CN108490177A - 鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒。其中鼻咽癌抗体检测试剂包括EBV抗原，EBV抗原选自EA‑D P54、EA‑D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原。通过选取EA‑D P54、EA‑D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的优势片段，同时利用至少三种抗原的特异性片段对鼻咽癌抗体进行检测，相比现有采用单一抗原进行分别检测不仅具有检测效率高的优势，而且还具有检测灵敏度高和特异性高的优势。

Description

鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒

技术领域

本发明涉及鼻咽癌检测领域，具体而言，涉及一种鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是一种γ疱疹病毒，基因组全长184kb。目前已有令人信服的证据支持EB病毒是鼻咽癌重要的致病因子，参与鼻咽癌的多阶段、多因素的发生过程。EB病毒在人群中的感染率达到90％以上，与多种人类疾病相关，如传染性单核细胞增多症、鼻咽癌等。被病毒感染的细胞具有EBV的基因组，并可产生各种抗原及相应的抗体。

鼻咽癌在我国东南地区是一种常见恶性肿瘤，其发生被证实与EB病毒感染密切相关，鼻咽癌组织中往往可以检测到EBV的存在。国内外对EB病毒作了大量研究均发现抗EB病毒抗原的免疫球蛋白对鼻咽癌诊断有特异性。

常用于鼻咽癌筛查的血清学指标有EBV EA IgA、EBV EA IgG、EBV VCA IgA、EBVNA IgA等，另外，有研究表明EBV MA IgA、EBV ZTA IgA、EBV RTA IgA、EBV ZTA IgG、EBVRTA IgG等也可用于鼻咽癌的辅助筛查。

EB病毒在细胞中的生活周期可分为潜伏期、立即早期、早期、病毒DNA复制期和晚期。EBV基因组的不同片段编码的特异性病毒抗原可分为两类：(1)病毒潜伏感染时表达的抗原。当EB病毒感染后，大部分病毒都处于潜伏状态，处于这种状态下的病毒表达大约10种病毒蛋白，主要有EB NA1(EBV核抗原1)、EB NA2、EB NA3A、EB NA3B、EB NA3C、EB NALP、LMP1(EBV潜伏膜蛋白1)、LMP2A、LMP2B等。(2)与病毒增殖周期相关的抗原。在病毒增殖开始时产生EBV早期抗原(EA)，EA是病毒增殖期诱导的非结构蛋白，可分弥散性早期抗原(EA-D)和局限性早期抗原(EA-R)，EA-D和EA-R都不是由单一的抗原构成的，而是由多种抗原构成的复合物。随着EB病毒早期抗原的积累，病毒的DNA开始复制。病毒的晚期蛋白主要有EBV病毒壳抗原(virus capsid antigen，VCA)和EBV膜抗原(membrane antigen，MA)。

Zta蛋白属于立即早期反式激活因子，是调节病毒从潜伏期进入复制状态的关键，Zta一开始表达病毒就进入复制的链式反应过程。Zta-IgA的出现，表明病毒已经被激活进入溶解性感染期。

Rta是EB病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因BRLF1的编码转录激活蛋白，是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件而且仅在鼻咽癌发生时表达，对诊断鼻咽癌具有极高的特异性。

目前国内外报道的用于筛查鼻咽癌的试剂主要有EBV EA IgA、EBV EA IgG、EBVVCA IgA、EBV NA IgA、EBV MA IgA、EBV Zta IgA、EBV Zta IgG、EBV Rta IgA、EBV Rta IgG等。但是这些检测试剂都是单一指标，在筛查鼻咽癌时意义不大，灵敏度和特异性都较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒，以解决现有技术中的鼻咽癌检测存在灵敏度低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种鼻咽癌抗体检测试剂，该试剂包括EBV抗原，EBV抗原选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原。

进一步地，EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原物理混合的抗原。

进一步地，物理混合的抗原以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在；优选地，以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在的物理混合的抗原中，可选的EA-D P54、可选的EA-D P138、可选的VCA P18、可选的VCA P23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，更优选地，按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)；进一步优选地，固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

进一步地，EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原重组表达的融合抗原。

进一步地，融合抗原以融合抗原-固相载体偶联物的形式或者以融合抗原-发光标记偶联物的形式存在；更优选地，固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

进一步地，试剂还包括抗人IgA抗体或抗人IgG抗体；优选地，抗人IgA抗体为鼠抗人IgA抗体或羊抗人IgA抗体；抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体；更优选地，抗人IgA抗体或抗人IgG抗体以抗体-固相载体偶联物或抗体-发光标记偶联物的形式存在；进一步优选地，抗体-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，抗体-发光标记偶联物中的发光标记物为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

根据本发明的第二个方面，提供了一种鼻咽癌诊断试剂盒，该试剂盒包括鼻咽癌抗体检测试剂，鼻咽癌抗体检测试剂为上述任一种试剂。

进一步地，试剂盒还包括校准品和质控品；优选地，校准品包括第一浓度校准品和第二浓度校准品，第二浓度校准品的浓度高于第一浓度校准品的浓度，更优选地，第一浓度校准品的浓度为0.1AU/mL～1AU/mL，进一步优选为0.326AU/mL，第二浓度校准品的浓度为5AU/mL～10AU/mL，进一步优选为6.132AU/mL；优选地，质控品包括第一浓度质控品和第二浓度质控品，第二浓度质控品的浓度高于第一浓度质控品的浓度，更优选地，第一浓度质控品的浓度为1AU/mL～2AU/mL，进一步优选为1.414AU/mL，第二浓度质控品的浓度为5AU/mL～8AU/mL，进一步优选为6.132AU/mL。

根据本发明的第三个方面，提供了一种上述任一种鼻咽癌抗体检测试剂的制备方法，该制备方法包括：制备选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的EBV抗原。

进一步地，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，得到EBV抗原；优选地，物理混合的步骤中，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原制备成抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记偶联物的形式进行物理混合；更优选地，以抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记物偶联物的形式进行物理混合的步骤中，可选的EA-D P54、可选的EA-DP138、可选的VCAP18、可选的VCA P23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，更优选地，按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)。

进一步地，物理混合的步骤包括：先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原分别包被固相载体，形成各抗原对应的抗原-固相载体偶联物；再将各抗原对应的抗原-固相载体偶联物进行物理混合，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的EBV抗原；或者先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，形成抗原混合物；再将抗原混合物包被固相载体，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的EBV抗原；进一步优选地，EBV抗原-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球。

进一步地，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行重组表达，得到融合的EBV抗原；优选地，制备方法还包括：将融合的EBV抗原制备成融合抗原-固相载体偶联物形式或融合抗原-发光标记偶联物形式的抗原的步骤；更优选地，固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

应用本发明的技术方案，通过选取EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的优势片段，同时利用至少三种抗原的特异性片段对鼻咽癌抗体进行检测，相比现有采用单一抗原进行分别检测不仅具有检测效率高的优势，而且还具有检测灵敏度高和特异性高的优势。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术中的鼻咽癌诊断过程中存在检测灵敏度低的缺陷，为了提高现有检测水平的灵敏度，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种鼻咽癌抗体检测试剂，该试剂包括EBV抗原，EBV抗原选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原。

本申请的上述鼻咽癌抗体检测试剂，通过选取EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCAP23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的优势片段，同时利用至少三种抗原的特异性片段对鼻咽癌抗体进行检测，相比现有采用单一抗原或两种抗原进行分别检测不仅具有检测效率高的优势，而且还具有检测灵敏度高和特异性高的优势。

