CN109929040B - 一种eb病毒bfrf3-bzlf1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸条及其生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种EB病毒BFRF3‑BZLF1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸条及其生产方法和应用，EB病毒BFRF3‑BZLF1融合蛋白由EB病毒BFRF3蛋白或EB病毒BFRF3蛋白片段通过连接肽与EB病毒BZLF1蛋白或EB病毒BZLF1蛋白片段连接得到，优选的，EB病毒BFRF3‑BZLF1融合蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明的EB病毒BFRF3‑BZLF1融合蛋白可以作为靶抗原用于EB病毒的检测，为筛查和早期诊断鼻咽癌、传染性单核细胞增多症和伯基特淋巴瘤提供依据，且具有简便、快速、灵敏、特异的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸条及其生产方法和应用。
背景技术
Epstein-Barr(EB)病毒是疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒。EB病毒具有嗜B淋巴细胞的特性，能够在B淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生和转化。近年来发现，在人类的腮腺管、口咽部以及宫颈外口处上皮细胞表面有类似EB病毒受体的结构。EB病毒与人类传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤以及鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)等疾病的发生密切相关。
鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一，据统计，世界范围内80％的鼻咽癌发生在我国。因此，探索鼻咽癌的早期诊断方法是我国医学工作者责无旁贷的任务。曾毅院士曾于1982年创建了免疫酶标法，目前我们仍然将其作为常规方法协助诊断或筛查鼻咽癌患者。
在诊断鼻咽癌过程中得到较广泛认可的是壳蛋白VCA和早期蛋白EA。EB病毒-衣壳抗原-免疫球蛋白A(EBV-VCA-IgA)，EB病毒-早期抗原-免疫球蛋白A(EBV-EA-IgA)检测目前已用于NPC的临床辅助诊断。VCA是在感染EB病毒后最晚表达的一种抗原，可在宿主体内终身存在，因此衣壳抗原-免疫球蛋白A(VCA-IgA)检测常用于筛查以排除NPC的诊断，灵敏度高于90％，但其特异性有时会低于70％，在进行大规模的人群筛查时易造成误诊；抗EA抗体罕见于健康人，但在鼻咽癌患者则特异性升高，因此，早期抗原-免疫球蛋白A(EA-IgA)检测目前被用于鼻咽癌的确定性检测，特异性高于90％，但灵敏度低于80％，在进行大规模的人群筛查时易造成漏诊。所以，EB病毒-衣壳抗原-免疫球蛋白A(EBV-VCA-IgA)、EB病毒-早期抗原-免疫球蛋白A(EBV-EA-IgA)检测在单独检测时均无法同时获得高灵敏度和高特异性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸条及其生产方法和应用，该EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白作为靶抗原用于EB病毒的检测同时具有高灵敏度和高特异性。
为了解决上述问题，本发明提供一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白，其特征在于，由EB病毒BFRF3蛋白或EB病毒BFRF3蛋白片段通过连接肽与EB病毒BZLF1蛋白或EB病毒BZLF1蛋白片段连接得到。
根据本发明，术语EB病毒BFRF3蛋白是指EB病毒BFRF3基因编码的蛋白，GenBank登录号为AWG90566.1。EB病毒BFRF3蛋白片段指BFRF3蛋白的免疫原性片段，即至少部分的保留了BZLF1蛋白的免疫原性的多肽片段。
根据本发明，术语EB病毒BZLF1蛋白是指EB病毒BZLF1基因编码的蛋白，GenBank登录号为CEQ32851.1。EB病毒BZLF1蛋白片段指BZLF1蛋白的免疫原性片段，即至少部分的保留了BZLF1蛋白的免疫原性的多肽片段。
由于衣壳抗原-免疫球蛋白A(VCA-IgA)检测具有灵敏度高，特异性低，而早期抗原-免疫球蛋白A(EA-IgA)检测特异性高，灵敏度低，单独检测时无法同时获得高灵敏度和高特异性，BFRF3蛋白是VCA的主要抗原多肽之一，具有诊断灵敏度高的优点，BZLF1蛋白是EA的主要抗原多肽之一，具有高特异性，因此，将EB病毒BFRF3蛋白与BZLF1蛋白通过连接肽连接获得融合蛋白，作为诊断蛋白，可同时具有BFRF3蛋白的高特异性和BZLF1蛋白的高灵敏度，可提高EB病毒诊断的特异性和灵敏度。
优选的，为了提高表达产量及诊断的特异性，选择截短的EB病毒BFRF3蛋白片段，由于EB病毒BFRF3蛋白的抗原性主要集中在其靠近氨基端的部分，因此，EB病毒BFRF3蛋白片段选择BFRF3蛋白的N端的83个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述SEQ IDNO：3的序列结构具体如下：
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala AspPhe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu ProAsn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln PheCys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala IleAsp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala。
优选的，为了提高表达产量及诊断的特异性，选择截短的EB病毒BZLF1蛋白片段，由于EB病毒BZLF1基因编码的蛋白的抗原性主要集中在其靠近羧基端的部分，因此，EB病毒BZLF1蛋白片段选择BZLF1蛋白的C端的90个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述SEQ ID NO：4的序列结构具体如下：
