CN114276445A

CN114276445A - 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法

Info

Publication number: CN114276445A
Application number: CN202111613315.XA
Authority: CN
Inventors: 吴静; 武戌青; 洪淑凡; 陈安琪; 吴琼杉; 余铭恩
Original assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114276445B

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由轮状病毒VP6的两个优势抗原表位串联组成，本发明还涉及用该重组蛋白免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与重组蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR技术将这些淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列扩增出来，并将其构建成完整鼠IgG抗体表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达并纯化单克隆抗体。利用胶体金免疫层析技术及正交实验确定最佳单抗配对组合，对轮状病毒肠胃炎的早期诊断和防治具有重要意义。

Description

轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。本发明涉及一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，简称RV)感染是波及全球人和动物急性肠胃炎的一种常见疾病，根据VP6的抗原性分为A～G 7个组，其中A、B、C三组分别感染流行于婴幼儿、青壮年、青少年三个年龄阶段。在发展中国家，5岁以下住院的腹泻患儿中有20％—50％是轮状病毒肠炎患者，每年约44万儿童死于轮状病毒肠炎，而且自然感染后的免疫性不完整，可能导致终生反复感染。虽然儿童是轮状病毒的易感人群，成人也有野生型轮状病毒感染的风险，研究发现成年人粪便中轮状病毒与沙门氏菌、志门氏菌等细菌病原体一样常见。因此轮状病毒的预防和检测对人类尤其是儿童的健康有重要的指示作用，对全球卫生医疗发展也具有重大意义。

国内外对轮状病毒感染的病原学检查方法主要有包括电镜技术、病毒分离培养的经典检测技术，由于病毒颗粒易于降解并且电镜设备昂贵，故电镜技术的应用大大受到限制；包括琼脂糖电泳、PCR技术、分子探针技术等基因检测技术，除了可以定性检测轮状病毒还能对样本中病毒进行定量分析，但是RNA提取较难成功且操作繁琐耗时，需要专门培训的技术人员和特殊的仪器设备；以ELISA双抗体夹心法、单克隆抗体技术、固相免疫分析技术等方法为代表的免疫检测技术在快速诊断轮状病毒方面表现得尤为突出，不仅简化了检测步骤，而且提高了检测轮状病毒的特异性和灵敏度。其中轮状病毒单克隆抗体技术不仅克服了体外培养病毒的限制，减少了对高价免疫血清的需求，还可进行血清分型、毒株鉴别，适用于大规模临床检测和流行病学调查。

因此制备轮状病毒单克隆抗体成为轮状病毒特异性检测诊断的主要方式。

发明内容

为了实现上述设计目的。

本发明的第一方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

进一步的，编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

进一步的，编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第五方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.7所示的轻链可变区核苷酸序列。

本发明的第六方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.8所示的重链可变区核苷酸序列。

本发明的第七方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤:

a)通过PCR将轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；

b)将步骤a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到轮状病毒重组蛋白单克隆抗体；

c)纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合；

所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；

所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。

本申请的有益之处在于：提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法。

具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

轮状病毒VP6蛋白优势抗原表位选择

以VP6蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。

VP6蛋白优势抗原表位串联

为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将VP6蛋白的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，并在序列碳端加His标签得到重组蛋白氨基酸序列。

优化编码重组蛋白的核苷酸序列

为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

构建重组蛋白表达载体

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(爱思进生物技术杭州有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

构建重组VP6抗原表达菌株

将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1mL保存，剩余加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。

纯化轮状病毒重组蛋白

接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。

轮状病毒重组蛋白单克隆抗体制备

取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白，共400μl/只。20天后进行加强免疫，方法为取80μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg重组蛋白腹腔加强注射，于72小时后处死小鼠，用小鼠淋巴细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离出鼠脾脏淋巴细胞。加入重组蛋白制备的荧光标记探针对目标B淋巴细胞进行染色，借助流式细胞荧光分选技术从中分离出能表达特异性抗体的单个B细胞。提取单个B细胞的mRNA，进行RT-PCR合成cDNA，以cDNA为模板，采用鼠源抗体可变区通用简并引物分别扩增出编码抗体轻、重链可变区核苷酸序列，将编码序列酶切、连接插入pcDNA3.1(+)载体中构建出表达特定抗体轻、重链的重组质粒。将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1：1质量比混合后转染进HEK293F细胞中进行单克隆抗体轻重链的表达和组装,37℃、5％CO2、120rpm摇床培养7天后收集细胞培养液并用Protein A亲和纯化出单克隆抗体。最后用12％SDS-PAGE电泳检测其纯度。

第二天进行ELISA筛选，筛选步骤如下：

包被：用包被液稀释轮状病毒VP6重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；

封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；

加样：将纯化的抗体按一定比例稀释后100μL/孔加入检测板，同时加入对照血清，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；

加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释HRP酶标二抗(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；

加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；

终止反应：以50μL/孔加入终止液；

结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示有4个阳性克隆OD值较高，经测序得到4株序列，分别为1A5，1C3，4G6，4E5。

相关溶液配方如下:

0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。

1％氯金酸溶液：AuCL₃.HCl.4H₂O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。

1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。

0.2mol/L碳酸钾溶液：碳酸钾27.64g，加超纯水溶解并定容至1000ml。

复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容到1000ml。

硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

轮状病毒单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)分别经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1μl/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃干燥12小时。

胶体金免疫检测卡的制备

组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)喷涂轮状病毒单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有胶体金标记轮状病毒单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)的金垫；(3)样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得胶体金免疫层析检测卡。