本申请的上述试剂中，含有上述至少三个抗原的EBV抗原可以是以物理混合形式存在的抗原，也可以是以融合抗原形式存在的抗原，只要能够同时利用三个或三个以上的上述抗原的特异性片段去检测相应的抗体，使对抗体的检测灵敏度有所提高即可。在本申请一种优选的实施例中，上述EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原物理混合的抗原。

上述优选的实施例中，以物理混合形式存在的抗原可实现各抗原的充分混合，从而最大程度地发挥各抗原的检测性能，从而在提高灵敏度的同时提高检测的特异性。以重组表达的融合抗原形式存在的抗原，也能充分发挥各抗原识别对应抗体的特异性，从而提高检测的灵敏度和特异性。

上述以物理混合形式存在的抗原，可以根据检测方法的不同或制备效率的不同而制备成不同的形式。在本申请一种优选的实施例中，上述物理混合的抗原以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在。通过将抗原与固相载体或发光标记进行偶联形成偶联物的形式，能够可以实现定量检测或提高检测效率。

在一种优选实施例中，抗原无论是以抗原-固相载体偶联物的形式存在，还是以抗原-发光标记偶联物的形式存在，在物理混合的抗原中，可选的EA-D P54、可选的EA-DP138、可选的VCA P18、可选的VCA P23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，优选的按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)。

上述试剂中抗原的总工作浓度可以根据工艺的放大缩小需求调节，在作为试剂盒的成分时，优选为4～30ug/ml，更优选为10ug/ml。试剂中各个抗原的工作浓度依据试剂中抗原总工作浓度进行计算，其中，工作浓度是指试剂中各组分的质量体积浓度。上述优选的实施例中，由于本申请的抗原至少包括其中三种，因而根据实际需要，可以选择其中的任意三种、任意四种、任意五种或任意六种，甚至可以同时包括上述七组抗原。而上述七种抗原中，可选的任一种在与其他可选的抗原进行混合的过程中，可以根据实际各抗原的效价进行合理调整混合比例，也可以通过将各抗原的效价调整一致后，按照同等比例进行混合。

在本申请的上述优选实施例中，按照上述优选的特定比例进行混合，使得该检测试剂的抗体检测灵敏度和特异性更高。上述“可选的”的涵义是指上述七种抗原中的任意三种、四种、五种、六种进行混合时，均是按上述对应的抗原的比例进行混合。

上述固相载体和发光标记均可以采用现有的相关产品，在本申请中，上述固相载体包括但不仅限于磁性微球、包板或塑料微球，发光标记包括但不仅限于ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

在本申请一种优选的实施例中，EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCAP23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原重组表达的融合抗原。通过融合表达的抗原，在一个抗原上同时展现出多个抗原蛋白的特异性片段，进而能够同时检测多种对应的抗体，从而提高抗体检测的灵敏度。

在上述融合抗原中，可以选择其中的任意三个抗原进行融合，也可以选择其中的任意四个、五个、六个抗原进行融合，还可以将上述七种抗原进行融合。具体地，可以以基因片段串联的方式进行融合表达。

在一种优选的实施例中，上述融合抗原以融合抗原-固相载体偶联物的形式或者以融合抗原-发光标记偶联物的形式存在。以上述形式存在便于实现自动化的检测，提高检测效率。

具体地，固相载体和发光标记均采用现有的即可。在本申请中，上述固相载体包括但不仅限于磁性微球、包板或塑料微球，发光标记包括但不仅限于ABEI、、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

本申请的上述鼻咽癌抗体的检测试剂中，通过采用上述包含至少三种抗原的试剂进行抗体检测已经能够提高检测的灵敏度。在此基础上，为了进一步提高检测的便捷性，在一种优选的实施例中，上述试剂还包括抗人IgA抗体或抗人IgG抗体；优选地，抗人IgA抗体为鼠抗人IgA抗体或羊抗人IgA抗体；抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体；更优选地，抗人IgA抗体或抗人IgG抗体以抗体-固相载体偶联物或抗体-发光标记偶联物的形式存在；进一步优选地，抗体-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，发光标记为ABEI、、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

上述抗人IgA抗体或抗人IgG抗体的存在能够有效结合待检血清中的抗体。当上述抗体以与磁性微球等固相载体形成偶联物的形式存在时，对应的抗原以发光标记偶联物的形式存在。而上述抗体以与发光标记形成偶联物的形式存在时，对应的抗原以包被磁性微球的偶联物的形式存在。以适用于现有自动化的免疫检测设备，从而提高检测效率。

上述抗体中，抗人IgA抗体比抗人IgG抗体更灵敏，特异性也更高，本申请更优选针对相关的IgA抗体，采用本申请的含有至少三种抗原的试剂能够一次性检测出尽可能多的与鼻咽癌相关的IgA抗体，提高了检测的灵敏度和特异性，从而实现高效筛查。

在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种鼻咽癌诊断试剂盒，该试剂盒包括鼻咽癌抗体检测试剂，鼻咽癌抗体检测试剂为上述任一种试剂。采用本申请的试剂盒，由于采用至少三种抗原对待测血清中的抗体进行检测，因而不仅能够提高检测的灵敏度，而且能够提高检测的特异性。

为了进一步提高上述试剂盒在自动化免疫检测设备中的应用便利性，在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括校准品和质控品。标准品和标准品采用现有的检测鼻咽癌检测试剂盒中常用的标准品和质控品即可。

在本申请一种优选的实施例中，上述校准品包括第一浓度校准品和第二浓度校准品，第二浓度校准品的浓度高于第一浓度校准品的浓度，更优选地，第一浓度校准品的浓度为0.1AU/mL～1AU/mL，进一步优选为0.326AU/mL。采用上述高低浓度范围的两个校准品检测浓度范围广且准确的优势。

在本申请一种优选的实施例中，上述质控品包括第一浓度质控品和第二浓度质控品，第二浓度质控品的浓度高于第一浓度质控品的浓度，更优选地，第一浓度质控品的浓度为1AU/mL～2AU/mL，所述第二浓度校准品的浓度为5AU/mL～10AU/mL，进一步优选为6.132AU/mL。采用上述高低浓度范围的两个质控品能够更准确地检测待检仪器的稳定性。

在本申请第三种典型的实施方式中，还提供了上述任一种鼻咽癌抗体检测试剂的制备方法，该制备方法包括：制备选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的EBV抗原。

本申请的上述鼻咽癌抗体检测试剂的制备方法，通过制备至少含有上述三种抗原的EBV抗原来获得至少含有三种抗原的抗体检测试剂，从而提高检测的灵敏度，同时也提高了检测特异性。

上述至少含有三种抗原的抗体检测中，抗原按照不同的目的采用不同的方法进行制备。在本申请一种优选的实施例中，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，得到EBV抗原；优选地，物理混合的步骤中，将EA-DP54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原制备成抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记偶联物的形式进行物理混合；更优选地，以抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记物偶联物的形式进行物理混合的步骤中，可选的EA-D P54、可选的EA-DP138、可选的VCA P18、可选的VCA P23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，优选的按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)。试剂盒中抗原的总工作浓度可以根据工艺的放大缩小需求调节，在作为试剂盒成分时优选为4～30ug/ml，更优选为10ug/ml。试剂中各个抗原的工作浓度根据实际所欲制备的试剂中抗原总工作浓度进行计算，其中，工作浓度是指试剂盒中各组分的质量体积浓度。

在本申请一种优选的实施例中，物理混合的步骤包括：先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原分别包被固相载体，形成各抗原对应的抗原-固相载体偶联物；再将各抗原对应的抗原-固相载体偶联物进行物理混合，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的EBV抗原；或者先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，形成抗原混合物；再将抗原混合物包被固相载体，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的EBV抗原；优选地，EBV抗原-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球。

