CN113848319B

CN113848319B - 免疫法检测冠状病毒的横向流动检测装置

Info

Publication number: CN113848319B
Application number: CN202110367892.9A
Authority: CN
Inventors: 叶春生; 张振兴; 王桢煜; 侯鲁娜
Original assignee: Hangzhou Biotest Biotech Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Biotest Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN113848319A

Abstract

本发明提供了一种免疫法检测冠状病毒的横向流动检测装置，该检测装置包含两根横向流动测试条，通过测试条1针对N全长蛋白和/或S全长蛋白抗原的抗体检测，以及测试条2针对S‑RBD位点蛋白抗原的抗体检测，并联合检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体，进一步提高血清学抗体检测的检出率，可切实降低漏检、错检的可能性，全方位避免漏检，同时还可用于识别先天免疫和/或患病康复后免疫产生有效抗体，两条测试条互补效果显著。本发明提供的检测装置具有快速、简单、可靠、能尽最大程度防止漏检、操作简便、无需专业仪器和人员、易于临床推广应用等优点。同时，本发明还提供了两组用于制备快速检测新型冠状病毒的检测装置的抗原组合及其用途。

Description

免疫法检测冠状病毒的横向流动检测装置

本申请主张中国在先申请，申请号：2020103004847申请日2020年4月16日的优先权；主张美国临时申请,申请号:63/018,024,申请日2020年4月30日的优先权,其所有的内容作为本发明的一部分。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种免疫法快速检测新型冠状病毒的横向流动检测装置。

背景技术

目前用于新冠感染检测的方法主要有核酸检测法和免疫学检测法，核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是确诊新冠感染的“金标准”。但是受样本采集、RNA提取及检测设备条件要求较高的影响，容易出现假阴性，因此急需快捷的免疫学检测方法来弥补核酸检测假阴性容易造成漏诊的缺点。

2019-nCoV包含冠状病毒突蛋白(Spike，S)、囊膜蛋白(Envelope，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N)等结构。S蛋白可以与宿主细胞表面ACE2受体结合，是介导病毒入胞的重要结构蛋白，也是诱发中和抗体的主要抗原。通常S蛋白可被切割成两个部分S1和S2，其中S1介导病毒的附着，S2介导膜融合，RBD是S1结构的受体结合结构域。

CN111505277A公开了一种新型冠状病毒的检测试剂盒，试剂盒中包被了RBD和N抗原组合，用于IgG抗体的检测。该试剂盒中作为精准位点蛋白的RBD与核衣壳N蛋白进行了组合，容易存在交叉影响，而且仅进行抗体IgG的检测，进一步扩大了漏检、错检的可能性。

因此急需筛选更合适的抗原组合用于制备快速检测新型冠状病毒的检测装置，进一步降低检测漏检、错检的可能性，提高检测灵敏度，从而为疑似患者排查和无症状感染者筛查提供更可靠的现场检测手段，帮助预防疫情扩散。

发明内容

为弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种快速、简单、可靠、尽最大程度防止漏检的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置，该检测装置包含两根横向流动测试条，通过测试条1针对N蛋白(全长)和/或S蛋白(全长)抗原的抗体检测，以及测试条2针对S-RBD位点蛋白抗原的抗体检测，更全方位地覆盖新型冠状病毒的各个可能使人体产生抗体的位点，进一步提升血清学抗体检测的检出率，从而避免造成漏检，而且检测速度快，操作简便，无需专业仪器和人员，易于临床推广应用。

新型冠状病毒一开始入侵人体时，主要靠病毒上的突刺蛋白S蛋白与人体细胞的ACE2受体结合，在实际结合中并不是简单的S蛋白突刺插到ACE2上，而是S蛋白被宿主蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等)裂解为S1亚基和S2亚基，S1和S2会和受体结合膜融合，其中S1里包含这受体结合域RBD，RBD才是与ACE2结合的关键核心所在。因此可见S-RBD位点蛋白的抗体与S全长蛋白的抗体并不一定是同时存在的，单独检测S-RBD位点蛋白抗原产生的抗体或是单独检测S全长蛋白产生的抗体产生的抗体，都有可能存在漏检，非常有必要同时分别检测针对S全长蛋白产生的抗体，和S-RBD位点蛋白产生的抗体。S1亚基可进一步分成两个相对独立的区域(domain)，分别是N-端区域(N-terminal domain，NTD)和C-端区域(C-terminal domain，CTD)。S1包含有受体结合域(receptor binding domain，RBD)，大部分的冠状病毒S蛋白的RBD都位于CTD，例如SARS-CoV和MERS-CoV等。只有少部分β冠状病毒的RBD位于NTD(通常NTD结合糖类受体，CTD结合蛋白类受体)。从这些似乎可以看出，如果仅仅检测RBD抗原的抗体，可能造成漏检，如果配合监测全长S蛋白的抗体，则可以更全面的检测出病毒产生的所有的抗体。

N蛋白是新型冠状病毒中含量最丰富的蛋白，具有高度保守性，它与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关，因此N蛋白可用作新型冠状病毒诊断检测工具，是免疫学快速诊断试剂的核心原料。但是由于N蛋白是在新型冠状病毒入侵体内之后才发挥作用，单独检测N全长蛋白的抗体仍然存在漏检风险，非常有必要与刚开始入侵时即发挥作用的S全长蛋白进行联合检测，从而减少漏检的可能性。

同时S-RBD位点为新型冠状病毒的受体结合域，是与人体细胞ACE2受体结合的关键核心所在，是决定新型冠状病毒感染能力的重要片段。针对S-RBD位点蛋白的抗体是众多有效抗体里效率最高的，单独检测S-RBD位点蛋白的抗体可以提高检测准确度和效率，同时还可用于识别先天免疫和/或患病康复后免疫产生有效抗体，产生包含性抗体，能直接作用于刺突蛋白中的RBD片段，直接阻止病毒侵染细胞。而S全长或者N蛋白都没有这样的功能)。但是S-RBD位点蛋白作为精准位点蛋白，若与全长抗原(例如S或者其它N抗原)放在一条测试条进行检测，都处理在检测反应区，容易产生交叉反应，没有相互补充的作用，不仅降低了检测有效抗体的作用，而且还容易导致漏检，而且，不能识别先天免疫和/或患病康复后免疫产生有效抗体。先天免疫就是被病毒感染后，自己机体产生抗体，但是可以表现为没有症状，但是病毒仍然存在机体内，可能具有传染性，而患病康复后的抗体，则表示曾经被病毒感染，但是具有抗体的存在，表示患者处于康复状态。

本发明意外发现，在第一测试条用于检测N蛋白(全长)和/或S蛋白(全长)抗原的抗体或者全长抗原的基础上，联合第二份测试条2检测针对S-RBD位点产生的最有效的抗体或者RBD抗原，则可产生互补效果，从而全方位避免漏检，同时还可用于识别先天免疫和/或患病康复后免疫产生有效抗体，效果显著。

