CN117777283B - 一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体及其应用，属于生物抗体技术领域。为解决目前现有技术尚缺乏针对BLV感染后p24抗体的商用化试剂盒的技术问题，本发明采用原核表达系统高效表达可溶性BLV p24蛋白，利用p24蛋白免疫BLAB/c小鼠后，采用杂交瘤技术制备针对p24蛋白的单克隆抗体，经鉴定该单抗效价高、反应原性良好、特异性强。此外，本发明不但检测出了单克隆抗体识别的抗原表位序列，而且还利用获得的单克隆抗体建立了检测BLV p24蛋白抗体的cELISA，该检测方法将是对现有检测gp51抗体cELISA方法的重要补充，也是当检测gp51抗体出现假阳性或假阴性时的一种特异、敏感的验证方法。
Description
技术领域
本发明属于生物抗体技术领域，具体涉及一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
牛白血病病毒（Bovine leukemia virus, BLV）是引起地方性牛白血病（Enzooticbovine leukosis, EBL）的病原，属于逆转录病毒科、δ逆转录病毒属，与人类嗜T细胞淋巴病毒I型和II型（HTLV-I和HTLV-II）亲缘关系较近。EBL是一种以B细胞淋巴肉瘤为特征的淋巴细胞增生性传染病，在世界范围内广泛流行。绝大多数EBL患病动物均呈现终身持续性感染状态，其中约29%的牛只表现为持续性淋巴细胞增生，约有5%的病患将发展为恶性B淋巴细胞肉瘤。BLV感染的危害不仅包括由于恶性病患的淘汰以及对活牛、胚胎和精液的进出口贸易限制所造成的直接经济损失，同时BLV感染后的一些亚临床表现也对动物的生产性能造成严重影响。有报道表明，BLV感染牛可出现消化障碍、食欲不振、体重减轻、全身虚弱等表现，能够显著降低奶牛产奶量和繁殖性能。流行病学研究显示，BLV在北美洲、南美洲和亚洲流行最为广泛。在加拿大89%的牛群、阿根廷90.9%的牛群以及日本40.9%的牛群均能检测到BLV血清学阳性。在我国，综合1985~2019年间的35项流调研究表明，我国牛群中BLV的总体感染率已经达到10%，部分地区甚至高达50%以上，表明BLV在我国已经呈现广泛流行态势。对牛群实施及时、准确的检测与诊断是防控BLV流行以及开展EBL净化的关键步骤。
BLV作为一种逆转录病毒，感染动物后可产生持续的免疫反应，其特征是产生针对核衣壳蛋白p24以及囊膜糖蛋白gp51的高滴度抗体，而这种体液反应更是判定病毒感染的最早迹象之一，因此血清学阳性是判定BLV感染的最佳指标。琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）是由世界动物卫生组织（WOAH）批准的用于贸易目的的BLV血清学诊断方法。与AGID相比，ELISA由于具有检测敏感性高、更快速的特点，已经成为BLV抗体检测的主流手段。现有商品化的BLV ELISA抗体试剂盒主要由外国公司开发并生产，其主要通过检测针对gp51蛋白的抗体判定BLV感染情况，如基于gp51单克隆抗体的竞争ELISA（cELISA）抗体检测试剂盒等，目前尚缺乏针对BLV感染后检测p24抗体的商用化试剂盒。
尽管有研究报道表明，在BLV人工感染试验中，针对gp51的抗体比针对p24的抗体出现地更早且滴度更高，但也有研究发现，在自然感染的一部分牛中，产生了更高水平的p24抗体，甚至只出现了针对p24的抗体。此外，p24蛋白无论在病毒粒子上还是感染牛淋巴细胞中的免疫原性和表达量均高于gp51；针对p24的抗体水平与BLV前病毒载量高度相关；尤其在BLV感染的中后期，p24蛋白能够诱导更高水平的抗体滴度。目前，p24蛋白及其抗体已经成为人免疫缺陷病毒（HIV-I）、HTLV-I和HTLV-II等逆转录病毒主要的诊断标记。因此，研制针对p24抗体的BLV血清学检测方法具有显而易见的必要性和重要的现实意义。
发明内容
为了解决目前现有技术尚缺乏针对BLV感染后p24抗体的商用化试剂盒的技术问题，本发明采用原核表达系统高效表达可溶性BLV p24蛋白，利用p24蛋白免疫BLAB/c小鼠后，采用杂交瘤技术制备针对p24蛋白的单克隆抗体，并对单抗进行全面鉴定。此外，本发明不但检测出了单克隆抗体识别的抗原表位序列，而且还利用获得的单克隆抗体建立了检测BLV p24蛋白抗体的cELISA。
为解决上述技术问题并达到相应的技术效果，本发明具体提供了如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括单克隆抗体重链可变区和单克隆抗体轻链可变区；单克隆抗体重链可变区包括CDR H1、CDR H2、CDR H3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，单克隆抗体轻链可变区包括CDR L1、CDR L2、CDR L3，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示。
在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明的第二个目的是提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述单克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体重链可变区中CDR H1、CDR H2、CDRH3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示，所述单克隆抗体轻链可变区中CDR L1、CDR L2、CDR L3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQID NO.17所示。
在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体重链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的核酸分子。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明提供的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可，包括各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的重组表达载体或所述宿主细胞的基因组中整合有上述的核酸分子。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞等。
本发明的第五个目的是提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株产生上述单克隆抗体，分类命名为分泌牛白血病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45806，保藏日期为2024年1月22日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第六个目的是提供上述的单克隆抗体或上述的核酸分子或上述的重组表达载体或上述的宿主细胞或上述的杂交瘤细胞株在制备检测牛白血病病毒抗体的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的单克隆抗体或上述的核酸分子或上述的重组表达载体或上述的宿主细胞或上述的杂交瘤细胞株在以非诊断为目的检测牛白血病病毒抗体中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述检测基于竞争ELISA方法。
在本发明的一种实施方式中，所述竞争ELISA方法具体是将rp24蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液（包被液）稀释至2.5 μg/mL并加入酶标板中，100 μL/孔，4℃包被过夜，次日，用PBST洗板3次；将单克隆抗体2G11用PBS稀释至0.5 μg/mL，将待检血清、阴性对照血清、阳性对照血清分别作2倍稀释；将50 μL稀释后的2G11分别和50 μL稀释后的待检血清（或对照血清）混合，37℃孵育45 min，用PBST洗板3次；每孔加入100 μL 1：5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育45 min，用PBST洗板3次；每孔加入100 μL TMB显色液，与室温作用10min，每孔加入50 μL 2M H2SO4；采用酶标板读取OD450nm，并计算待检样品PI值；PI=（阴性对照OD平均值-样品OD平均值）/阴性对照OD平均值×100%；当样品PI值≥44.5%时，判定为阳性；当PI值＜44.5%时，判定为阴性。
本发明的第八个目的是提供一种上述单克隆抗体识别的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
本发明的有益效果：
本发明采用原核表达系统高效表达可溶性BLV p24蛋白，将蛋白免疫BLAB/c小鼠后，采用杂交瘤技术制备针对p24蛋白的单克隆抗体2G11，并对单抗2G11进行全面鉴定，经鉴定，单抗2G11具有效价高、反应原性良好、特异性强的特点。此外，本发明检测获知所制备的单抗2G11能够精确识别BLV p24蛋白的124位至188位氨基酸，并能够用于建立检测BLVp24蛋白抗体的cELISA，该检测方法将是对现有检测gp51抗体cELISA方法的重要补充，也是当检测gp51抗体出现假阳性或假阴性时的一种特异、敏感的验证方法。
附图说明
图1为BLV p24重组蛋白的SDS-PAGE分析结果图；其中，M为蛋白Marker，1为未诱导pCold-rp24-GST，2为诱导后pCold-rp24-GST，3为纯化后rp24-GST，4为TEV酶切后获得的rp24；