上述优选的实施例中，采用将抗原以物理混合的形式进行制备的步骤中，既可以先将各个抗原负载到固相载体上，比如进行磁性微球包被，形成抗原-磁性微球偶联物，然后再物理混合，也可以先将各个抗原进行物理混合后再统一负载到固相载体上。两种制备方法均适用于本申请。在上述物理混合的过程中，各抗原可以等比例混合，也可以根据实际需要按照特定比例进行混合。上述优选实施例中按照特定的比例进行混合所制备的抗原具有灵敏度和特异性更高的优势。

在本申请一种优选的实施例中，上述制备方法还包括：将融合的EBV抗原制备成融合抗原-固相载体偶联物形式或融合抗原-发光标记偶联物形式的抗原的步骤；更优选地，固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

上述形成融合抗原的制备步骤中，可按照常规的重组蛋白表达的操作手段获得。具体地，可以从NCBI网站上查找EB病毒的EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA抗原的氨基酸序列(依次为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7)及基因序列(依次为SEQ IDNO:8～SEQ ID NO:14)，并根据选择的抗原的数量的多少人工合成融合序列，然后通过设计引物进行PCR反应，经克隆测序选择表达正确的克隆进行转化及蛋白表达，最后纯化出相应的融合蛋白。上述各抗原的氨基酸序列或基因序列包括但不限于上述具体的氨基酸或基因序列，也可以是各抗原的截断或者重组的序列。

以下将结合实施例对本申请做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。需要说明的是，以下实施例中，各试剂的来源分别如下：

鼠抗人IgA抗体，购自芬兰Medix公司。

磁性微球，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产的已知产品。

ABEI，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产的已知产品。

各单个的EBV抗原(EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA)，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，具体按照常规的蛋白表达操作手段获得。

重组表达的EBV融合抗原(包括EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA七种抗原的特异性识别片段)，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产。按照常规的重组蛋白表达的操作手段获得。具体地，可以从NCBI网站上查找EB病毒的EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA抗原的氨基酸序列(依次为SEQ ID NO:1～SEQID NO:7)及基因序列(依次为SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14)，并根据选择的抗原的数量的多少人工合成融合序列，然后通过设计引物进行PCR反应，经克隆测序选择表达正确的克隆进行转化及蛋白表达，最后纯化出相应的融合蛋白。

实施例1实施例1提供了一种鼻咽癌快速筛查试剂盒，包括如下组分：

1)EBV重组表达的七种融合抗原包被的磁球体系：抗原总浓度10μg/ml，磁球浓度为1mg/ml。

2)缓冲液体系：含羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊血清、鼠血清的Tris-HCl缓冲体系

3)低浓度校准品，浓度：0.326AU/mL；

4)高浓度校准品，浓度：6.132AU/mL；

5)发光标记物体系：一株抗人IgA单抗标记的示踪物(发光标记物为ABEI)，抗人IgA单抗的工作浓度：4μg/ml，发光物工作浓度：400ng/ml(即按照10:1的质量比进行偶联)。

6)质控品1，浓度：1.414AU/mL；

7)质控品2，浓度：6.132AU/mL；

上述各组分均含有BSA和防腐剂，BSA的质量体积(w/v)浓度为0.01％-0.5％，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种。

上述鼻咽癌筛查试剂盒中各试剂的制备方法，除以下试剂外，其余试剂均按照常规方法制备。

1)EBV重组表达融合抗原：具体制备步骤如下：从NCBI网站上查找EB病毒的EA-DP54、EA-D P138及VCA P18抗原的氨基酸序列(依次为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO：7)及基因序列(依次为SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:1:4)，并根据上述7种抗原的基因序列进行串联设置，且每个片段的数量均为1，然后设计引物进行PCR扩增，经克隆测序选择表达正确的克隆进行转化及蛋白表达，最后纯化出相应的融合蛋白。

磁性微球体系的制备：取一定量的纳米磁性微球，按每毫克磁性微球加入0.5mg的DCC，然后加入DMF溶液使磁性微球的浓度为20mg/ml，置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。活化好的纳米磁性微球溶液去除上清液，然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液，使其浓度达到20mg/ml(以纳米磁性微球计)；再以每毫克磁性微球10μg的量添加EBV重组表达融合抗原，然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离，用洗液(0.5％BSA溶液)清洗固体三遍，得到包被好抗原的磁性微球。将该获得的包被好的抗原的磁性微球按1mg磁性微球加入稀释液(碳酸盐缓冲液，也可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液)至1ml，得到含有10μg/ml抗原浓度的磁性微球体系，备用。

2)标记了示踪物(发光标记物)的鼠抗人IgA单抗通过以下方法制备：取1mg鼠抗人IgA抗体，用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1ml，然后放入透析袋中，并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的鼠抗人IgA抗体，加入100μg ABEI-半琥珀酰胺酸-NHS，室温震摇1.5小时。安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好ABEI的鼠抗人IgA抗体过柱纯化，然后收集出现峰值的蛋白溶液。将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含5％的BSA的保护液(缓冲液+BSA)，加入稀释液稀释至250ml，得到含有4μg/ml抗人IgA单抗的发光标记物体系，备用。

采用本实施例的检测试剂盒进行鼻咽癌快速筛查的方法，包括以下步骤：

1)第一步反应：加入10μL血清样本，180uL缓冲液混匀，在37℃温育10min，不清洗。

2)第二步反应：加入20μL磁球体系溶液，加入20μL缓冲液，在37℃温育10min，在磁环境中清洗3遍。

3)第三步反应：加入50μL发光标记物体系溶液，混匀。在37℃温育10min，形成包括磁性微球、EBV抗原、待测抗体、鼠抗人IgA单抗与ABEI复合的发光免疫复合物。

4)检测：外加磁场将上述发光免疫复合物沉淀，除去上清液，并以自动灌注系统缓冲液进行清洗，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过校准品修正后的工作曲线可计算得出样本的EBV七种融合抗原对应IgA抗体的总含量。

实施例2实施例2与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)磁性微球体系：同时包被有EBV EA-D P54抗原、EBV EA-D P138抗原、EBV VCAP18抗原、EBV VCA P23抗原、EBV NA1抗原、EBV ZTA抗原及EBV RTA抗原的磁性微球，抗原总浓度为10μg/ml。上述磁性微球体系中，将七种抗原先按照EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA均为1.43μg的量混合，然后包被磁球。具体步骤如下:

磁性微球体系的制备：取一定量的纳米磁性微球，按每毫克磁性微球加入0.5mg的DCC，然后加入DMF溶液使磁性微球的浓度为20mg/ml，置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。活化好的纳米磁性微球溶液去除上清液，然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液，使其浓度达到20mg/ml(以纳米磁性微球计)；再以每毫克磁性微球10μg添加混合抗原(EA-DP54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA对应的添加量分别为1.43μg、1.43μg、1.43μg、1.43μg、1.43μg、1.43μg、1.43μg)，然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离，用洗液(0.5％BSA溶液)清洗固体三遍，得到包被好的抗原偶联物的磁性微球。将该获得的包被好的抗原的磁性微球按1mg磁性微球加入稀释液(碳酸盐缓冲液，也可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液)至1ml，得到含有10μg/ml抗原浓度的磁性微球体系，备用。

2)鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例3实施例3与实施例2的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)磁性微球体系：包括包被EBV EA-D P54抗原的磁球、包被EBV EA-D P138抗原的磁球、包被EBV VCA P18抗原的磁球、包被EBV VCA P23抗原的磁球、包被EBV NA1抗原的磁球、包被EBV ZTA抗原的磁球、包被EBV RTA抗原的磁球。