这里的抗体，可以包括这些抗原对应的IgM或者/和IgG抗体。这些抗体可以存在于血液、唾液、肺部、喉咙等分泌物中，血液包括血清、血浆或者全血样本。研究表明，新型冠状病毒在侵入人体后，首先在5-7天出现IgM抗体，随后在10-15天出现IgG抗体。因此，IgM抗体增高提示近期急性感染，IgG抗体增高提示既往感染。联合本发明提供的两根测试条中的两组抗原蛋白，并进一步联合检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体，可切实降低漏检、错检的可能性，全方位避免漏检。

当然，通过调整标记区和检测区的抗体，或者抗原的种类，本发明的提供的测试装置也可以用于新型冠状病毒抗原的检测。例如可以在第一检测试剂条上检测RBD抗原，在第二试剂条上检测全长N抗原或者/和全长S抗原。检测抗原的抗体或者其它能够与抗原结合的受体都可以用来检测抗原。

本发明所述的两组抗原组合既可以是天然抗原，也可以是通过常规基因工程技术表达后得到的重组抗原。但是都需要分开检测，而不能混合在一起，具体分开检测意义在本申请中下面进行详细的解释。

所以，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供了用于检测冠状病毒的横向流动检测装置，其中，该装置包括第一和第二横向流动测试条，其中第一横向流动测试条包含用于检测新型冠状病毒的S全长蛋白抗原的抗体和/或N全长蛋白的抗体，第二横向流动测试条包含用于新型冠状病毒的S-RBD位点蛋白抗原的抗体。在有一些方式中，所述的抗体包括IgM或者/和IgG抗体。

在一些方式中，第二横向流动测试条包含用于冠状病毒的S-RBD位点蛋白抗原的IgM或者/和IgG抗体。

在一些方式中，第一横向流动测试条包含用于检测新型冠状病毒的S全长蛋白抗原或者/和N全长蛋白抗原的IgM或者/和IgG抗体。在一些方式中，是S蛋白或者N蛋白的IgM和IgG抗体。在一些方式中，N蛋白和S蛋白混合形成一个检测区域。在一些方式中，检测N蛋白和S蛋白的IgG为一个检测区域；检测N蛋白和S蛋白的IgM为另一个检测区域，两个检测区域或者其中一个位于同一个测试条上。而检测RBD抗原的抗体的试剂位于另一个不同的测试条上，该测试条包括抗IgG或者IgM的抗体。

所述的S全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，N全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，S-RBD位点蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供了一种免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置，所述检测装置包含第一测试条和第二测试条，其中所述第一测试条上含有S全长蛋白抗原和/或N全长蛋白抗原；所述第二测试条上含有S-RBD位点蛋白抗原。

1、QHR63250-nCov-S RBD-263aa：

MPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFHHHHHHHH(SEQ ID NO：1).

2、QHN73817-nCov N-419aa：(N蛋白全长)

MHHHHHHSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID NO：2).

3、S蛋白全长氨基酸序列

1mfllttkrtmfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhst

61qdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttld

121sktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyv

181sqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpi

241ginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdc

301aldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvy

361awnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqia

421pgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdiste

481iyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkst

541nlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcs

601fggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcli

661gaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnns

721iaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgia

781veqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtlada

841gfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgag

901aalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdv

961vnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqq

1021liraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaq

1081eknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvig

1141ivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevak

1201nlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscg

1261scckfdeddsepvlkgvklhyt(SEQ ID NO：3)

进一步地，所述第一测试条或第二测试条都分别包含样品区、标记区和检测区，按照液体流动方向依次排列，其中包被在标记区的物质可随液体流动，并且该物质需偶联标记物质；检测区设有检测线，包被在检测区的物质需固定在检测线；所述抗原可被包被在标记区或检测区。

标记区的可随液体流动的物质，偶联标记物质，待流动到检测线，被检测线上的抗体或抗原捕获，从而形成带有颜色的线条。检测线包被的物质是固定不动的。所述的标记物质，可以是荧光、或者带有颜色的颗粒，例如乳胶、金颗粒，或者带有颜色的水溶性物质。

进一步地，所述第一测试条或第二测试条上还可含有抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体；并且当所述抗原被包被在标记区时，所述抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体则被包被在检测区。或者，当所述抗原被包被在检测区时，所述抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体则被包被在标记区，能够随着样本一起流动。

所述的抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体，即所需检测的抗体IgM或者IgG的抗体，可以采用鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体、兔抗人IgM抗体、兔抗人IgG抗体等等，只要能够特异性捕获待检测的抗体IgM或者IgG即可。

第一检测条的S全长蛋白抗原和/或N全长蛋白抗原可以包被在标记区并偶联标记物，在与样品中的IgM或IgG结合后，随液体一起流动至检测区，并被包被在检测线的抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体捕获并显色，从而得到检测结果；反之当抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体包被在标记区并偶联标记物时，可与样品中的IgM或IgG结合后，随液体一起流动至检测区，并被包被在检测线的S全长蛋白抗原和/或N全长蛋白抗原捕获并显色，从而得到检测结果。

同样，第二检测条的S-RBD位点蛋白抗原可以包被在标记区并偶联标记物，在与样品中的IgM或IgG结合后，随液体一起流动至检测区，并被包被在检测线的抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体捕获并显色，从而得到检测结果；反之当抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体包被在标记区并偶联标记物时，可与样品中的IgM或IgG结合后，随液体一起流动至检测区，并被包被在检测线的S-RBD位点蛋白抗原捕获并显色，从而得到检测结果。

进一步地，所述检测区可设有一条或多条检测线，所述检测线分别用于检测IgG和IgM中的任意一种或两种。

当设置一条检测线时，用于检测IgG和IgM的总和，只要IgG或IgM中有一个是阳性，即为阳性结果；当设置两条检测线时，可分别用于检测IgG和IgM，其中有一个是阳性，即为阳性结果，且IgM抗体增高提示近期急性感染，IgG抗体增高提示既往感染；当设置两条检测线时，在同一个测试条中还有一种情况，就是一条检测线用于检测N全长蛋白的抗体(包括IgG和IgM的总和)，另一条检测线用于检测S全长蛋白的抗体(包括IgG和IgM的总和)。

当然，通过调整标记区和检测区的抗体种类，本发明的提供的测试装置也可以用于新型冠状病毒抗原的检测。此时的一条或多条检测线可以分别用于检测不同的抗原。

进一步地，所述第二测试条上的S-RBD位点蛋白抗原被包被在标记区，所述抗人IgG的抗体和抗人IgM的抗体分别被包被在检测区的不同检测线上。

测试条2中的S-RBD位点蛋白抗原被包被在标记区，抗人IgG的抗体和抗人IgM的抗体分别被包被在检测区的不同检测线上，可以分别检测IgG和IgM，在防漏检的基础上，还可用于高效判断先天免疫和/或康复后免疫产生有效抗体，进一步发挥测试条2的作用。