图2为BLV p24重组蛋白与商品化p24单抗的Western blot分析结果图；其中，M为蛋白Marker，1为rp24-GST，2为TEV酶切后获得的rp24；
图3为IFA检测HEK293T-p24和HEK293T细胞系分别与p24抗体的特异性荧光反应结果图；
图4为细胞裂解物与p24抗体的Western blot分析结果图；其中，图4中的M为蛋白Marker，1为HET293T-p24，2为HEK293T；
图5为阳性杂交瘤细胞上清的鉴定结果图，其中，图5中的A为间接ELISA检测阳性杂交瘤细胞上清与rp24的特异性反应结果图，判定临界值为NC OD值的2.1倍，图5中的B为IFA检测阳性杂交瘤上清与HEK293T-p24的特异性反应结果图；图5的A和B中，2A7、2G11和3E6分别代表能够分泌单克隆抗体2A7、2G11和3E6的杂交瘤细胞上清，PC为rp24免疫小鼠血清，NC为未免疫小鼠血清；
图6为单抗腹水纯化的SDS-PAGE鉴定结果图；其中，M为蛋白Marker，1为纯化前2A7，2为纯化后2A7，3为纯化前2G11，4为纯化后2G11，5为纯化前3E6，6为纯化后3E6；
图7为单抗竞争性分析结果图；
图8为单抗2G11的效价、反应原性和特异性鉴定结果图；其中，图8中的A为间接ELISA测定单抗2G11的效价结果图，图8中的B为Western blot分析单抗2G11与p24蛋白的反应原性结果图，图8中的C为IFA分析单抗2G11的特异性结果图；
图9为单抗2G11所识别p24抗原表位的鉴定结果图；其中，图9中的A为p24蛋白1~218位氨基酸不同截短表达方案的示意图，图9中的B为Western blot分析单抗2G11与p24不同截短蛋白反应性结果图，M为蛋白Marker，1为p24全长1~218位氨基酸，2为p24截短片段94~218位氨基酸，3为p24截短片段94~188位氨基酸，4为p24截短片段124~218位氨基酸，5为p24截短片段124~188位氨基酸，6为p24截短片段124~158位氨基酸，7为p24截短片段154~188位氨基酸；
图10为p24-cELISA的受试者ROC分析结果图；其中，图10中的A为p24-cELISA的ROC分析结果图，该试验的曲线下面积为0.9992，图10中的B为当判定临界值为44.5%时，牛血清样品的检测结果的交互点分析结果图；
图11为采用不同牛源病毒阳性血清评价p24-cELISA的特异性结果图；
图12为通过检测感染动物抗体动态变化比较p24-cELISA和商品化gp51-cELISA试剂盒的敏感性结果图；其中左侧红色纵坐标为商品化试剂盒竞争率%（S/N），当S/N≤50%时，BLV抗体判定为阳性，当S/N＞50%时，BLV抗体判定为阴性；右侧黑色纵坐标为p24-cELISA抑制率%（PI），当PI≥44.5%时，BLV抗体为阳性，当PI＜44.5%时，BLV抗体为阴性。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步地详细说明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。实施本发明的过程、条件、实验方法及试剂等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和市场常规产品，本发明没有特别限制内容。
实施例1：BLVp24蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定
（1）BLV p24重组蛋白的表达与纯化
基因合成BLV p24蛋白的编码序列，并根据大肠杆菌偏嗜密码子对序列进行优化，优化后序列如SEQ ID NO.1所示。采用In-fusion克隆技术将优化后的p24编码基因克隆入pCold-GST原核表达载体中，将连接产物转化BL21感受态细胞，提取重组菌株质粒，将测序正确的质粒命名为pCold-rp24-GST。将阳性重组表达菌株在0.5 mM IPTG、16℃、220 rpm的条件下诱导表达16 h，将诱导后菌株经超声破碎后离心，取上清进行SDS-PAGE鉴定。采用GST标签亲和纯化树脂对重组融合蛋白进行纯化，对纯化后的蛋白采用TEV蛋白酶进行酶切处理，并再次进行GST亲和层析，去除GST标签从而获得重组p24蛋白（rp24）。采用BLV p24商品化单克隆抗体对表达的蛋白进行Western blot鉴定。
结果如图1所示，经SDS-PAGE鉴定，重组菌株经诱导后，获得以可溶形式表达的融合蛋白rp24-GST，经亲和层析与酶切处理去除GST标签，获得纯度较高的rp24蛋白；如图2所示，获得的rp24蛋白能够与商品化单克隆抗体发生特异性反应，表明表达的蛋白具有良好的反应原性。所获得的rp24蛋白将用来免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。
（2）稳定表达p24蛋白的HEK293T细胞系的构建
基因合成BLV p24编码基因序列（如SEQ ID NO.2所示），采用In-fusion克隆技术将基因克隆入pLVX-IRES-PURO载体中，将测序正确的质粒命名为pLVX-p24-IRES-PURO，同时制备辅助质粒psPAX2和pVSVG。将HEK293T细胞接种至六孔板，待细胞长至80%-90%时，将1.5 µg pLVX-p24-IRES-PURO、1.5 µg psPAX2、0.5 µg pVSVG加入到200 µL Opti-MEM® IReduced-Serum培养基，轻柔混匀，加入转染试剂PEI 10.5 µl（1 µg/µL），轻柔混匀，室温孵育15 min后滴加至细胞孔中，收集转染后48小时和72小时的细胞上清，混合至一起，作为感染用的慢病毒。将HEK293T细胞接种于六孔板，用收集的慢病毒感染HEK293T细胞，设置对照组即未感染慢病毒的空白对照，孵育48 h后换液至含有2 µg/mL的嘌呤霉素的培养基，之后每隔48 h换含有2 µg/mL的嘌呤霉素培养基，继续培养，直至对照组细胞全部死亡，将筛选得到的细胞命名为HEK293T-p24。
将细胞进行间接免疫荧光试验（IFA）鉴定，结果如图3所示，细胞能够与商品化p24抗体发生特异性荧光反应；将细胞裂解后进行Western blot分析，结果如图4所示，细胞裂解物能够与商品化p24抗体产生特异性反应条带，表明构建的HEK293T-p24能够稳定表达p24蛋白。
（3）杂交瘤细胞的制备与鉴定
将纯化的rp24蛋白配以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠，皮下注射100 μg/只，共免疫3次，间隔3周；于3免后2周采用不加佐剂的rp24蛋白对小鼠进行加强免疫，腹腔注射100 μg/只。在加强免疫3天后，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，制备杂交瘤细胞。采用包被rp24蛋白的间接ELISA（iELISA）进行阳性杂交瘤细胞的筛选，并将阳性杂交瘤上清与稳定表达p24蛋白的HEK293T细胞系进行IFA进行验证。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆，从而获得阳性单克隆抗体细胞株。经筛选与鉴定，共获得3株强阳性杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体分别为2A7、2G11和3E6。如图5所示，这3株杂交瘤细胞上清的间接ELISA反应OD值均高于小鼠阴性血清OD值的10倍（图5中的A），且均与稳定表达p24蛋白的HEK293T细胞发生特异性荧光反应（图5中的B）。
（4）单抗腹水的制备、纯化及单抗亚类鉴定
将无菌液体石蜡腹腔途径注射BALB/c小鼠，500 μL/只。一周后，将分泌2A7、2G11、3E6单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别以0.5×105个/只的剂量腹腔注射小鼠，一周后，每日观察小鼠状态，陆续采集小鼠腹水。将腹水4000 rpm离心去除上层脂肪组织和细胞沉淀，收取上清液。采用ProteinG填料对收集的腹水进行亲和层析。将纯化后的单抗进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，3种单抗纯化后均呈现为一条55 kDa的重链和一条25 kDa的轻链。经抗体型别检测试剂盒鉴定，3种单抗的重链均为IgG1链，A7和3E6的轻链均为Kappa链，2G11的轻链为Lambda链（表1）。
表1 单抗亚类鉴定结果
（5）单抗竞争性的评价
将rp24包被于酶标板中，次日采用5%脱脂乳进行封闭。用等量的PBS对5份BLV阳性血清和5份BLV阴性血清分别进行稀释，用PBS对2A7、2G11、3E6三株单抗分别进行1:1000稀释；分别将稀释后的血清与单抗1：1混合，同时将PBS作为阴性对照，与单抗进行混合；将混合物加入酶标板中，37℃孵育1 h，洗板3次后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h，洗板3次后，采用TMB显色液对酶标板进行显色，最后对酶标板进行OD450nm读值并计算抑制率（PI），PI=（阴性对照OD平均值－样品OD平均值）/阴性对照OD平均值×100%。结果如图7所示，3株单抗对BLV阴性血清的抑制率均低于20%，且均能对BLV阳性血清产生一定的竞争作用，其中2G11对5份阳性血清的抑制率均高于70%，达到平均80.32%，明显高于2A7和3E6对阳性血清的抑制率。因此，2G11是一株强竞争性单抗，可用于建立BLV p24抗体cELISA检测方法。本发明对上述步骤（3）中获得的能够分泌单克隆抗体2G11的杂交瘤细胞株记为HP2411，并进行了保藏，该杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45806，保藏日期为2024年1月22日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
