CN115819580A - 针对人il-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供针对人IL‑12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用。本发明提供针对人IL‑12的高亲和力兔单克隆抗体对，开发出高灵敏度、特异性针对IL‑12蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法。其中，捕获抗体为针对人IL‑12的兔单克隆抗体12E3，检测抗体为经生物素标记的针对人IL‑12的兔单克隆抗体7G11，标准样品为体外重组表达的人IL‑12蛋白，检测灵敏度为11.05pg/mL，所建立的方法可以用于人IL‑12蛋白的高灵敏度检测。同时，该方法经验证与人IL‑12相似的其他人白介素系列蛋白及大鼠来源的IL‑12蛋白没有交叉反应。

Description

针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

人白介素-12蛋白(简称“人白介素-12”或IL-12)是一种异源二聚体形式的多活性细胞因子，由IL-12A(p35)和IL-12B(p40)亚基组成，主要来源于巨噬细胞、B淋巴细胞和其他抗原呈递细胞等，其靶细胞是T细胞、NK细胞和骨髓祖细胞。IL-12能促进激活的T细胞和NK细胞增殖，增强T细胞、NK细胞等的细胞毒活性并诱导其产生γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)、β肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor beta，TNF-β)等，促进NK细胞和IL-2Rα、TNF受体及CD56分子的表达，增强对肿瘤细胞的ADCC效应，是诱导细胞免疫的关键细胞因子。

另外，IL-12产生或表达异常与临床疾病有密切关系，通过测定激活淋巴细胞上清液、人外周血等中IL-12的水平，可作为对人自身免疫性疾病、哮喘、慢性肝病、艾滋病、肾细胞癌、黑色素瘤及皮肤T细胞淋巴瘤等疾病诊断、预后及观察的早期诊断。在正常人血清中IL-12蛋白水平较低，参考范围为5.62±0.78pg/mL，且其在体内的半衰期很短，约3小时，因此开发一种高灵敏度的IL-12蛋白检测方法，具有非常重要的意义。

目前，市场上的IL-12ELISA检测试剂盒常采用鼠抗人IL-12单克隆抗体，亲和力较低。

发明内容

基于此，有必要提供针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用。本发明开发的兔单克隆抗体对人IL-12的亲和力高，且利用兔单克隆抗体12E3作为捕获抗体和经生物素标记的兔单克隆抗体7G11为检测抗体，开发双抗夹心法酶联免疫检测方法，可以于人IL-12蛋白的高灵敏度检测，特异性好。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体12E3或兔单克隆抗体7G11；所述兔单克隆抗体12E3的互补决定区的序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体7G11的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

优选地，所述兔单克隆抗体12E3的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。具体地，所述兔单克隆抗体12E3的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的序列如SEQ IDNO.6所示。

优选地，所述兔单克隆抗体7G11的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。具体地，所述兔单克隆抗体7G11的轻链的序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体在制备高灵敏度检测人IL-12的试剂或者试剂盒中的应用。在其中一些实施例中，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人IL-12，其中所述兔单克隆抗体12E3作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体7G11用作标记抗体。

本发明还可以提供检测人IL-12的试剂或者试剂盒，包含上述针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体12E3和高亲和力兔单克隆抗体7G11。优选地，所述人IL-12选自重组人IL-12、细胞分泌的人IL-12、人血清中IL-12蛋白中的至少一种。

本发明还可以提供编码上述针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体的基因，或者包含该基因的表达载体。

本发明还可以提供针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建上述表达载体；转染工程细胞，培养，纯化，获得所述针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供高亲和力的抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体，开发出高灵敏度、特异性针对IL-12蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法。其中，捕获抗体为针对人IL-12的兔单克隆抗体12E3，检测抗体为经生物素标记的针对人IL-12的兔单克隆抗体7G11，标准样品为体外重组表达的人IL-12蛋白，检测灵敏度为11.05pg/mL(11.05ng/L)，所建立的方法可以用于人IL-12蛋白的高灵敏度检测。同时，该方法经验证与人IL-12相似的其他人白介素系列蛋白及大鼠来源的IL-12蛋白没有交叉反应。

