CN111239394A - 一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，包括COVID‑19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID‑19纤突蛋白抗原胶体金。将该试剂盒用于用于诊断新型冠状肺炎，操作简便，可直接将COVID‑19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID‑19纤突蛋白抗原胶体金混合作为整体进行检测，或者检测时直接将COVID‑19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID‑19纤突蛋白抗原胶体金混合进行检测，检测灵敏度高，利于疫情的有效控制。

Description

一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒
技术领域
本发明涉及肺炎检测技术领域，具体涉及一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，用于诊断新型冠状肺炎。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-2019)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此对于疾病的预防和早期诊断对于控制新型冠状病毒疫情蔓延尤为重要。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了解决上述问题的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，用于快速、准确地检测新型冠状肺炎。
本发明通过下述技术方案实现：
一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，包括COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。将该试剂盒用于诊断新型冠状肺炎，操作简便，可直接将COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金混合作为整体进行检测，或者检测时直接将COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金混合进行检测，检测灵敏度高，利于疫情的有效控制。
进一步地，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的质量配比为1:1。
进一步地，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金中包含的COVID-19核衣壳蛋白，所述COVID-19核衣壳蛋白是基于COVID-19核衣壳蛋白的全基因，经表达纯化获得的融合蛋白；所述COVID-19纤突蛋白抗原胶体金中包含的COVID-19纤突蛋白，所述COVID-19纤突蛋白是基于S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，经表达纯化获得的融合蛋白。
进一步地，所述COVID-19核衣壳蛋白通过以下表达和纯化方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，全合成编码核衣壳蛋白的基因，将核衣壳蛋白的基因克隆至原核表达载体，构建N-His表达载体；
步骤2，将表达载体转入感受态大肠杆菌中，诱导表达核衣壳蛋白；
步骤3，收集细胞，破碎细胞后离心获得上清，分离纯化N-His融合蛋白。
进一步地，所述步骤1中，所述原核表达载体包括pET28a，核衣壳蛋白带有His标签，构建N-His表达载体。
进一步地，所述步骤1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC；反向引物的核苷酸序列为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。
进一步地，所述COVID-19纤突蛋白通过以下表达和纯化方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因；
步骤2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
步骤3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
步骤4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。
进一步地，所述步骤1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。
进一步地，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金的原料包括COVID-19核衣壳蛋白、氯金酸溶液和柠檬酸三钠；所述COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的原料包括COVID-19纤突蛋白、氯金酸溶液和柠檬酸三钠。
进一步地，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金或COVID-19纤突蛋白抗原胶体金通过以下方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料配制胶体金溶液；
步骤2，将COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液分离纯化；
步骤3，将分离纯化后的COVID-19核衣壳蛋白或COVID-19纤突蛋白加入等体积的胶体金溶液中，经分离、沉淀、再溶解获得COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金或COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
进一步地，所述步骤2中，COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液通过透析分离纯化：将COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
本发明具有如下的优点和有益效果：
本发明一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，该试剂盒操作简单，检测灵敏度高，能够快速诊断出患者是否感染COVID-19，利于疫情的有效控制。