（6）单抗2G11的效价、反应原性和特异性鉴定
将纯化后的单抗2G11的浓度标定至1 μg/μL，将rp24包被酶标板，采用间接ELISA对纯化后单抗2G11的效价进行测定。用PBS对2G11进行稀释，稀释倍数从1:100开始进行2倍倍比稀释，加入酶标板，100 μL/孔，将PBS作为阴性对照。将大于阴性对照OD值2.1倍（判定临界值）的抗体最大稀释度作为2G11的效价。如图8中的A所示，经测定，2G11的效价高达1：51200。
采用Western blot对纯化后的2G11反应原性进行分析，结果如图8中的B所示，2G11能够分别于原核表达的rp24-GST和rp24发生特异性反应，同时能够与持续性感染BLV的牛淋巴细胞BL3.1的裂解物发生特异性反应，表明2G11具有良好的反应原性。
采用IFA对2G11的特异性进行分析，将2G11分别与稳定表达BLV p24蛋白的HEK293T-p24细胞、感染牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的MDBK细胞、感染牛疱疹病毒1型（BHV-1）的MDBK细胞、感染牛轮状病毒（BRV）的Marc145细胞、感染牛冠状病毒（BcoV）的HRT-18G细胞、感染牛结节性皮肤病病毒（LSDV）的Vero细胞以及感染阿卡斑病毒（AKAV）的BHK细胞共同孵育，分别将各种病毒的单抗或者多抗血清作为阳性对照，将空白小鼠血清作为阴性对照。结果如图8中的C所示，2G11仅与HEK293T-p24发生特异性荧光反应，与BVDV、BHV-1、BRV、BCoV、LSDV、AKAV均不发生反应，表明单抗2G11具有良好的特异性。
实施例2：单克隆抗体2G11识别p24氨基酸序列的鉴定
为了确定单抗2G11识别p24蛋白的特异性序列片段，本研究将p24蛋白进行一些列截短设计，采用pcold-GST载体对截短蛋白进行表达，并通过Western blot分析截短蛋白与p24的反应原性。结果如图9所示，单抗2G11识别的氨基酸序列位于p24蛋白的第124位~188位，序列如SEQ ID NO.23所示。
实施例3：单克隆抗体2G11重链和轻链可变区克隆和测序
采用RNA提取试剂盒提取分泌2G11单抗的杂交瘤细胞株HP2411的总RNA，采用特异性反向引物或通用引物将RNA反转录为cDNA，随后采用金斯瑞末端快速扩增（RACE）技术扩增单抗2G11的VH和VL抗体片段。将扩增的抗体片段克隆到测序载体中，通过菌落PCR筛选具有正确大小插入片段的克隆。对每个片段菌选择不少于5个具有正确大小插入片段的菌落进行测序，对每个克隆测序结果进行比对分析。
经测定，单抗2G11的重链DNA序列长度为1386 bp，其序列如SEQ ID NO.3所示，其序列组成结构为：Signal peptide-FR1-CDR H1-FR2-CDR H2-FR3-CDR H3-FR4-Constantregion-Stop codon，其中重链可变区的编码序列如SEQ ID NO.4所示，CDR H1的编码序列如SEQ ID NO.5所示，CDR H2的编码序列如SEQ ID NO.6所示，CDR H3的编码序列如SEQ IDNO.7所示；重链编码序列共编码461个氨基酸，序列如SEQ ID NO.8所示，其序列组成结构为：Signal peptide-FR1-CDR H1-FR2-CDR H2-FR3-CDR H3-FR4-Constant region-Stopcodon，其中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR H1的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，CDR H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，CDR H3的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。单抗2G11的轻链DNA序列长度为705 bp，序列如SEQ ID NO.13所示，其序列结构为Signal peptide-FR1-CDR L1-FR2-CDR L2-FR3-CDR L3-FR4-Constant region-Stopcodon，其中轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO.14所示，CDR L1的编码序列如SEQ IDNO.15所示，CDR L2的编码序列如SEQ ID NO.16所示，CDR L3的编码序列如SEQ ID NO.17所示；轻链共编码234个氨基酸，序列如SEQ ID NO.18所示，其序列结构为Signal peptide-FR1-CDR L1-FR2-CDR L2-FR3-CDR L3-FR4-Constant region-Stop codon，其中轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，CDR L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，CDR L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，CDR L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
