CN110894217B

CN110894217B - 一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

Info

Publication number: CN110894217B
Application number: CN201911293235.3A
Authority: CN
Inventors: 孟赓; 朱文壮; 孟凯闻; 唐振庭
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110894217A

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。本发明所述嵌合抗原序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了一种新型的牛冠状病毒嵌合抗原，作为牛冠状病毒抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中牛冠状病毒抗体，解决规模化奶牛场犊牛腹泻快速诊断问题，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

Description

一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。

背景技术

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)隶属于乙型冠状病毒科冠状病毒属2a群，可引起犊牛腹泻、成牛冬痢和牛的呼吸道疾病。感染奶牛产奶量下降，病愈犊牛生长发育受影响、成年期生长性能低于正常水平，且该病易与其他病毒混合感染并引发继发性细菌感染，从而表现出复杂的临床症状，为诊断及治疗带来极大困难。

BCoV为不分节段的单股正链RNA病毒，基因组表达五种结构蛋白，包括核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、纤突蛋白(S)、小衣壳蛋白和血凝素酯酶蛋白(HE)。目前国内外最常见的报道是以纯化牛冠状病毒N蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。

BCoV可通过粪口途径和呼吸道气溶胶传播，在集约化养牛场中一旦爆发则难以控制。目前BCoV在我国部分地区普遍流行，同时在牛群中与牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒混合感染严重，给当地养牛业造成巨大经济损失。然而，针对BCoV灭活疫苗与减毒活疫苗效果均不理想，同时临床尚缺乏能有效治疗BCoV的药物，因此BCoV的监测就成为了控制BCoV的重要环节。

BCoV的检测方法包括：病毒的分离培养鉴定，该方法由于BCoV对营养要求复杂、初代分离困难，故不适宜基层应用；电镜观察，BCoV易与粪便样品中的细小颗粒混淆，降低检出率；病毒中和试验(VN)，是鉴定BCoV的经典方法，虽然敏感、特异，但应用时操作复杂，成本昂贵；分子生物学检测技术，是近年研究较多发展较快的诊断方法，该方法敏感性、特异性高，但操作较为复杂，对仪器设备要求高；血凝(HI)与血凝抑制(HA)试验，操作相对简便，适用于流行病学调查，但结果常受初乳样品中的IgG和粪便中的IgA影响；荧光抗体技术(FA)，应用范围有限，操作复杂，不适宜临床快速诊断；酶联免疫吸附试验(ELISA)该方法具有灵敏、便捷的特点，已报道过利用单克隆抗体建立的竞争ELISA方法、针对IgM和IgA的捕获ELISA 方法、利用重组N蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法等。

相对而言，ELISA方法是目前基层应用最广的大规模快速诊断的方法之一，但ELISA实验对酶标仪精度，技术人员水平要求高，操作繁琐，耗时较长，不易现场大规模应用；并且其易受其他病毒或细菌引发的牛疾病的干扰。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牛冠状病毒嵌合抗原，使其应用于牛冠状病毒抗体检测时具备较高的特异性、重复性和准确性；

本发明的另外一个目的在于提供上述牛冠状病毒嵌合抗原在制备免疫层析检测产品中的相关应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种牛冠状病毒嵌合抗原，序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述嵌合抗原通过对NCBI网站牛冠状病毒N蛋白和S蛋白序列的分析研究，选择特别区域的基因设计牛冠状病毒嵌合抗原基因(SEQ ID NO:2所示)，同时进行序列优化并使用化学合成的方法合成牛冠状病毒嵌合抗原基因，然后通过原核表达的方式获得嵌合抗原。

所述嵌合抗原原核表达的方法如下：

将嵌合抗原基因插入pET28a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段，保持pET28a(+)的其它序列不变，构建得到牛冠状病毒嵌合抗原基因重组表达质粒pET28a-BCoV-NS，然后将其转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3) 筛选重组表达菌，重组表达菌经IPTG诱导表达牛冠状病毒嵌合抗原蛋白。