附图说明

图1为试验例1中针对IL-12的血清效价检测结果统计图。

图2为试验例1中的表达载体构建示意图。

图3为针对人IL-12的兔单克隆抗体可变区序列比对结果。

图4为针对人IL-12的兔单克隆抗体的SDS-PAGE电泳结果图。

图5为针对人IL-12的兔单克隆抗体的亲和力测定结果。

图6为针对人IL-12兔单克隆抗体的抗原决定簇测定结果图。

图7为基于人IL-12兔单克隆抗体建立的酶联免疫灵敏度曲线图。

图8为基于人IL-12兔单克隆抗建立的酶联免疫方法的特异性结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明的技术构思在于开发获得高亲和力的抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体12E3和7G11，并以该抗体对开发出高灵敏度、特异性针对IL-12蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法。

其中，抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体12E3的氨基酸序列如下：

12E3-轻链全长序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSIGSYLSWYQQQPGQPPKLLIYQASKLESGVPSRFKGSGSGSEFTLTISDLECADAATYYCLCTYGSASNSFLTAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO.1)。

12E3-轻链可变区序列：

DVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSIGSYLSWYQQQPGQPPKLLIYQASKLE SGVPSRFKGSGSGSEFTLTISDLECADAATYYCLCTYGSASNSFLTAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.2)。

12E3-轻链的可变区的互补决定区CDR1的序列如下：

QSIGSYLSW(SEQ ID NO.3)。

12E3-轻链的可变区的互补决定区CDR2的序列如下：

LIYQASKLESGV(SEQ ID NO.4)。

12E3-轻链的可变区的互补决定区CDR3的序列如下：

LCTYGSASNSFLTAF(SEQ ID NO.5)。

12E3-重链全长序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNFYMNWVRQAPGEGLEWIGAIVYGGATYYTSWAEGRFTISKTSTTVDLKIPSPTTEDTATYFCARSIGGYKSGNIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK

(SEQ ID NO.6)。

12E3-重链可变区序列：

QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNFYMNWVRQAPGEGLEWIGAIVYGGA TYYTSWAEGRFTISKTSTTVDLKIPSPTTEDTATYFCARSIGGYKSGNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.7)。

12E3-重链的可变区的互补决定区CDR1的序列如下：

FSLNNFYMN(SEQ ID NO.8)。

12E3-重链的可变区的互补决定区CDR2的序列如下：

WIGAIVYGGATYYTSWAE(SEQ ID NO.9)。

12E3-重链的可变区的互补决定区CDR3的序列如下：

YFCARSIGGYKSGNI(SEQ ID NO.10)。

抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体的7G11的氨基酸序列如下：

7G11-轻链全长序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVLTQTPSSVSEPVGGTVTINCQASENIYSSLAWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFSGSGSGTEFTLTISDLECDDAATYYCQGGYYSGSDTEVAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO.11)。

7G11-轻链可变区序列：

ADIVLTQTPSSVSEPVGGTVTINCQASENIYSSLAWFQQKPGQPPKLLIYGASTLA SGVSSRFSGSGSGTEFTLTISDLECDDAATYYCQGGYYSGSDTEVAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.12)。

7G11-轻链的可变区的互补决定区CDR1的序列如下：

ENIYSSLAW(SEQ ID NO.13)。

7G11-轻链的可变区的互补决定区CDR2的序列如下：

LIYGASTLASGV(SEQ ID NO.14)。

7G11-轻链的可变区的互补决定区CDR3的序列如下：

QGGYYSGSDTEVAF(SEQ ID NO.15)。

7G11-重链全长序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSPAMSWVRQAPGKGLEWIGFIHSDGSTYYASWVNGRFTISKTSSTTVDLTLSSPTTEDTATYFCVRGAGYAGYGYAYTRLDLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK

(SEQ ID NO.16)。

7G11-重链可变区序列：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSPAMSWVRQAPGKGLEWIGFIHSDGST YYASWVNGRFTISKTSSTTVDLTLSSPTTEDTATYFCVRGAGYAGYGYAYTRLDLWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO.17)。

