KR100576170B1

KR100576170B1 - 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약, 항원의제조방법, 항체의 검출방법 및 이를 이용한 진단용 키트

Info

Publication number: KR100576170B1
Application number: KR1020040002758A
Authority: KR
Inventors: 탁동섭; 윤소라; 권창희; 권준헌
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2004-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2006-05-03
Also published as: KR20050074847A

Abstract

본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 제조한 P24 또는 NP 단백질을 검출항원으로 하는 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약을 제공한다.

또한, 본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 항원을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 소지방병성백혈병바이러스의 P24 또는 NP 단백질을 제조하고, 이를 검출항원으로 하여 소지방병성백혈병바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 제조한 P24 또는 NP 단백질을 검출항원으로 스트립상에 고정시킨 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 진단키트를 제공한다.

Description

소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약, 항원의 제조방법, 항체의 검출방법 및 이를 이용한 진단용 키트 {Antibody Detecting Reagent for BLV, Manufacturing Method of Antigen for The Detection, Antibody Detecting Method thereby, and The Kit}

도 1은 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 제시되는 소지방병성백혈병바이러스 p24 및 p15-24-12 유전자의 클로닝 과정과, 배큘로바이러스를 이용하는 발현벡터작성과정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 제시되는 ELISA를 이용한 소지방병성백혈병바이러스에 대한 항체 검출방법을 나타내는 순서도이다.

도 3은 본 발명에 따른 소지방병성백혈병바이러스 재조합 BLV-P24 및 BLV-NP(P15-24-12) 단백질의 발현을 확인하는 사진이다.

1. coomassie brilliant blue stain,

2. 웨스턴블롯팅(1st antibody: anti 6xHis-Mouse IgG, 2nd antibody: anti-Mouse IgG conjugated HRP),

3. 웨스턴블롯팅(1st antibody: anti-BLV bovine serum, 2nd antibody: anti-bovine IgG conjugated HRP),

A: 대조세포, B: BLV-NP(P15-24-12) 재조합단백질, C: BLV-P24 재조합단백질]

도 4는 본 발명에 따른 ELISA용 최적 BLV-P24 재조합 단백질의 농도 결정도이다.

도 5는 본 발명에 따른 ELISA용 최적 BLV-NP 재조합단백질 농도 결정도이다.

본 발명은 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약 등에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다량의 가검재료로부터 소지방병성백혈병바이러스에 대한 항체를 정확하면서도 신속하게 검출할 수 있어 질병감염유무를 손쉽게 판단할 수 있는 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약, 항원의 제조방법, 항체의 검출방법 및 이를 이용한 진단용 키트를 제공함에 있다.

소지방병성백혈병은 레트로바이러스에 속하는 소백혈병바이러스에 의해 발병하는 성우의 질병으로 모든 일령의 소에서 감염이 이루어질 수 있지만 주로 준임상형으로 3년생 이상의 소에서 영구적인 임프증가증(lymphocytosis)를 나타내며, 감염우 중 약 0.1∼1％에서 임프육종인 악성종양으로 발전한다.