在本发明具体实施方式，利用所述嵌合抗原制备成胶体金免疫层析试纸卡，特异性试验结果显示，对己知的牛布鲁氏菌阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛轮状病毒阳性血清、牛疱疹病毒阳性血清及牛冠状病毒抗体阳性血清进行交叉试验，只有牛冠状病毒抗体阳性血清样本检测线和质控线均显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显红色，呈阴性反应，表明所述嵌合抗原用于检测牛冠状病毒抗体时具有高度的特异性。

同时，分别检测5份牛冠状病毒抗体阳性血清和5份牛冠状病毒抗体阴性血清(均经病毒中和试验验证)，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表明所述所述嵌合抗原用于检测牛冠状病毒抗体时具有较好的重复性和准确性。

基于上述试验结果，本发明提出了所述嵌合抗原在制备检测牛冠状病毒抗体的免疫层析产品中的应用。作为优选，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸卡。

依据所提出的应用，本发明提供了一种检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，其以SEQ ID NO:1所示序列的蛋白为检测抗原。

作为优选，所述试纸卡包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被SEQ ID NO:1 所示序列的牛冠状病毒嵌合抗原的检测线。其中，所述牛冠状病毒嵌合抗原在检测线上的喷涂量为1ul/cm，所述牛冠状病毒嵌合抗原的工作浓度为 5mg/ml。

作为优选，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗牛IgG抗体的质控线，所述兔抗牛IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm；所述兔抗牛抗体的工作浓度为2mg/ml。

作为优选，所述标记物垫喷涂有胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌蛋白A (SPA)的复合物，所述胶体金标记的SPA复合物在标记物垫上的喷涂量为 8uL/cm。在本发明具体实施方式中，所述胶体金与所述SPA在胶体金标记过程中的标记比含量为：2ml胶体金∶20ugSPA。

作为优选，所述背衬为聚乙烯背衬。

作为优选，所述试纸卡还包括装载卡壳。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种新型的牛冠状病毒嵌合抗原，作为牛冠状病毒抗体的检测抗原时，具备极高的特异性、重复性和准确性，能够应用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中牛冠状病毒抗体，解决规模化奶牛场犊牛腹泻快速诊断问题，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。

附图说明

图1所示为胶体金免疫层析试纸卡示意图；

图2所示为胶体金免疫层析试纸卡特异性分析；其中，1表示牛冠状病毒抗体阳性血清；2表示牛布鲁氏菌阳性血清；3表示牛口蹄疫O型阳性血清； 4表示牛病毒性腹泻病毒阳性血清；5表示牛轮状病毒阳性血清；6表示牛疱疹病毒阳性血清。

具体实施方式

本发明公开了一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述牛冠状病毒嵌合抗原以及胶体金免疫层析试纸卡已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述牛冠状病毒嵌合抗原以及胶体金免疫层析试纸卡进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

利用本发明胶体金免疫层析试纸卡检测，当被检血清样品中含有牛冠状病毒抗体时，胶体金标记的SPA与血清中牛冠状病毒抗体形成复合物一起层析移动，被喷涂在硝酸纤维素膜上T线位置的牛冠状病毒嵌合抗原蛋白捕获， T线形成金标SPA-牛冠状病毒抗体-牛冠状病毒嵌合抗原蛋白复合物，未结合的金标SPA-牛IgG继续运动到C线上，被兔抗牛IgG抗体捕获，形成金标 SPA-牛IgG-兔抗牛IgG 抗体复合物，此时，T线和C线均显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有牛冠状病毒抗体时，金标SPA-牛IgG复合物与T 线上牛冠状病毒重组嵌合抗原蛋白不反应，金标SPA-抗体复合物继续运动到 C线上，被兔抗牛IgG 捕获,形成金标SPA-抗体-兔抗牛IgG 复合物，T线不显色，而C线显示出肉眼可见的红色。结果判定：T线不显色，C线显红色，检测样品为阴性，T线和C线都显红色，检测样品为阳性，若C线和T线均不显色，则说明试纸卡失效。