Ala Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys AspSer Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg AlaLys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser GluAsn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp SerIle Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu Asp Leu Leu Asn Phe。
优选的，连接肽包括但不限于柔性连接肽，进一步优选的，连接肽为3-5个甘氨酸，更优选的，连接肽为3个甘氨酸。
进一步优选的，EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列结构，所述SEQ ID NO：1的序列结构具体如下：
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala AspPhe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu ProAsn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln PheCys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala IleAsp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Thr Arg Lys ProGln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr LysAsn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His TyrArg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu LysGln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val LeuHis Glu Asp Leu Leu Asn Phe。
本发明的另一目的是提供一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因，编码得到上述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白。
根据宿主细胞大肠埃希菌的嗜好，对融合蛋白进行密码子优化，优化之后的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列，所述SEQ ID NO：2的序列结构具体如下：
atggcacgccgtctgccgaagccgactctgcaaggtcgtctggaggctgattttccggactctccgctgctgccgaagtttcaagagctgaaccagaataatctgccgaatgatgtgtttcgtgaggctcagcgttcttacctggtatttctgacttcccagttctgctacgaagaatacgtgcagcgtacttttggtgtgcctcgtcgtcaacgtgccatagacaagcgtcagcgtgcttctgtggctggtggtggtgctcgtcgtactcgtaaaccgcagcagccggaatctctggaagaatgcgactctgaactggaaatcaagcgttacaagaaccgtgttgcttctcgtaagtgccgtgctaagttcaaacagcttctgcagcactaccgtgaggtagctgctgctaagtcttctgaaaacgaccgtctgcgtctgctgctgaaacagatgtgcccgtctctggacgttgactctatcattcctcgtactccggatgttctgcacgaagacctgctgaacttc。
本发明的再一目的是提供一种包含上述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的重组载体。
优选的，重组载体可以是连接有上述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的克隆载体，也可以是连接有EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的表达载体。
其中，克隆载体可以是质粒或噬菌体；表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体，例如质粒、噬菌体或病毒。
进一步优选的，重组载体为质粒pET-30a。
本发明的再一目的是提供一种包含上述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠埃希菌细胞，真核细胞，例如酵母菌细胞，昆虫细胞，植物细胞和小鼠细胞等动物细胞。
本发明的再一目的是提供一种含有上述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的胶体金试纸条。
本发明的再一目的是提供一种表达上述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的方法，将上述的重组载体导入宿主细胞，使其表达EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白，宿主可以是大肠埃希菌、芽孢杆菌、农杆菌、酵母菌等。
本发明的再一目的是提供上述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白在制备EB病毒检测试剂领域的应用。
本发明的再一目的是提供上述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白在制备鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤的检测试剂领域的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明通过设计EB病毒的BFRF3-BZLF1融合基因，构建BFRF3-BZLF1融合基因的表达载体，通过基因的表达，获得BFRF3-BZLF1融合蛋白，并以该融合蛋白为抗原建立ELISA方法，作为EB病毒的诊断方法，可为筛查和早期诊断鼻咽癌、传染性单核细胞增多症和伯基特淋巴瘤提供依据；