본 질병에 대한 진단법으로는 한천내 평판응집반응법(agar gel immunodiffusion test; AGID), 형광항체검사법, 보체결합반응법, 바이러스중화시험 법, 효소면역검사법(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)등이 있으나, 국제수역사무국(Office International des Epizooties ; OIE)에서 공인된 방법으로는 AGID와 ELISA 두가지 검사법으로 특히 AGID보다 ELISA가 민감도와 재현성이 높고 시간이 절약됨으로 세계적으로 널리 사용되고 있다. ELISA에 사용되고 있는 항원은 소지방병성백혈병바이러스가 영구적으로 감염되어있는 세포인 면양신장세포(fetal lamb kidney cell ;FLK)로부터 바이러스를 정제하여 사용하고 있는 데 주로 gp51 단백질과 내부단백질인 p24단백질이다. 하지만 이와 같이 ELISA를 개발하는 데 있어 사용되는 항원으로 FLK세포주를 이용할 경우 세포변성을 일으키지 않고 세포내에서 증식함으로 검출이 곤란한 바이러스 특히 소설사바이러스(bovine diarrhea virus)가 오염되는 경우가 있어 많은 주의를 기울여야 하며, 이로 인하여 진단효율이 저하될 수 있는 문제점이 있다. 또한 바이러스의 특정부위만을 추출하여 사용하기 위해서는 많은 시험단계를 걸쳐야 하기 때문에 이를 보완할 필요성이 제기되었다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 다량의 가검재료로부터 소지방병성백혈병바이러스에 대한 항체를 신속하게 검출함으로써 질병감염유무를 손쉽게 판단할 수 있고, 상기 질병에 대한 국가방역사업에도 크게 공헌할 수 있는 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 항원을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 간단하고 정확하게 소지방병성백혈병바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 진단키트를 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 수단으로 본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 제조한 P24 또는 NP 단백질을 검출항원으로 하는 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약을 제공한다.

또한, 본 발명은 소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유 전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 숙주에 코트랜스펙션시켜 제조한 P24 또는 NP 단백질을 검출항원으로 플레이트상에 고정시킨 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 진단키트를 제공한다.

상기 본 발명에서 배큘로바이러스는 바람직하게는 멀티캡시드핵다각체바이러스에 속하는 것에서 선택된다.

상기 본 발명에서 숙주세포는 바람직하게는 곤충세포이고, 보다 바람직하게는 스포돕테라 프루기페르다(sf) 세포이며, 더욱 바람직하게는 sf9, sf21 세포에서 선택된다.

상기 본 발명에서 소지방병성백혈병바이러스 항체를 검출하는 과정에서 사용되어지는 항원 P24 또는 NP 단백질의 함량은 바람직하게는 0.1∼0.15㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.125㎍/㎖로 한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

상기 본 발명에 따른 항체검출용 시약, 항체검출용 항원의 제조방법 및 항체 검출 방법은 소지방병성백혈병바이러스(이하, 'BLV'라 한다) 유전자를 구성하는 p24 또는 p15-24-12를 소정 벡터에 결합시켜 얻어지는 재조합벡터를 배큘로바이러스와 함께 코트랜스펙션하여 숙주로부터 얻어지는 항원을 이용하는데 그 특징이 있다. 즉, 이와 같이 기존에 제공되는 항체검출용 항원들이 BLV로부터 직접 추출하여 제공되어지는 것임에 대하여, 본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 원하는 항원단백질만을 순수하게 대량으로 생산할 수 있는 기초를 제공할 수 있다.

p24 유전자는 뉴클레오캡시드를 구성하는 일부 단백질이며, p15-24-12 유전 자는 전체 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자에 의해 발현되는 단백질은 이하에서 각각 P24, NP로 명명할 것이며, 이들 단백질은 소에서 항체를 유발하는 항원으로서 작용할 수 있다.

상기 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자는 BLV에 감염된 젖소로부터 프로바이랄 DNA를 추출하고, 소정의 프라이머 셋을 이용한 PCR 증폭과정을 거쳐 얻어질 수 있다. 반응에 사용되는 PCR의 구체적인 조건 등은 국제수역사무국(OIE)에서 제시하는 조건을 따르는 것으로 충분하다.

도 1은 상기 PCR과정으로 증폭시킨 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 재조합벡터로 제조하는 과정이 도시되어 있다. 이를 참조하여 설명하면, BLV의 프로바이랄 DNA로부터 소정의 프라이머 셋을 사용해 PCR 증폭시켜 얻은 산물은 각각 p24를 함유하는 650bp 유전자와, p15-24-12 유전자를 함유하는 1178bp 유전자로서, 특정한 제한효소 부위 예를 들어, EcoRⅠ과 KpnⅠ의 제한부위를 가지고 있다.

