CN118126175A

CN118126175A - 抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体制备方法及应用

Info

Publication number: CN118126175A
Application number: CN202410227189.1A
Authority: CN
Inventors: 程瑶; 吴海; 雷雅君; 田科; 涂雅伦; 王田利; 徐若
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本申请公开了一种抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体、制备方法及应用，属于生物技术领域。该单克隆抗体能够特异性结合大鼠白介素10蛋白，因此，可用该单克隆抗体制备检测大鼠白介素10蛋白水平的试剂盒。另外，由于该抗大鼠白介素10的单克隆抗体具有高亲和力，且通过测试证明抗体对结合于大鼠白介素10表面的不同抗原决定簇，可以用于建立抗大鼠白介素10蛋白的双抗夹心酶联免疫检测方法，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

Description

抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体制备方法及应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体制备方法及应用。

背景技术

白细胞介素10(IL-10)，也称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，是一种多效性细胞因子，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用。IL-10主要由辅助性T细胞2(Th2)、活化的B细胞、单核细胞、巨噬细胞产生，IL-10参与免疫细胞、炎症细胞、肿瘤细胞等多种细胞的生物调节，在自身免疫性疾病、严重感染性疾病、肿瘤及移植免疫等多种疾病中发挥重要作用。

IL-10是一种抗炎因子，是免疫应答的重要调节剂，IL-10直接影响APC通过下调MHCⅡ类和共刺激分子在巨噬细胞和单核细胞表面的表达而起作用；IL-10抑制许多促炎细胞因子、趋化因子和趋化因子受体的表达，并介导过敏原特异性免疫治疗中的过敏原耐受性；IL-10抑制TH1淋巴细胞产生的IFN-g和IL-2，抑制TH2淋巴细胞产生IL-4和IL-5；IL-10还可以抑制细胞表面抗原的表达，如CD23、CD80、CD86等，辅助功能的这种抑制主要是TH1和TH2细胞因子产生的抑制。近期研究数据表明，IL-10通过抑制T细胞共刺激分子CD28和诱导型T细胞共刺激因子的表达直接在T细胞上起作用，抑制T细胞相关因子的产生，从而调节T细胞活化的阈值。IL-10促进人B细胞的存活、增殖和分化，并增加IgG4的产生。

白介素IL-10在疾病研究方面的应用比较广泛。比如，在人类过敏性疾病中，IL-10起着重要的调节作用。有研究证明健康受试者的呼吸道中IL-10的表达量比哮喘和过敏性鼻炎患者的呼吸道中含量高。在小鼠敲除IL-10的测试中，小鼠可以生成慢性结肠炎。IL-10对嗜酸性粒细胞存活和IL-4诱导的IgE合成具有抑制作用；IL-10属于细胞毒性T细胞的生长辅助因子；细胞免疫和过敏性炎症相关的细胞因子的表达会被IL-10抑制；IL-10还可以刺激体液应答。

发明内容

为解决或缓解上述部分技术问题，本申请提供了一种抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，所述抗体能与大鼠白细胞介素10蛋白特异性结合且具有高亲和力。该单克隆抗体可应用于制备检测大鼠白细胞介素10蛋白水平的试剂盒，以实现对大鼠白细胞介素10检测，可应用于产业上的大鼠白细胞介素10的检测以及相关疾病的诊断和治疗，具有重要的实用价值。

为此，本申请至少公开了如下技术方案：

(1)一种抗体，所述第一抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:3所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:4所示的VLCDR2以及如SEQ ID NO:5所示的VLCDR3；

和/或

三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:8所示的VHCDR1、如SEQ ID NO:9所示的VHCDR2以及如SEQ ID NO:10所示的VHCDR3。

(2)一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：如SEQ IDNO:1所示的轻链；以及如SEQ ID NO:6所示的重链。

(3)一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：如SEQ IDNO:2所示的轻链可变区(VL)；以及如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(VH)。