2.由于衣壳抗原-免疫球蛋白A(VCA-IgA)检测具有灵敏度高，特异性低，而早期抗原-免疫球蛋白A(EA-IgA)检测特异性高，灵敏度低，BFRF3蛋白是VCA的主要抗原多肽之一，具有诊断灵敏度高的优点，BZLF1蛋白是EA的主要抗原多肽之一，具有高特异性，因此，将EB病毒BFRF3蛋白与BZLF1蛋白通过连接肽连接获得融合蛋白，作为诊断蛋白，可同时具有BFRF3蛋白的高特异性和BZLF1蛋白的高灵敏度，可提高EB病毒诊断的特异性和灵敏度。实验结果显示，本发明的BFRF3-BZLF1融合蛋白作为靶抗原用于EB病毒的检测，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为95％，健康人群检测的阴性率为96.2％，检测灵敏度和特异性均高于常规的单独使用EA、VCA抗体进行检测的值；
3.本发明还提供了基于该BFRF3-BZLF1融合蛋白的免疫层析胶体金试纸条，使用该BFRF3-BZLF1融合蛋白胶体金试纸条在诊断时，被检样品加在试纸条卡上样垫上，整个操作时间仅需20分钟就可以直接观察免疫反应结果，其作为靶抗原用于EB病毒的检测具有简便、快速、灵敏、特异的优点，具有很高的临床诊断价值。
附图说明
图1是含有EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的大肠埃希菌表达质粒pET-30a/BFRF3/BZLF1的构建流程图；
图2是纯化后的BFRF3-BZLF1融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为低分子量蛋白标准；泳道2为经硫酸铵沉淀后复溶样品；泳道3为经流穿后的样品；泳道4为经50mMNaCl洗脱后的样品；泳道5-7为经100mM NaCl洗脱的3个样品；泳道8为经200mM NaCl洗脱后的样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一 EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的设计及克隆
1、融合蛋白氨基酸序列选定
BFRF3蛋白选择其N端的83个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述SEQ IDNO：3的序列结构具体如下：
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala AspPhe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu ProAsn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln PheCys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala IleAsp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala。
BZLF1蛋白选择其C端的90个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述SEQ IDNO：4的序列结构具体如下：
Ala Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys AspSer Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg AlaLys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser GluAsn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp SerIle Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu Asp Leu Leu Asn Phe。
BFRF3蛋白的片段与BZLF1蛋白的片段通过连接肽连接，得到融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，所述SEQ ID NO：1的序列结构具体如下：
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala AspPhe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu ProAsn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln PheCys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala IleAsp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Thr Arg Lys ProGln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr LysAsn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His TyrArg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu LysGln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val LeuHis Glu Asp Leu Leu Asn Phe。
需要说明的是，所述连接肽包括但不限于柔性连接肽，只要能够实现连接蛋白片段即可，可通过市售获得，不同厂家、型号的产品并不影响本发明技术效果的实现。本实施例中，所述连接肽为3个甘氨酸；作为本实施例可替换的实现方式，所述连接肽还可以是3-5个甘氨酸中的任意一种。
2、密码子优化
根据宿主大肠埃希菌的嗜好，对融合蛋白进行密码子优化，优化之后基因序列如SEQ ID NO：2，所述SEQ ID NO：2的序列结构具体如下：
atggcacgccgtctgccgaagccgactctgcaaggtcgtctggaggctgattttccggactctccgctgctgccgaagtttcaagagctgaaccagaataatctgccgaatgatgtgtttcgtgaggctcagcgttcttacctggtatttctgacttcccagttctgctacgaagaatacgtgcagcgtacttttggtgtgcctcgtcgtcaacgtgccatagacaagcgtcagcgtgcttctgtggctggtggtggtgctcgtcgtactcgtaaaccgcagcagccggaatctctggaagaatgcgactctgaactggaaatcaagcgttacaagaaccgtgttgcttctcgtaagtgccgtgctaagttcaaacagcttctgcagcactaccgtgaggtagctgctgctaagtcttctgaaaacgaccgtctgcgtctgctgctgaaacagatgtgcccgtctctggacgttgactctatcattcctcgtactccggatgttctgcacgaagacctgctgaacttc。