상기 얻어진 각 유전자를 pGEM-T 벡터에 삽입하여 클로닝한 다음, EcoRⅠ과 KpnⅠ을 이용하여 각각의 유전자를 절단시키고, 절단된 유전자를 전이벡터 예를 들면, pAcHLT-A에 라이게이션시켜 형질전환용 재조합 벡터를 제조한다.

본 발명은 상기 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터와 통상적으로 곤충을 숙주로 하면서 동물을 숙주로 하지 않아 안전하게 사용할 수 있는 배큘로바이러스를 코트랜스펙션하여 P24 또는 NP 단백질을 정제하는 과정을 포함한다.

배큐로바이러스는 바람직하게는 멀티캡시드핵다각체바이러스에 속하는 것에 서 선택되며, 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 AcMNPV가 사용되었다.

상기 숙주세포로는 바람직하게는 밤나방의 일종인 스포돕테라 프루기페르다 의 세포가 이용되며, 보다 바람직하게는 sf9, sf21이 좋다. 이들 세포들은 특정 유전자의 발현을 위한 형질전환체의 용도로서 현재 광범위하게 사용되고 있다. 하지만, 아직까지는 BLV에 의해 발현되는 P24 또는 NP 단백질의 발현을 위한 용도로서 보고된 바는 없다.

현재 상기 라이게이션된 재조합 벡터를 특정 숙주에 트랜스펙션시키고, 이들 숙주로부터 재조합단백질을 정제하는 과정은 공지되어 있는 기술이며, 이들은 다양한 제조사 (예를 들어, PharMingen) 로부터 제공되고 있다.

본 발명에 따라 최종 형질전환체로부터 정제되어지는 P24 또는 NP 단백질은 소를 대상으로 하여 BLV에의 감염여부를 확인시켜 주기 위한 항원의 용도로서 매우 유용하다. 즉, 이들은 재조합 기술을 이용하여 생산하므로 세포주를 이용하는 기존기술에서와는 달리 검출이 곤란한 바이러스 예를 들면, 소설사바이러스 등에 의한 오염의 염려가 없어 진단효율이 매우 높다.

상기 본 발명에 따른 항원은 면역학적 검출방법에 제공될 수 있으며, 예를 들면, 효소면역검사법(ELISA), 진단용 키트를 이용한 직접 검사방법 등에 다양하게 적용될 수 있다. 또한, BLV 항체 확인을 위한 면역학적 검사시에 본 발명에 따른 항원을 1종 또는 2종을 동시에 사용하여도 좋다. 2종을 동시에 사용하는 경우에는 검출에 대한 정확성을 더욱 향상시킬 수 있다.

검출방법으로 효소면역검사법(ELISA)를 이용하는 경우의 적용예가 도 2에 도시되어 있다. 이를 참조하여 상기 효소면역검사법(ELISA)을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 상기 항원, 즉 P24 또는 NP 단백질과 정상세포를 플레이트에 코팅한다. 이때, P24 또는 NP 단백질의 함량은 바람직하게는 0.1∼0.15㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.125㎍/㎖로 한다. 여기서는 코팅용 완충용액으로 0.05M 카보네이트-바이카보네이트 완충용액(pH, 9.6)이 사용되고 있다. 이때, 코팅반응은 4℃에서 15∼17시간 정도로 수행하는 것이 좋다.

항원이 코팅된 플레이트는 세척액으로 3회 정도 세척한 후 다시 PBS로 2회정도 세척한다. 여기서는 세척용 버퍼로서 PBS-0.05％Tween20 이 사용되고 있다.

블로킹과정은 PBS-0.01％Tween10 에 혼합된 3％ 스킴밀크가 블로킹 액으로 사용되며, 37℃에서 1시간 반응을 수행하고 이후 다시 세척용액으로 4회정도 세척한다.

혈청반응에 사용되어질 피검체는 PBS-0.05％Tween20 에 혼합된 3％ 스킴밀크를 희석액으로 하여 약 25배 희석하고 이를 항원 및 세포가 코팅된 웰에 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 반응시킨다.