进一步地，所述第一测试条上，当标记区包被S全长蛋白和/或N全长蛋白的抗体的第一抗体时，检测区可固定抗S全长蛋白和/N全长蛋白的抗体的第二抗体，或者检测区也可以固定抗S全长蛋白和/或N全长蛋白抗体的第一抗体的第二抗体。

检测N全长蛋白或者S全长蛋白的抗体可以利用双抗夹心的直接方法，也可以利用间接法，在这里N全长蛋白或者S全长蛋白的抗体(样本里，例如血液中)实际上可以认为是抗原。检测N或S全长蛋白的抗体的时候，可以与标记物偶联抗N或S全长蛋白的抗体，在检测区域固定抗N全长蛋白的抗体的第二抗体，所谓双抗夹心法。当然，可选的，可以标记物偶联抗N全长蛋白抗体的第一抗体，在检测区域固定抗第一抗体的第二抗体，所谓的间接法。

还有一些方式，如果测试条2的仅用于防漏检时，也可以采用上述抗体设置方法，当标记区包被S-RBD位点蛋白的抗体的第一抗体时，检测区可固定抗S-RBD位点蛋白的抗体的第二抗体，或者检测区也可以固定抗S-RBD位点蛋白抗体的第一抗体的第二抗体。

进一步地，所述检测区还设有质控线。质控线可设置能与标记区物质反应形成带标记的复合物的物质，一般可采用羊抗鸡IgY抗体、羊抗鼠IgG抗体等等。

进一步地，所述第一测试条或第二测试条还包含吸水区，用于递加缓冲液。

吸水区也可称为缓冲溶液递加区，其中的缓冲液可采用缓冲溶液PBS等。

再一方面，本发明提供了两组抗原组合用于制备免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的用途，其中第一组包含新型冠状病毒的S全长蛋白抗原和/或N全长蛋白抗原，第二组包含新型冠状病毒的S-RBD位点蛋白抗原；所述的S全长蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，N全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，S-RBD位点蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的制备方法：

(1)检测区：采用硝酸纤维素膜，用缓冲溶液PBS溶解检测线抗体，然后利用点膜的设备在硝酸素膜上划线，让不同抗体之间距离3-8毫米，然后把硝酸纤维素膜放在烘箱里烘干备用。

(2)样品区：采用样本施加垫，样本施加垫的材质是玻璃纤维。

(3)标记区：准备金颗粒标记的抗原或抗体，然后通过喷洒的设备，把标记混合物喷洒在聚酯膜上，制成标记垫。

(4)吸水区：吸水垫采用一般的吸水滤纸。

(5)组装：让样本施加垫的一端叠加在标记垫上，让标记垫叠加到硝酸纤维膜上，让控制线的一端的硝酸纤维膜被吸水滤纸叠加上，这样就形成了整个检测试纸条，然后被装配在检测卡中，其中，检测卡上的加样孔对应样本施加垫上，硝酸纤维膜对应度数窗口。

本发明提供的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的使用方法为：

取适量样品滴加到检测装置的样品区，静置一段时间后，根据检测线和质控线的显示情况，判断样品中是否含有新型冠状病毒抗体，其中检测线的颜色对比与标准的比色卡对比，如果颜色度数值小于3则判断为阴性，大于或者等于3则判断为阳性。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供了一种免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置，该检测装置包含两根横向流动测试条，通过测试条1针对N蛋白(全长)和/或S蛋白(全长)抗原的抗体或者抗原的检测，以及测试条2针对S-RBD位点蛋白抗原的抗体检测，并联合检测新型冠状病毒IgG和/或IgM抗体，进一步提高血清学抗体检测的检出率，可切实降低漏检、错检的可能性，全方位避免漏检，同时还可用于识别先天免疫和/或患病康复后免疫产生有效抗体，两条测试条互补效果显著。本发明提供的检测装置具有快速、简单、可靠、能尽最大程度防止漏检、操作简便、无需专业仪器和人员、易于临床推广应用等优点。同时，本发明还提供了两组用于制备快速检测新型冠状病毒的检测装置的抗原组合及其用途。

附图说明

图1是本发明一个实施方式的示意图，对于不同组合检测IgG和IgM的检测，每一个测试条上具有两条检测钱。

图2是本发明另一个实施方式的示意图，对于不同组合中，RBD用于检测IgG和IgM的检测，而对于N和S，分别检测N抗原的抗体或者S抗原的抗体，或者N抗原或者S抗原。

图3是本发明另一个实施方式的示意图，对于不同组合中，RBD用于检测IgG和IgM的检测，而对于N和S，分别检测N抗原的抗体或者S抗原的抗体；或者N抗原或者S抗原。

图4是本发明另一个实施方式的示意图，对于不同组合中，RBD用于检测IgG和IgM的检测，而对于N+S，检测N抗原的抗体或者S抗原的抗体，或者N抗原或者S抗原，只要样本中存在一个N或者S对应的抗体，或者N或者/和S抗原，具有一条检测线(T)。

图5是本发明是实施例子3的检测结果照片图，是如图3所示的示意图而实际的检测结果(阳性样本1-10的结果图)(检测S和N的抗体，S和N在同一个测试条上分开，表示S检测线和N检测线，用于检测血液中的S抗原或者N抗原对应的抗体IgG和/或者IgM)。

图6是本发明是实施例子3的检测结果照片图，是如图3所示的示意图而实际的检测结果图(阳性样本11-20的结果图)(检测S和N的抗体，S和N在同一个测试条上分开，表示S检测线和N检测线)。

图7是本发明是实施例子3的检测结果照片图，是如图3所示的示意图而实际的检测结果图(阴性样本1-10的结果图)(检测S和N的抗体，S和N在同一个测试条上分开，表示S检测线和N检测线，用于检测血液样本中是否存在S或者N抗原对应的抗体)。

图8是本发明一个实施例子2的检测结果照片图，是如图1所示的示意图而实际的检测结果图(阳性样本1-10的结果图)(RBD是用于检测血液中的IgM和IgG抗体；N+S抗体，分别对应IgM检测线和IgG检测线，只要存在两种抗原中任何一种抗体，都会出现阳性结果)。

图9是本发明所使用的判读T线条颜色浓度或者深浅的标准比色卡。

图10和图11是本发明实施例子4的具体检测结果图。

详细说明

下面对本发明涉及的结构或技术术语做进一步的说明，如果没有特别指明，按照本领域的通用的一般术语进行理解和解释。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本发明的方式是如何实现的，并不能对本发明构成任何的限制，本发明的范围由权利要求进行限定和表达。