(4)一种抗体，所述第二抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:13所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:14所示的VLCDR2以及如SEQ ID NO:15所示的VLCDR3；

和/或

三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO:18所示的VHCDR1、如SEQ ID NO:19所示的VHCDR2以及如SEQ ID NO:20所示的VHCDR3。

(5)一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：如SEQ IDNO:11所示的轻链；以及如SEQ ID NO:16所示的重链。

(6)一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：如SEQ IDNO:12所示的轻链可变区(VL)；以及如SEQ ID NO:17所示的重链可变区(VH)。

(7)一种抗体衍生物，包含前述的抗体以及与所述抗体连接的缀合物。

(8)一种试剂盒，用于检测大鼠白细胞介素10，所述试剂盒包括前述的抗体或前述抗体衍生物。

(9)一种检测白细胞介素10的方法，其包括：获得所述抗体；以前述抗体作为捕获抗体，以经生物素标记的所述抗体作为检测抗体，构建双抗夹心酶联免疫检测的步骤。

(10)前述抗体或前述抗体衍生物或前述试剂盒在检测大鼠白细胞介素10的应用。

附图说明

图1为本申请实施例提供的构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图。

图2为本申请实施例提供的构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图。

图3为本申请实施例提供的抗大鼠白细胞介素10第一抗体的亲和力曲线图。

图4为本申请实施例提供的抗大鼠白细胞介素10第二抗体的亲和力曲线图。

图5为本申请实施例提供的抗大鼠白细胞介素10第一抗体和第二抗体的EPassay测试结果。

图6为本申请实施例提供的第一抗体和第二抗体对大鼠白细胞介素10的ELISA检测结果图。

图7为本申请实施例提供的第一抗体和第二抗体夹心ELISA的交叉蛋白识别数据图。

图8为本申请实施例提供的第一抗体和第二抗体热稳定性测试结果统计图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规测试方法，可从现有技术中获知。

在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与大鼠白细胞介素10特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括能识别相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“兔抗体”或“抗大鼠白细胞介素10的单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在其中一个实施例中，抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的CDR和骨架区(FR)。术语“抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的或体内体细胞突变引入的突变。然而，术语“抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体”并不包括CDR区来自其他哺乳动物的种系(如小鼠)的抗体。

在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavychain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Lightchain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variableregion，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有三个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariableregion，HVR)或互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH和VL的三个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-bindingsite)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。

在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以通过相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

在本申请中，术语“双抗体夹心酶联免疫检测法”、“双抗夹心酶联免疫法”、“双抗夹心酶联免疫检测方法”、“双抗夹心酶联免疫检测”表示同一概念，可以互换使用；术语“大鼠白细胞介素IL-10”、“大鼠白细胞介素IL-10蛋白”、“Rat IL-10”等表示同一概念，可以互换使用。

本申请实施例成功开发了一对高亲和力的抗大鼠白细胞介素10蛋白兔单克隆抗体，同时开发了一种高灵敏度和特异性针对大鼠白细胞介素10蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

本申请实施例中所制备的抗大鼠白细胞介素10蛋白的兔单克隆抗体包括第一抗体和第二抗体，第一抗体和第二抗体通过蛋白相互作用非标技术验证证明其结合于大鼠白细胞介素10表面的不同抗原决定簇，可以用于建立针对大鼠白细胞介素10蛋白的双抗夹心酶联免疫检测方法。

本申请实施例提供的基于所述的抗大鼠白细胞介素10蛋白兔单克隆抗体所建立的大鼠白细胞介素10双抗夹心酶联免疫检测方法，捕获抗体为第一抗体，检测抗体为经生物素标记的第二抗体，标准样品为体外重组表达的大鼠白细胞介素10蛋白，检测灵敏度高，所建立的方法可以用于大鼠白细胞介素10蛋白的高灵敏度检测。