반응에 사용할 컨쥬게이트는 HRP가 컨쥬게이트되어진 KPL 염소 항 소 IgG가 사용되며, 약 4,000배 정도 희석시킨 것을 상기 각 웰에 첨가시켜 실온에서 30분 반응시키고, 다시 세척용액으로 4회 정도 세척한다.

여기에 기질로서 ABTS(KPL)을 첨가시켜 10분 후 반응정지액으로서 1％ SDS를 첨가한다.

상기 과정을 거쳐 얻어지는 결과는 405nm에서의 흡광도로서 측정될 수 있으며, 진성 OD(TO)는 다음과 같은 식 (1)로부터 얻어질 수 있다.

(1) 진성 OD(TO) = 첨가한 항원 코팅웰 OD(AO) - 세포 코팅웰 OD(CO)

최종 결과는 국제 수역사무국(OIE) 표준양성 혈청인 E4를 10배 희석한 BLV에 대한 약양성혈청으로 BLV 진단의 표준혈청인 E4/10의 결과와 대비하여 하기 관계 (2)와 같이 판단할 수 있다.

(2) 음성(샘플 TO) < E4/10(TO) ≤양성(샘플 TO)

진단용 키트를 이용한 직접 검사방법은 현재 다양한 제조사로부터 시판되고 있는 진단용 키트가 이용될 수 있다. 예를 들어 나이트로셀룰로오스를 전개막으로 하는 스트립상의 특정위치에 상기 본 발명에 따른 항원을 대조라인을 형성하는 마커물질과 함께 서로 이격시켜 고정시키고, 적당한 공극을 가지며 셀룰로오스 등의 재질로 구성되는 샘플 로딩패드를 상기 스트립의 하단에 구비하면서, 이들스트립을 커버하기 위한 하우징을 포함하여 구현되어질 수 있다. 검출은 육안으로 가능하며, 샘플을 로딩함과 함께 소정 시간경과 후 항원라인과 대조라인의 발색 등을 확인하여 BLV에의 감염여부를 쉽게 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 소지방병성백혈병바이러스(Bovine leukemia virus : BLV) p24 및 p15-24-12 유전자 클로닝

소지방병성백혈병바이러스에 감염된 국내 젖소로부터 BLV 프로바이랄 DNA를 추출(Genomic DNA Purification kit, Promega)한 다음 프라이머 셋(p24 : 전방 프라이머 5`-G GAA TTC ATG TTG CCA ATT ATA TCT GAA GGA -3`, 후방 프라이머 5`-GGT ACC TTA GAC GAG GAT TGC AGG CTG TTT-3`, P15-24-12 : 전방 프라이머 5`-G GAA TTC ATG GGA AAT TCC CCC TCCC TAT AAC-3`, 후방 프라이머 5`-GGT ACC TTA GTT TTT TGA TTT GAG GGT TGG -3`)를 이용하여 PCR 반응시약(Taq PCR Master Mix, Qiagen)과 혼합하여 국제수역사무국(OIE)에서 제시한 PCR 조건으로 DNA를 증폭하였다. 증폭된 각각의 유전자는 pGEM-T 벡터에 삽입하여 클로닝한 다음, EcoRI와 KpnI 제한효소를 이용하여 유전자를 절단하였다. 절단된 유전자는 pAcHLT-A 전이벡터에 라이게이션한 다음 DH5α 콤피턴트 세포에 형질전환 시켰으며, 재조합 DH5α세균을 선발하였다 (도 1 참조). 코트랜스펙션 하기 전에 세균으로부터 재조합 플라즈미드를 추출하였다. 트랜스펙션 과정에서 부터 재조합단백질의 정제까지의 과정은 제조사(BaculoGold 6x His Purification and Expression kit, PharMingen)의 술식에 따라 진행하였다. 간단히 요약하면 다음과 같다. 추출된 p24 와 p15-24-12 pAcHLT-A 프라즈미드를 선형 AcMNPV DNA와 동시에 Sf9 곤충세포에 코트랜스펙션시켰다.