检测

检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在。所述的物质或材料例如、但并不限于化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测还可以表示测试物质或材料的数量。化验还表示免疫检测、化学检测、酶检测等。

样本

本发明中，检测装置所使用的样本包括生物液体。样本的初始状态可以是液态、固态或半固态的，固态或半固态的样本可以通过任何适当的方法转化成液态样本，例如混合、捣碎、浸软、孵育、溶解、酶解等等，然后倒入收集腔中，通过测试元件检测样本是否含有被分析物。样本可以取自人体、动物、植物、自然界等。取自人体的样本，例如可以是血液、血清、尿液、脑脊髓液、汗液、淋巴液、唾液、胃液等液态样本；粪便、毛发、角质、牙垢、指/趾甲等固态或半固态的样本。取自植物的样本，例如可以是根、茎、叶等固态样本；由根、茎、叶制备的组织液、细胞液等液态或半固态样本。取自自然界的样本，例如可以是雨水、河水、海水、地下水等液态样本；土壤、岩石、矿石、石油等固态或半固态样本。

在一些方式中，本发明所述的样本为血清或者全血或者血浆，或者检测抗原的时候，样本来自咽拭子样本，鼻拭子或者肺部样品。

测试装置

测试装置中一般包括测试元件，所谓的测试元件指的是能够对待测样本中的被分析物质进行检测的部件。测试元件对被分析物质的检测可以基于任何技术原理，例如免疫学、化学、电学、光学，分子学、物理学等。本发明的测试元件可以是一种，也可以是两种以上测试元件的组合。测试元件具有用于显示检测结果的检测区，进行检测之后、检测区显示检测结果。

各种测试元件可以被组合在一起运用到本发明中。一种形式是检测试纸。用于分析样本中的被分析物(如毒品或表明身体状况的代谢物)的检测试纸可以是各种形式，如免疫测定或化学分析的形式。检测试纸可以采用非竞争法或竞争法的分析模式。检测试纸包含一具有样本加样区的吸水材料，试剂区和测试区。加样本至样本加样区，通过毛细管作用流到试剂区。在试剂区，如果存在被分析物，样本与试剂结合。然后样本继续流动到检测区。另一些试剂，如与被分析物特异性结合的分子被固定在检测区。这些试剂与样本中的被分析物(如果存在)反应并将被分析物结合在该区，或者与试剂区的某一个试剂结合。用于显示检测信号的标记物存在与试剂区或分离的标记区。

典型的非竞争法分析模式是如果样本中含有被分析物，信号就会产生，如果不包含被分析物，就不产生信号。在竞争法中，如果被分析物不存在于样本中，信号产生，如果存在被分析物，则不产生信号。

测试元件可以是检测试纸，可以选用吸水或不吸水的材料。检测试纸可包括多种材料用于液体样本传递。其中一种检测试纸的材料可覆盖在另一种材料上，如滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上。检测试纸的一个区可以选用一种或多种材料，而另一区选用其他不同的一种或多种材料。检测试纸可以被黏附在某种支持物或者硬质表面用于提高拿捏检测试纸的强度。

被分析物通过信号发生系统而被检测到，如利用与本分析物发生特异性反应的一种或多种酶，利用如前述将特异结合物质固定在检测试纸上的方法，将一种或多种信号发生系统的组合物固定在检测试纸的被分析物检测区。产生信号的物质可在加样区，试剂区，或检测区，或整个检测试纸上，该物质可以充满检测试纸的一种或多种材料上。将含有信号物的溶液加到试纸的表面或将试纸的一种或多种材料浸没在含信号物的溶液中。使加入含信号物溶液的试纸干燥。

检测试纸的各个区可以按以下方式排列：加样区，试剂区，检测区，控制区，确定样本是否掺假区，液体样本吸收区。控制区位于检测区之后。所有的区可以被安排在只用一种材料的一条试纸上。也可是不同区采用不同的材料。各个区可以直接和液体样本接触，或不同的区依据液体样本流动的方向排列，将各区的末端与另一区的前端相连并交叠。所用的材料可以是吸水性较好的材料如滤纸，玻纤或者硝酸纤维素膜等。检测试纸也可以采用其他形式。

一般常用的试剂条为硝酸纤维素膜试剂条，即检测区域包括硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果；还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等。例如如下一些专利描述的试剂条或含有试剂条的装置：US 4857453；US 5073484；US5119831；US 5185127；US 5275785；US 5416000；US 5504013；US 5602040；US 5622871；US5654162；US 5656503；US 5686315；US 5766961；US 5770460；US 5916815；US 5976895；US6248598；US 6140136；US 6187269；US 6187598；US 6228660；US 6235241；US 6306642；US6352862；US 6372515；US 6379620；和US 6403383。以上专利文献所公开的测试条以及带有测试条的类似装置都可以被运用到本发明的测试元件或者检测装置中进行被分析物质的检测，例如样本中被分析物质的检测。

运用到本发明的检测试剂条可以是通常所说的横向侧流试剂条(Lateral flowtest strip)，这些检测试剂条的具体结构和检测原理在现有技术中是本领域一般技术人员公知的技术。普通的检测试剂条，包括样本收集区域，标记区域，检测区域和吸水区域，样本收集区域包括样本接受垫，标记区域包括标记垫，吸水区域可以包括吸水垫，其中检测区域上包括能检测是否含有被分析物质的必要化学物质,例如免疫试剂或者酶化学试剂。一般常用的检测试剂条为硝酸纤维素膜试剂条，即检测区域包括硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果；还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等，当然，在检测区域的下游还可以包括检测结果控制区域，通常，控制区域和检测区域上以横线的形式出现，为检测线或者控制线。这样的检测试剂条是传统的试剂条，当然，也可是其他利用毛细作用进行检测的其它类型的试剂条。另外，一般检测试剂条上带有干化学试剂成分，例如固定的抗体或者其他试剂，当遇到液体后，液体随着毛细作用沿着试剂条流动，随着流动，让干的试剂成分溶解于液体，从而到下一个区域处理在该区的干试剂发生反应，从而进行必要的检测。液体流动主要通过毛细作用进行的。这些测试元件见如下文件的描述和记载：李福刚的《硝酸纤维素膜的再生处理及其吸附蛋白能力的研究》；马红艳，李强等的《胶体金诊断试剂盒中层析膜材料性能的分析》；王勇，王路海等的《一种新型胶体金免疫层析试纸条》。在这里都可以被运用到本发明的检测装置中，或者被设置在检测腔中与液体样本接触，或者用来检测进入检测腔中的液体样本中被分析物质是否存在或者存在的数量。