7G11-重链的可变区的互补决定区CDR1的序列如下：

FSLSSPAMS(SEQ ID NO.18)。

7G11-重链的可变区的互补决定区CDR2的序列如下：

WIGFIHSDGSTYYASWVN(SEQ ID NO.19)。

7G11-重链的可变区的互补决定区CDR3的序列如下：

YFCVRGAGYAGYGYAYTRLDL(SEQ ID NO.20)。

下面举例说明：

试验例1

本试验例提供抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1，动物免疫：

获得免疫原：采用重组人IL-12蛋白(ABclonal，货号RP02584)作为免疫原。其中，活性重组人IL-12蛋白由HEK293细胞表达系统产生，包含取IL-12A(登录号NP_002178.2)的Ile23-Ser328序列和IL-12B(登录号NP_000873.2)的Arg23-Ser219序列。

采用重组人IL-12蛋白(ABclonal，货号RP02584)为免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。

三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对IL-12的血清效价，血清效价的测试统计结果见图1。取OD_450nm大于0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

S2，脾脏细胞分离：

在生物安全柜中无菌操作，取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基(RPMIMedium 1640basic+1％Pen Strep；RPMI 1640购自Gibco，C11875500BT；Pen Strep购自Gibco，15140-163)，放入一个细胞筛网，将脾脏取出放置于细胞筛中，用无菌剪刀、镊子剪去脾脏上多余的结缔组织、脂肪组织后，将脾脏尽量剪碎于研筛中，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨，尽可能研磨彻底至整个脾脏组织接近于白色；研磨后的细胞会通过细胞筛网过滤至培养基中；用移液管吸取含有细胞的培养基至无菌的50mL离心管中，并吸取10mL培养基再次清洗一遍培养皿，将残余在培养皿中的细胞尽可能吸取至离心管中；室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自Biogems公司)，用移液枪轻柔的吹打细胞几次后计时1min，进行红细胞裂解，计时完成后加入37mL的基础培养基以终止反应，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入40mL常温放置的基础培养基，用移液枪吹打重悬细胞，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入20mL常温放置的B细胞培养基，用移液枪吹打重悬细胞，经由筛网再次过滤细胞，进行计数。

S3，B淋巴细胞分选：

分选方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞。

S4，获取抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的基因及表达载体：

培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNA^TM MicroPrep试剂盒说明书(ZYMO,货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。

其中，反转录体系如下：Oligo(dT)12-18primer(Life)1μL、dNTPs(10mM)(Thermo)1μL、RNA1μL；在PCR仪中进行65℃，5min后，向以上产物中加入5×FS Buffer(ABconal)4μL、DTT(100mM)(thermo)1μL、RNase OUT(40U/μL)(life)1μL、ABScriptⅡRT(200U/μL)(ABconal)1μL，混匀后在42℃1h，85℃5min反应下进行，得到cDNA。

后采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体的轻、重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来。其中PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(Primer-F，10mM)，1μL反向引物(Primer-R，10mM)，12.5μL 2×Gloria HiFi(ABclonal)，6.5μL N.FH₂O。

其中，轻链可变区的引物对为：

VL-Primer-F：

5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO.21)；

VL-Primer-R：

5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO.22)；

重链可变区的引物对为：

VH-Primer-F：

5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO.23)；

VH-Primer-R：

5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO.24)。

PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

将获得的兔单克隆抗体的重链、轻链可变区基因纯化后，分别装载在表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体见图2。其中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promoter为转录启动子，SV 40PAterminator是加尾信号，Heavychainconstant(图2a)和Light chain constant(图2b)分别为兔重链不变区和轻链不变区序列。将含兔重链不变区和轻链不变区序列的哺乳动物表达质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，采用同源重组的方式分别将重链和轻链可变区基因连接到相应的哺乳动物表达载体上，并经测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。