基于此，本申请实施例公开了一种第一抗体，其特异性结合大鼠白细胞介素10。所述第一抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VLCDR1，其由SEQ ID NO:3所示序列组成；VLCDR2，其由SEQ ID NO:4所示序列组成；以及VLCDR3，其由SEQ ID NO:5所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第一抗体，其特异性结合大鼠白细胞介素10。所述第一抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：VHCDR1，其由SEQ ID NO:8所示序列组成；VHCDR2，其由SEQ ID NO:9所示序列组成；以及VHCDR3，其由SEQ ID NO:10所示序列组成。

在某些实施例中，所述第一抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VLCDR1，其由SEQ ID NO:3所示序列组成；VLCDR2，其由SEQ IDNO:4所示序列组成；VLCDR3，其由SEQ ID NO:5所示序列组成；以及三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：VHCDR1，其由SEQ ID NO:8所示序列组成；VHCDR2，其由SEQ ID NO:9所示序列组成；VHCDR3，其由SEQ ID NO:10所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第一抗体，所述第一抗体包含：轻链可变区(VL)；所述轻链可变区由SEQ ID NO:2所示序列组成；及重链可变区(VH)；所述重链可变区由SEQ ID NO:7所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第一抗体，所述第一抗体包含：轻链(L)，所述轻链由SEQ ID NO:1所示序列组成；及重链(H)，所述重链(H)由SEQ ID NO:6所示序列组成。

基于此，本申请实施例公开了一种第二抗体，其特异性结合大鼠白细胞介素10，所述第二抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VLCDR1，其由SEQ ID NO:13所示序列组成；VLCDR2，其由SEQ ID NO:14所示序列组成；以及VLCDR3，其由SEQ ID NO:15所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第二抗体，其特异性结合大鼠白细胞介素10，所述第二抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：VHCDR1，其由SEQ ID NO:18所示序列组成；VHCDR2，其由SEQ ID NO:19所示序列组成；以及VHCDR3，其由SEQ ID NO:20所示序列组成。

在某些实施例中，所述第二抗体包含三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：VLCDR1，其由SEQ ID NO:13所示序列组成；VLCDR2，其由SEQ IDNO:14所示序列组成；VLCDR3，其由SEQ ID NO:15所示序列组成；以及三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：VHCDR1，其由SEQ ID NO:18所示序列组成；VHCDR2，其由SEQ ID NO:19所示序列组成；VHCDR3，其由SEQ ID NO:20所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第二抗体，所述第二抗体包含：轻链可变区(VL)；所述轻链可变区由SEQ ID NO:12所示序列组成；及重链可变区(VH)；所述重链可变区由SEQ ID NO:17所示序列组成。

基于此，本申请实施例还公开了一种第二抗体，所述第二抗体包含：轻链(L)，所述轻链由SEQ ID NO:11所示序列组成；及重链(H)，所述重链(H)由SEQ ID NO:16所示序列组成。

基于此，本申请实施例公开了上述抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体的制备方法，本申请的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，如通过基因工程重组技术来获得；通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。