这里的检测装置包括两个横向流动测试条，一个用于检测RBD对应的血液样本的IgG和IgG抗体，或者用于检测咽拭子、鼻拭子、肺液、或者痰液、鼻涕中的病毒抗原，例如RBD抗原；或者，S或者N蛋白抗原的存在。另一个测试条用于检测S或者N蛋白对应的血液IgG和或者IgG；或者用于检测咽拭子、鼻拭子、肺液、或者痰液、鼻涕中的病毒抗原S或者N蛋白抗原的存在。

冠状病毒

这里所述的“冠状病毒”包括以下病毒：严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和新冠感染(COVID-19)。虽然他们在流行病学方面存在一定的差异。在全球，10％～30％的上呼吸道感染由HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1四类冠状病毒引起，在造成普通感冒的病因中占第二位，仅次于鼻病毒。感染呈现季节性流行，每年春季和冬季为疾病高发期。潜伏期2-5天，人群普遍易感，主要通过人与人接触传播。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明提供的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的制备

本实施例制备的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置如图1和图5所示，包括测试条1和测试条2，测试条1和测试条2的结构大致相同，按照液体流动方向,从砂上游到下游,依次为样品区，其包括加样孔S和缓冲液孔B，这两个加样孔位于样品区上、标记区，检测区，吸水区；其中吸水区采用一般的吸水滤纸作为吸水垫制备；样品区采用样本施加垫，样本施加垫的材质是玻璃纤维，这样通过加样孔S添加的样本流到玻璃纤维上，然后通过B孔添加的缓冲液流到玻璃纤维上，然后与样本混合流入到标记垫上；标记区制成标记垫，包括标记颗粒(例如金颗粒，乳胶颗粒或者染料，或者其它带有颜色的标记物质)偶联的抗原或抗体，然后通过喷洒的设备，把标记混合物喷洒在聚酯膜上，制成标记垫，标记垫上的标记物质能够随着液体的流动而流动；检测区采用硝酸纤维素膜，用缓冲溶液PBS溶解检测线的抗体或者抗原，然后利用点膜的设备在硝酸素膜上划线，让不同抗体之间距离3-8毫米，然后把硝酸纤维素膜放在烘箱里烘干备用，被处理在膜上的抗体、抗原或者其它结合物质一般是不移动的。

分别完成吸水区、样品区、标记区、检测区的制备后，再进行组装，让样本施加垫的一端叠加在标记垫的一端上，让标记垫的另一端叠加到硝酸纤维膜上，让控制线的一端的硝酸纤维膜被吸水滤纸叠加，这样就形成了整个检测试纸条，然后被装配在检测卡中，其中检测卡上的加样孔S和缓冲液孔B对应样本施加垫上，硝酸纤维膜对应度数窗口，另外加样孔S位于缓冲液孔B的下游。

实施例2：测试条1标记区包被全长S蛋白抗原和N蛋白抗原，测试条2标记区包被 RBD抗原。

本实施例的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的制备方法参照实施例1的方式，仅仅是标记垫和检测线上的试剂不同。

对于测试条1：在硝酸纤维素膜上，质控线处包被或者固定羊抗鸡IgY抗体，IgG检测线上包被或者固定鼠抗人IgG抗体，IgM检测线上包被或者固定鼠抗人IgM抗体；标记垫上包被胶体金标记的全长S蛋白和全长N蛋白(抗原)与胶体金标记的鸡IgY抗体(用于质控线)。在处理标记的时候，S全长蛋白与N全长蛋白的质量比是20：1-5:1。这里的S全长蛋白与N全长蛋白的质量比是20：1(图1示意图中的右边测试条)。

测试条2，在硝酸纤维素膜上，质控线处包被或者固定羊抗鸡IgY抗体，IgG检测线上包被鼠抗人IgG抗体，IgM检测线上包被鼠抗人IgM抗体，标记垫上包被胶体金标记的RBD抗原与胶体金标记的鸡IgY抗体。IgG检测线用于检测样本中的IgG，IgM检测线用于检测样本中的IgM，按照实施例子1上的检测区域处理的方式处理(图1示意图中的左边测试条)。

测试条1的检测原理是：如果血液样本存在S蛋白或者N全长蛋白(抗原)的抗体(IgG or IgM),则标记垫上的抗原就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒-S蛋白或者N全长蛋白(抗原)-IgG or IgM(样本)，再被检测线上固定的人IgG的抗体，或者人IgM的抗体捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-S蛋白或者N全长蛋白(抗原)-IgG orIgM(样本)-人IgG的抗体，或者人IgM的抗体)(间接方法)。对于N或者S蛋白，只要其中一个或者两个在人体类具有感染而产生抗体，则都会被检测出。

测试条2的检测原理是：如果血液样本存在S蛋白-RBD(识别区域)的抗体(IgG orIgM)，则标记垫上的抗原就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒-S蛋白-RBD-IgG or IgM，再被检测线上固定的人IgG的抗体，或者人IgM的抗体捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-S蛋白-RBD(抗原)-IgG or IgM(样本)-人IgG的抗体，或者人IgM的抗体)。

测试条1和测试条2分别放置在一个检测卡里，同时向样品施加孔S滴加(正方形的孔)阳性血液样本或者阴性血液样本，并向另一个孔递B加缓冲溶液(圆形孔)：缓冲溶液的成分是磷酸缓冲液，PH＝7.4。对20份阳性样本P1-P20(这些阳性样本经过临床确认的阳性样本：样本是经过咽拭子样本核酸测试为含有冠状肺病毒)和20份阴性样本N1-N20(经过临床确认的样本-样本是经过咽喉样本(咽拭子)核酸测试为不含有冠状肺病毒为阴性的样本)进行检测，获得的检测结果如表1所示：

表1：实施例2检测结果

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检测线的颜色浓度或者深度与标准的比色卡(图9)进行对比(比色卡也是不同浓度下的阳性结构线条的浓度，具有G1到G10不同的颜色深度而形成了梯度)，如果检测线条的颜色度数值小于3(G3)则判断为阴性，大于或者等于3(G3)的则判断为阳性。具体结果见图8的部分阳性结果，阴性结果没有显示。

由表1可见，对于阴性样本N1-N20，测试条1和测试条2的读数值都为1，表示都为阴性，与实际样本的结果一致，和核酸检测的结果一致。对于阳性样本P1-P20，如果只采用标记的颜色颗粒的RBD抗原(测试条2)进行检测，对于IgG来讲，在5个确认为阳性结果的样本中具有5个阴性结果(P1、P2、P11、P13和P18)；而N+S(测试条1)的测试结果中，对于IgG来讲，5个阳性样本中具有3个阴性结果(P11、P13和P18)，其它的样本为阳性结果(P1、P2)。说明N+S的检测至少可以多检测出2个样本为阳性。IgG为感染后或者治愈后出现的抗体，则说明仅仅检测RBD所产生的IgG抗体，则会出现漏检的现象。这可能是，核酸阳性样本是采用咽拭子样本，而本发明采用的而是血液样本，一般血液产生抗体是在感染后的几天才产生，例如一般，最早是IgM，其次才是IgG。如果对于仅仅采用RMD抗原来检测抗体，则会造成IgG的漏检，则可能认为这些样本虽然IgM是阳性，但是IgG是阴性，则会造成不适合或者错误的治疗措施的。