实施例4：基于单克隆抗体2G11的p24-cELISA方法的建立
（1）rp24包被浓度和2G11使用浓度的确定
将标定为1 μg/μL rp24蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液（包被液）分别稀释至10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，分别将稀释好的rp24加入酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜。将浓度为1 μg/μL的单抗2G11用PBS分别稀释至4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。将50 μL稀释后的2G11和BLV阴性血清等量混合后作为一抗、以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，进行方阵滴定间接ELISA。以OD450nm值接近1.0时的rp24包被浓度和2G11使用浓度作为最佳rp24包被浓度和2G11使用浓度。结果如表2所示，rp24的最佳包被浓度为2.5 μg/mL，2G11的最佳使用浓度为0.5 μg/mL。
表2 利用方阵滴定间接ELISA确定最佳rp24包被浓度和最佳2G11使用浓度的结果
注：a代表OD450nm值接近于1.0
（2）待检血清稀释度的确定
将3份阳性牛血清和3份阴性牛血清分别做原倍、2倍、3倍和4倍稀释，将稀释后血清分别与单抗2G11等量混合后作为一抗、以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗进行cELISA反应，将阳性血清和阴性血清反应OD450nm值之比（P/N）最小时的血清稀释度作为cELISA的最佳待检血清稀释度。结果如表3所示，当血清2倍稀释时，P/N值最小，因此待检血清最佳稀释度为2倍。
表3 待检血清最佳稀释度的确定
注：a代表P/N最小
（3）p24-cELISA判定临界值的确定
采集247份牛血清样本，其中87份阳性采集自BLV流行牛场，均采自经BLV前病毒PCR鉴定的BLV感染牛，160份阴性血清采集自经PCR鉴定的无BLV健康牛群，所有血清均采用Western blot检测p24抗体，从而对血清背景进行确认。采用p24-cELISA对每份样本进行检测并计算抑制率（PI），PI=（阴性对照OD平均值－样品OD平均值）/阴性对照OD平均值×100%。采用GraphPad Prism软件（8.0版本）对获得的样品检测结果进行ROC曲线分析，结果如图10中的A所示，曲线下面积为0.9992（95%置信区间：99.79%~100%，P<0.0001），表明该cELISA方法具有很高的准确度。根据ROC曲线计算约登指数，约登指数=灵敏度－（1－特异度）；竞争ELISA的判定临界值是约登指数最大的切点。本研究中，当约登指数为0.9698时，cELISA的判定临界值为44.5%。因此，建立的cELISA判定方法为：当PI≥44.5%时，BLV抗体为阳性；PI＜44.5%时，BLV抗体为阴性。上述血清样品的cELISA检测结果如图10中的B所示，87阳性血清中仅有1份检测为假阴性，PI为40.43%；160份阴性血清中仅有3份检测为假阳性，PI分别为46.05%、47%、49.99%；表明该方法具有良好的准确性。综上，p24-cELISA的判定临界值确定为44.5%。
（4）p24-cELISA的反应术式与条件
将rp24蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液（包被液）分别稀释至2.5 μg/mL加入酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜。次日，用PBST洗板3次。将单抗2G11用PBS分别稀释至0.5 μg/mL，将待检血清、阴性对照血清、阳性对照血清分别作2倍稀释。将50 μL稀释后的2G11分别和50 μL稀释后的待检血清（或对照血清）混合，37℃孵育45 min，用PBST洗板3次。每孔加入100 μL 1：5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育45 min，用PBST洗板3次。每孔加入100 μL TMB显色液，与室温作用10 min，每孔加入50 μL 2M H2SO4。采用酶标板读取OD450nm，并计算待检样品PI值。PI=（阴性对照OD平均值-样品OD平均值）/阴性对照OD平均值×100%。当样品PI≥44.5%时，判定为阳性；当PI＜44.5%时，判定为阴性。