3、EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的克隆
在基因的5’端加上NdeI的酶切位点，3’端加上XhoI的酶切位点，进行基因合成，合成的基因挂在克隆载体上。合成基因的序列如SEQ ID NO：5，所述SEQ ID NO：5的序列结构具体如下：
catatggcacgccgtctgccgaagccgactctgcaaggtcgtctggaggctgattttccggactctccgctgctgccgaagtttcaagagctgaaccagaataatctgccgaatgatgtgtttcgtgaggctcagcgttcttacctggtatttctgacttcccagttctgctacgaagaatacgtgcagcgtacttttggtgtgcctcgtcgtcaacgtgccatagacaagcgtcagcgtgcttctgtggctggtggtggtgctcgtcgtactcgtaaaccgcagcagccggaatctctggaagaatgcgactctgaactggaaatcaagcgttacaagaaccgtgttgcttctcgtaagtgccgtgctaagttcaaacagcttctgcagcactaccgtgaggtagctgctgctaagtcttctgaaaacgaccgtctgcgtctgctgctgaaacagatgtgcccgtctctggacgttgactctatcattcctcgtactccggatgttctgcacgaagacctgctgaacttctaactcgag。
实施例二 EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的表达
1、表达质粒的构建
对克隆质粒进行NdeI和XhoI的双酶切，内切酶NdeI和XhoI均购自于NEB公司，切下来的目的基因用连接酶连接到pET-30a表达载体上，连接酶为生工生物工程股份有限公司供给的T4 DNA ligase酶，即为构建好的表达质粒。
表达质粒转化感受态细胞大肠埃希菌细胞E.coli BL21(DE3)，进行小量表达，目的蛋白条带大小约20KDa，挑取阳性克隆在细菌培养皿上分区划碟，再次进行小量表达，挑取阳性克隆提取质粒，进行酶切鉴定，鉴定阳性的样品送测序公司进行测序，以证实表达质粒构建的正确性，如图1为大肠埃希菌表达质粒pET-30a/BFRF3/BZLF1的构建流程图。
2、重组融合蛋白的表达和纯化
将测序正确的工程菌涂于细菌培养皿，单个细菌菌落摇起活化之后，接种至大量LB培养基中过夜培养，次日1mM IPTG低温诱导(28℃)5小时，8000g离心10分钟，收集细菌沉淀，用裂解液(10％甘油、500mM NaCl,0.1％NP40,10mMTris·HCl,pH8.0)裂解细菌，超声波破碎，12000g离心10分钟，收集上清，上清用饱和硫酸铵溶液沉淀，后用基液(10mM Tris·HCl,pH8.0)溶起，用阳离子层析介质SP-FF对样品进行纯化，得到纯的重组BFRF3-BZLF1融合蛋白。对纯化后的BFRF3-BZLF1融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，分析结果如图2所示。
实施例三 EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白在EB病毒ELISA检测中的应用
ELISA检测原理：利用本发明制备的重组抗原包板，加入待检测血清，待血清中抗体与包板抗原结合后，应用酶标抗人二抗与抗体结合，显色测定结果。
(1)抗原包被：纯化的重组BFRF3-BZLF1融合蛋白用包被稀释液(35mM NaHCO3,15mM Na2CO3,pH9.6)稀释至100μg/mL浓度。ELISA酶标板上每孔加入100μL，37℃，3h。
(2)洗板：用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)冲洗酶标板5次。
(3)封闭：加入5％牛血清白蛋白(BSA)封闭液(PBST配制)100μL/孔，37℃封闭1小时。
(4)洗板：同上。
(5)一抗反应：EB病毒相关病人的血清以及正常人血清1:80稀释后加入反应孔中，100μL/孔，37℃孵育1小时。
(6)洗板：同上。
(7)二抗反应：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人工作液100μL/孔，37℃孵育1h。
(8)洗板：同上。
(9)显色：加入TMB显色工作液(1mL TMB原液加9mL去离子水和250μL双氧水)100μL/孔，显色10min。
(10)中止：显色后用硫酸终止反应。
(11)结果判断：使用450nm波长检测各孔吸光度(OD)值。
根据上述检测步骤，使用重组BFRF3-BZLF1蛋白作为诊断抗原包板对NPC患者及健康人群血清样本进行ELISA检测，结果如表1(通过ROC曲线确定其cut-off值)，在NPC患者和健康对照中，阳性率分别为94.5％和3.6％。
表1 NPC患者和健康人群中IgA抗体的ELISA检测
对比例不同抗体检测方法对NPC患者和健康人群血清样本的检测
为进一步确立本研究建立检测方法的诊断价值，使用临床上常用的EBV检测指标VCA抗体和EA抗体对本研究中部分样本进行了检测。被检测样本中有NPC样本中随机抽取的50例，非NPC患者血清中随机抽取的10例，检测结果见表2。
表2不同抗体检测方法对NPC患者和健康人群血清样本的检测结果比较
结论：使用BFRF3-BZLF1重组蛋白作为诊断抗原进行ELISA检测后，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为95％，健康人群检测的阴性率为96.2％，高于常规使用的EA、VCA抗体的检测。
实施例四EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白在EB病毒金标试纸条检测中的应用
胶体金试纸条诊断原理：胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团产生静电吸引，从而牢固结合。以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原-抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应，检测抗原/抗体。