测得兔单克隆抗体12E3-轻链基因如下：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGCCTGCTCCTCTTGTGGCTGCCTGGAGCGCGCTGTGA TGTTGTCATGACACAGACCCCTGCATCCGTGGAGGCGGCTGTTGGAGGTACGGTTACTATTAAGTGCCAGGCTTCC CAATCCATTGGAAGTTACCTCTCATGGTATCAGCAACAGCCTGGGCAGCCGCCCAAACTGCTCATTTATCAAGCAA GTAAACTCGAATCTGGAGTGCCATCCCGGTTCAAAGGTAGCGGATCAGGTAGCGAGTTCACCCTCACTATCTCAGA CCTGGAGTGCGCAGACGCCGCGACCTATTACTGTCTCTGTACCTATGGCTCCGCGAGCAATTCATTTCTGACCGCA TTCGGAGGCGGGACCGAGGTGGTCGTTAAGGGTGACCCAGTTGCGCCGACGGTCCTCATCTTTCCGCCCGCAGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ IDNO.25)，其中下划线部分为轻链可变区序列。

2E3-重链基因序列如下：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTTGCTGTTTTGAAGGGGGTTCA

ATGCCAGAGTCTGGAAGAGAGTGGTGGAAGACTGGTTACGCCGGGAACACCTTTG

ACACTCACCTGTACTGTTAGCGGATTTAGCCTCAACAATTTTTATATGAATTGGGTCA

GGCAGGCCCCCGGTGAGGGTCTCGAATGGATCGGTGCTATTGTTTACGGGGGTGCT

ACTTATTACACCAGTTGGGCTGAGGGTCGGTTTACGATCTCAAAAACTTCTACAACA

GTGGATTTGAAGATCCCCTCTCCAACCACCGAGGATACAGCTACCTACTTTTGTGCC

CGGAGTATTGGTGGTTACAAGTCAGGAAATATTTGGGGCCCAGGCACTTTGGTGAC

GGTTTCCTCCGGTCAGCCCAAAGCGCCTTCTGTGTTTCCCTTGGCACCCTGTTGTGG

AGATACGCCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGG

AGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTC

CCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGAC

CTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAA

GTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGA

ACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA

TGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGAC

CCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCC

GCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCA

TCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAA

GGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTG

GAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGG

TCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGG

AGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACA

GCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAG

CGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACAC

GCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO.26)，其中下划线部分为重链可变区序列。

测得兔单克隆抗体7G11-轻链基因序列如下：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCTTGCTCCTCTGGTTGCC

TGGTGCCAGATGTGCCGATATTGTCCTGACTCAGACCCCATCCTCTGTCTCTGAACC

GGTGGGGGGAACTGTTACCATAAATTGTCAGGCTTCAGAGAATATATACAGTAGCCT

GGCGTGGTTTCAGCAAAAACCCGGACAACCCCCGAAGTTGCTCATTTACGGTGCTT

CTACGCTCGCTTCAGGTGTGTCTAGTCGCTTTAGTGGTTCAGGCTCTGGCACCGAGT

TCACTCTGACGATCTCCGATTTGGAGTGTGACGATGCCGCCACGTACTACTGTCAGG

GCGGCTACTACTCAGGTTCCGATACAGAGGTGGCTTTCGGGGGTGGAACTGAGGTT

GTGGTGAAGGGCGATCCGGTCGCACCTACTGTGCTCATATTTCCACCCGCTGCTGAT

CAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGA

TGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAAC

AGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGAC

ACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAG

GGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO.27)，其中下划线部分为轻链可变区序列。

7G11-重链基因序列如下：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCAGTTCTGAAGGGTGTTCA

GTGTCAGTCTGTGGAAGAAAGTGGTGGTCGCCTCGTCACACCAGGTACACCGCTGA

CGCTGACCTGCACCGTGTCAGGGTTTTCTCTCTCCAGTCCCGCCATGTCTTGGGTCC

GCCAAGCGCCAGGTAAGGGTTTGGAGTGGATCGGATTCATCCATAGCGATGGCTCTA

CATATTACGCCTCATGGGTCAATGGGCGGTTCACTATCTCCAAAACGTCTTCAACAA

CAGTTGACCTCACTCTGTCAAGTCCCACGACGGAAGACACTGCCACATACTTTTGC

GTGCGGGGGGCAGGATACGCGGGGTATGGATACGCTTACACACGGTTGGACCTGTG

GGGACAGGGTACACTCGTTACTGTCTCATCCGGTCAACCGAAGGCGCCATCAGTGT

TCCCATTGGCGCCATGTTGCGGAGATACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGC

CTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCT

CACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCT

GAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCC

CACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCA

AGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCC

CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTG

GTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGA

GCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATC

CGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGT

TCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC

AAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGG

AGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCT

TCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAG

ACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTC

AGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCAC

GAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATA

A(SEQ ID NO.28)，其中下划线部分为重链可变区序列。

并且，抗体可变区氨基酸序列比对见图3，可以看出12E3和7G11重轻链可变区的互补决定区氨基酸序列均有明显差异，表明两者可能识别不同的抗原决定簇。

S5，工程细胞培养纯化获得抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体：

将步骤S4获得的含有相应兔单克隆抗体轻、重链基因的表达质粒共转染到293F细胞；培养72～96h时，获得培养上清中含有重组的、识别人IL-12蛋白的兔单克隆抗体。

使用protein A 亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人IL-12蛋白的兔单克隆抗体，实验步骤如下：

将培养上清转移至无菌50mL离心管中，1000g，4℃(或常温)离心10分钟，收集上清液。将预处理后的Protein A Agarose悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育3-4小时(室温)或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，用掌上离心机常温离心1分钟，使固液分离，收集流穿液。加入10倍Protein AAgarose体积的洗涤缓冲液并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入l洗脱缓冲液，用离心机离心，获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋中，透析过夜后，得到纯化后的、可以识别人IL-12重组蛋白的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，胶图见图4：可清晰可见兔单克隆抗体12E3和7G11的重链及轻链条带，抗体纯度>90％，测得浓度均为1mg/mL；合格后分装，于-20℃低温保存备用。

本试验例最终筛选获得抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体12E3和7G11：

抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体12E3的轻链氨基酸序列如为SEQ ID NO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体7G11的轻链氨基酸序列如为SEQ ID NO.11所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15；重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。

试验例2

本试验例提供抗人IL-12蛋白兔单克隆抗体12E3和7G11的筛选和鉴定方法，包括如下步骤：

利用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对试验例1纯化获得的抗人IL-12兔单克隆抗体12E3和7G11的亲和力进行精确测定。

其中，本试验例所使用抗体12E3和7G11的浓度分别为2μg/mL，并分别将其固定在pro A探针上；然后针对抗体12E3和7G11抗体分别用150nM、75nM两个浓度的重组人IL-12蛋白(ABclonal，货号RP02584)去结合，获得亲和力曲线，结果见图5。

最终通过曲线拟合和计算抗体亲和力(KD＝Koff/Kon)，获得针对人IL-12兔单克隆抗体12E3的亲和力为1.95×10^-9M(图5a)；针对人IL-12兔单克隆抗体7G11的亲和力为2.14×10^-9M(图5b)。

试验例3

本试验例提供抗原识别表位的鉴定方法，使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪，对兔抗人IL-12单克隆抗体12E3和7G11(试验例1纯化获得)在人IL-12蛋白上面所结合的抗原识别表位进行鉴定。

其中使用到的材料为His-tag重组人IL-12蛋白(ABclonal，货号RP02584)，使用浓度为6μg/mL，使用所获得兔抗人IL-12抗体12E3和7G11的浓度分别为3.34μg/mL和4.26μg/mL。测试结果见图6。

通过分析两种抗体之间的配对数据可知，在兔抗人IL-12单克隆抗体12E3和重组人IL-12蛋白结合后，兔抗人IL-12单克隆抗体7G11仍旧能够结合重组人IL-12蛋白，证明兔抗人单克隆抗体12E3和7G11结合在IL-12蛋白表面不同的部位，且相互不干扰。

试验例4

本试验例提供针对人IL-12蛋白的兔单克隆抗体12E3和7G11，建立双抗夹心法酶联免疫检测方法：

1)包被：将兔单克隆抗体12E3(捕获抗体，试验例1纯化获得)用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。

2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

3)封闭：将E013封闭液(含有5％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20、pH7.2，0.05M的磷酸盐缓冲液)，以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用。