结合下面IgM的结果来讲，对于P2样本来讲，采用RBD抗原进行抗体的检测，无论IgM和IgG都出现了阴性结果，这样就会认为该患者是阴性，不会进一步进行核酸确认的检测，而是造成漏检，从而引发更大范围传染性，或者可以传染健康人权。相反，如果采用N+S的方式进行补充检测，则让P2样本为阳性，至少检测的IgG为阳性，虽然认为IgG的意义是患者康复的标志或者曾经感染过的标志，则至少可以改变治疗策略或者医疗策略或者防护策略，例如可以进行核酸的确认检测体内是否存在病毒。

对于P1样本来讲，N+S组合检测对于IgM和IgG都是阳性，如果仅仅单独用RBD检测，则IgM是阳性，而IgG是阴性，至少说明仅仅RBD检测是不全面的，不能获得全面的评估。而采用N+S可以全面评估患者感染情况。

而对于IgM来讲，采用RBD的抗原和N+S的抗原出现一样的结果，都为2个阴性(P2和P14)，但其中检出的读数值存在差异，有些样本采用测试条1检测结果度数值更高(如P3、P4、P13、P15等)，有些样本采用测试条2检测结果更高(如P1、P6、P10、P16等)。这说明，在有些样本中，N+S在血液中总体的抗体浓度高，而对于RBD的抗体的浓度低，或者，对于某些样本来讲，RBD的抗体浓度高，而N+S抗体的浓度低。至少可以说明，当一些样本处于不确定状态的时候，例如处于色卡读数值3.0-3.5之间的时候，如果单单用一个指标，例如仅仅用RBD、或者仅仅是N或者S来检测，就处于结果不确定状态。但是，如果联合检测，从各自的不同测试结果上，可以相互进一步确认检测结果的可靠性，避免漏检，或者避免假阴性或者假阳性，特别是假阴性。

比如，类似具有如P17的样本的时候，用RBD检测，出现6(IgG)和4(IgM)的结果，而用N+S检测的时候，出现7(IgG)和5(IgM)的结果，刚刚具有一个色差等级的差异。如果遇到类似的样本，样本抗体含量或者抗体与抗原的结合能力相对P17样本中弄滴更低的时候，用RBD检测的时候，可能出现5(IgG)和3(IgM)的结果，这个时候会认为IgM为阴性。但是采用N+S作为补充检测的时候，则判读结果可能是5(IgG)和4(IgM)的结果，则认为IgM为阳性。更有稍微极端的例子，当用RBD单独检测的时候，出现2(IgG)和2(IgM)的结果，则认为该样本就是阴性，但是如果利用N+S补充检测，则如果出现3(IgG)和3(IgM)的结果，则可能认为该样本的患者感染了病毒或者极有可能感染了病毒，至少可以提醒检测者，该样本的患者需要进行进一步的确然检测，例如核酸确认检测。

这是因为，在对新冠感染和传播途径上，可以倾向于该患者感染过新冠，处于急性感染期，而需要进行进一步的确认或者隔离治疗，让本来是阴性的结果更加确定为阳性。当然，在这个时候，可以进行咽拭子或者血液样本的核酸检测，进行进一步的确认检测。毕竟有些病毒携带者，本身并不表现症状，但是具有传染性。这样，尽可能的能够获得准确的检测结果，可以正确的采用恰当的措施进行进一步的处理，做好防护措施。

综合上述说明，同时检测IgG和IgM时，测试条2会对P2和P14造成漏检，如果采用测试条1进行补充检测，可以完全避免漏检；对于检测IgG来讲，如果采用测试条1和测试条2一起检测，可以避免IgG抗体的漏检，增加检测的全面性，防止漏检；对于检测IgM来讲，虽然在此处检测结果中由于测试条1和测试条2都已全部检出IgM的阳性结果，而导致防漏检效果不明显，但不可否认测试条1和测试条2同样具有互补作用，若碰到弱阳样本时(IgM抗体含量比比较低的时候)，通过测试条1和测试条2读数值的差异进行互补检测，也将明显起到防漏检的作用。如果仅仅通过RBD抗体的检测，可能出现阴性的结果的概率就会很高，如果采用N+S作为补充检测，则就会出现阳性结果，弥补了RBD抗体检测的天然缺陷(RBD对一些样本出现弱阳性结果)。

我们经过大量的实验，当采用RBD单独检测的时候，随机选取了50个血液样本进行检测，具有5个样本出现弱阳性(都对于IgG和IgM)，读数值大约在3或者接近3，而采用N+S检测的时候，都出现阳性结果，读数结果在4-5之间。这5个样本的患者采用核酸测试，样本是咽拭子样本，都确认为阳性结果。这就进一步确认，单独联合检测可以进行有益的补充确认。

实施例3测试条1检测区包被全长S蛋白和N蛋白，测试条2标记区包被RBD抗原。

本实施例的免疫法检测新型冠状病毒的横向流动检测装置的制备方法参照实施例1。测试条1，在硝酸纤维素膜上，质控线处包被或者固定羊抗鼠IgG抗体，N检测线上包被全长N蛋白(抗原)，S检测线上包被全长S蛋白(抗原)，标记垫上包被胶体金标记的鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体(过量)。其中测试条1的N检测线检测得到的是抗原N全长蛋白的抗体(包括IgG和IgM)，S检测线检测得到的是抗原S全长蛋白的抗体(包括IgG和IgM)。也就是说，对于N或者S抗原，只要样本中含有N抗原的IgG或者IgM，或者S抗原的IgG或者IgM，都会在N检测钱上出现阳性结果，反之则为阴性结果。

测试条2，在硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鸡IgY抗体，IgG检测线上包被鼠抗人IgG抗体，IgM检测线上包被鼠抗人IgM抗体，标记垫上包被胶体金标记的RBD抗原与胶体金标记的鸡IgY抗体。测试条2的IgG检测线用于检测IgG，IgM检测线用于检测IgM。

测试条1的检测原理是：如果血液样本存在S蛋白或者N全长蛋白的抗体(IgG orIgM),则标记垫上的抗体就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒-鼠抗人IgG抗体或鼠抗人IgM抗体-IgG or IgM(样本)，再被检测线上的全长N蛋白或全长S蛋白捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-鼠抗人IgG抗体或鼠抗人IgM抗体-IgG or IgM(样本)-S蛋白或者N全长蛋白)。