<실시예 2> 소지방병성백혈병바이러스 재조합 BLV-P24 및 BLV-NP(P15-24-12) 단백질 발현 확인

코트렌스펙션된 Sf9세포를 27℃에서 7일간 관찰하면서 세포변성유무를 확인하였다. 세포변성이 확인된 세포는 세포배양상청액을 새로운 Sf9세포에 감염시킨 다음 배양하고, 세포변성효과가 나타난 5일 후에 소량 분주하여 -70℃에 보관하고, 일부 세포배양상청액은 재조합단백질이 발현되는지의 유무를 판단하기 위해서 바이러스의 증식성이 뛰어난 HI-5 곤충세포에 재접종하였다. 재접종 후 감염이 확인된 세포는 키트 (BaculoGold 6x His Purification and Expression kit, PharMingen)를 이용하여 용해시키고, Ni-NTA 아가로오즈로 정제하여 SDS-PAGE 및 웨스턴블로팅법을 이용하여 재조합단백질을 분석하였다.

(1) SDS-PAGE 분석

정제된 재조합단백질은 단백질 샘플 로딩 완충액(10％ SDS, 10mM Tris-HCl, pH6.8, 25％ 글리세롤, 0.01％ 브로모페놀블루, 10％ β-머캡토에탄올)와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓인 다음 12,000rpm/3min으로 원심분리하였다. SDS-PAGE용 12.5％ 폴리아크릴아마이드겔과 버퍼스트립은 상품화된 것(Pharmacia Biotech)을 사용하였다. 겔의 웰당 15㎕의 처리된 샘플을 로딩한 다음 300V에서 2시간 반응(GenePhor, Pharmacia Biotech)시켰다. 전기영동이 완료된 겔은 Zehr등(Anal. Biochem.,1989,182:157-159)의 염색용액(50％ 메탄올, 0.2％ Coomassice Brilliant Blue R-250, 7％ 아세트산, 43％ D.W.)에 담근후 마이크로웨이브오븐(대우, KOR- 603MT)에서 2분간 가열한 다음 탈색용액(15％ 메탄올, 10％ 아세트산)에서 밤샘 탈색시켰다. 겔상에 나타난 밴드를 분석한 결과 BLV-P24와 BLV-NP는 각각 약28 및 50kDa의 분자량을 나타냈었다 (도 3 참조).

(2) 웨스턴 블로팅 분석

Towbin 등(Proc. Natl. Acad. sci. USA., 1979,76:4350-4354)과 Blake 등(Anal. Biochem., 1984, 136:175-179)의 전기블로팅 방법을 응용한 NovaBlot System(Pharmacia Biotech)을 이용하여 블로팅하였다. 전기블로팅 조건은 겔 ㎠당 0.8mA로 계산한 다음 1.5시간 블로팅하였다. 블로팅이 완료된 니트로셀룰로오스 페이퍼(NC 페이퍼)를 TBS(10mM Tris(pH8.0), 150mM NaCl)에 침적하고 실온에서 10분간 반응시킨 다음, 블로킹 버퍼(5％스킴 밀크, 5％ 락토알부민 가수분해물, TBST ;10mM Tris(pH8.0), 150mM NaCl, 0.05％ Tween20))로 1시간 반응시켰다. 이후 세척액 TBST로 10분 간격으로 2회 세척하고 블로킹 버퍼로 1:1000 희석한 항- His 항체(Qiagen)과 별도의 NC 페이퍼에 1:100 희석한 항-BLV 소 혈청(NVSL)을 넣고 1시간 반응시켰다. 반응 후 같은 방법으로 세척하고 항-마우스 IgG HRP 용액 또는 항-소 IgG HRP 용액을 3％ BSA(W/V)를 함유한 TBST로 1:1000 희석하여 1시간 반응시켰다. 세척액으로 10분 간격으로 4회 세척한 다음 DAB 기질을 첨가하여 발색시켰다. 그 결과 SDS-PAGE와 마찬가지로 BLV-P24와 BLV-NP는 각각 약 28 및 50kDa 분자량의 위치에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있어 소 지방병성백혈병바이러스에 대한 재조합단백질이 발현되고 있음을 확인하였다 (도 3 참조).