4)加蛋白：将标准样品(重组人IL-12蛋白，ABclonal，货号RP02584)、待测样品用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释，稀释浓度：2000,1000,500,250,125,62.5,31.25,0pg/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

6)加检测抗体：将兔单克隆抗体7G11-biotin稀释成0.04μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。

其中，标记单克隆抗体7G11的方法为：将抗人重组Human IL-12蛋白的单克隆抗体7G11配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚胺基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL单克隆抗体7G11溶液，加入10μLTris-HCl溶液终止反应；最后加入4mL pH＝7.4的1×PBS溶液，用排阻极限为30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡，得兔单克隆抗体7G11-biotin。

7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

8)加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

10)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

11)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数，用OD_450nm减去OD_630nm位校正后的吸光度值。

12)以重组人Human IL-12蛋白浓度为横坐标，校正后吸光度值为纵坐标作图，拟合得到的曲线图如图7所示。

以18个0孔平均值+2*SD代入标准拟合曲线，得出抗人Human IL-12蛋白的单克隆抗体12E3和7G11建立的双抗夹心酶联免疫检测方法的检测灵敏度为11.05pg/mL。

试验例5

本试验例针对人IL-12的兔单克隆抗体12E3和7G11的交叉反应检测，human G-CSF、human IL-6、RatIL-12被用于对兔单克隆抗体12E3和7G11的交叉反应检测，所有标准品蛋白的浓度均为1μg/mL。采用的方法参照例4所述的双抗夹心法酶联免疫检测方法，其中步骤4)加蛋白过程为：将重组Human IL-12蛋白用稀释液稀释成100pg/mL。测试结果统计见图8。

图8的测试结果显示：基于兔单克隆抗体12E3和7G11的双抗夹心法酶联免疫检测方法对于humanIL-6及其他人白介素相似蛋白均无明显交叉反应，证明蛋白兔单克隆抗体12E3和7G11对于人IL-12蛋白具有高特异性。

总体来讲，本发明从通过免疫兔的方法，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞并进行相关培养，并通过特定引物提取抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，进一步构建到特定表达载体上，转染细胞，培养，获得含有兔单克隆抗体12E3、7G11的上清，纯化筛选得兔单克隆抗体12E3和7G11。

本发明实质提供了高亲和力的Human IL-12兔单克隆抗体对：兔单克隆抗体12E3和7G11，并证明了这两个抗体可以识别Human IL-12蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。本发明利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒相较市售常见的鼠源IL-12ELISA检测试剂盒，具有亲和力高、特异性好、检测灵敏度高等优点，且兔单克隆抗体制备12E3和7G11的方法的稳定性较高，批间差异小。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体12E3或兔单克隆抗体7G11；

所述兔单克隆抗体12E3的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；

所述兔单克隆抗体7G11的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体12E3的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或，所述兔单克隆抗体12E3的重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；或者

所述兔单克隆抗体7G11的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或所述兔单克隆抗体7G11重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求2所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体12E3的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或所述兔单克隆抗体12E3的重链的序列如SEQ ID NO.6所示；或者

所述兔单克隆抗体7G11的轻链的序列如SEQ ID NO.11所示，和/或所述兔单克隆抗体7G11的重链的序列如SEQ ID NO.16所示。

4.一种针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体偶联物，其特征在于，采用权利要求1至3任一项所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体与偶联分子制备而成。

5.如权利要求1至3任一项所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体在制备检测人IL-12的试剂或者试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人IL-12，其中所述兔单克隆抗体12E3作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体7G11用作标记抗体。

7.一种检测人IL-12的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体12E3和高亲和力兔单克隆抗体7G11。

8.根据权利要求7所述的检测人IL-12的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述人IL-12选自重组人IL-12、细胞分泌的人IL-12、人血清中IL-12蛋白中的至少一种。

9.一种权利要求1所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体的基因或者该包含基因的表达载体。

10.权利要求1至3任一项所述的针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建如权利要求9所述的表达载体；

转染工程细胞，培养，纯化，获得所述针对人IL-12的高亲和力兔单克隆抗体。

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