建得到，该pET-22b-ELPs已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日)，并已申请专利(专利申请号：201010562100.5)。
SpyTag的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SpyCatcher的氨基酸序列如SEQID No.2所示。本发明采用的SpyTag基因和SpyCatcher基因，在各自氨基酸序列的基础上，根据宿主大肠杆菌对密码子的偏好性，对基因序列进行密码子优化，例如，SpyTag的基因序列如SEQ ID No.3所示，SpyCatcher的基因序列如SEQ ID No.4所示(其中7-363位为编码序列)。
所述基因拼接采用限制性内切酶NdeI、EcoRI、HindIII中的一种或多种，利用该些限制性内切酶将目的基因插入到表达载体中，并在宿主细胞中高效诱导表达。
进一步优选地，所述第一表达载体、第二表达载体为质粒pET-22b(+)。
进一步优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR。
一实施例中：所述步骤1)中，诱导高效表达的方法为：将导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞或导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞按1:100的体积比接入到含100mg/L氨苄青霉素Amp的LB液体基中，OD600值为0.6～1.0，37℃、200rpm下恒温培养10～12h；然后按1:100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床、200rpm下恒温培养3～4小时，至OD600值达到0.6～0.8；然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂并使其终浓度为0.5mM，20℃、200rpm下恒温培养24h，即可诱导基因高效过量表达。
一实施例中：所述步骤2)包括：2-1)对第二宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液：20mL PBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；2-2)在1～4mol/L的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将2-1)得到的细胞粗提液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；2-3)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；2-4)根据需要重复步骤2-2)和2-3)，最终弃沉淀物，收集上清液，即为纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs溶液。
6.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤3)包括：3-1)对第一宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液:20mL PBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；3-2)将该细胞粗提液与纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs混合，37℃反应3h，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该上清液中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；3-3)在1～4mol/L的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将3-2)得到的溶液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；3-4)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；3-5)根据需要重复步骤3-3)和3-4)，最终同时收集上清液和沉淀物，上清即为纯化的三臂拓扑结构的重组双酶，不可溶沉淀物即为固定化的重组双酶。
一实施例中：所述盐离子由盐溶液提供，该盐溶液的盐为氯化钠、碳酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钾、碳酸钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵中的任意一种。
本发明应用的类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides，ELPs)是一类具有特殊性质的环境敏感响应型人造蛋白。ELPs敏感性表现在：当环境温度低于某个温度时，蛋白质是可溶状态；而环境温度高于某个温度时，蛋白质是不可溶状态。这种性质称之为ELPs的可逆相变。利用ELPs的这一种特殊性质，将其作为重组蛋白纯化标签，仅通过控制环境温度经简单离心即可对重组蛋白分离纯化。通过控温、离心分离纯化蛋白操作简便，耗时短，耗材少，可有效降低蛋白质的生产成本；同时设备要求低，容易实现工业化生成。