配对单抗筛选

用无菌拭子分别插入RV阳性粪便样本和正常人粪便样本，随即插入1mL稀释液中，将拭子至少旋转10次，直至标本完全溶解在稀释液中，80μL/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金层析读数仪(杭州唯赞科技有限公司)分别读取NC膜上T、C线信号并计算测量值T/(T+C)，详见表1、表2。

通过上表可知4E5单抗包被与1C3单抗标记胶体金配对为检测轮状病毒的最佳抗体配对。

一种新的轮状病毒重组蛋白VP6，通过流式细胞仪分选出与该重组蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR技术将B淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列扩增出来，将其构建成完整鼠IgG抗体序列表达载体，表达并纯化VP6单克隆抗体，筛选得到最佳单抗配对并应用于轮状病毒肠胃炎疾病早期的诊断

设计目的：

因传统制备单克隆抗体周期长、产量低，并且不同批次间抗体的差异性较大，为克服解决这些不足之处，本发明致力于通过设计、合成重组轮状病毒VP6蛋白并通过流式细胞仪和单细胞PCR筛选出与重组蛋白VP6特异性结合的淋巴B细胞并扩增出其抗体核苷酸序列，通过瞬转表达制备其单克隆抗体。

设计方案：

(1)以轮状病毒VP6蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。

(2)为了促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位串联，并在序列碳端加His标签形成重组蛋白氨基酸序列。

(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。

(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。

(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加卡那青霉素抗性筛选培养基，筛选得到重组蛋白表达菌株。

(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白。

(7)重组蛋白VP6多次免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，用淋巴细胞分离液试剂盒分离出脾淋巴细胞，利用BD FACS流式细胞仪对B淋巴细胞悬液进行分选，并收集在含有适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的96孔PCR板中，针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区，将mRNA逆转录为cDNA，通过RT-PCR克隆出对应的抗体可变区核苷酸序列，凝胶电泳分析纯化、测序，最终得到能与重组蛋白结合的抗体核苷酸序列。

(8)将重链和轻链可变区序列构建成完整鼠IgG表达载体并通过HEK293F细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)利用胶体金免疫层析筛选平台显示4E5单抗包被与1C3胶体金标记单抗配对检测轮状病毒重组蛋白为最佳组合。

SEQ ID NO1：轮状病毒重组蛋白特异性抗体1C3轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO2：轮状病毒重组蛋白特异性抗体1C3重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO3：轮状病毒重组蛋白特异性抗体4E5轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO4：轮状病毒重组蛋白特异性抗体4E5重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO5：轮状病毒重组蛋白特异性抗体1C3轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO6：轮状病毒重组蛋白特异性抗体1C3重链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO7：轮状病毒重组蛋白特异性抗体4E5轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO8：轮状病毒重组蛋白特异性抗体4E5重链可变区核苷酸序列；

序列表

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Lys Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Arg Asn Gly Asn Ser Leu Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Phe Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Tyr Cys Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Gly Arg Asn Ile Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Leu

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacatccaaa tgacccagac cacctcttcc ctgtctgcct ctctgggcga tagagtgacc 60

atctcctgta gagcttccca ggatatcagc aactacctga attggtacca gcagaagcct 120

gatggcacaa tcaagctgct gatctactac acctccagac tgcactccgg cgtccccagc 180

cggttttccg gctctggatc tggcaccgac tacagcctga ctatttctaa cctggaacaa 240

gaggacatcg ccacctactt ctgccagcag ggcgacaccc tgccttatac cttcggcgga 300

ggcaccaagc tggaaatgaa gaga 324

<210> 6

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagtgcagc tgcaagagtc cggcccttct ctggtgaagc catcccagac actgtccctg 60

acctgctccg tcaccggcga ctccattact tctggatact ggaactggat cagaaagttc 120

cctggcaaaa agctggaata catgggctac atcacctatt ctggcaacac ctactacaac 180

cccagcctga agtcccggat ctccatcacc agagacacct ccaagaacca gtactacctg 240

caactgaact ccgtgaccac cgaggataca gctacctact actgcgccag ataccgcaac 300

ggcaactccc tgtacgccta ctggggacag ggcaccctgg tgaccgtgtc cgcc 354

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacgtcctga tgacccagac ccctctgtcc ctgcctgtgt ctctcggcga ccaggcctct 60

atctcctgca gatccagcca aacattcgtg cattctgatg gcaacaccta cctggaatgg 120

tacctgcaga agcctggcca gtctccaaag ctgctgatct acaaggtgtc caatagattc 180

agcggcgtcc ccgatagatt ttctggctcc ggatctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tctagagtgg aagctgagga cctgggcgtg tactactgtt tccagggctc tcatgtgcct 300

tggaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcaagcgg 339

<210> 8

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacgttcagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cctctcagtc tctgagcctg 60

acatgttcag tcaccggcta tagcattacc agaggctact actgtaattg gatcagacag 120

tttccaggca acaagctgga gtggatgggc tccatcacct acgccggccg caacatctac 180

aacccttccc tgaagaaccg gatctctatc acaagggata cctccaagaa ccagttcttc 240

ctgcggctga actccgtgac caccgaggac accgctgtgt actactgcgc cagagaaggc 300

cctcactggt acttcgacgt gtggggcgct ggcctgaccg tgaccgtgtc ctcc 354

Claims

1.一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：

所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的轮状病毒重组蛋白特异性抗体，其特征在于：

编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

3.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。

4.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。

5.一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：

所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求5所述的轮状病毒重组蛋白特异性抗体，其特征在于：

编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；

编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。

7.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.7所示的轻链可变区核苷酸序列。

8.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.8所示的重链可变区核苷酸序列。

9.一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤: