CN1902230A - 抗sars病毒抗体、产生该抗体的杂交瘤和使用该抗体的免疫测定试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供特异性识别SARS病毒的单克隆抗体，还公开了使用检测SARS病毒的该单克隆抗体的免疫测定方法、免疫测定试剂或免疫测定工具。本发明的单克隆抗体是针对引起严重急性呼吸综合症(Severe acute respiratory syndrome；SARS)的冠状病毒的核蛋白的单克隆抗体。

Description

抗SARS病毒抗体、产生该抗体的杂交瘤和 使用该抗体的免疫测定试剂

技术领域

本发明涉及引起严重急性呼吸综合症(Severe acute respiratorysyndrome；SARS)的冠状病毒(以下称为SARS)的衣壳蛋白(以下称为“核蛋白”)的单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤、使用上述单克隆抗体作为固相抗体和/或标记抗体的SARS病毒免疫测定试剂或免疫测定工具。

背景技术

2002年至2003年，世界各地报道了重症肺炎患者，出现了感染患者以及众多的死亡患者。从患者体内分离的病毒被命名为SARS病毒，已确认为新型的冠状病毒。该SRAS病毒的全部基因序列已由加拿大不列颠哥伦比亚省的Michael Smith Genome Sciences Center解读(非专利文献1)。

SARS感染者被病毒感染，在2天至7天的潜伏期后出现超过38度的高热、咳嗽、头痛、呼吸困难等。SARS感染者的症状看起来与流感症状相似，为了确定适当的处置方式，需要在早期判定是否为SARS病毒感染。目前已报道的诊断是否SARS病毒感染的方法有以下的方法。

1)通过ELISA进行的抗体测定法：可在临床症状表现后约第20天以后检测出SARS患者血清中的抗体(IgM/IgA)。

2)免疫荧光抗体法：使用SARS病毒感染VERO细胞的免疫荧光抗体法(检测出IgM)。发病约10天后可检测血清中的抗体。

3)PCR法：从血液、粪便、呼吸道分泌物等各种试样中扩增SARS病毒基因并检测。

4)细胞培养法：用SARS患者试样(呼吸道分泌物、血液)中的病毒去感染VERO细胞等的培养细胞并检测。

非专利文献1：科学(Science)；2003年5月30日；300(5624)：1394-9

发明内容

目前为止，作为确定SRAS病毒感染的方法，在抗体检查法中必须是在感染第10天后才可确定，并且可靠性高的荧光抗体法的操作特别繁杂。另外，PCR法需要分离SARS相关基因并扩增，必须有特殊的扩增装置、测定装置，难以称其为简便的测定方法。并且，细胞培养法难以一次性处理较多的试样，虽然可以判别有否感染冠状病毒，但只用该方法不是特定判断是否感染了SARS病毒的方法。对于识别SARS病毒的抗体，人们总是希望具有更优异的特异性和亲和性。

本发明鉴于上述现状，其目的在于提供特异性识别SARS病毒的单克隆抗体，还提供使用检测SARS病毒的该单克隆抗体进行的免疫测定方法、免疫测定试剂或免疫测定工具。

本发明人致力于获得具有SARS病毒特异性且具有高亲和性的抗SARS病毒单克隆抗体，结果，利用PCR法合成多聚核苷酸，由此得到SARS病毒的核蛋白基因，采用基因重组技术，制备了含有该基因的转化体，使用由此得到的SARS病毒的核蛋白作为免疫原，对动物实施免疫，得到了目标单克隆抗体。本发明人还使用该单克隆抗体开发了免疫测定试剂。

即，本发明提供针对引起严重急性呼吸综合症(Severe acuterespiratory syndrome；SARS)的冠状病毒的核蛋白的抗SARS病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段。本发明还提供杂交瘤，该杂交瘤是产生上述本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可通过使抗SARS病毒单克隆抗体产生细胞与肿瘤细胞进行细胞融合来获得。本发明还提供引起SARS的冠状病毒的免疫测定试剂，该试剂是在固相抗体和标记抗体的至少一方中使用上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段。本发明又提供引起SARS的冠状病毒的免疫测定工具，该工具具有在可传输液体的基质上固定有抗SARS抗体的检测区域、在上述基质上可移动地点加(点着する)标记抗SARS抗体的标记试剂区域，固定于上述检测区域的抗体和标记抗SARS抗体的至少一方为上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段。本发明还提供SARS病毒的免疫测定方法，该方法包含利用上述本发明的抗SARS病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段与受检试样中的SARS病毒的抗原抗体反应进行免疫测定，由此测定受检试样中的SARS病毒。

本发明的单克隆抗体对SARS病毒的核蛋白的特异性和亲和性高，因此可作为高灵敏度的SARS病毒的免疫测定法。本发明的杂交瘤可提供特异性识别SARS病毒的单克隆抗体。使用本发明的单克隆抗体的免疫测定试剂只需通过简便的操作即可无遗漏地只检测含有SARS病毒的试样或来自SARS患者的试样。

附图简述

[图1]是表示本发明的实施例中使用的、作为免疫原使用的核蛋白表达用质粒pW6A的限制酶图谱。

[图2]是模式性地表示在本发明的实施例中表达的重组蛋白(S-N)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的图。

[图3]是表示在本发明的实施例中进行的表示单克隆抗体(rSN-18抗体、rSN-122抗体、rSN-150抗体)的反应性的蛋白质印迹法的结果的图。

[图4]是表示在本发明的实施例中进行的表示单克隆抗体(rSN-21-2抗体、rSN-29抗体、rSN-122抗体)的反应性的蛋白质印迹法的结果的图。

[图5]是本发明的采用免疫层析法的免疫测定工具的一个具体例子的模式截面图。

实施发明的最佳方案

如上所述，本发明的单克隆抗体是针对引起SARS的冠状病毒的核蛋白(即衣壳蛋白)(以下简称为“核蛋白”)的单克隆抗体。这里，“针对核蛋白的单克隆抗体”是指与核蛋白发生抗原抗体反应的单克隆抗体。因此，不仅是以核蛋白作为免疫原而制备的单克隆抗体，即使是以核蛋白的部分区域或核蛋白或者其部分区域的突变体为免疫原而制备的单克隆抗体，只要是与核蛋白发生抗原抗体反应的单克隆抗体都包含在本发明的范围内。

众所周知，用木瓜蛋白酶分解或胰蛋白酶分解，可得到如Fab片段或F(ab’)₂片段等具有与对应抗原的结合性的抗体片段(本说明书中称为“抗原结合性片段”)，本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段也可以与本发明的单克隆抗体同样地使用，包含在本发明的范围内。

本发明的单克隆抗体可以使用核蛋白作为免疫原来获得。核蛋白的氨基酸序列是公知的(非专利文献1)，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核酸的碱基序列如SEQID NO.1所示。因此，本发明的单克隆抗体可以使用具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽作为免疫原来获得。还可以是SEQ ID NO.2的氨基酸序列的天然突变体。核蛋白可以无需纯化为高纯度，即使是粗制纯化物也可以作为免疫原使用。在免疫原不受影响的范围内，SEQID NO.2所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端附加其它的氨基酸序列得到的蛋白质也可以作为免疫原使用。或者也可以将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的部分区域作为免疫原使用。从特异性的观点看，所述部分区域优选含有10个或以上的氨基酸。部分区域的大小上限是低于总长，不过氨基酸数量为10个-50个、优选15个-30个左右的肽可以诱使本发明的单克隆抗体产生。例如，下述实施例表明：使用SEQ ID NO.3(含有SEQ ID NO.2的氨基酸244-260和半胱氨酸的序列)所示的肽作为免疫原，可得到本发明的单克隆抗体。这样的大小比较小的肽可以使用市售的肽合成仪容易地进行化学合成，因此很方便。众所周知，这样的大小比较小的肽通过与例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等载体蛋白结合，作为免疫原使用，更可提高抗原性。

免疫原优选使用具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核蛋白或其部分区域、特别优选核蛋白全长，不过，使用SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其部分区域中的少数氨基酸置换和/或缺失、以及/或者有少数氨基酸插入的多肽作为免疫原，也可以诱使本发明的单克隆抗体产生。所述免疫原的氨基酸序列优选与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其部分区域具有尽可能高的同一性，同一性优选为90％或以上，进一步优选95％或以上。氨基酸序列的同一性可使用BLAST等周知的计算机软件容易地计算出来，所述软件可通过计算机网络提供使用。并且，少数的氨基酸置换、缺失和/或插入时，置换、缺失和/或插入的氨基酸总数优选为1个至数个。构成天然蛋白质的20种氨基酸可以分成：具有低极性支链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、ala、Met、Pro)、具有亲水性支链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Arg、Lys、His)、芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)等具有相似性质的组，如果是在它们各组内置换，则免疫原的性质大多不会实质性变化。

上述作为免疫原使用的SARS病毒的核蛋白例如可通过采用了以下的基因重组技术的方法获得。

通过PCR法扩增编码核蛋白的基因区(SEQ ID NO.1)，由此得到编码实质含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的DNA片段。即，例如从SARS病毒中提取RNA，实施RT-PCR。即，分别通过RT-PCR扩增由N蛋白基因的5’末端至限制位点NheI的区(5’末端附加限制位点、例如EcoRI的识别序列)、和由限制位点NheI至N蛋白基因的3’末端的区(3’末端附加限制位点、例如BamHI的识别序列)。接着，将各片段用限制酶处理，进行连接，由此可得到编码实质含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的DNA片段。再将该DNA片段插入适当的表达载体，可以制备表达载体。另外的方法是，可根据上述碱基序列，通过化学合成，得到编码实质含有序列表的SEQ ID NO.2或3的氨基酸序列的多肽的DNA片段。将这样的得到的DNA片段整合到具有氨苄青霉素抗性基因等适当的标记基因的表达载体中，由该载体转化大肠杆菌等宿主，可得到转化体。培养该转化体，纯化培养物，可得到上述SARS病毒的核蛋白。另外，如果是含有SEQ ID NO.3所示序列的多肽，则可通过化学合成装置，按照公知的合成方法获得。

上述抗SARS病毒单克隆抗体可如下产生：用上述免疫原免疫动物，通过常规方法，将由该动物得到的抗核蛋白抗体产生细胞和肿瘤细胞进行细胞融合，通过由此得到的杂交瘤来产生上述抗体。

上述杂交瘤例如可通过以下的方法获得。即，将如上所述得到的核蛋白与弗氏完全佐剂一起分数次、间隔2-3周、腹腔内或静脉内给予小鼠等动物，由此进行免疫。接着，使抗体产生细胞和肿瘤细胞融合，其中所述抗体产生细胞来自由免疫的动物获得的脾脏等，肿瘤细胞是选自骨髓瘤细胞株等的无限增殖性细胞的骨髓瘤细胞等可在试管内增殖的肿瘤细胞。

上述融合方法例如可按照Khler和Milstein的常规方法(自然、256卷、495页、1975年)，采用聚乙二醇法，或可采用仙台病毒法等。

从上述融合的细胞中选择产生识别SARS病毒的核蛋白的抗体的杂交瘤的方法例如可如下进行。即，从上述融合的细胞中选择在HAT培养基中存活的细胞作为杂交瘤。接着使上述杂交瘤的培养基在固定有高纯度纯化的SARS病毒的核蛋白的测定板上反应。再将该测定板与抗小鼠免疫球蛋白(Ig)等反应。通过所述EIA法等，可以选择产生特异性识别SARS病毒的核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的杂交瘤只要是产生特异性识别核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤即可，没有特别限定，例如有本发明人通过上述方法建立的6种杂交瘤。

上述6种杂交瘤分别命名为杂交瘤rSN-18、杂交瘤rSN-122、杂交瘤rSN-150、杂交瘤rSN-21-2、杂交瘤rSN-29和杂交瘤SN5-25。上述各杂交瘤保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心[地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6]，其中杂交瘤rSN-18的保藏号是FERM P-19572(保藏日：2003年10月24日)、杂交瘤rSN-122的保藏号是FERM P-19573(保藏日：2003年10月24日)、杂交瘤rSN-150的保藏号是FERM P-19574(保藏日：2003年10月24日)、杂交瘤rSN-21-2的保藏号是FERM P-19619(保藏日：2003年12月26日)、杂交瘤rSN-29的保藏号是FERM P-19620(保藏日：2003年12月26日)。这些杂交瘤于2004年10月18日转为国际保藏，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心[地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6]，其中杂交瘤rSN-18的保藏号是FERM BP-10143、杂交瘤rSN-122的保藏号是FERM BP-10144、杂交瘤rSN-150的保藏号是FERM BP-10145、杂交瘤rSN-21-2的保藏号是FERM BP-10146、杂交瘤rSN-29的保藏号是FERM BP-10147。

上述各杂交瘤可在通常用于细胞培养的培养基中培养。可从该培养上清中回收单克隆抗体。单克隆抗体还可如下获得：将杂交瘤移植到杂交瘤来源动物种的腹腔内，待增殖后采集腹水，由其纯化。

上述单克隆抗体的回收方法可以使用通常实行的纯化方法，例如有凝胶过滤色谱法、离子交换层析法、通过A蛋白进行的亲和层析等。

上述单克隆抗体可以通过常规确认方法确认其反应性。本发明的抗体中，可以以与SARS病毒的核蛋白的反应性的特异性为指标进行确认。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段可用于SARS病毒的检测或定量用免疫测定。免疫测定方法本身是周知的，可以采用任何周知的免疫测定方法。即，如果以测定形式进行分类，有夹层法、竞争法、凝聚法、蛋白质印迹法等，如果以所使用的标记进行分类，则有荧光法、酶法、放射法、生物素法等，这些都可使用。还可通过免疫组织染色进行诊断。免疫测定方法中使用标记抗体时，抗体的标记方法本身是周知的，可以采用周知的任何方法。

这些免疫测定法本身是周知的，本说明书中无须赘述，简单来讲，例如夹层法是将本发明的抗体或抗原结合性片段作为第一抗体固定为固相，与试样反应，清洗后，使其与第二抗体反应，所述第二抗体与本发明的酶发生抗原抗体反应，漂洗后测定与固相结合的第二抗体。将第二抗体用酶、荧光物质、放射性物质、生物素等标记，可以测定与固相结合的第二抗体。通过上述方法对已知浓度的多个标准试样进行测定，根据测定的标记量与标准试样中本发明的酶的关系制作标准曲线，将对未知浓度的受检试样的测定结果对照该标准曲线，可以对受检试样中本发明的酶进行定量。还可以将第一抗体和第二抗体在上述说明中替换。凝聚法中，将本发明的抗体或其抗原结合性片段固定在胶乳等颗粒上，与试样反应，测定吸光度。通过上述方法对已知浓度的多个标准试样进行测定，根据测定的标记量与标准试样中本发明的酶的关系制作标准曲线，将对未知浓度的受检试样的测定结果对照该标准曲线，可以对受检试样中本发明的酶进行定量。

供给上述免疫测定法的试样只要是含有SARS病毒的核蛋白的试样即可，没有特别限定，例如可以来自人和动物的血清、血浆、全血，除此之外还有鼻腔拭液(鼻腔拭子)、鼻腔吸引液、咽拭液(咽拭子)等体液提取液，呼吸道分泌物，细胞或组织匀浆液等。

通过使用上述本发明的单克隆抗体，可将该抗体用作固相抗体和标记抗体的至少一方，制备SARS病毒测定试剂。与上述单克隆抗体结合的固相可以使用以往免疫测定中使用的各种固相，例如有：ELISA板、胶乳、明胶颗粒、磁性颗粒、聚苯乙烯、玻璃等各种固相，珠，可传输液体的基质等不溶性载体等。另外，可用酶、胶体金属颗粒、着色胶乳颗粒、发光物质、荧光物质、放射性物质等标记抗体，制备标记抗体。将这些固相抗体和/或标记抗体等试剂组合，可以制备在酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法等中使用的试剂。这些测定试剂是通过夹层法或竞争性结合测定法测定试样中的目标抗原的试剂。本发明的SARS病毒的免疫测定工具采用免疫层析的原理，具有以下区域：将本发明的单克隆抗体固定在可传输液体的基质上的检测区域、在上述基质上可移动地点加被标记的本发明的抗SARS病毒单克隆抗体的标记试剂区域。

上述通过夹层法进行免疫测定的试剂可以使用以下的试剂：例如准备两种本发明的单克隆抗体，以其中一种为上述标记抗体，以另外一种为与上述固相结合的固相抗体。首先，使含有待测定的抗原的试样与该固相抗体反应，接着使标记抗体(第二抗体)与被捕捉到该固相抗体上的抗原反应，通过检测与不溶性载体结合的标记物的存在，可以实施免疫鉴定。同样，使含有待测定的抗原的试样与固相抗体反应，接着使标记抗体(第二抗体)与被捕捉到该固相抗体上的抗原反应，通过测定与不溶性载体结合的标记物，即通过标记抗体的量对待测定的抗原的量进行定量，可以实施免疫测定。夹层法的免疫测定试剂中，可以使用一种单克隆抗体作为固相抗体和标记抗体(例如抗原为多聚物时)，但通常优选使用可分别识别待测定的抗原的两个不同的表位的2种或以上的抗体。即，优选从可识别固相抗体和标记抗体不同的表位的单克隆抗体中选择使用。并且，对于任何的固相抗体和标记抗体，可以从各2种或以上的单克隆抗体中选择组合使用。

作为采用竞争性结合测定法的免疫测定试剂，例如可以制备成用酶、胶体金属颗粒、着色胶乳颗粒、发光物质、荧光物质、放射性物质等标记的一定量的标记病毒抗原。使用该试剂，可以与例如含有一定量的本发明的单克隆抗体、上述标记病毒抗原和待测定的抗原的试样进行竞争性反应，由与抗体结合的或未结合的标记病毒抗原的量相对待测定的抗原的量进行定量，从而实施免疫测定。

本发明中，使上述抗体或抗原与固相或标记物结合时，可以采用物理吸附法、化学结合法等方法(参照蛋白质 核酸 酵素 别册No.31，37-45(1987年))。

将本发明的抗SARS病毒单克隆抗体应用于适用免疫层析的免疫测定工具时，无需使用特别的测定装置即可简便地检测出试样中的SARS病毒。该测定工具具备可通过毛细管作用传输液体(展开)的带状基质，以此作为不溶性载体，该基质具有以下区域：固定了至少一种抗SARS抗体(固相化)的SARS病毒检测区域、可移动地点加经标记的抗SARS病毒单克隆抗体的标记试剂区域、点样区域、在上述基质的长度方向的一端附设有展开液垫的展开液供应区域、以及设于上述基质的长度方向的另一端部的展开液吸收区域。

所述免疫层析用免疫测定工具的一个优选例子的模式截面图如图5所示。图5中，参照号1表示免疫层析用的免疫测定工具，2表示可传输液体的基质，3表示干燥的、具有基质区域7的展开液供应区域，4表示标记试剂区域，5表示展开液吸收区域，6表示检测区域，8表示点样区域，9表示试样，10表示展开液。以下对该免疫测定工具的各构成要素进行说明。

基质

该免疫测定工具中的基质由带状的、可通过毛细管作用输送液体的吸收性材料构成。该吸收性材料例如为将纤维素、硝基纤维素等纤维素或其衍生物，玻璃纤维等单独或混合而制备的纸、膜、多孔性材料。该基质的大小没有限制，宽度3mm-10mm左右、长度30mm-100mm左右的条状的容易使用，因而优选。基质的厚度例如可以使用100μm-1mm。为防止测定时来自试样的蛋白质通过非特异反应与基质吸附，例如可用牛血清白蛋白(BSA)等动物血清、酪蛋白、蔗糖等对基质的部分或全部进行封闭后使用。

检测区域

检测区域可以设置使抗SARS病毒单克隆抗体在上述基质上固相化的SARS病毒检测部分。为了以优异的灵敏度测定，优选检测部分的上述抗SARS病毒单克隆抗体在基质上，沿着与在基质上展开的液体的移动方向(基质的长度方向)成直角的方向设置成带状。

该检测区域的抗SARS病毒单克隆抗体可以使用单独的上述抗体或将上述单克隆抗体混合使用。抗SARS病毒单克隆抗体可以是IgG抗体、IgM抗体、还有这些抗体的片段——Fab、Fab’、F(ab’)₂等。

固定在检测部分的抗SARS病毒单克隆抗体可以直接物理吸附于基质的检测区域，也可以通过共价键等化学键固定。另外还可以使抗SARS病毒单克隆抗体与水不溶性的载体结合，使其包含于基质内。该不溶性的载体可以是使含有明胶、阿拉伯树胶和六偏磷酸钠的混合物不溶解而得到的颗粒(日本特公昭63-29223)、聚苯乙烯胶乳颗粒、玻璃纤维等。不溶性的载体和抗SARS病毒单克隆抗体可通过上述化学键或物理吸附键合。

该检测部分相对于标记试剂区域、点样区域和展开液供应区域，设置在基质上展开液移动方向的下游一侧，且位于展开液吸收区域的上游一侧。检测部分可以在基质上设置成宽0.5mm至5mm左右的带状，还可以设置成多条带。如果是宽5mm左右的基质，则可分别点0.1μg-10μg左右的上述抗体和/或抗原，使其干燥，制备检测部分。标记试剂区域

标记试剂区域可以设置成可移动地点加标记抗SARS病毒单克隆抗体。该标记试剂区域可以设置在展开液由展开液供应区域移动的方向上、上述检测区域的上游一侧。该标记试剂区域可通过以下方法设置：在基质上点加标记试剂的方法；将含有标记试剂的吸水性垫设置在基质上的方法；或者与垫贴合的基质部分的一部分或全部与垫均含有标记试剂的方法。吸水性的垫可以使用与后述点样区域中使用的垫同样的物质。

标记抗体与设置在检测区域的抗体中的至少一方为本发明的抗SARS病毒单克隆抗体，进一步优选两者抗体都是本发明的抗SARS病毒单克隆抗体。标记抗SARS病毒单克隆抗体与上述检测区域的抗体同样，可以使用其片段。

上述标记抗SARS病毒单克隆抗体可以通过使抗SARS病毒单克隆抗体与标记物结合来制备。标记物可以是酶、胶体金属颗粒、着色胶乳颗粒、荧光胶乳颗粒、发光物质、荧光物质等。酶可以是酶联免疫测定法(EIA)中使用的各种酶，例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶等。胶体金属颗粒例如可以使用胶体金颗粒、胶体硒颗粒等。

标记物与抗SARS病毒单克隆抗体的结合方法可以利用公知的制备共价键或非共价键的方法。结合的方法例如有：戊二醛法、高碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶基·二硫法、使用各种交联剂的方法等(例如参照“蛋白质核酸酵素”别册31号、37-45页(1985))。使用交联剂的结合方法中，交联剂例如可使用N-琥珀酰亚氨基-4-马来酰亚氨基丁酸(GMBS)、N-琥珀酰亚氨基-6-马来酰亚氨基己酸、N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸等。通过共价键结合的方法中，可以使用存在于抗体中的官能团，除此之外可以按照常规方法例如将硫羟基、氨基、羧基、羟基等官能团导入抗体中，然后采用上述结合方法，使该官能团与标记物结合，由此制备标记抗SARS病毒单克隆抗体。通过非共价键结合的方法还有物理吸附法等。

标记抗SARS病毒单克隆抗体量通常可以根据检查对象物的预测量来适当改变，通常，干燥重量为0.01μg-5μg左右。标记抗SARS病毒单克隆抗体可以与试剂的稳定剂、溶解调节剂等一起涂布。

点样区域

点样区域位于展开液供应区域中展开液移动方向的下游一侧，且可设置成无需在检测区域的上游一侧的基质中特别含有试剂等。点样区域可以设置在1)展开液供应区域中展开液移动方向的下游一侧、标记试剂区域的上游一侧的规定位置、2)标记试剂区域的下游一侧、检测区域的上游一侧的规定位置、或者3)标记试剂区域上的规定位置等。另外，设置点样区域的装置中，如上所述，如果在上述标记试剂区域中附设含有标记试剂的吸水性垫，则可以更有效地进行分析，因而优选。附设该垫的装置可以点加大量的试样液，因此可以以良好的检测灵敏度测定试样中的微量成分。该吸水性垫从较少吸附标记试剂或试样中的SARS病毒的材料中选择，例如可以单独含有聚乙烯醇(PVA)、无纺布、纤维素等多孔质的合成或天然高分子化合物的材料或由其组合构成。该垫的大小、厚度、密度等没有限定，通常使用纵和横为3mm-10mm左右、厚度为0.5mm-4mm左右的垫，这可以有效地进行测定，因而优选。

展开液供应区域

展开液供应区域是设置于基质的长度方向的一端、供应展开液的区域。测定的开始是通过将该区域浸泡在装有展开液的容器中来进行，其中所装展开液的量是展开液至少可到达展开液吸收区域的量。并且展开液的供应是在展开液供应区域附设装有展开液的液槽，使该液槽的盖子破碎，使展开液与基质接触，由此开始测定。展开液可以适当含有表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、抗菌剂等。使用酶作为标记物时，可以与后述的底物区域一起向展开液中添加底物。含有缓冲剂的缓冲液例如有乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、二乙醇胺缓冲液等。展开液供应区域可以附设可稳定、连续地将展开液供给基质的展开液垫。展开液垫例如可使用纤维素或纤维素衍生物等的滤纸。

展开液吸收区域

展开液吸收区域相对于设置在基质一端的上述展开液供应区域，设置在另一端。该区域为吸收供应给基质的展开液，以顺利地进行分析而设。展开液吸收区域可通过使基质形成为长形来保证。另外，通过在基质上附设吸水性材料，也可以制成吸收区域，这种情况可以促进展开液的展开。该吸水性材料可以使用含有天然高分子化合物、合成高分子化合物等保水性高的滤纸、海绵等。展开液吸收区域优选设置其容积完全可吸收展开液的垫状吸收性材料。通过将吸收性材料设置在基质上或下面来设置展开液吸收区域时，可以制备小型化的免疫测定工具。

底物试剂区域

使用酶作为标记试剂区域的标记物时，如上所述，可使展开液中含有底物，或可在基质的上述展开液供应区域的附近设置底物试剂区域。底物试剂区域优选含浸在附设于展开液供应区域的上述展开液垫中，这样可以提高底物量，进行高灵敏度的测定，因而优选。

底物可以使用对应于标记试剂的酶并如下表示的各种显色底物、荧光底物、发光底物等。

(a)显色底物  用于过氧化物酶：与过氧化氢组合的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)，用于碱性磷酸酶：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、对硝基苯磷酸酯(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸钠(BCIP·Na)

(b)荧光底物  用于碱性磷酸酶：4-甲基伞形苯基磷酸酯(4-MUP)，用于β-D-半乳糖苷酶：4-甲基伞形基苯基-β-D-半乳糖苷(4MUG)

(c)发光底物  用于碱性磷酸酶：3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷·2钠盐(AMPPD)，用于β-D-半乳糖苷酶：3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-β-D-吡喃半乳糖基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷(AMGPD)，用于过氧化物酶：与过氧化氢组合得到的鲁米诺、异鲁米诺

底物区域通常可如下形成：将上述底物溶解于水溶液，在展开液垫上涂布成带状，然后干燥形成，还可以根据需要添加底物信号增强剂、稳定剂、溶解调节剂等。底物区域只要是在附设于基质的端部的展开液垫内即可，没有特别限定。在展开液和展开液垫中添加的底物量可根据测定条件决定，每个工具通常可以使用5-500μg左右。

测定试剂的使用方法

可通过本发明的测定试剂进行各种试样中SARS病毒的测定。测定如下进行：首先将试样供给本发明的测定工具的点样区域，然后将展开液供应给展开液垫，在基质上进行展开。展开液通过毛细管作用在基质上移动，到达展开液吸收区域，未与检测区域结合的试样中的成分、酶标记试剂等被展开液吸收区域吸收，展开结束。经过规定时间(通常为10分钟-20分钟)后，观察检测区域，检测和/或测定通过检液中的SARS病毒抗原固定在检测部分的标记物，进行SARS病毒的测定。该检测根据标记物的不同，可通过目视、或使用比色计、荧光光度计、光量子计数仪、感光胶片等的测定装置实施。测定方法中，例如目视测定检测区域的显色的方法较为简便。该方法中，可通过使用与SARS病毒的浓度对应的色纸(色标卡片)进行半定量分析。还可以通过比色计将检测区域的显色数值化，进行定量。

上述基质可以设置并固定在塑料、金属、纸等支撑材料上使用。并且上述基质固定在塑料等块体上，在展开液供应区域附设含有展开液的液槽，用至少在试样区域和检测区域部分开有孔的块体覆盖，可构成容易操作的工具。

作为可通过上述试剂测定的试样，只要是含有SARS病毒的核蛋白的试样即可，没有特别限定，例如可以是来自人或动物的血清、血浆、全血，除此之外还有鼻腔拭液(鼻腔拭子)、鼻腔吸引液、咽拭液(咽拭子)等体液提取液，呼吸道分泌物，细胞或组织匀浆液等。对于这些试样，可以将含有SARS病毒的溶液直接作为试样使用，也可以使用表面活性剂例如非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂等对病毒实施了处理的溶液。非离子表面活性剂例如可以使用Nonidet(Nonidet T-40)、三通、Brij等，阴离子表面活性剂例如可以使用SDS等。

将来自人或动物的各种细胞、组织等固定，通过使本发明的单克隆抗体与其反应，可以直接测定分布在细胞、组织等中的SARS病毒的核蛋白。使用本发明的单克隆抗体，可以进行所谓的蛋白质印迹、亲和层析等。

通过将使用本发明的单克隆体的SARS病毒的核蛋白的测定方法用于来自人或动物的各种试样，可以实施SARS病毒感染的诊断。使用本发明的单克隆抗体，通过免疫化学方法或免疫组织化学方法，可以直接测定来自人或动物的各种体液、细胞、组织等中的SARS病毒的核蛋白。SARS病毒的感染途径可能是从哺乳动物、鸟类等感染至人，除通常的人试样之外，还可通过动物试样的测定来了解感染途径。

上述免疫测定方法、试剂和工具的说明中，可以使用本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段来代替本发明的单克隆抗体。

实施例

以下根据参考例和实施例更具体地说明本发明。本发明并不受下述实施例限制。

参考例1质粒的制备

核蛋白(称为“N蛋白”)基因全长由1270对碱基对构成。根据已报道的基因序列，在水解几乎位于N蛋白基因正中间的限制位点NheI的分成前后两个片段，分别将根据已知的序列信息合成的、互相具有15个碱基重叠的50-55个碱基的寡聚物退火，在DNA合成条件下进行链伸长反应，接着通过PCR依次扩增。将该操作反复进行，使前半部分的正向引物的5’一侧具有EcoRI位点，反向引物的3’一侧具有NheI位点，且在后半部分的反向引物的3’一侧附加BamHI位点，正向引物的5’一侧附加NheI位点，进行PCR。

将这些片段用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒进行纯化，前半部分用EcoRI和NheI水解，后半部分用NheI和BamHI水解，插入到图1所示的表达用质粒pW6A的EcoRI-BamHI位点，制备质粒pWS-N。使用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Brookhaven NationalLaboratry)，得到氨苄青霉素抗性的转化大肠杆菌BL21(DE3)/pWS-N。核蛋白的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。参考例2重组蛋白(S-N)的表达

将参考例1中制备的转化体在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中、在37℃培养。在预备培养中，增殖至600nm下的OD为0.6-0.8，然后向培养物中添加0.4mM IPTG，诱导表达，再培养3小时。以5000rpm将1.5ml量的菌体培养液离心2分钟，收集菌体，悬浮于100μl的缓冲液(10mM Tris-盐酸、pH 8.0、0.1M氯化钠、1mMEDTA)，通过15分钟的超声波破碎使菌体完全破碎。以此作为菌体试样。

向8μl菌体试样中加入4μl 3倍浓度的SDS聚丙烯酰胺缓冲液(0.15M Tris-盐酸、pH 6.8、6％SDS、24％甘油、6mM EDTA、2％2-巯基乙醇、0.03％溴酚蓝)，充分搅拌，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将展开的试样转印硝基纤维素滤膜，用1％BSA封闭滤膜，然后使其与用磷酸缓冲液(10mM磷酸、pH 7.4、0.15M氯化钠)稀释至1000倍的N5肽血清反应。再使其与过氧化物酶标记的抗小鼠Ig兔多克隆抗体(ダコ公司制备)反应，清洗后添加10ml底物显色液(0.01％过氧化氢水、0.6mg/ml 4-氯-1-萘酚)使其显色。结果如图2所示。

抗N5肽血清如下制备：用根据参考例4制备的N5肽KIH偶联物免疫小鼠，由该小鼠采集血液，从血液中分离。

参考例3可溶性S-N的纯化

将参考例1中制备的大肠杆菌BL21(DE3)/pWS-N在含有氨苄青霉素的LB培养基中、在37℃条件下培养。通过预培养使该转化体增殖，达到600nm下的OD为0.7的密度，然后添加0.4mM IPTG，进行表达诱导，培养18小时后进行离心操作，回收大肠杆菌。向回收的大肠杆菌中加入20mM Tris-盐酸pH 8.0、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)，在冰冷却下进行超声波破碎处理。离心后，向可溶性组分S-N中加入硫酸铵，回收20-40％的组分。将该硫酸铵组分过经0.1M氯化钠、8M尿素、20mM磷酸缓冲液pH 6.9平衡的SP sepharose fast flow(アマシャム公司制备)，用0.2M氯化钠、8M尿素、20mM磷酸缓冲液pH6.9洗脱并纯化。将洗脱组分用0.2M氯化钠、20mM Tris-盐酸缓冲液pH 8.0进行透析。与参考例2同样地，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及蛋白质印迹确认该制备物的纯度。结果显示了单一的条带。

实施例1抗N蛋白单克隆抗体的构建

抗N蛋白单克隆抗体如下制备：将参考例3制备的重组N蛋白免疫小鼠，使该小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而制备抗N蛋白单克隆抗体。即，用弗氏完全佐剂使重组N蛋白乳化，以50-100μg/只小鼠对BALB/C小鼠进行初次免疫，2-3周后，以50-100μg/只小鼠，用经弗氏不完全佐剂乳化的该抗原进行追加免疫。抗体效价的检查通过固相ELISA进行，其中该固相ELISA使用涂有重组N蛋白的96孔ELISA板。对于可见抗体效价升高的小鼠静脉内给予25-100μg游离的重组N蛋白，3-4天后，从小鼠体内摘出脾脏，制备脾细胞。将预先在RPMI-1640培养基中培养的骨髓瘤细胞(P3U1)与脾细胞以1∶2-1∶5的比例混合，使用PEG(ベ一リンガ一公司制备)进行细胞融合。融合的细胞浮游于HAT培养基中，然后分注于96孔培养板，在37℃、CO₂培养箱中培养。

通过上述所示的ELISA进行筛选。即，以1μg/ml的浓度、按照50μl/孔将重组N蛋白分注于96孔ELISA板中(フアルマシア公司制备)，在4℃放置过夜进行吸附。将孔用1％脱脂乳封闭，然后用漂洗缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS)漂洗3次，加入50μl进行了细胞融合的孔板中的培养上清，在37℃反应1小时。同样用漂洗缓冲液漂洗3次，然后加入POD标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DACO公司制备)，再在37℃反应1小时。用漂洗缓冲液漂洗4次，然后加入底物(ABTS)，选择可见显色的孔。接着，将所选择的孔的细胞转移至24孔培养板，在37℃的CO₂培养箱中培养，然后用有限稀释法制成单一克隆，构建了产生以下所示的抗N蛋白单克隆抗体的5种杂交瘤rSN-18、rSN-122、rSN-150、rSN-21-2以及rSN-29。这些杂交瘤保藏于上述特许生物寄托中心，其保藏号分别为FERM P-19572、FERM P-19573、FERMP-19574、保藏号FERM P-19619和FERM P-19620。这些杂交瘤于2004年10月18日转为国际保藏，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心[地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6]，其中杂交瘤rSN-18的保藏号是FERM BP-10143、杂交瘤rSN-122的保藏号是FERM BP-10144、杂交瘤rSN-150的保藏号是FERM BP-10145、杂交瘤rSN-21-2的保藏号是FERM BP-10146、杂交瘤rSN-29的保藏号是FERM BP-10147。

实施例2蛋白质印迹法(WB)确定单克隆抗体的反应性

通过以浓缩病毒悬浮液作为样品以WB对所构建的单克隆抗体的天然型抗原(来自病毒的N蛋白)的反应性进行验证。使SARS病毒Hanoi病毒株感染Vero E6细胞，在CO₂培养箱中培养48小时，然后以2000rpm离心15分钟，制备病毒培养上清(TCID₅₀为7.95×10⁶/ml)。对该培养上清进行56℃、90分钟的灭活处理，然后用日立超离心机(40T转子)、以30Krpm将31.5ml该上清离心3小时。向所得沉淀中加入0.3ml TNE(Tris-NaCl-EDTA)缓冲液，进行移液混合，制备浓缩病毒的悬浮液。向该悬浮液中加入等量的用于电泳的样品处理液，接着进行过热处理，制备分析用样品。使用12.5％凝胶，进行SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PSGE)，然后将样品转印至硝基纤维素膜上，制备WB用转印膜(抗原转印WB膜)。将转印膜用脱脂乳封闭，然后进行与抗体的反应。抗N蛋白单克隆抗体使用rSN-18抗体、rSN-122抗体、rSN-150康体、rSN-29抗体、rSN-21-2抗体、rSN-122抗体，使用不相关的单克隆抗体E2CT-38抗体作为阴性对照，实施WB。

与抗体的反应如下进行。将各单克隆抗体与抗原转印WB膜一起在室温下振荡1小时，进行反应，然后用漂洗缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS)漂洗3次(振荡漂洗5分钟)。接着加入POD标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DACO公司制备)，再在室温下反应1小时。用漂洗缓冲液漂洗4次(振荡漂洗5分钟)，然后加入底物4-氯萘酚，进行条带确认。如图3和图4所示，使用各单克隆抗体时，在相当于接近分子量50Kd的N蛋白的位置可见条带。

实施例3夹层ELISA法检测病毒培养上清中的N蛋白

以重组N蛋白和病毒培养上清为样品，进行夹层ELISA，确认N蛋白测定体系是否建立。ELISA如下进行。即，用PBS(pH 7.4)将各单克隆抗体稀释至5μg/ml浓度，向フアルコン公司制备的ELISA板上每孔加入50μl，在4℃放置过夜，包被抗体。接着加入150μl/孔1％BSA-PBS(pH 7.4)，在37℃放置1小时，进行掩蔽。用漂洗缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS(pH 7.4))将孔漂洗3次，然后加入50μl/孔重组蛋白质或病毒培养上清，在37℃反应1小时。使用20ng/ml重组蛋白质，培养上清直接或用漂洗缓冲液稀释后使用。此时，使用未经病毒感染的细胞的培养上清作为阴性对照。接着收集，通过抗小鼠免疫球蛋白抗体亲合柱，从实施例1中记载的杂交瘤培养上清中纯化的单克隆抗体，向各孔中加入50μl/孔用碱性磷酸酶标记的标记抗体，在37℃反应1小时。用漂洗缓冲液漂洗3次，然后加入50μl/孔底物对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，在室温下放置15分钟，然后目视观察，再测定405nm波长。如表1所示，本实施例中使用的所有单克隆抗体中均可检测出N蛋白。

                          [表1]

抗体	夹层ELISA目视		夹层ELISAA405
					病毒培养上清	对照培养上清	病毒培养上清*	重组N蛋白
	rSN-18rSN-122rSN-150E2CT-38	+++-	----	0.620.800.900.05					0.460.991.240.10

                                                  ^*稀释四倍使用

实施例4碱性磷酸酶标记抗SARS病毒单克隆抗体的制备

使2-亚氨基四氢噻吩(イミノチオラン)(アルドリツチ公司制备)与实施例1中制备的抗SARS病毒单克隆抗体反应，导入硫羟基(チオ一ル)。

接着，使导入有马来酰亚氨基的碱性磷酸酶与上述导入有硫羟基的抗体反应，进行凝胶过滤处理，得到纯化碱性磷酸酶标记抗SARS病毒单克隆抗体。

实施例5使用碱性磷酸酶标记抗SARS病毒单克隆抗体的夹层ELISA法测定

使用重组N蛋白和在56℃热处理90分钟而得到的灭活病毒培养上清作为试样，进行以下所示的夹层ELISA。

用磷酸缓冲液(pH 7.5)将各单独或混合的单克隆抗体的浓度稀释为10-15μg/ml，按照每孔100μl加入到Nunc公司制备的IMMUNOMODULE MAXISORP板上，在4℃放置过夜，使其固相化。接着，用漂洗缓冲液[含有0.02％TritonX-100的PBS(Tris缓冲生理盐水)pH 7.2]将各孔漂洗3次，加入250μl/孔1％BSA-磷酸缓冲液，在37℃放置过夜，通过实施封闭来制备抗体固相化板。将抗体固相化板用漂洗缓冲液漂洗3次，然后加入用反应溶液(含有1％BSA的PBS)稀释的重组N蛋白(1.0ng/ml)和病毒培养上清(100μl/孔)，在室温(25℃)下反应1小时。此时，使用未经病毒感染的细胞的培养上清作为阴性对照。将板用漂洗缓冲液漂洗4次，然后按照100μl/孔加入实施例4中制备的1.0-5.0μg/ml单独或混合的标记抗体，室温(25℃)下反应1小时。将板用漂洗缓冲液漂洗4次，然后按照100μl/孔加入底物对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，室温下放置30-60分钟，然后以波长405nm测定。对重组N蛋白和病毒培养上清测定的吸光度测定结果分别如表2a和表2b所示。如表2a所示，在全部单克隆抗体中，组合的反应性各有不同，但可检测出重组N蛋白。如表2b所示，对于病毒培养上清也可见与对重组N蛋白大致相同的反应性。

                                [表2a]

标记抗体	固相化抗体
						rSN-122	rSN-150	rSN-18	rSN-21-2	rSN-29
	rSN-122	0.029	0.416	0.253	0.429						0.439
rSN-150						0.231	0.078	0.121	0.137	0.127
	rSN-18	0.140	0.136	0.071	0.067						0.101
rSN-21-2						0.255	0.162	0.127	0.042	0.052
	rSN-29	0.240	0.140	0.117	0.028						0.027

                                   [表2b]

标记抗体	固相化抗体
						rSN-122	rSN-150	rSN-18	rSN-21-2	rSN-29
	rSN-122	0.069	2.339	0.197	1.697						2.264
rSN-150						1.801	0.032	0.086	0.916	1.099
	rSN-18	0.067	0.080	0.030	0.049						0.059
rSN-21-2						1.907	1.194	0.076	0.062	0.043
	rSN-29	2.104	1.260	0.084	0.040						0.030

实施例6免疫层析测定

以重组N蛋白和在56℃热处理90分钟而得到的灭活病毒培养上清作为试样，确认免疫层析可以迅速检测N蛋白。图5所示的免疫层析的免疫测定工具如下制作。

在硝基纤维素膜2(5mm×50mm)的一端设置展开液供应区域3、在另一端设置吸水性的吸收垫(展开液吸收区5)，其中所述展开液供应区域3具有底物区域7，该底物区域7是以20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸钠(BCIP·Na)为底物，滴加在吸水性的无纺布上并干燥而得到的。在膜部分的标记试剂区域4(点样区域8)的液体传输方向下游一侧设有检测区域6。检测区域可通过带状滴加表3a或b记载的单克隆抗体(1mg/ml)并干燥来制备。标记试剂区域4通过向吸水性无纺布上滴加表3a或b所示的单独或2种碱性磷酸酶标记单克隆抗体(35ng/垫)并干燥来制备。接着，将设置有检测区域6的上述硝基纤维素膜可以直接或用含有BSA的PBS封闭，在其上附设标记试剂区域4。

对于上述制备的免疫测定工具1，用含3％BSATris-盐酸缓冲生理盐水(试样处理液)稀释重组N蛋白或培养上清制备试样9(25-30μl)，将其添加到设置于标记试剂区域4上的点样区域8。接着，将300μl展开液10滴加到展开液供应区域3，使试样和底物在硝基纤维素膜上展开，15分钟后确认带状出现在检测区域6。结果如表3a所示。如表3a所示，重组N蛋白因与抗体的组合不同而可见反应性的差异，但在反应时间15分钟内都可检测出来。另一方面，从表2a、b和表3a的结果可知：在固相抗体和标记抗体的组合中，通过选择反应性高的组合的系统，可以进行病毒培养上清的测定，可以以高稀释倍率检测出病毒培养上清中的N蛋白。结果如表3b所示。

                   [表3a]

固相抗体	标记抗体
				rSN-150	rSN-122	rSN-18
	rSN-150	-	4w				2
rSN-122				3	3w	4
	rSN-18	2	4				-

表中的数值(显色强度)是通过目视判定反应开始15分钟后的检测带的颜色浓度

(4＞4w＞3＞3w＞2＞2w＞1、—：为检测出带状)

                               [表3b]

标记抗体	固相抗体
					rsN-150	rsN-122	rSN-21-2	rSN-29
	rSN-122	1500	-	20000					15000
rSN-150					-	1500	1500	1500
	rSN-21-2	1500	30000	-					-
rSN-29					3000	30000	-	-
	rSN-122+rSN-150	1000	-	＞3000					＞3000
rSN-122+rSN-18					1000	-	＞3000	＞3000

数值表示培养上清的可检测稀释倍率

—：表示未实施

＞3000表示可检测出3000倍或以上

参考例4 N5肽的合成和KLH偶联物的制备

使用岛津制作所制备(PSSM-8)的肽合成仪、通过Fmoc法合成含有SARS和蛋白244-260的肽序列(N5肽、GQTVTKKSAAEASKKPRC：SEQ ID NO.3)。N5肽的合成方法按照合成仪记载的方法进行。接着，按照常规方法将合成的上述肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合，制备KLH偶联物。

实施例7使用N5肽抗原构建抗N蛋白单克隆抗体

将参考例4中制备的N5肽KLH偶联物免疫小鼠，通过使该小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合来制备产生抗N蛋白的单克隆抗体产生杂交瘤。详细的制备方法按照实施例1记载的方法实施，筛选，构建生产抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤SN5-25。由该杂交瘤得到的单克隆抗体命名为SN5-25。

实施例8通过使用碱性磷酸酶标记抗SARS病毒单克隆抗体的夹层ELISA法进行测定

按照实施例4制备表4所示的碱性磷酸酶标记抗SARS病毒单克隆抗体。再与实施例5同样地，制备表4所示的抗体固相化板，使用病毒培养上清进行测定。结果如表4所示。结果通过使用以相当于SARS核蛋白(244-260)的肽为抗原制备的单克隆抗体的试剂可以以高灵敏度(高稀释倍率的试样)检测出病毒培养上清中的N蛋白。

                   [表4]

培养上清(TCID50/mL)	固相抗体	标记抗体	检测
				3.55×104	SN5-25	rSN-18	+
1.77×104	SN5-25	rSN-18	+
				1.22×104	SN5-25	rSN-18	+
rSN-150	rSN-122	+
			8.11×103		rSN-150	rSN-122	+

产业实用性

本发明的单克隆抗体或抗原结合性片段可在用于检测或定量试样中的SARS病毒的免疫测定方法、该方法的试剂或免疫测定工具中使用。

序列表文本

SEQ ID NO.3：含有SEQ ID NO.2的氨基酸244-260和半胱氨酸的肽序列。

Claims (11)

1.抗SARS病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段，其针对引起严重急性呼吸综合症SARS的冠状病毒的核蛋白。

2.权利要求1的抗SARS病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段，其为单克隆抗体。

3.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合性片段，该抗体是由下述杂交瘤产生的，该杂交瘤是以整合有SEQ ID NO.1所示碱基序列的载体所表达的冠状病毒核蛋白作为免疫原来制备的。

4.权利要求3的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其具有单克隆抗体的结合特异性，所述单克隆抗体由保藏号为FERM BP-10143的杂交瘤rSN-18、保藏号为FERM BP-10144的杂交瘤rSN-122、保藏号为FERM BP-10145的杂交瘤rSN-150、保藏号为FERM BP-10146的杂交瘤rSN-21-2、保藏号为FERM BP-10147的杂交瘤rSN-29产生。

5.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其由SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列作为免疫原制备的杂交瘤产生。

6.产生权利要求1-5中任一项中的单克隆抗体的杂交瘤，其是通过将产生抗SARS病毒单克隆抗体的细胞与肿瘤细胞进行细胞融合所获得的杂交瘤。

7.产生权利要求1-5中任一项的单克隆抗体的杂交瘤，它们是：保藏号为FERM BP-10143的杂交瘤rSN-18、保藏号为FERM BP-10144的杂交瘤rSN-122、保藏号为FERM BP-10145的杂交瘤rSN-150、保藏号为FERM BP-10146的杂交瘤rSN-21-2、保藏号为FERM BP-10147的杂交瘤rSN-29。

8.对引起SARS的冠状病毒进行免疫测定的试剂，该试剂将权利要求1-5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合性片段用作固相抗体和标记抗体的至少一方。

9.对引起SARS的冠状病毒进行免疫测定的工具，该工具具有在可传输液体的基质上固定有抗SARS抗体的检测区域、在上述基质上可移动地点加标记抗SARS抗体的标记试剂区域，其中固定于上述检测区域的抗体和标记抗SARS抗体的至少一方为权利要求1-5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合性片段。

10.权利要求9的免疫测定工具，其中所述标记是酶，基质的标记试剂区域的液体传输方向的上游一侧具有与酶反应的底物。

11.SARS病毒的免疫测定方法，该方法包含利用权利要求1-5中任一项的抗SARS病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段与受检试样中的SARS病毒之间的抗原抗体反应进行免疫测定，由此，测定受检试样中的SARS病毒。

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