核衣壳蛋白(N)蛋白是核蛋白，能与病毒RNA紧密结合，通过螺旋堆积将RNA封装，从而保护病毒的基因组RNA，导致细胞生长延迟，使细胞更长时间的停留在分裂间期，此时病毒RNA可以最大程度的翻译。因其含量高，刺激机体产生抗体的量也较高。纤突蛋白(S)蛋白是伸出囊膜的球-杆形的病毒融合性糖蛋白，是冠状病毒感染细胞的关键蛋白，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；决定病毒感染的种属特异性和组织亲嗜性，是病毒毒力的主要决定部分。因其直接与机体接触，最先诱导机体产生抗体。目前文献报道的单独检测患者血清中针对N蛋白的IgM和IgG抗体的检测方法灵敏度只有百分之八十多，存在一定的漏检。本发明在开发中发现部分患者N蛋白的抗体阳性而S蛋白抗体阴性，部分患者S蛋白的抗体阳性，而N蛋白的抗体阴性。具体来说，例如，5名确诊患者中，用单独的N抗原检测患者血清中针对N的抗体时，只有3名确诊患者OD值显著高于阴性样本的OD值，检出率为60％；单独使用S抗原检测患者血清中针对S的抗体时，只有2名确诊患者OD值显著高于阴性样本的OD值，检出率为40％；而使用混合抗原(N抗原和S抗原 1:1配比)同时检测患者血清中针对N的抗体和S抗体时，5名确诊患者的OD值都显著高于阴性样本的OD值，检出率为100％。
虽然SARS和SARS-CoV2有较高的同源性，但抗原蛋白的表达过程中，即使只有几个氨基酸的差异，采用相同的表达方法所制备的抗原都会有性质的差异，而且所用的表达载体和表达系统不同，生产出的抗原也不一定能有效的检测出病毒的抗原或者抗体。本发明创新性地将N蛋白抗原和S蛋白抗原按1:1的比例混合后，用于同时检测患者血清中的N蛋白抗体和S蛋白抗体，可以提高检出率，降低假阴性率。且核衣壳蛋白抗原胶体金和纤突蛋白抗原胶体金混合包被后检测确诊阳性患者的吸光度显著高于单独包被核衣壳蛋白抗原胶体金或者纤突蛋白抗原胶体金，表明混合包被N蛋白抗原胶体金和S蛋白抗原胶体金用于患者血清抗N和抗S蛋白抗体的检测更灵敏。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例3样本测试显色图；
图2为本发明实施例3样本OD值；
图3为本发明实施例3样本OD值统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种新型冠状病毒快速诊断试剂盒，具体通过以下步骤制备获得：
1、COVID-19核衣壳蛋白的表达和纯化
1-1.以COVID-19核衣壳蛋白(即N蛋白)的氨基酸序列所对应的核苷酸序列为模板，设计核苷酸序列为ATGTCTGATAATGGACCCCA的正向引物、核苷酸序列为GGCCTGAGTTGAGTCAGC的反向引物；经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体、克隆至原核表达载体中，载体包括但不限于pET28a/pET22b/pET21b/pET32a/pET40/pGex-6P-1/pMal-c2x。
1-2.将包含COVID-19核衣壳蛋白核苷酸序列的重组质粒转化至E.coli BL21或者Rossetta 菌株中，涂布于含有氨苄青霉素或者卡那霉素的平板中，于37℃孵育16h后，挑取单菌落接种液体培养基中，培养2h～5h，加入的IPTG进行诱导；3h～18h后，离心、收集菌体；加入缓冲溶液破碎菌体后离心获取上清，经过层析纯化后获得COVID-19核衣壳重组蛋白。
2、COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金的制备
2-1.取质量浓度为0.01％氯金酸水溶液并加热至沸腾，滴加体积浓度为1％柠檬酸三钠溶液并不断搅拌，在氯金酸水溶液由金黄色变为紫红色后继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复至原体积，2℃-8℃保存待用。
2-2.将COVID-19核衣壳重组蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
2-3.将透析处理之后的COVID-19核衣壳重组蛋白加入等体积的胶体金溶液中，2℃-8℃静置，使新冠病毒核衣壳抗原充分与胶体金结合，然后按每10mL胶体金加2mL质量浓度为5％BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混匀后离心0.5h-1.5h，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金。
3、COVID-19纤突蛋白进行表达和纯化
3-1.全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因；
3-2.将S1基因克隆到真核表达载体pMFcIg(ABLINK biotech)的IL2分泌信号肽和小鼠 Fc(mFc，包括hinge-CH2-CH3)标签基因之间，构成S1-mFc融合基因，克隆所采用的正向引物为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT；
3-3.将S1-mFc表达质粒电转到感受态细胞Rosseta，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
3-4.使用293Fectin(thermofisher)转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养5天，收集细胞培养基，离心获得上清，使用protein Aresin(GE) 分离纯化S1-mFc融合蛋白。
4、制备COVID-19纤突蛋白抗原胶体金
4-1.取质量浓度为0.01％氯金酸水溶液并加热至沸腾，滴加体积浓度为1％柠檬酸三钠溶液并不断搅拌，在氯金酸水溶液由金黄色变为紫红色后继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复至原体积，2℃-8℃保存待用。
4-2.将COVID-19纤突蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
4-3.将透析处理之后的COVID-19纤突蛋白加入等体积的胶体金中，2℃-8℃静置并使新冠病毒纤突抗原充分与胶体金结合，然后按每10mL胶体金加2mL质量浓度为5％BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混匀后离心0.5h-1.5h，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
实施例2