测试条2的检测原理是：如果血液样本存在S蛋白-RBD的抗体(IgG or IgM)，则标记垫上的抗原就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒－S蛋白-RBD-IgG or IgM，再被检测线上固定的人IgG的抗体，或者人IgM的抗体捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-S蛋白-RBD(抗原)-IgG or IgM(样本)-人IgG的抗体，或者人IgM的抗体)。

测试条1和测试条2分别放置在一个检测卡里，同时向样品施加孔递加阳性血液样本，并向另一个孔递加缓冲溶液：缓冲溶液的成分是磷酸缓冲液，PH＝7.4。对20份阳性样本P1-P20(经过临床确认的阳性样本)和20份阴性样本N1-N20(经过临床确认的样本)进行检测，获得的检测结果如表2所示：

表2：实施例3检测结果

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其中，检测线的颜色与标准的比色卡进行对比，如果颜色度数值小于3则判断为阴性，大于或者等于3的则判断为阳性。

由表2可见，对于阴性样本N1-N20，测试条1和测试条2的读数值都为1，表示都为阴性，与实际样本的结果一致。

对于阳性样本P1-P20，测试条2会对P2造成漏检，测试条1中的N蛋白抗原则可对其进行补充，防止漏检；但若单独检测N蛋白抗体，将会造成3个样本的漏检(P11、P13、P19)，此时S蛋白抗体或是测试条2的RBD抗体检测IgM则能提供补充，防止漏检；若单独检测S蛋白抗体，也将会出现2个样本的漏检(P2、P14)，也需要N蛋白抗体或是测试条2的RBD抗体检测IgG则能提供补充，防止漏检。可见测试条1的N蛋白、S蛋白，以及测试条2的RBD蛋白三者之间都具有互补作用，能起到有效减少漏检的可能性，符合真实的情况。换句话说，仅仅采用RBD的抗体来进行检测，则对于标本P2造成漏检，而采用N+S组合的方式进行检测，虽然有些样本仅仅依靠N来检测会造成阴性，或者仅仅依靠S来检测，也会造成一些样本的阴性。但是综合N+S结合起来看(不单独区分N和S各自的检测率)，则具有100％的阳性检测率，与实际阳性结果一直。一般核酸检测为新冠病毒检测的金标准，只要血液样本里或者咽拭子样本里含有新冠病毒，和通过核酸检测就能确定。而通过抗体检测，一般是感染病毒后的一定时间内，比如首先在5-7天出现IgM抗体，随后在10-15天出现IgG抗体。则抗体的产生具有滞后性。如果在多于5天后采集的样本，对于抗体检测可能出现阴性结果，如果只用RBD检测的话，无论如何都可能出现漏检，而采用N+S联合检测的话，则与核酸检测的结果100％一致性。

实施例4：

测试条2标记区包被RBD抗原，测试条1中的检测区域只有一个检测线，在上固定有N和S全长蛋白的抗原的抗体。具体处理与实施例子3中的测试条1不用的就是，不区分N和S，把N和S抗原混合处理在标记区域，采用同样的样本进行检测，获得如下的检测结果。

表3：实施例4的检测结果

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从以上表格的检测结果来看，如果是阳性结果，采用N+S的方式，100％的阳性结果，而仅仅采用RBD的检测方式，并不能获得100％的检测率，而会造成漏检。这似乎说明，N+S方式的检测与核酸结果具有非常高的一致性，符合度为100％。从另一个侧面说明，采用N+S联合或者混合抗原的抗体作为检测线，可以有效检测出患者是否具有新冠感染，而仅仅采用RBD的抗原来检测血液中的抗体，则可能造成漏检，例如对于标本P2来讲，核酸检测为阳性，而RBD的检测，无论IgG还是IgM都为阴性结果。而采用N+S的检测，结果却为阳性结果，而且是强阳性结果(度数值为7.5)，则说明RBD与N+S联合检测，可以克服RBD天然的漏检缺陷(具体检测结果见图10和11)。

实施例5：利用抗体来检测咽试子样本中的抗原。

试条1上的标记垫：处理有金标记的抗RBD抗原的第一单克隆抗体(AB-RBD)，检测线上固定有抗该单克隆抗体的AB-RBD的抗体。当咽试子样本中含有RBD抗原的时候，则第一单克隆的抗体结合RBD抗原形成金标-AB-RBD-RBD的复合物质，当复合物质运动到硝酸纤维素膜上的抗AB-RBD的抗体区域上，则形成抗AB-RBD的抗体捕获金标-AB-RBD-RBD复合物而显示出颜色线条。当然检测线上可以固定抗RBD抗原的第二单克隆抗体(双抗体夹心方法)。采用同样的道理，可以用来检测S抗原，或者检测S+N抗原。当检测N+S抗原的时候，金标记的抗S抗原的第一单克隆抗体(AB-S)和金标记的抗N抗原的第一单克隆抗体(AB-N)，两个标记混合在一起或者分别标记后，分别喷洒在标记垫上。在检查线上固定S抗原的第二单克隆抗体和抗N抗原的第二单克隆抗体。只要样本里含有N或者S抗原片段，都会在检测线上出现阳性结果。对于临床确认的感染有新冠病毒患者的10个血液样本进行检测，获得如下的检测结果。

表4：实施例5的检测结果

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从以上检测结果可以看出，对于10份阳性样本，使用RBD或者S全长抗原，都不能有效进行检测，造成一个样本的漏检(漏检率几乎是10％)，而采用N抗原或者与N抗原联合S抗原的检测，没有漏检。从另外一个方面说明，如果单独采用N抗原的检测，则也可以获得100％的检测率。这似乎说明，单独采用N全长抗原的检测，在对于阳性检测率方面，比采用单独的RBD更加有效果。但是，对于实际检测来看，检测RBD抗体或者抗原的则更多，这可能是都认为RBD是引起感染的主要感染区域，与细胞的ACE2区域结合，从而引起传染细胞，缺忽略了对于N或者S全长序列的检测，全长序列的检测，可以检测更多的位点，这些位点都有可能引起免疫应答，刺激机体产生抗体，一般RBD是作为关键位点，但是同时单独检测其它蛋白的位点，可以有效避免漏检，提高检测率，从而有效控制传染风险。

实施例子6：不同时期的血液样本的检测效果。

检测试剂条1:该测试条与与实施例子2的测试条一样，对于不同时期血液样本的监测，出现不同的检测结果。硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG或羊抗鸡IgY抗体，IgG检测线上包被鼠抗人IgG抗体，IgM检测线上包被鼠抗人IgM抗体，标记垫上包被胶体金标记的S蛋白-RBD(只包括RBD位点的抗原)与胶体金标记的鸡IgY抗体(控制线)。检测原理是:如果血液样本存在S蛋白-RBD的抗体(IgG or I gM),则标记垫上的抗原就会结合样本里的抗体形成：S蛋白-RBD-IgG or I gM-金属颗粒，然后被固定的人IgG的抗体，或者人IgM的抗体捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果。

表5：实施例6的检测结果(检测试剂条1)

仅仅只检测S-RBD位点的抗体，对于10个阳性样本(核酸确认咽拭子)，对于早期或者中期，都具有漏检的存在，而且，越是早期，漏检的机会就越大。

检测试剂条2:该测试条与与实施例子2的测试条一样，对于不同时期血液样本的监测，出现不同的检测结果。硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG和/或羊抗鸡IgY抗体，IgG检测线上包被鼠抗人IgG抗体，IgM检测线上包被鼠抗人IgM抗体，标记垫上包被胶体金标记的全长S蛋白和全长N蛋白(抗原)与胶体金标记的鸡IgY抗体。

表6：实施例6的检测结果(检测试剂条2)

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检测原理是:如果血液样本存在S蛋白或者N全长蛋白的抗体(IgG or I gM),则标记垫上的抗原就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒-S蛋白或者N全长蛋白(抗原)-IgG orI gM(样本)，然后被固定的人IgG的抗体，或者人IgM的抗体捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-S蛋白或者N全长蛋白(抗原)-IgG or I gM(样本)-人IgG的抗体，或者人IgM的抗体)。

从以上结果可以看出，检测全长S和N蛋白，比仅仅只检测S-RBD位点，更加符合实际的情况，减少了漏检的可能性。

检测试剂条3:该测试条与实施例子2的测试条一样，对于不同时期血液样本的监测，出现不同的检测结果。硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG，S检测线上包被全长S蛋白，N检测线上包被全长N蛋白，标记垫上包被胶体金标记的鼠抗人IgG和鼠抗人IgM抗体。

表7：实施例6的检测结果(检测试剂条3)

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从以上可以说明，检测N全长序列可以作为S-RBD全长序列的补充检测或者结合检测，降低了漏检率。

检测原理是:如果血液样本存N全长蛋白的抗体(IgG or I gM),则标记垫上的鼠抗人IgG和鼠抗人IgM抗体就会结合样本里的抗体形成：金属颗粒-鼠抗人IgG和鼠抗人IgM抗体(标记)-IgG or I gM(样本)，然后被固定的人N蛋白捕获颗粒复合物，而形成阳性或者阴性结果(金属颗粒-鼠抗人IgG和鼠抗人IgM抗体(标记)-IgG or I gM(样本)-N蛋白)。

检测试剂条4:硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG和/或羊抗鸡IgY抗体，S检测线上包被全长S蛋白，N检测线上包被全长N蛋白，标记垫上包被胶体金标记的全长S蛋白和全长N蛋白与胶体金标记的鸡IgY抗体。

表8：实施例6的检测结果(检测试剂条4)

检测原理是：如果样本中存在S蛋白或者N蛋白的抗体，则与标记垫上形成：标记物质-S蛋白或者N蛋白-抗体(样本里)，在检测区域分别固定的S蛋白后者N蛋白捕获形成：标记物质-S蛋白或者N蛋白-抗体(样本里)-S蛋白后者N蛋白。

检测试剂条5:硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠的IgG和/或羊抗鸡IgY的抗体，检测线(T)上包被全长S蛋白(抗原)和全长N蛋白(抗原)，标记垫上包被胶体金标记的全长S蛋白和全长N蛋白与胶体金标记的鸡IgY的抗体。

表9：实施例6的检测结果(检测试剂条5)

同时检测S和N，也可以降低单独检测S-RBD的漏检率，让检测结果更加接近真实的情况。

检测试剂条6：硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG和/或羊抗鸡IgY抗体，检测线(T)上包被全长S蛋白，标记垫上包被胶体金标记的全长S蛋白与胶体金标记的鸡IgY抗体。

表10：实施例6的检测结果(检测试剂条6)

检测试剂条7:硝酸纤维素膜上，质控线处包被羊抗鼠IgG和/或羊抗鸡IgY抗体，检测线(T)上包被全长N蛋白(抗原)，标记垫上包被胶体金标记的全长N蛋白与胶体金标记的鸡IgY抗体。

表11：实施例6的检测结果(检测试剂条7)

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以上试剂条即可以单独检测，也可以使用试剂条1与试剂条2～7进行两两组合，联合检测，如图一至图四。从以上实验至少可以说明，对于全长S或者N蛋白的检测，可以作为仅仅检测S-RBD的一个有效的补充，可以有效减少漏检的可能性，符合真实的情况。

本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里的所谓的“一个”仅仅表示“一”的意思，而不排除仅仅只是包括一个，也可以表示包括2个以上。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。

Claims

1.一种免疫法检测冠状病毒的横向流动检测装置，其特征在于，包含第一测试条和第二测试条，其中所述第一测试条上含有S全长蛋白抗原和/或N全长蛋白抗原；所述第二测试条上含有S-RBD位点蛋白抗原；或者；所述第一测试条上含有结合S全长蛋白抗原或N全长蛋白的抗体；所述第二测试条上含有结合S-RBD位点蛋白抗原的抗体；所述的S全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，N全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，S-RBD位点蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的冠状病毒为新冠病毒。

2.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于，所述第一测试条或第二测试条都分别包含样品区、标记区和检测区，按照液体流动方向依次排列，其中包被在标记区的物质可随液体流动，并且该物质需偶联标记物质；检测区设有检测线，包被在检测区的物质需固定在检测线；所述抗原可被包被在标记区或检测区。

3.如权利要求2所述的检测装置，其特征在于，所述第一测试条或第二测试条上的检测区固定有抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体；并且当所述抗原与带有颜色颗粒的标记物质偶联并被处理在标记区域上；或者，当所述抗原被固定在检测区时，所述抗人IgG的抗体和/或抗人IgM的抗体则与带颜色颗粒的标记物质偶联并则被包被在标记区。

4.如权利要求3所述的检测装置，其特征在于，所述检测区可设有第一和第二条检测线，所述第一和第二检测线分别用于检测样本中IgG或IgM。

5.如权利要求4所述的检测装置，其特征在于，所述第二测试条上的S-RBD位点蛋白抗原被包被在标记区，所述抗人IgG的抗体和抗人IgM的抗体分别被固定在检测区的第一和第二检测线上。

6.如权利要求4所述的检测装置，其特征在于，所述第一测试条上的N或者/和S蛋白抗原被包被在标记区，所述抗人IgG的抗体和抗人IgM的抗体分别被固定在检测区的第一和第二检测线上。

7.如权利要求2所述的检测装置，其特征在于，所述检测区还设有质控线。