上述磁性微球体系中，将七种抗原分别包被磁球，然后分别取EA-D P54、EA-DP138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA包被好的磁球等比例进行混合，七种抗原工作浓度均为1.43μg/ml。具体步骤如下:

磁性微球体系的制备：取一定量的纳米磁性微球，按每毫克磁性微球加入0.5mg的DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二环己基碳二亚胺)，然后加入DMF溶液使磁性微球的浓度为20mg/ml，置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。活化好的纳米磁性微球溶液去除上清液，然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液，使其浓度达到20mg/ml(以纳米磁性微球计)；再以每毫克磁性微球10μg的量添加抗原，然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离，用洗液(0.5％BSA溶液)清洗固体三遍，得到包被好的抗原和蛋白载体偶联物的磁性微球。将该获得的包被好的抗原的磁性微球按1mg磁性微球加入稀释液(碳酸盐缓冲液，也可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液)至1ml，得到含有10μg/ml抗原浓度的磁性微球体系，备用。

将上述七种抗原分别制备成10μg/ml抗原浓度的的抗原-磁性微球偶联物后，再制备磁性微球体系混合体系：取上述制备好的包被EBV EA-D P54抗原的磁球、包被EBV EA-DP138抗原的磁球、包被EBV VCA P18抗原的磁球、包被EBV VCA P23抗原的磁球、包被EBVNA1抗原的磁球、包被EBV ZTA抗原的磁球、包被EBV RTA抗原的磁球等比例混合，得到含有10μg/ml混合抗原的磁性微球体系，分装。

2)鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例4实施例4与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)鼠抗人IgA抗体包被磁球体系：鼠抗人IgA单抗的工作浓度为10μg/ml。具体制备步骤同实施例1中磁性微球体系的制备，仅将抗原包被磁球替换为鼠抗人IgA抗体包被磁球。

2)发光标记物体系：

融合抗原标记的发光标记物(ABEI)，融合抗原的工作浓度为：4μg/ml。

融合抗原表达的方法同实施例1，融合抗原标记ABEI的步骤同实施例1中鼠抗人IgA单抗标记ABEI的制备方法，仅将鼠抗人IgA抗体标记ABEI替换为抗原标记ABEI。

鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例5实施例5与实施例4的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

发光标记物体系的制备：

同时包被有EBV EA-D P54抗原、EBV EA-D P138抗原、EBV VCA P18抗原、EBV VCAP23抗原、EBV NA1抗原、EBV ZTA抗原及EBV RTA抗原的发光标记物。

混合抗原总浓度为4μg/ml。上述发光标记物体系中，将七种抗原先按照EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA等比例混合，然后标记ABEI。具体步骤如下:

发光标记物体系制备方法：取4mg混合抗原(EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCAP23、NA1、ZTA、RTA对应的添加量分别为0.571mg、0.571mg、0.571mg、0.571mg、0.571mg、0.571mg、0.571mg)，用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至4ml，然后放入透析袋中，并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的混合抗原，加入0.4mg ABEI-半琥珀酰胺酸-NHS，室温震摇1.5小时。安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好ABEI的抗原过柱纯化，然后收集出现峰值的蛋白溶液。将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含5％的BSA的保护液(缓冲液+BSA)，加入稀释液稀释至1L，得到含有4μg/ml混合抗原的发光标记物体系，备用。

鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例6实施例6与实施例5的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)发光标记物体系：

包括包被EBV EA-D P54抗原的ABEI、包被EBV EA-D P138抗原的ABEI、包被EBVVCA P18抗原的ABEI、包被EBV VCA P23抗原的ABEI、包被EBV NA1抗原的ABEI、包被EBV ZTA抗原的ABEI、包被EBV RTA抗原的ABEI。

上述发光标记物体系中，将七种抗原分别包被ABEI，然后分别取包被好的EA-DP54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA、RTA发光标记抗原等比例混合，七种抗原总工作浓度为4μg/ml。具体步骤如下:

发光标记物体系的制备：

取1mg抗原，用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1ml，然后放入透析袋中，并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的鼠抗人IgA抗体，加入0.1mgABEI-半琥珀酰胺酸-NHS，室温震摇1.5小时。安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好ABEI的鼠抗人IgA抗体过柱纯化，然后收集出现峰值的蛋白溶液。将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含5％的BSA的保护液(缓冲液+BSA)，加入稀释液稀释至1ml，得到含有1mg/ml抗原标记的发光标记物体系，备用。

将上述七种抗原分别制备成1mg/ml抗原浓度的抗原-ABEI偶联物后，再制备发光标记物混合体系：取上述制备好的包被EBV EA-D P54抗原的ABEI、包被EBV EA-D P138抗原的ABEI、包被EBV VCA P18抗原的ABEI、包被EBV VCA P23抗原的ABEI、包被EBV NA1抗原的ABEI、包被EBV ZTA抗原的ABEI、包被EBV RTA抗原的ABEI各0.571ml混合，加入稀释液(碳酸盐缓冲液，也可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris缓冲液)至1L，得到含有4μg/ml混合抗原的发光标记物体系，分装。

2)鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例7至实施例12

实施例7至实施例12分别按照实施例1至6类似的制备方法，并按照表1所示的参数条件进行制备。鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用该实施例的检测试剂盒进行检测。

表1：

实施例13至实施例17

实施例13至实施例17采用与实施例1至6中类似的操作方法，并按照表2所示的参数条件进行制备。鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用该实施例的检测试剂盒进行检测。

表2：

实施例18至实施例23

实施例18至实施例23采用与实施例1至6中类似的操作方法，并按照表3所示的参数条件进行制备。鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用该实施例的检测试剂盒进行检测。

表3：

同时发明人还设计了对比例1至9，具体制备参数见表4和表5。鼻咽癌快速筛查的方法与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用该实施例的检测试剂盒进行检测。

表4：

表5：

采用上述所有实施例和对比例中的检测试剂盒和检测方法在化学发光分析仪(制造商：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，仪器型号：Maglumi 4000plus)上进行测定实验，测试样本包括：1022例正常人样本，498例鼻咽癌患者样本(来自中山大学附属肿瘤医院)，其中，实施例1至16及对比例1至9分别测试了100例正常人样本和100例鼻咽癌患者样本，实施例17至23分别测试了1022例正常人样本，498例鼻咽癌患者样本。测试结果如下表6至表11。

表6：

表7：

表8：

编号	实施例13	实施例14	实施例15	实施例16
					检测阳性例数/鼻咽癌患者样本总例数	93/100	93/100	93/100	93/100
检测灵敏度(鼻咽癌阳性样本检出率)	93％	93％	93％	93％
					检测阴性例数/正常人样本总例数	93/100	93/100	92/100	91/100
检测特异性(正常人样本阴性率)	93％	93％	92％	91％

表9：

表10：

编号	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4	对比例5
						检测阳性例数/鼻咽癌患者样本总例数	83/100	81/100	88/100	90/100	83/100
检测灵敏度(鼻咽癌阳性样本检出率)	83％	81％	88％	90％	83％
						检测阴性例数/正常人样本总例数	95/100	94/100	82/100	82/100	86/100
检测特异性(正常人样本阴性率)	95％	94％	82％	82％	86％

表11：

编号	对比例6	对比例7	对比例8	对比例9
					检测阳性例数/鼻咽癌患者样本总例数	76/100	52/100	90/100	93/100
检测灵敏度(鼻咽癌阳性样本检出率)	76％	52％	90％	93％
					检测阴性例数/正常人样本总例数	91/100	99/100	93/100	89/100
检测特异性(正常人样本阴性率)	91％	99％	93％	89％