<실시예 3> 재조합 BLV-P24 및 BLV-NP 단백질을 이용한 효소면역검사법

재조합바이러스가 감염된 세포를 상용화된 키트 (BaculoGold 6x His Purification and Expression kit, PharMingen)를 이용하여 용해시키고, Ni-NTA 아가로오즈로 정제한 다음 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer를 이용하여 재조합단백질의 함량을 측정하였다. 측정된 재조합 단백질의 함량을 토대로 효소면역검사법(ELISA)에 적합한 재조합단백질의 함량을 검사한 결과 재조합 BLV-P24 및 BLV-NP 단백질 모두 0.125㎍/㎖로 나타났다 (도 4, 도 5 참조).

<실시예 4> 본 발명에 따른 ELISA와 상품화된 ELISA 키트와의 상관관계 비교

재조합 소지방병성백혈병바이러스 단백질인 BLV-P24 및 BLV-NP 단백질을 이용하여 개발된 본 발명에 따른 ELISA와 국제수역사무국에서 인정한 Bovine Leukemia Virus Antibody Test Kit (IDEXX laboratories, inc., USA)를 비교분석한 결과 민감도와 특이도가 하기 표 1에 나타난 것과 같이 고도의 상관성을 나타냄을 확인하였다.

<표 1> 본 발명에 따른 ELISA와 상품화된 ELISA 키트와의 상관관계 비교

구분		P24		NP
구분		양성	음성	양성	음성
IDEXX¹⁾	양성	165	4	165	4
IDEXX¹⁾	음성	11	233	13	231
계	413	176	237	178	235
민감도(％)²⁾		97.6		97.6
특이도(％)³⁾		95.5		94.7

1) IDEXX laboratories, inc.(USA) : Bovine Leukemia Virus Antibody Test Kit

2) 민감도(％) = 개발진단법에서의 IDEXX사와 일치한 양성혈청수 / IDEXX사 양성혈청수 X 100

3) 특이도(％) = 개발진단법에서의 IDEXX사와 일치한 음성혈청수 / IDEXX사 음성혈청수 X 100

상기 결과를 참조하면, 기존의 국제적으로 인정되어 표준진단킷트의 하나로 사용되고 있는 IDEXX 사의 효소면역측정(ELISA) 킷트와 비교해 본 결과 본 발명에 따른 BLV- P24 재조합 단백질을 이용한 ELISA의 경우 민감도와 특이도가 각각 97.6％과 95.5％였고, BLV-NP 단백질의 경우 97.6％과 94.7％의 고도의 일치율을 나타내고 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에 의하면, 다량의 가검재료로부터 소지방병성백혈병바이러스에 대한 항체를 신속하게 검출함으로써 질병감염유무를 손쉽게 판단할 수 있고, 상기 질병에 대한 국가방역사업에도 크게 공헌할 수 있게 된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

소지방병성백혈병바이러스의 p24 유전자 또는 p15-24-12 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 배큘로바이러스를 스포돕테라 프루기페르다 세포에 코트랜스펙션시켜 제조한 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 항원의 제조방법
제 1항에 있어서, 배큘로바이러스는 멀티캡시드핵다각체바이러스에 속하는 것임을 특징으로 하는 항원의 제조방법
제 1항 방법에 의해 제조된 항원을 검출항원으로 하여 소지방병성백혈병바이러스 항체를 검출하는 방법
제 3항에 있어서, 검출에 사용되는 항원의 함량은 0.1∼0.15㎍/㎖로 함을 특징으로 하는 방법
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