以下就本发明所提供的一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡做进一步说明。

实施例1：本发明所述嵌合抗原的原核表达

1、牛冠状病毒嵌合抗原基因重组表达质粒pET28a-NS的构建

根据NCBI网站牛冠状病毒N蛋白和S蛋白序列进行保守性和抗原性分析，选择特别区域的基因设计牛冠状病毒嵌合抗原基因(SEQ ID NO:2所示)，同时进行序列优化并使用化学合成的方法合成牛冠状病毒嵌合抗原基因。将 pET28a(+)载体用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切体系为50uL：BamHI 和XhoI各1uL,载体片段20uL，10X酶切buffer 5uL，ddH2O23uL；酶切产物经过1％的琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。然后分别将酶切好的载体与嵌合抗原基因进行连接，构建10μL的连接体系：嵌合抗原基因片段5.5μL，pET28a 载体1.5μL，T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接缓冲液1μL。轻敲管壁，上下颠倒混匀之后离心，放置室温连接1h。连接产物用常规的化学法转化DH5α感受态细胞，用PCR方法对阳性克隆进行鉴定，将PCR鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序鉴定为阳性的质粒命名为pET28a-NS。

2、嵌合抗原蛋白的原核表达

将pET28a-NS重组质粒转化至BL21(DE3)细胞中。无菌条件下，取适量菌液加到LB(Kan+)固体培养基平板上，将菌液涂布均匀，待菌液完全吸收后，做好标记，倒置于37℃恒温培养箱中，过夜培养。挑取单克隆菌落分别进行菌液鉴定、酶切鉴定、菌液测序，确定pET28a-NS转化进了BL21(DE3) 中。取50μL含有pET28a-NS的BL21(DE3)菌液接种于50mlKan+LB培养基中，置37℃摇床中以210r/min过夜培养，第二天转接至1L LB液体培养基中，置37℃摇床中以210r/min培养120min至OD600nm值达0.4～0.6。加入终浓度为1mmol/L量的IPTG，置18℃190r/min过夜培养。

3、嵌合抗原蛋白的纯化

收集诱导后菌液1L，以6000r/min离心10min，弃上清，收集菌体，并用25mL含有5mM咪唑的Tris缓冲液重悬菌体，在130W功率的超声波的作用下冰浴裂解，有效时间为25min，工作时间为5s，间隔10s。将超声裂解物4℃12000r/min离心60min，保留上清。使用HisTrapHP层析柱对重组抗原进行纯化，用含有5mM咪唑的Tris缓冲液进行洗涤杂质，然后用含有500 mM咪唑的Tris缓冲液进行洗脱纯化，并将镍柱纯化的目的蛋白样品通过GE 公司生产的superdex 75凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化，收集分子筛精细纯化后的收集液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析和纯度分析，其蛋白纯度可达 95％以上。以此重组嵌合抗原作为检测用抗原。

实施例2：制备牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸卡

1、制备标记有金颗粒的SPA的金标结合物

取40nm胶体金颗粒2ml用0.1mol/L碳酸钾调节溶液调节pH至6.8，加入20ug金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，快速混匀并在3D旋转仪上室温混匀30min，然后加入终浓度1％BSA并在3D旋转混合仪上混匀30min，将金标液于4℃12000r/min离心10min，小心弃去上清液，沉淀物用0.01M PBS 缓冲液洗涤2次，再离心所得沉淀即为纯化的SPA金标复合物，制备的胶体金标记SPA用0.01M PBS重悬，4℃保存备用。

2、硝酸纤维素膜检测线和质控线喷洒及胶体金结合垫制备

将重组表达的牛冠状病毒嵌合抗原蛋白用0.01M PBS稀释成5mg/ml，用喷金划膜仪以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的T线位置。将兔抗牛IgG抗体用0.01M PBS稀释成2mg/ml，用喷金划膜仪以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的C线位置，然后放于37℃过夜烘干备用。用喷金划膜仪将SPA-胶体金复合物以8uL/cm均匀喷涂在标记物垫上，37℃过夜烘干备用。