从上述检测结果可知：

1)从实施例与对比例的检测结果比对可知，实施例的检测灵敏度在93％～99.6％，对比例的检测灵敏度在52％～95％，对比例9虽然具有95％的灵敏度，但其特异性偏低，为89％，表明具有较高的11％的假阳性率。在检测特异性方面，实施例在91％～99.22％，高于对比例的82％～95％。对比例1虽然具有95％的特异性，但其灵敏度偏低，为83％，表明具有较高的17％的假阳性率。可见，在综合本申请的多种抗原共同检测时，不同实施例的正常人样本假阳性率、鼻咽癌样本检出率均远远优于采用单一抗原或者双抗原检测的结果，可有效兼顾灵敏度和特异性。

2)在实施例中，由实施例1-6以及实施例7-12的结果对比可知：在等比例混合条件下，测定100例鼻咽癌样本，实施例1至6的样本阳性检出率为97～99例，灵敏度为97％～99％；测定100例正常人阴性样本，实施例1至6的假阳性检出率为3～7例，特异性为93％～97％。同样的测定条件下，实施例7至实施例12的检测灵敏度为94％～96％，特异性为93％～94％。由比对结果可知：七种抗原联合检测正常人样本假阳性率、鼻咽癌样本检出率低于三种抗原联合检测的结果。

3)由实施例1至实施例3的结果对比，或者实施例4至实施例6的结果对比可知：实施例1和4的检测效果优于实施例2和5，更优于实施例3和6。说明同样条件下，不同制备方式对最终检测结果会产生影响。其中，通过融合表达、先等比例混合再包被磁球、先包被磁球后再等比例混合三种方式制备得到的EBV联合检测抗原均具有良好的灵敏度和特异性。同时，融合表达抗原的效果优于先等比例混合再包被磁球，先等比例混合再包被磁球进一步略优于先包被磁球后再等比例混合的制备方式。

4)由实施例1-3和实施例4-6的结果对比可知：实施例1-3的灵敏度和特异性略优于实施例4-6的灵敏度和特异性。说明同样条件下，联检抗原以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在均具有良好的检测效果。其中，联检抗原以抗原-固相载体偶联物的形式的检测灵敏度和特异性优于抗原-发光标记偶联物的形式。实施例7-9和实施例10至12的结果对比，同样支持这一检测结果。

5)由实施例7、13、14、15、16的结果对比可知：实施例7、13、14、15、16的灵敏度分别为96％、93％、93％、93％、93％，检测特异性分别为：94％、93％、93％、92％、91％，

可知，同样是三种抗原的联合检测，不同抗原的组合抗原检测效果存在差异，其中：EA-D P54、VCA P23与RTA的融合抗原优于EA-D P54、VCA P23与ZTA的融合抗原，或EA-DP54、NA1、RTA的融合抗原优于ZTA、VCA P23与RTA的融合抗原，同样优于EA-D P138、NA1与ZTA的融合抗原。

6)实施例17-19是在实施例2基础上优化比例，即优化七种抗原，先混合再包被磁球的投料比例，由结果可知：实施例17中EA-D P54:EA-D P138:VCA P18:VCA P23:NA1:ZTA:RTA按照1:0.5:0.5::1:0.5:0.5:1的比例；实施例18中EA-D P54:EA-D P138:VCA P18:VCAP23:NA1:ZTA:RTA按照1:0.2:0.2:1:0.2:0.2:1的比例；实施例19中EA-D P54:EA-D P138:VCA P18:VCA P23:NA1:ZTA:RTA按照1:1:1:1.7:1:1:1.7的比例先混合再包被磁球制备得到的EBV抗原的灵敏度和特异性，更优于实施实施例2的1:1:1:1:1:1:1其他比例的混合方式制备得到的EBV抗原；

7)实施例20-22是在实施例23的基础上优化比例，即优化三种抗原(EA-D P54、VCAP23、ZTA)先包被磁球，再混合的投料比例，由结果可知：实施例20中EA-D P54:VCA P23:ZTA按照1：1：0.5的比例；实施例21中EA-D P54:VCA P23:ZTA按照1：1：0.2的比例；实施例22中EA-D P54:VCA P23:ZTA按照1：1.7：1的比例先包被磁球，再混合制备得到的EBV抗原的灵敏度和特异性，更优于实施例23的1:1:1比例的混合方式制备得到的EBV抗原，这可能与各单个抗原的灵敏度和特异性互补有关。由此表明，按照特定比例将抗原进行混合能够调整不同抗原在检测中的权重，进而能够有效降低鼻咽癌筛查过程中的假阳性率，提高鼻咽癌患者的筛查率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司

<120> 鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒

<130> PN82163

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1212)

<223> EA-D P54，即BMRF1基因序列

<400> 1

atggaaacca ctcagactct ccgctttaag accaaggccc tagccgtcct gtccaagtgc 60

tatgaccatg cccagactca tctcaaggga ggagtgctgc aggtaaacct tctgtctgta 120

aactatggag gcccccggct ggccgccgtg gccaacgcag gcacggccgg gctaatcagc 180

ttcgaggtct cccctgacgc tgtggccgag tggcagaatc accagagccc agaggaggcc 240

ccggccgccg tgtcatttag aaaccttgcc tacgggcgca cctgtgtcct gggcaaggag 300

ctgtttggct cggctgtgga gcaggcttcc ctgcaatttt acaagcggcc acaagggggt 360

tcccggcctg aatttgttaa gctcactatg gaatatgatg ataaggtgtc caagagccac 420

cacacctgcg ccctgatgcc ctatatgccc ccggccagcg acaggctgag gaacgagcag 480

atgattgggc aggtgctgtt gatgcccaag acggcttcct cgttgcagaa gtgggcacgc 540

cagcaaggct caggcggcgt taaggtgaca ctcaatccgg atctctacgt caccacgtat 600

acttctgggg aggcctgcct caccctagac tacaagcctc tgagtgtggg gccatacgag 660

gccttcactg gccctgtggc caaggctcag gacgtggggg ccgttgaggc ccacgttgtc 720

tgctcggtag cagcggactc gctggcggcg gcgcttagcc tctgccgcat tccggccgtt 780

agcgtgccaa tcttgaggtt ttacaggtct ggcatcatag ctgtggtggc cggcctgctg 840

acgtcagcgg gggacctgcc gttggatctt agtgttattt tatttaacca cgcctccgaa 900

gaggcggccg ccagtacggc ctctgagcca gaagataaaa gtccccgggt gcaaccactg 960

ggcacaggac tccaacaacg ccccagacat acggtcagtc catctccttc acctccgcca 1020

cctcctagga cccctacttg ggagagtccg gcaaggccag agacaccctc gcctgccatt 1080

cccagccact ccagcaacac cgcactggag aggcctctgg ctgttcagct cgcgaggaaa 1140

aggacatcgt cggaggccag gcagaagcag aagcacccca agaaagtgaa gcaggccttt 1200

aaccccctca tt 1212

<210> 2

<211> 3384

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3384)