本发明应用的SpyTag/SpyCatcher来源于革兰氏阳性菌S.pyogenes产生的纤连蛋白的免疫球蛋白二级结合区域(CnaB2)结构区域。CnaB2结构区域极其稳定，原因是该结构区域包含一个极其稳定的异肽键，使其在pH 2或者100℃中都可以维持正常折叠构象。异肽键是指两个氨基酸通过侧链基团或者侧链基团与主链基团形成的肽键。根据异肽键的位置，将CnaB2结构域分成含116个氨基酸的蛋白质结构部分(SpyCatcher)以及含13个氨基酸的多肽结构部分(SpyTag)，两者相互碰撞即可形成异常稳定的异肽键，1min内的反应率就可达50％，同时该反应在不同pH(5～8)、缓冲液、温度、洗涤剂都可以稳定的发生，生成的异肽键即使在100℃煮沸的情况下也不会断裂，可承受1900pN的强度，该反应在胞内和胞外都可发生，具有良好的环境兼容性。SpyTag/SpyCatcher具有可基因编码以及稳定性的特性，其作为分子粘合剂具有非常广阔的应用前景。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明的方法利用类弹性蛋白多肽(ELPs)的特有的温度敏感性，结合SpyTag/SpyCatcher自主粘合性，通过简单的离心即可得高纯度的蛋白质。将其ELPs基因与目标蛋白基因通过酶切连接，经基因表达后，使用适宜的盐溶液，通过控制环境温度触发融合蛋白发生相变，之后使用离心法对目标蛋白进行纯化。目前常用的纯化方法纯化蛋白质1kg所需原材料的费用：利用His纯化标签亲和层析为$838124.73；IMPACT-CN纯化系统为$989606.23；而采用ELPs体系仅需$74509.75，比前两者少了一个数量级以上，不到前两者的10％。本发明提供了一套可用离心法纯化目标蛋白、浓缩蛋白溶液以及固定化酶的方法，避免了色谱分离的繁琐操作及对蛋白样品的稀释。且具有以下特点：1)能简单、快速与目标蛋白基因拼接，实现高效表达；2)对目标蛋白结构和正常功能无明显影响，安全性高；3)固定化作用明显，效果良好；4)蛋白表达条件简单，纯化方便，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。本发明为重组蛋白的分离和固定化提供了一条新策略，在生物分离及生物大分子固定化领域具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明实施例中第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体的示意图。
图2为本发明实施例中重组蛋白表达及纯化的SDS-PAGE蛋白电泳分析检测图。图中，
泳道1-7：纯化的SpyCatcher-ELPs、Xyl-SpyTag-BglS粗酶液、三臂拓扑结构的重组双酶粗酶液、一次纯化的三臂拓扑结构的重组双酶、二次纯化的三臂拓扑结构的重组双酶、一次固定的重组双酶、二次固定的重组双酶；泳道M：蛋白质分子量标准。
图3为固定化的重组木聚糖酶-地衣多糖酶重复利用率。图中，A：重组双酶中地衣多糖酶的重复利用率；B：重组双酶中木聚糖酶的重复利用率。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，包括：
1)选择待重组的木聚糖酶(Xyl)与地衣多糖酶(BglS)两个半纤维素酶为对象，将编码木聚糖酶的基因序列Xyl与编码地衣多糖酶的基因序列BglS分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后将得到的重组基因序列Xyl-SpyTag-BglS克隆到第一表达载体pET-22b(+)上，构建得到第一重组蛋白表达载体pET-Xyl-SpyTag-BglS；另利用SpyCatcher基因序列和pET-22b-ELPs构建得到第二重组蛋白表达载体pET-SpyCatcher-ELPs；如图1所示，为得到的第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体的示意图。将上述第一重组蛋白表达载体pET-Xyl-SpyTag-BglS和第二重组蛋白表达载体pET-SpyCatcher-ELPs分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达。
其中，SpyTag、SpyCatcher、Xyl和BglS基因片段基因为全基因合成，通过NdeI、EcoRI和HindIII实现拼接。SpyTag的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，SpyCatcher的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，SpyTag基因和SpyCatcher基因在上述的各自氨基酸序列的基础上，根据宿主大肠杆菌对密码子的偏好性，对基因序列进行密码子优化，SpyTag的基因序列如SEQ ID No.3所示，SpyCatcher的基因序列如SEQ ID No.4所示(其中7-363位为编码序列)。
所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR。所述pET-22b-ELPs已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日)，并已申请专利(专利申请号：201010562100.5 SEQ ID No.2)。
具体的，第一重组蛋白表达载体pET-Xyl-SpyTag-BglS和第二重组蛋白表达载体pET-SpyCatcher-ELPs分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞后，诱导高效表达的方法为：将导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞或导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的甘油菌按1:100的体积比接入到含100mg/L氨苄青霉素Amp的LB液体基中，OD600值为0.6～1.0，37℃、200rpm下恒温培养10～12h；然后按1:100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床、200rpm下恒温培养3～4小时，至OD600值达到0.6～0.8；然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂并使其终浓度为0.5mM，20℃、200rpm下恒温培养24h，即可诱导基因高效过量表达。
2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher-ELPs；具体包括：
2-1)对第二宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液：20mL PBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；2-2)在2mol/L的氯化钠条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将2-1)得到的细胞粗提液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；2-3)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；2-4)根据需要重复步骤2-2)和2-3)，最终弃沉淀物，收集上清液，即为纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs溶液。如图2所示，该重组蛋白SpyCatcher-ELPs(图2中泳道1)的纯度可达95％。