(1)反应膜的制备；用磷酸盐缓冲液将重组BFRF3-BZLF1抗原稀释到包被浓度为1.0mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释成包被浓度为2.0mg/mL，两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜37℃干燥3h保存。
(2)鼠抗人IgA单抗金结合物垫的制备：将标记浓度为12μg/mL的鼠抗人IgA单抗与胶体金进行偶联制备胶体金标记鼠抗人IgA单抗溶液，离心弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，用混合液浸泡金标垫，制备成EB-IgA金结合物垫后37℃干燥3h保存。
(3)将反应膜、EB-IgA金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配成反应板，切成4mm试纸条。
(4)样品检测：将被检血清平衡至室温，将试纸条平放，在上样垫上加入50-100μL被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，肉眼直接观察15-20分钟内C线、T线出现情况，判定检测结果，20分钟后检验结果无效。
(5)检验结果
a.阴性：只在C线凝集出现红色条带。
b.阳性：分别在T线和C线出现一条红色条带。
c.无效：无C线出现或T线与C线均不出现，表明实验无效。
(6)反应膜包被条件的优化：
检测线包被浓度和胶体金标记鼠抗人IgA稀释比例的选择：按照上述条件进行标记，将其体积浓缩至原体积的1/10，再以不同比例稀释浓缩液，用稀释液1.5mL/条浸泡金标垫，干燥后配对检测内控血清。实验方案如下表3，结果如表4、5。
表3实验方案
表4阳性内控品和最低检出限
| P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | |
| A1B1 | ± | ++ | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ |
| A1B2 | ± | + | + | + | ± | + | + | ++ |
| A1B3 | ± | + | ++ | + | ± | + | ++ | + |
| A2B1 | + | ++ | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ |
| A2B2 | + | ++ | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ |
| A2B3 | ± | + | ++ | + | ± | + | ++ | + |
| A3B1 | + | ++ | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ |
| A3B2 | + | ++ | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ |
| A3B3 | ± | + | ++ | ++ | + | ++ | +++ | + |
表5阴性内控品
通过以上实验可知，A2B2和A3B2两组结果较理想。浓缩液稀释比例为1:5，检测线包被浓度为1.0mg/mL-1.2mg/mL时，EB-IgA反应膜检测线显色效果好，灵敏度、特异性较好。在此选择A2B2组合，即检测线包被浓度为1.0mg/mL，胶体金结合物稀释液至原体积的1/2。
b.质控线包被浓度的选择：将羊抗鼠IgG抗体配成不同浓度包被在质控线上，干燥后用内控血清进行检测，结果如表6：
表6
由表6可知：当质控线浓度为1.0mg/mL、1.5mg/mL时，质控线显线较弱，检测强阳性样本显线更弱，主要由于检测线与质控线竞争引起。当质控线浓度为2.5mg/mL时，质控线显线粗且不规则。选取2.0mg/mL作为质控线的包被浓度。
根据上述检测步骤，分别对NPC患者血清340份和健康人血清300份进行抗体检测，检测结果如下表7：
表7 NPC患者和健康人群中EBV抗体的胶体金检测
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京贝思泰生物科技有限公司
<120> 一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸
条及其生产方法和应用
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro
85 90 95
Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys
100 105 110
Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu
115 120 125
Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg
130 135 140
Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp Ser
145 150 155 160
Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu Asp Leu Leu Asn Phe
165 170 175
<210> 2
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcacgcc gtctgccgaa gccgactctg caaggtcgtc tggaggctga ttttccggac 60
tctccgctgc tgccgaagtt tcaagagctg aaccagaata atctgccgaa tgatgtgttt 120
cgtgaggctc agcgttctta cctggtattt ctgacttccc agttctgcta cgaagaatac 180
gtgcagcgta cttttggtgt gcctcgtcgt caacgtgcca tagacaagcg tcagcgtgct 240
tctgtggctg gtggtggtgc tcgtcgtact cgtaaaccgc agcagccgga atctctggaa 300
gaatgcgact ctgaactgga aatcaagcgt tacaagaacc gtgttgcttc tcgtaagtgc 360