（5）p24-cELISA特异性和敏感性分析
为了确定p24-cELISA的特异性，分别选择针对BCoV、BRV、BVDV、BHV-1、LSDV和AKAV的6种牛源病毒阳性血清进行检测，结果如图11显示，6种血清抑制率为0.61%-23.67%，均低于p24-cELISA的判定临界值，均判定为阴性；而针对BLV阳性血清的抑制率为72.0%-86.6%，这表明所建立的p24-cELISA具有良好的特异性。
将BLV感染性克隆pLV344质粒转染至HEK293T细胞，将转染产物接种BLV阴性牛，建立BLV牛体感染模型。于接种后0 w、2 w、4 w、6 w、8 w、10 w、12 w、14 w采集牛血清，分别采用建立的p24-cELISA和商品化的gp51-cELISA试剂盒（ID Screen, BLVC-5P，法国）进行抗体动态检测。结果如图12所示，试验牛在接种后0 w和2 w时，p24-cELISA和商品化试剂盒检测结果均为阴性；然而试验牛从接种后4 w开始，采用两种方法均能检测到血清抗体转阳，且抗体水平随时间逐渐升高。结果表明，针对感染动物血清动态变化，我们建立的p24-cELISA和商品化试剂盒具有相似的检测敏感性。
（6）p24-cELISA重复性评价
可重复性是检测方法可靠性的重要指标。本发明采用已建立的p24-cELISA对8份血清样本进行分析，并测定各血清OD值的变异系数（CV），以评估批间检测和批内检测的重复性。结果如表4显示，p24-cELISA批内检测CV值在0.87%~6.84%，批间检测CV值在0.54%~4.73%。批间检测和批内检测的CV值均低于10%，表明已建立的p24-cELISA重复性良好。
表4 p24-cELISA重复性评价结果
（7）p24-cELISA、gp51-cELISA试剂盒与免疫印迹法（Western boltting）检测的一致性比较
为了确定所建立的p24-cELISA是否可用于临床样本的检测，采用p24-cELISA、商品化gp51-cELISA试剂盒和免疫印迹法检测了242份临床牛血清样本。结果如表5显示，p24-cELISA与gp51-cELISA试剂盒的检测一致性为94.63%，而p24-cELISA与Western boltting的检测一致性为97.52%。此外，统计学分析也表明，p24-cELISA与Western boltting的检测一致性（kappa=0.95）高于p24-cELISA与gp51-cELISA试剂盒的一致性（kappa=0.88）。重要的是，统计学上3种方法之间的样品检测效果无明显差异，具有高度一致性，表明p24-cELISA具有良好的临床应用价值。
表5 p24-cELISA、gp51cELISA试剂盒和Western blotting检测临床样品的比较分析
注：a表示一致性（%）=（A+D）/242×100
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种牛白血病病毒p24蛋白的单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体包括单克隆抗体重链可变区和单克隆抗体轻链可变区；单克隆抗体重链可变区包括CDR H1、CDR H2、CDRH3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，单克隆抗体轻链可变区包括CDR L1、CDR L2、CDR L3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求5所述的重组表达载体或所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子。
7.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，产生权利要求1-3任一所述单克隆抗体，保藏编号为：CGMCC No.45806。
8.权利要求1-3任一所述的单克隆抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的单克隆抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体或权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的杂交瘤细胞株用于制备检测牛白血病病毒抗体的试剂或试剂盒。
9.一种权利要求1-3任一所述单克隆抗体识别的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
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