3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher-ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。具体包括：
3-1)对第一宿主细胞高效表达后得到的菌液在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体，按照1L菌液:20mL PBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后高速冷冻离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液，或Xyl-SpyTag-BglS粗酶液(图2中泳道2)；3-2)将该细胞粗提液与纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs混合，37℃反应3h，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该上清液中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，得到含有重组双酶的粗酶液(图2中泳道3)；3-3)在2mol/L的氯化钠盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将3-2)得到的溶液在38℃恒温水浴20min后，38℃下12000rpm离心10min，去上清液；3-4)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，反复吹打，充分混匀，冰浴15min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液；3-5)根据需要重复步骤3-3)和3-4)，最终同时收集上清液和沉淀物，上清液为纯化的三臂拓扑结构的重组双酶(three arms with Xyl-BglS)，不可溶沉淀物即为固定化的重组双酶。该过程不仅可对目标重组双酶分离纯化，并同时实现重组双酶的固定化集成。如图2所示，步骤3-5)得到的二次纯化的三臂拓扑结构的重组双酶(泳道5)和第二次固定化的重组双酶(泳道7)的纯度可达95％以上。
上述固定化的重组双酶的动力学常数测定如下：分别配置浓度1～10g/L的地衣多糖和木聚糖，分别与50μL稀释一定倍数的酶液在最适反应温度和最适反应pH条件下反应10min后，测定酶活力，利用双倒数法计算出Km和Vmax值，结果如表1所示。
米氏方程：V＝Vmax[S]/Km+[S]；
双倒数方程
其中V：反应初速度，μmol/min；Vmax：最大反应速度，μmol/min；[S]：底物浓度，g/L；Km：米氏常数mg/mL。
以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，所得直线的截距是1/Vmax，斜率是Km/Vmax，由此计算出Km和Vmax值。
表1三臂拓扑结构重组双酶的动力学常数
上述固定化的重组双酶的重复利用率的测定如下：酶液和地衣多糖(木聚糖)在最适反应温度和最适反应pH下反应10min后，加入DNS终止反应，38℃，12000rpm，离心10min，取上清液测酶活，回收沉淀用PBS溶液洗去残留的DNS溶液，加入一定量的PBS溶液重新溶解后进行下一轮实验，首轮反应的酶活力为100％，计算各轮反应的相对酶活力。固定化酶的重复利用率如图3所示。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110>华侨大学
<120>一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法
<160>4
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>1
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400>2
Phe Gln Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr
20 25 30
His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala
35 40 45
Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser
50 55 60
Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro
65 70 75
Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu
80 85 90
Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val
95 100 105
Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Asp
110 115
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gcacatatcg taatggtcga cgcatacaag ccaaccaaa 39
<210>4
<211>369
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
catatgttcc agggtgctat ggtagatacc ctgtctggtc tgtcttccga gcagggtcaa 60
tctggtgaca tgactatcga agaggactct gcaactcaca tcaagttctc caagcgcgat 120
gaagacggca aagaactggc tggtgcaacg atggaactgc gtgacagctc cggcaaaact 180
atcagcactt ggatcagcga cggtcaggtt aaagacttct acctgtaccc aggcaaatac 240