3、试纸卡的组装

将样品垫、喷涂有SPA金标结合物的标记垫、喷涂有牛冠状病毒重组嵌合抗原作为检测线和喷涂有兔抗牛IgG 作为质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬上。其组装结构为硝酸纤维素膜置于聚乙烯背衬的上面，样品垫平贴于硝酸纤维素膜左侧，吸收垫平贴于硝酸纤维素膜右侧，胶体金结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于硝酸纤维素膜之上。将组装好的大板用切条机切成5mm胶体金试纸条，然后将试纸条与卡壳组装，真空封装，常温保存；示意图见图1。

4、检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡的应用

取100ul待测样品液滴在本发明试纸卡加样孔上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性血清样品和阴性血清样品分别作为阳性和阴性对照。结果判定：当加入检测样品时，若检测线和质控线均显红色，为牛冠状病毒抗体阳性，即样品中含有牛冠状病毒抗体；若检测线不显色而质控线显红色，为牛冠状病毒抗体阴性，即样品中不含牛冠状病毒抗体；若质控线不显色，则试纸卡无效。

实施例3：胶体金免疫层析试纸卡特异性试验

对己知的牛布鲁氏菌阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛轮状病毒阳性血清、牛疱疹病毒阳性血清及牛冠状病毒抗体阳性血清进行交叉试验，结果见图2。

图2结果显示，只有牛冠状病毒抗体阳性血清样本检测线和质控线均显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显红色，呈阴性反应，表明胶体金免疫层析试纸卡具有高度的特异性。

实施例4：胶体金免疫层析试纸卡重复性和准确性试验

将不同批次的所述免疫层析胶体金试纸分别检测5份牛冠状病毒抗体阳性血清和5份牛冠状病毒抗体阴性血清(均经病毒中和试验验证)，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表明所述胶体金免疫层析试纸卡具有良好的重复性和准确性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种牛冠状病毒嵌合抗原以及检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡

<130> MP1925395

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Arg Ala Ser Ser Gly Asn Arg Ser Gly Asn Gly Ile Leu Lys Trp

1 5 10 15

Ala Asp Gln Ser Asp Gln Ser Arg Asn Val Gln Thr Arg Gly Arg Arg

20 25 30

Ala Gln Pro Lys Gln Thr Ala Thr Ser Gln Gln Pro Ser Gly Gly Asn

35 40 45

Val Val Pro Tyr Tyr Ser Trp Phe Ser Gly Ile Thr Gln Phe Gln Lys

50 55 60

Gly Lys Glu Phe Glu Phe Ala Glu Gly Gln Gly Val Pro Ile Ala Pro

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Thr Glu Ala Lys Gly Tyr Trp Tyr Arg His Asn Arg

85 90 95

Arg Ser Phe Lys Thr Ala Asp Gly Asn Gln Arg Gln Leu Leu Pro Arg

100 105 110

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro His Ala Lys Asp Gln Tyr

115 120 125

Gly Thr Asp Ile Asp Gly Val Phe Trp Val Ala Ser Asn Gln Ala Asp

130 135 140

Val Asn Thr Pro Ala Asp Ile Leu Asp Arg Asp Pro Ser Ser Asp Glu

145 150 155 160

Ala Ile Pro Thr Arg Phe Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Gln Gly Tyr

165 170 175

Tyr Ile Glu Gly Ser Gly Arg Ser Ala Pro Asn Ser Arg Ser Thr Ser

180 185 190

Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ala Gly Ser Arg Ser Arg Ala Asn

195 200 205

Ser Gly Asn Arg Thr Pro Thr Ser Gly Val Thr Pro Asp Met Ala Asp

210 215 220

Gln Ile Ala Ser Leu Val Leu Ala Lys Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Thr Lys Gln Thr Ala Lys Glu Ile Arg Gln Lys Ile

245 250 255

Leu Asn Lys Pro Arg Gln Lys Arg Ser Pro Asn Lys Gln Cys Thr Val

260 265 270

Gln Gln Cys Phe Gly Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Gly Val Ile Phe Asn Ala Val Asp

290 295 300

Cys Lys Ser Asp Phe Met Ser Glu Ile Lys Cys Lys Thr Leu Ser Ile

305 310 315 320

Ala Pro Ser Thr Gly Val Tyr Glu Leu Asn Gly Tyr Thr Val Gln Pro

325 330 335

Ile Ala Asp Val Tyr Arg Arg Ile Pro Asn Leu Pro Asp Cys Asn Ile

340 345 350

Glu Ala Trp Leu Asn Asp Lys Ser Val Pro Ser Pro Leu Asn Trp Glu

355 360 365

Arg Lys Thr Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Met Ser Ser Leu Met Ser

370 375 380

Phe Ile Gln Ala Asp Ser Phe Thr Cys Asn Asn Ile Asp Ala Ala Lys

385 390 395 400

Ile Tyr Gly Met Cys Phe Ser Ser Ile Thr Ile Asp Lys Phe Ala Ile

405 410 415

Pro Asn Gly Arg Lys Val Asp

420

<210> 2

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccgtgcgt ctagcggtaa ccgttccggt aacggtattc tgaaatgggc tgatcagtcc 60

gatcagtccc gcaacgttca aacccgtggt cgtcgtgctc agcctaaaca gactgcgacc 120

tctcaacagc cgtccggcgg taacgtggtt ccgtactatt cctggttctc tggtattacc 180

cagtttcaaa aaggtaagga atttgaattc gctgaaggtc agggtgtacc gatcgcaccg 240

ggtgtacctg ctacggaagc aaaaggctac tggtaccgtc acaaccgtcg ttctttcaaa 300

accgctgacg gtaaccagcg tcagctgctg ccgcgttggt atttctacta cctgggcact 360

ggcccgcacg ctaaagacca gtacggcact gacattgatg gcgtcttctg ggttgcatcc 420

aaccaggcag atgttaacac cccggctgat atcctggatc gcgatccgtc ctctgatgaa 480

gctatcccaa cccgtttccc tccgggtact gttctgccgc agggctatta cattgagggc 540

tctggtcgct ccgcgccaaa ctctcgtagc acctctcgcg ctagctctcg tgcttcttct 600

gccggttctc gctctcgtgc taactctggt aaccgcactc cgacctctgg cgttactccg 660

gacatggctg atcagatcgc gagcctggtt ctggctaaac tgggcaaaga cgctactaag 720

ccacagcaag ttaccaaaca gaccgcgaaa gaaattcgcc agaaaatcct gaacaaaccg 780

cgtcagaaac gctctccgaa caaacaatgc actgtacagc agtgctttgg taaacgtggt 840

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttccggc ggtggtggtt ctcaggatgg tgttatcttt 900

aatgctgttg attgtaagtc tgacttcatg tccgaaatta agtgtaaaac tctgtccatc 960

gcaccgtcta ccggcgtcta cgaactgaat ggctacactg tgcagccgat cgcagatgtg 1020

taccgtcgta tcccgaacct gccggattgc aatatcgagg cctggctgaa cgataagagc 1080

gttccgagcc ctctgaactg ggaacgcaag accttctcta actgtaactt caacatgtcc 1140

agcctgatga gcttcatcca ggcggatagc ttcacctgca acaacatcga tgctgccaaa 1200

atctatggca tgtgtttctc ttctattacc attgataaat ttgctatccc gaacggtcgc 1260

aaggtggat 1269

Claims

1.一种牛冠状病毒嵌合抗原，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述嵌合抗原在制备检测牛冠状病毒抗体的免疫层析产品中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸卡。

4.一种检测牛冠状病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，以SEQ ID NO:1所示序列的蛋白为检测抗原。

5.根据权利要求4所述试纸卡，其特征在于，包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被SEQ ID NO:1所示序列的牛冠状病毒嵌合抗原的检测线。

6.根据权利要求5所述试纸卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上划有包被兔抗牛IgG抗体的质控线。

7.根据权利要求5所述试纸卡，其特征在于，所述标记物垫喷涂有胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌蛋白A的复合物。

8.根据权利要求5所述试纸卡，其特征在于，所述背衬为聚乙烯背衬。

9.根据权利要求4-8任意一项所述试纸卡，其特征在于，还包括装载卡壳。