cgtgctaagt tcaaacagct tctgcagcac taccgtgagg tagctgctgc taagtcttct 420
gaaaacgacc gtctgcgtct gctgctgaaa cagatgtgcc cgtctctgga cgttgactct 480
atcattcctc gtactccgga tgttctgcac gaagacctgc tgaacttc 528
<210> 3
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala
<210> 4
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Arg Arg Thr Arg Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys
1 5 10 15
Asp Ser Glu Leu Glu Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg
20 25 30
Lys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val
35 40 45
Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys
50 55 60
Gln Met Cys Pro Ser Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro
65 70 75 80
Asp Val Leu His Glu Asp Leu Leu Asn Phe
85 90
<210> 5
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catatggcac gccgtctgcc gaagccgact ctgcaaggtc gtctggaggc tgattttccg 60
gactctccgc tgctgccgaa gtttcaagag ctgaaccaga ataatctgcc gaatgatgtg 120
tttcgtgagg ctcagcgttc ttacctggta tttctgactt cccagttctg ctacgaagaa 180
tacgtgcagc gtacttttgg tgtgcctcgt cgtcaacgtg ccatagacaa gcgtcagcgt 240
gcttctgtgg ctggtggtgg tgctcgtcgt actcgtaaac cgcagcagcc ggaatctctg 300
gaagaatgcg actctgaact ggaaatcaag cgttacaaga accgtgttgc ttctcgtaag 360
tgccgtgcta agttcaaaca gcttctgcag cactaccgtg aggtagctgc tgctaagtct 420
tctgaaaacg accgtctgcg tctgctgctg aaacagatgt gcccgtctct ggacgttgac 480
tctatcattc ctcgtactcc ggatgttctg cacgaagacc tgctgaactt ctaactcgag 540
Claims (8)
1.一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白，其特征在于，所述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的氨基酸序列结构如SEQ ID NO：1所示。
2.一种EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因，其特征在于，编码得到权利要求1所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因，其特征在于，所述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的碱基序列结构如SEQ ID NO：2所示。
4.一种包含权利要求2或3所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的重组载体。
5.一种包含权利要求2或3所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白基因的宿主细胞。
6.一种含有如权利要求1所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的胶体金试纸条。
7.一种生产权利要求1所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求4所述的重组载体导入宿主细胞，使其表达所述EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白。
8.权利要求1所述的EB病毒BFRF3-BZLF1融合蛋白在制备鼻咽癌检测试剂领域的应用。
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| CN1584593A (zh) * | 2003-08-20 | 2005-02-23 | 香港神农有限公司 | Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 |
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| Localization and Diagnostic Application of Immunodominant Domains of the BFRF3-Encoded Epstein-Barr Virus Capsid Protein;Vangrunsven等;《Journal of Infectious Diseases》;19941231;第170卷(第1期);第13-19页 * |
| Molecular Properties of the Epstein-Barr virus BFRF3 Gene;Cai等;《Virologica Sinica》;20131231;第28卷(第6期);第368-372页 * |
| The DNA-Binding Domain of Two bZIP Transcription Factors, the;Ivan等;《Journal of Virology》;19930228;第67卷(第2期);第734-742页 * |
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