<223> EA-D P138,即BALF2基因序列

<400> 2

atgcagggtg cacagactag cgaggataat ctgggcagcc agagccagcc gggtccgtgc 60

ggctacatct acttttaccc cctggccacc taccctctta gggaggtggc cacactgggg 120

accggctacg cgggccacag gtgcctgacg gtgccgctcc tttgcggcat caccgtggag 180

ccgggcttca gcatcaatgt caaggctctg cacaggaggc ccgaccccaa ctgcgggctc 240

ctacgcgcta cctcctatca cagggacatc tacgtgttcc acaatgccca tatggttccc 300

cccatctttg aggggccggg tctcgaggcc ctctgtggcg agaccaggga ggtgtttggg 360

tacgacgcct acagcgccct accgagggaa agctccaagc cgggggactt cttccccgaa 420

gggctagatc cctctgccta cctgggggcg gtggcaataa ccgaggcctt caaggagcga 480

ctctacagcg gaaacctggt ggccattcca tcgttaaaac aggaggtagc ggtggggcag 540

tctgcgagcg ttagggtccc gctctacgac aaggaggtgt tcccagaggg cgtgccccag 600

ctccgccagt tttacaactc ggacctcagc cgctgcatgc acgaggcgct gtacaccggg 660

ctggcgcagg cgctgcgcgt ccgacgggtg ggcaagctgg tggagctgct ggagaagcag 720

agcctgcagg accaggccaa ggtggccaag gtggcccccc tcaaggagtt cccagcctca 780

accatcagtc acccggactc gggagcctta atgattgtgg acagcgcggc atgcgagctg 840

gcggtgagct acgcacccgc catgctggag gcctcgcacg agaccccggc cagcctcaac 900

tacgactcgt ggcccctgtt tgccgactgt gagggtccag aggcccgtgt ggctgcgtta 960

caccgatata atgccagcct ggccccccac gtgtccacgc agatctttgc caccaattcc 1020

gtcctctacg tctcgggggt ctcgaagtca accggtcagg gcaaggagag tctctttaac 1080

agtttctaca tgacccacgg cctggggacc ctgcaggagg ggacctggga cccctgccgc 1140

cgaccctgct tctcgggctg gggtgggcca gacgtgaccg gaaccaacgg tccgggaaac 1200

tacgctgtgg agcacctggt ctatgcggcc tccttctcgc ccaaccttct tgcccgctat 1260

gcctactacc tgcagttttg ccagggacag aagagctctc tgaccccggt gccggagacg 1320

ggcagctacg tggcgggggc ggccgccagt cccatgtgct cgctctgcga gggccgggcc 1380

ccggccgtgt gcctgaacac gctcttcttt aggctgaggg accgcttccc ccccgtcatg 1440

tccacgcagc ggagggaccc ctatgtgatc tcgggggcct cgggctccta caacgagacg 1500

gactttttgg gcaactttct caacttcatc gataaggagg acgacgggca gcggccggac 1560

gacgagcccc gctacaccta ctggcagctg aaccagaacc tgctggagcg gctgtctcgg 1620

ctgggcatag acgctgaagg aaagctagag aaggagcccc atggcccgcg tgactttgtc 1680

aagatgttca aggacgtgga tgcggcggtg gacgccgaag tggtccagtt tatgaacagc 1740

atggccaaga acaacatcac ctacaaggac ctggtcaaga gctgctacca cgtgatgcag 1800

tactcgtgca acccctttgc gcagcccgcc tgccccatct tcacccagct gttttaccgc 1860

tcactgctga ccatcctgca ggacatctcc ctgcccatct gtatgtgcta tgagaatgac 1920

aaccccgggc ttggccagag ccccccagag tggctaaagg gtcactacca gacgctgtgc 1980

accaacttta ggagcctggc catcgacaag ggggtcctca cggccaagga ggccaaggtg 2040

gtgcatgggg agcccacctg cgacctgcca gacctggacg cggccctgca gggccgggtg 2100

tacggccggc ggctgcctgt gcgcatgtcc aaggtgctga tgctgtgccc caggaacatc 2160

aagatcaaga acagggtggt cttcacgggg gagaatgccg ccctccagaa cagcttcatc 2220

aagtccacta ccaggaggga gaactacatc atcaacgggc cctacatgaa attcctcaac 2280

acctaccaca agaccctatt cccggacact aagctctcaa gcctgtacct gtggcacaac 2340

ttttccaggc ggcgctcggt ccctgtcccc agcggggcca gcgcggagga gtactctgac 2400

ctggccctct ttgtggacgg gggctcccgg gcccacgaag agagcaacgt catagatgtg 2460

gtgcctggca acctggtcac ttacgccaag cagaggctca acaacgccat cctgaaggcg 2520

tgcggccaga cccagttcta catcagcctg attcagggac tggtgccgag gacgcagtcg 2580

gtgcccgccc gtgactaccc ccacgtactg ggcacgcggg cggtggagtc ggcagcggcc 2640

tacgcggagg ccacctcctc ccttactgcg accacggtgg tctgcgcggc cacagactgt 2700

cttagccagg tctgcaaggc ccgtccggtt gtcacgctgc cagtgaccat caacaagtac 2760

acgggggtca acggcaacaa ccagatattc caggccggga acctgggata ctttatgggc 2820

cggggcgtgg acaggaacct gctgcaggcc cccggggctg ggctgcgcaa gcaggccggg 2880

ggctcttcca tgcggaagaa gtttgtcttt gccaccccca ccctagggtt gaccgtgaag 2940

cgccggaccc aagccgcgac cacatatgag attgagaaca tcagggctgg cctggaggcc 3000

attatatcac aaaaacagga ggaagactgt gtgtttgatg tggtgtgcaa ccttgtggat 3060

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<210> 3

<211> 528

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(528)

<223> VCA P18,即BFRF3基因

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agtcccctgc ttcctaaatt tcaagagctg aaccagaata atctccccaa tgatgttttt 120

cgggaggctc aaagaagtta cctggtattt ctgacatccc agttctgcta cgaagagtac 180

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gggggacaac cccacgacac cgccccacgc ggggcacgta agaaacag 528

<210> 4

<211> 486

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(486)

<223> VCA P23,即BLRF2基因

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atgtcagctc cacgcaaagt cagattgcct tctgttaagg ctgttgacat gagcatggaa 60

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tctgat 486

<210> 5

<211> 1923

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1923)

<223> NA1,即BKRF1基因

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cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180

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ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300

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ggtggcccag atggtgagcc tgacgtgccc ccgggagcga tagagcaggg ccccgcagat 1320

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aaaggagggt ggtttggaaa gcatcgtggt caaggaggtt ccaacccgaa atttgagaac 1440

attgcagaag gtttaagagc tctcctggct aggagtcacg tagaaaggac taccgacgaa 1500

ggaacttggg tcgccggtgt gttcgtatat ggaggtagta agacctccct ttacaaccta 1560

aggcgaggaa ctgcccttgc tattccacaa tgtcgtctta caccattgag tcgtctcccc 1620

tttggaatgg cccctggacc cggcccacaa cctggcccgc taagggagtc cattgtctgt 1680

tatttcatgg tctttttaca aactcatata tttgctgagg ttttgaagga tgcgattaag 1740

gaccttgtta tgacaaagcc cgctcctacc tgcaatatca gggtgactgt gtgcagcttt 1800

gacgatggag tagatttgcc tccctggttt ccacctatgg tggaaggggc tgccgcggag 1860

ggtgatgacg gagatgacgg agatgaagga ggtgatggag atgagggtga ggaagggcag 1920

gag 1923

<210> 6

<211> 735

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(735)

<223> ZTA,即BZLF1基因

<400> 6

atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg 60

ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg 120

caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag 180

ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct 240

gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata 300

acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct 360

actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag 420

ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg 480

aaaccacaac agccagaatc gctggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac 540

aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac 600

cgtgaggtcg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag 660

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<211> 1815

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1815)