对实施例1方法制备的COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金进行临床验证。
取新型冠状病毒肺炎的临床确诊病例5例、正常人样本5例和2个阴性对照样本进行验证，验证方法为：
将COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和纤突蛋白抗原胶体金分别包被至96孔板中，每孔包被的量均为0.2μg/孔。另外，将COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金混合后包被至96孔板中，COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体各包被0.2μg/孔。包被时设置阴性对照孔。
分别加入上述不同类型的标本100μL，37度孵育1h后，洗板，再加入抗人IgG Fc段的酶标二抗，显色剂显色，显色结果如图1，利用酶标仪测定OD值，结果如表1、以及图2 和图3所示；其中，表1给出的是图1的加样顺序、以及对应的检测结果图2给出的OD值。
表1 ELISA加样顺序及OD450值
Figure RE-GDA0002467482430000051
Figure RE-GDA0002467482430000061
分析了临床确诊阳性(5例)和阴性标本(5例)，阳性患者的血清抗N和抗S蛋白抗体全部为阳性，阴性标本的吸光度(OD值)显著低于阳性患者，与临床诊断吻合。核衣壳蛋白抗原胶体金和纤突蛋白抗原胶体金混合包被后检测确诊阳性患者的吸光度显著高于单独包被核衣壳蛋白抗原胶体金或者纤突蛋白抗原胶体金，表明混合包被N蛋白抗原胶体金和S蛋白抗原胶体金用于患者血清抗N和抗S蛋白抗体的检测更灵敏。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，包括COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
2.根据权利要求1所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金和COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的质量配比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金中包含的COVID-19核衣壳蛋白，所述COVID-19核衣壳蛋白是基于COVID-19核衣壳蛋白的全基因，经表达纯化获得的融合蛋白；
所述COVID-19纤突蛋白抗原胶体金中包含的COVID-19纤突蛋白，所述COVID-19纤突蛋白是基于S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，经表达纯化获得的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19核衣壳蛋白通过以下表达和纯化方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，全合成编码核衣壳蛋白的基因，将核衣壳蛋白的基因克隆至原核表达载体，构建N-His表达载体；
步骤2，将表达载体转入感受态大肠杆菌中，诱导表达核衣壳蛋白；
步骤3，收集细胞，破碎细胞后离心获得上清，分离纯化N-His融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述步骤1中，所述原核表达载体包括pET28a，核衣壳蛋白带有His标签，构建N-His表达载体。
6.根据权利要求4所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述步骤1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAA CC；反向引物的核苷酸序列为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。
7.根据权利要求3所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19纤突蛋白通过以下表达和纯化方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因；
步骤2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
步骤3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
步骤4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述步骤1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。
9.根据权利要求1或2所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金的原料包括COVID-19核衣壳蛋白、氯金酸溶液和柠檬酸三钠；所述COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的原料包括COVID-19纤突蛋白、氯金酸溶液和柠檬酸三钠。
10.根据权利要求9所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金或COVID-19纤突蛋白抗原胶体金通过以下方法制备获得，包括以下步骤：
步骤1，以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料配制胶体金溶液；
步骤2，将COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液分离纯化；
步骤3，将分离纯化后的COVID-19核衣壳蛋白或COVID-19纤突蛋白加入等体积的胶体金溶液中，经分离、沉淀、再溶解获得COVID-19核衣壳蛋白抗原胶体金或COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
11.根据权利要求10所述的一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述步骤2中，COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液通过透析分离纯化：将COVID-19核衣壳蛋白溶液或COVID-19纤突蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
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