acctttgtgg aaaccgctgc cccggatggc tatgaagtcg ccacggcgat taccttcacc 300
gttaacgaac agggccaggt taccgtgaat ggtaaagcga ccaaaggcga tgcgcatatt 360
gatgaattc 369

Claims (10)

1.一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：包括：
1)选择一对待重组的酶A与酶B，将编码酶A的基因序列a与编码酶B的基因序列b分别拼接到SpyTag基因序列的5’端和3’端，然后利用得到的重组基因序列a-SpyTag-b构建得到第一重组蛋白表达载体；另构建带有SpyCatcher基因序列和ELPs基因序列的第二重组蛋白表达载体；将该第一重组蛋白表达载体和第二重组蛋白表达载体分别导入第一宿主细胞和第二宿主细胞，分别诱导高效表达；
2)对导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞的表达产物进行纯化处理：通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而分离纯化得到重组蛋白SpyCatcher-ELPs；
3)将步骤2)得到的重组蛋白SpyCatcher-ELPs与导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞的表达产物相混合，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该第一宿主细胞表达产物中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；然后通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变，从而纯化得到呈三臂拓扑结构的重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物，并同时实现该重组双酶的固定化集成。
2.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述第二重组蛋白表达载体通过SpyCatcher基因序列和pET-22b-ELPs构建得到。
3.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述SpyTag的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SpyCatcher的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤1)中，诱导高效表达的方法为：将导入了第一重组蛋白表达载体的第一宿主细胞或导入了第二重组蛋白表达载体的第二宿主细胞按1:100的体积比接入到含氨苄青霉素的LB液体基中，OD600值为0.6～1.0，37℃、200rpm下恒温培养10～12h；然后按1:100的接种量接种于TB培养基中，37℃、200rpm下恒温培养3～4h，至OD600值达到0.6～0.8；然后加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.5mM，20℃、200rpm下恒温培养24h，即可诱导基因过量表达。
5.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤2)包括：2-1)对第二宿主细胞高效表达后得到的菌液离心，收集菌体，按照1L菌液：20mLPBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；2-2)一定的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将2-1)得到的细胞粗提液在38℃恒温水浴20min后，38℃下离心，去上清液；2-3)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，混匀，冰浴15min，4℃下离心，取上清液；2-4)根据需要重复步骤2-2)和2-3)，最终弃沉淀物，收集上清液，即为纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs溶液。
6.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述步骤3)包括：3-1)对第一宿主细胞高效表达后得到的菌液离心，收集菌体，按照1L菌液:20mLPBS缓冲液的比例用PBS缓冲液重悬菌体；超声破碎PBS重悬的菌体，功率为300W，工作2s间隙4s，循环次数为80次，之后离心，收集细胞破碎液的上清液，即细胞粗提液；3-2)将该细胞粗提液与纯化的重组蛋白SpyCatcher-ELPs混合，37℃反应3h，重组蛋白SpyCatcher-ELPs中的SpyCatcher与该上清液中重组双酶-SpyTag化合物的SpyTag自主粘合，形成重组双酶-SpyTag-SpyCatcher-ELPs化合物；3-3)一定的盐离子浓度条件下，通过控制溶液温度变化使ELPs发生可逆相变：将3-2)得到的溶液在38℃恒温水浴20min后，38℃下离心，去上清液；3-4)沉淀物加入4℃预冷的PBS缓冲液，混匀，冰浴15min，4℃下离心，取上清液；3-5)根据需要重复步骤3-3)和3-4)，最终同时收集上清液和沉淀物，上清即为纯化的三臂拓扑结构的重组双酶，不可溶沉淀物即为固定化的重组双酶。
7.根据权利要求5或6所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述盐离子由盐溶液提供，该盐溶液的盐为氯化钠、碳酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钾、碳酸钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述表达载体为质粒pET-22b(+)。
9.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR。
10.根据权利要求1所述的重组双酶分离纯化及固定化集成的方法，其特征在于：所述基因拼接采用限制性内切酶NdeI、EcoRI、HindIII中的一种或多种。
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