<223> RTA，即BRLF1基因

<400> 7

atgaggccta aaaaggatgg cttggaagac tttctgaggc taactcctga aatcaaaaag 60

cagctgggct ctctggtctc tgactactgc aacgtcctca acaaggaatt tacagccggg 120

agtgtggaga ttactctgag atcctacaaa atatgcaagg catttataaa tgaggccaag 180

gcccacgggc gagaatgggg cgggctaatg gccacgctca acatctgcaa tttttgggcc 240

attctccgaa acaacagggt aagaagacgg gctgagaatg ccggcaacga cgcatgttcc 300

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tacaagctcc taaaacacag tcgggtgcgg gcctacacct acagcaaggt gctgggcgtg 480

gaccgcgcgg ccatcatggc ctccggcaag caggtagtgg aacacctgaa caggatggag 540

aaggaaggcc tcctaagctc caagttcaag gccttttgca agtgggtgtt cacctatccc 600

gtcctcgagg agatgttcca gactatggtc tcgtccaaga caggccatct gacggacgat 660

gttaaggatg tcagggctct gattaagaca ctgccccggg cctcctactc cagccacgcc 720

ggacagagga gctacgtgag cggcgtgctt cccgcgtgcc tgctgtcaac caagtccaag 780

gcagtggaaa ctcctatcct cgtgtccgga gccgacagga tggacgagga gctcatgggg 840

aatgatgggg gtgcctctca caccgaggcc cgctactcgg agtccggaca gtttcatgct 900

tttacagatg aactcgaaag tctcccgagc ccgaccatgc ccctgaagcc cggtgcccaa 960

agcgccgact gcggtgacag cagttccagc agcagtgact cgggcaacag tgacaccgag 1020

cagagcgagc gggaagaggc cagggccgag gccccgcgcc tgcgggcccc aaagtcgcgc 1080

cggacatcca ggcccaaccg tggtcaaact ccatgtcctt ccaacgcggc ggaacctgaa 1140

cagccttgga tagcagcggt ccaccaagag agcgatgaga gacccatatt cccccacccc 1200

tcaaagccca cctttcttcc tcccgttaaa aggaagaagg gcctcaggga tagccgggaa 1260

ggtatgttcc tgccaaagcc ggaagcgggc agtgccatat ctgacgtgtt cgaggggcga 1320

gaggtgtgtc agccaaagag gatcaggccc ttccatccac ccggatcccc gtgggccaac 1380

cggcccctgc ctgcctcttt ggctcccacc cccacaggac ctgtccatga accggtcgga 1440

tccctaacgc cagccccggt gccccagcca cttgacccgg cccccgcagt aacccccgag 1500

gcaagtcatc tgttggagga ccctgatgaa gaaaccagtc aggccgtgaa ggccctaagg 1560

gagatggctg acactgttat tccccagaag gaggaagcag ccatatgtgg acagatggac 1620

ctgagccacc cgccccctcg tggccatttg gacgaactga ccacaacact agagtccatg 1680

acagaggatt tgaatctgga ctcccccctg acccccgaac ttaatgaaat cttggataca 1740

tttctaaatg atgaatgtct gctgcatgcc atgcatattt caactgggct gtctattttt 1800

gacaccagct tattt 1815

<210> 8

<211> 404

<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 8

Met Glu Thr Thr Gln Thr Leu Arg Phe Lys Thr Lys Ala Leu Ala Val

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Leu Ser Lys Cys Tyr Asp His Ala Gln Thr His Leu Lys Gly Gly Val

20 25 30

Leu Gln Val Asn Leu Leu Ser Val Asn Tyr Gly Gly Pro Arg Leu Ala

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Ala Val Ala Asn Ala Gly Thr Ala Gly Leu Ile Ser Phe Glu Val Ser

50 55 60

Pro Asp Ala Val Ala Glu Trp Gln Asn His Gln Ser Pro Glu Glu Ala

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Pro Ala Ala Val Ser Phe Arg Asn Leu Ala Tyr Gly Arg Thr Cys Val

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Leu Gly Lys Glu Leu Phe Gly Ser Ala Val Glu Gln Ala Ser Leu Gln

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Phe Tyr Lys Arg Pro Gln Gly Gly Ser Arg Pro Glu Phe Val Lys Leu

115 120 125

Thr Met Glu Tyr Asp Asp Lys Val Ser Lys Ser His His Thr Cys Ala

130 135 140

Leu Met Pro Tyr Met Pro Pro Ala Ser Asp Arg Leu Arg Asn Glu Gln

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Met Ile Gly Gln Val Leu Leu Met Pro Lys Thr Ala Ser Ser Leu Gln

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Lys Trp Ala Arg Gln Gln Gly Ser Gly Gly Val Lys Val Thr Leu Asn

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Pro Val Ala Lys Ala Gln Asp Val Gly Ala Val Glu Ala His Val Val

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Cys Ser Val Ala Ala Asp Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Arg

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Ile Ala Val Val Ala Gly Leu Leu Thr Ser Ala Gly Asp Leu Pro Leu

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<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 9

Met Gln Gly Ala Gln Thr Ser Glu Asp Asn Leu Gly Ser Gln Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gly Pro Cys Gly Tyr Ile Tyr Phe Tyr Pro Leu Ala Thr Tyr Pro

20 25 30

Leu Arg Glu Val Ala Thr Leu Gly Thr Gly Tyr Ala Gly His Arg Cys

35 40 45

Leu Thr Val Pro Leu Leu Cys Gly Ile Thr Val Glu Pro Gly Phe Ser

50 55 60

Ile Asn Val Lys Ala Leu His Arg Arg Pro Asp Pro Asn Cys Gly Leu

65 70 75 80

Leu Arg Ala Thr Ser Tyr His Arg Asp Ile Tyr Val Phe His Asn Ala

85 90 95

His Met Val Pro Pro Ile Phe Glu Gly Pro Gly Leu Glu Ala Leu Cys

100 105 110

Gly Glu Thr Arg Glu Val Phe Gly Tyr Asp Ala Tyr Ser Ala Leu Pro

115 120 125

Arg Glu Ser Ser Lys Pro Gly Asp Phe Phe Pro Glu Gly Leu Asp Pro

130 135 140

Ser Ala Tyr Leu Gly Ala Val Ala Ile Thr Glu Ala Phe Lys Glu Arg

145 150 155 160

Leu Tyr Ser Gly Asn Leu Val Ala Ile Pro Ser Leu Lys Gln Glu Val

165 170 175

Ala Val Gly Gln Ser Ala Ser Val Arg Val Pro Leu Tyr Asp Lys Glu

180 185 190

Val Phe Pro Glu Gly Val Pro Gln Leu Arg Gln Phe Tyr Asn Ser Asp

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Leu Ser Arg Cys Met His Glu Ala Leu Tyr Thr Gly Leu Ala Gln Ala

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Leu Arg Val Arg Arg Val Gly Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Lys Gln

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Ser Leu Gln Asp Gln Ala Lys Val Ala Lys Val Ala Pro Leu Lys Glu

245 250 255

Phe Pro Ala Ser Thr Ile Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Leu Met Ile

260 265 270

Val Asp Ser Ala Ala Cys Glu Leu Ala Val Ser Tyr Ala Pro Ala Met

275 280 285

Leu Glu Ala Ser His Glu Thr Pro Ala Ser Leu Asn Tyr Asp Ser Trp

290 295 300

Pro Leu Phe Ala Asp Cys Glu Gly Pro Glu Ala Arg Val Ala Ala Leu

305 310 315 320

His Arg Tyr Asn Ala Ser Leu Ala Pro His Val Ser Thr Gln Ile Phe

325 330 335

Ala Thr Asn Ser Val Leu Tyr Val Ser Gly Val Ser Lys Ser Thr Gly

340 345 350

Gln Gly Lys Glu Ser Leu Phe Asn Ser Phe Tyr Met Thr His Gly Leu

355 360 365

Gly Thr Leu Gln Glu Gly Thr Trp Asp Pro Cys Arg Arg Pro Cys Phe

370 375 380

Ser Gly Trp Gly Gly Pro Asp Val Thr Gly Thr Asn Gly Pro Gly Asn

385 390 395 400

Tyr Ala Val Glu His Leu Val Tyr Ala Ala Ser Phe Ser Pro Asn Leu

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Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Tyr Leu Gln Phe Cys Gln Gly Gln Lys Ser

420 425 430

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Ser Thr Gln Arg Arg Asp Pro Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Gly Ser

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Tyr Asn Glu Thr Asp Phe Leu Gly Asn Phe Leu Asn Phe Ile Asp Lys

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Glu Asp Asp Gly Gln Arg Pro Asp Asp Glu Pro Arg Tyr Thr Tyr Trp

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Ala Glu Gly Lys Leu Glu Lys Glu Pro His Gly Pro Arg Asp Phe Val

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Lys Met Phe Lys Asp Val Asp Ala Ala Val Asp Ala Glu Val Val Gln

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Phe Met Asn Ser Met Ala Lys Asn Asn Ile Thr Tyr Lys Asp Leu Val

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Lys Ser Cys Tyr His Val Met Gln Tyr Ser Cys Asn Pro Phe Ala Gln

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Leu Asn Asn Ala Ile Leu Lys Ala Cys Gly Gln Thr Gln Phe Tyr Ile

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980 985 990

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<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

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Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala

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Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln

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Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu

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50 55 60

Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala

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Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala

85 90 95

Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala

100 105 110

Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro

115 120 125

Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala

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Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln

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<210> 11

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<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 11

Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp

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Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu

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<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 12

Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu

1 5 10 15

Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln

20 25 30

Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

35 40 45

Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile

65 70 75 80

Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

100 105 110

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly

115 120 125

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

130 135 140

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly

180 185 190

Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly

195 200 205

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala

210 215 220

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

245 250 255

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

260 265 270

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

275 280 285

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

305 310 315 320

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg

355 360 365

Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro

370 375 380

Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro

385 390 395 400

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

405 410 415

Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly

420 425 430

Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr

435 440 445

Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp

450 455 460

Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn

465 470 475 480

Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg

485 490 495

Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly

500 505 510

Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile

515 520 525

Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala

530 535 540

Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys

545 550 555 560

Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys

565 570 575

Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn

580 585 590

Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro

595 600 605

Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly

610 615 620

Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln

625 630 635 640

Glu

<210> 13

<211> 245

<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 13

Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val

20 25 30

Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu

35 40 45

Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr

50 55 60

His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro

65 70 75 80

Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro

85 90 95

Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu

100 105 110

Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val

115 120 125

Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile

130 135 140

Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg

145 150 155 160

Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu

165 170 175

Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys

180 185 190

Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser

195 200 205

Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser

210 215 220

Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu

225 230 235 240

Asp Leu Leu Asn Phe

245

<210> 14

<211> 605

<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 14

Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro

1 5 10 15

Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val

20 25 30

Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser

35 40 45

Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg

50 55 60

Glu Trp Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala

65 70 75 80

Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn

85 90 95

Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp

100 105 110

His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn

115 120 125

Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu

130 135 140

Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val

145 150 155 160

Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu

165 170 175

Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe

180 185 190

Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr

195 200 205

Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val

210 215 220

Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala

225 230 235 240

Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser

245 250 255

Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp

260 265 270

Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr

275 280 285

Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu

290 295 300

Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln

305 310 315 320

Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn

325 330 335

Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro

340 345 350

Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly

355 360 365

Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile

370 375 380

Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro

385 390 395 400

Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg

405 410 415

Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala

420 425 430

Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile

435 440 445

Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro

450 455 460

Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly

465 470 475 480

Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Arg Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala

485 490 495

Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr

500 505 510

Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro

515 520 525

Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Asn His Pro

530 535 540

Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met

545 550 555 560

Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu

565 570 575

Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His

580 585 590

Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe

595 600 605

Claims (12)

1.一种鼻咽癌抗体检测试剂，其特征在于，所述试剂包括EBV抗原，所述EBV抗原选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCAP18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原物理混合的抗原。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述物理混合的抗原以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在；

优选地，以抗原-固相载体偶联物的形式或者以抗原-发光标记偶联物的形式存在的所述物理混合的抗原中，可选的EA-D P54、可选的EA-D P138、可选的VCA P18、可选的VCAP23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，更优选地，按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)；

进一步优选地，所述固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，所述发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述EBV抗原为EA-D P54、EA-D P138、VCAP18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原重组表达的融合抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述融合抗原以融合抗原-固相载体偶联物的形式或者以融合抗原-发光标记偶联物的形式存在；

更优选地，所述固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，所述发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括抗人IgA抗体或抗人IgG抗体；

优选地，所述抗人IgA抗体为鼠抗人IgA抗体或羊抗人IgA抗体；所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体；

更优选地，所述抗人IgA抗体或抗人IgG抗体以抗体-固相载体偶联物或抗体-发光标记偶联物的形式存在；

进一步优选地，所述抗体-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，所述抗体-发光标记偶联物中的发光标记物为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。

7.一种鼻咽癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括鼻咽癌抗体检测试剂，其特征在于，所述鼻咽癌抗体检测试剂为权利要求1至6中任一项所述的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品和质控品；

优选地，所述校准品包括第一浓度校准品和第二浓度校准品，所述第二浓度校准品的浓度高于所述第一浓度校准品的浓度，更优选地，所述第一浓度校准品的浓度为0.1AU/mL～1AU/mL，进一步优选为0.326AU/mL，所述第二浓度校准品的浓度为5AU/mL～10AU/mL，进一步优选为6.132AU/mL；

优选地，所述质控品包括第一浓度质控品和第二浓度质控品，所述第二浓度质控品的浓度高于所述第一浓度质控品的浓度，更优选地，所述第一浓度质控品的浓度为1AU/mL～2AU/mL，进一步优选为1.414AU/mL，所述第二浓度质控品的浓度为5AU/mL～8AU/mL，进一步优选为6.132AU/mL。

9.一种权利要求1至6中任一项所述的鼻咽癌抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

制备选自EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原的EBV抗原。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，得到所述EBV抗原；

优选地，所述物理混合的步骤中，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原制备成抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记偶联物的形式进行物理混合；

更优选地，以所述抗原-固相载体偶联物或抗原-发光标记物偶联物的形式进行物理混合的步骤中，可选的EA-D P54、可选的EA-D P138、可选的VCA P18、可选的VCA P23、可选的NA1、可选的ZTA及可选的RTA按照如下工作浓度比进行混合：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10：0.2～5：0.2～5：0.4～10，更优选按照如下工作浓度比进行混合：1:(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7):(0.2～1):(0.2～1):(1～1.7)。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述物理混合的步骤包括：

先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原分别包被固相载体，形成各抗原对应的抗原-固相载体偶联物；再将所述各抗原对应的抗原-固相载体偶联物进行物理混合，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的所述EBV抗原；或者

先将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行物理混合，形成抗原混合物；再将所述抗原混合物包被固相载体，得到EBV抗原-固相载体偶联物形式的所述EBV抗原；

优选地，所述EBV抗原-固相载体偶联物中的固相载体为磁性微球、包板或塑料微球。

12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将EA-D P54、EA-D P138、VCA P18、VCA P23、NA1、ZTA及RTA中的至少三个抗原进行重组表达，得到融合的所述EBV抗原；

优选地，所述制备方法还包括：将所述融合的所述EBV抗原制备成融合抗原-固相载体偶联物形式或融合抗原-发光标记偶联物形式的抗原的步骤；

更优选地，所述固相载体为磁性微球、包板或塑料微球，所述发光标记为ABEI、金刚烷、吖啶酯或鲁米诺。