基于此，本申请实施例还公开了一种抗体衍生物，其包含前述第一抗体以及与前述第一抗体连接的缀合物，或包含前述第二抗体以及与前述第二抗体连接的缀合物。

本申请中，“缀合物”是通过化学修饰产生的抗原结合部分。在一个实施例中，所述化学修饰可以是化学交联。在一个实施例中，一个或多个缀合物可以共价连接到抗体或非共价连接到抗体上。在一个实施例中，该缀合物可以是共价附着到该抗体上的分子标记，以便于检测其抗原。该缀合物可以是任何合适的小分子。所述小分子可以包括但不限于，例如，生物素、链霉亲和素，和/或荧光染料。所述荧光染料可以是任何合适的荧光染料，包括但不限于AlexaFlour染料、氨基香豆素(AMCA)、Atto染料、花菁染料、DyLight染料、FITC、荧光探针647H、罗丹明和德克萨斯红。所述AlexaFlour染料包括但不限于AlexaFlour488、AlexaFlour555、AlexaFlour568、AlexaFlour594、AlexaFlour647和AlexaFlour700。所述Atto染料可以包括但不限于Atto390、Atto488、Atto565、Atto633和Atto700。所述花菁染料可以包括但不限于Cy3、Cy5和Cy5.5。DyLight染料可以包括但不限于DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594、DyLight633、DyLight650、DyLight680、DyLight755和DyLight800。在一个实施例中，所述缀合物可以是具有两个共价连接的荧光分子的串联染料。在实施例中，一个荧光分子作为供体，另一个作为受体。在一个实施例中，所述供体具有供体激发特性，而所述受体具有受体发射特性，二者可以进行独特荧光激发和发射反应。所述串联染料可包括但不限于异藻蓝蛋白-Cy5.5、异藻蓝蛋白-Cy7、PE-Atto594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、PE-AlexaFluor647、PE-AlexaFluor700，PE-AlexaFluor750、APC-AlexaFluor750和PerCP-Cy5.5。

在一些实施例中，缀合物也可以是大分子。在一个实施例中，该大分子可以是一种酶。该酶可包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(Gox)、辣根过氧化酶(HRP)。在一个实施例中，该大分子可以是荧光蛋白。该荧光蛋白可包括但不限于异藻蓝蛋白(APC)、B-藻红蛋白(BPER-藻红蛋白(R-PE)、PerCP和R-藻蓝蛋白(RPC)。在一个实施例中，大分子也可以是一种具有不同抗SARS-CoV-2S1兔单克隆抗体特异性的抗体，形成一个具有多种特异性的多价抗体。

基于此，本申请实施例还公开了一种试剂盒，用于检测大鼠白细胞介素10，所述试剂盒包括前述第一抗抗体和/或前述第二抗体，或前述抗体衍生物。

在某些实施例中，所述试剂盒包含特异性识别大鼠白细胞介素10的前述第一抗体和前述第二抗体，其中，第一抗体为捕获抗体，第二抗体为检测抗体。

基于此，实施例还公开了一种检测白细胞介素10的方法，其包括：获得所述抗体；以前述抗体作为捕获抗体，以经生物素标记的所述抗体作为检测抗体，构建双抗夹心酶联免疫检测的步骤。在某些实施例中，利用第一抗体作为捕获抗体，经生物素标记的所述第二抗体作为检测抗体，构建双抗夹心酶联免疫检测的步骤。

基于此，本申请实施例还公开了前述第一抗体或前述第二抗体或前述抗体衍生物或前述试剂盒在检测大鼠白细胞介素10的应用。

下面结合更加具体的实施例对本申请作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本申请的限制。

1、单克隆抗体的制备

在某些实施方式中，制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，所述制备方法包括：以大鼠白细胞介素10蛋白(重组表达)为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养；提取阳性克隆的B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA；cDNA经PCR扩增获得天然配对的兔单克隆抗体；将天然配对的兔单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因分别装载至表达载体上，并将载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从宿主细胞的培养液分离，纯化获得所述的单克隆抗体。

在上述实施方式的某些实施例中，其具体步骤包括：

(1)免疫原制备：本申请用来制备Rat IL-10兔单克隆抗体的免疫原为重组大鼠白细胞介素10蛋白，使用Rat IL-10(SwissProt：P29456)蛋白对应的基因片段构建至pYURK-secrecon-ChFC载体，在哺乳动物表达系统中表达出具有生物活性的高质量重组大鼠IL-10成熟蛋白。

(2)动物免疫：以重组大鼠白细胞介素IL-10蛋白为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次；三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对Rat IL-10的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原在皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏；

(3)脾脏细胞分离：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40ml的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10ml基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13ml常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37ml，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40ml常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20ml常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

(4)B淋巴细胞分选：B淋巴细胞筛选方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》。

(5)编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成；其中，用于扩增轻链可变区(VL)的引物对如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。用于扩增重链可变区(VH)的引物对如SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24所示。

PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL2×GloriaHiFi，6.5μLH₂O；2×GloriaHiFi试剂由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供；

PCR扩增程序：98℃预变性30s；随后按照98℃，10s、64℃，30s、72℃，30s的条件进行40次循环；最后在72℃保持5min；得到的反应液置于4℃保存；

(6)对于扩增结果经测序确定序列。

(7)单克隆抗体的生产和纯化；为了获得多株识别Rat IL-10的兔单克隆抗体，本申请将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图1和图2。图1和图2中，pRB322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearlypromotor为在真核生物中的启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，图1中重链常数(Heavy chain constant)为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图2中轻链常数(Light chain constant)为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。

将质粒转染293F细胞；转染72～96小时获得培养上清中含有重组的识别Rat IL-10的兔单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出识别RatIL-10的重组兔单克隆抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。

结果：本申请实施例筛选出两种识别大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，分别为第一抗体(6E12)和第二抗体(11E3)；其中，第一抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:6；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

第二抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:11重链氨基酸序列为SEQ ID NO:16；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。

2、单克隆抗体的筛选与鉴定

本申请实施例中，在获得多株抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体后，首先对抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定。

(1)抗体亲和力的鉴定

对所获得的抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体进行抗体亲和力的初步鉴定，通过ProbeLife公司的Gator生物分子相互作用分析仪(GatorPrime设备)进行，使用探针为Pro1探针。将待测第一抗体(6E12)、第二抗体(11E3)分别固化在Pro1探针上，固化浓度为3μg/ml；然后针对第一抗体、第二抗体分别用150nM、70nM两个浓度的重组Rat IL-10蛋白去结合，获得亲和力曲线，如图3～4所示。

结果：第一抗体和第二抗体对大鼠白细胞介素10的亲和力检测结果如表1所示：

表1

	K_off(1/s)	K_on(1/Ms)	KD(M)
				第一抗体(6E12)	3.75×10^-4	5.78×10⁵	6.49×10^-10
第二抗体(11E3)	6.25×10^-5	3.7×10⁵	1.69×10^-10

从表1、图3～4可知，第一抗体(6E12)和第二抗体(11E3)针对大鼠白细胞介素10的解离系数分别为3.75×10^-4、6.25×10^-5，亲和力常数分别为5.78×10⁵、3.7×10⁵，解离平衡常数为6.49×10^-10、1.69×10^-10；显示出第一抗体和第二抗体均与大鼠白细胞介素10具有较高的亲和力。

(2)抗原识别表位的鉴定

本申请实施例中，对本申请中所获得的抗大鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体与大鼠白细胞介素10蛋白的抗原识别表位进行鉴定，通过GatorPrime设备进行，使用探针为HFC(Anti-HIgGFC)Probe对所获得抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中使用到的材料为重组Rat IL-10蛋白，使用浓度为5μg/ml，以第一抗体(6E12)作为第一抗体，浓度为3μg/ml，以第二抗体(11E3)作为第二抗体，浓度为1μg/ml；通过分析两种抗体之间的配对数据，从中确定其识别抗原表位决定簇是否相同。

结果：如图5所示，固化重组Rat IL10蛋白后的探针在结合第一抗体(6E12)后能明显结合第二抗体(11E3)，此时shift值为0.233，以上结果说明，第一抗体和第二抗体结合Rat IL10蛋白的表位不一致，因此，第一抗体和第二抗体可组合为针对Rat IL-10蛋白的兔单克隆抗体对。

3、第一抗体和第二抗体建立双抗夹心法酶联免疫检测(灵敏度检测)

在本申请实施例中，将第一抗体作为捕获抗体、将第二抗体作为检测抗体进行双抗夹心ELISA测试，具体测试步骤包括：

(1)检测抗体-第二抗体(11E3)生物素标记

将抗Rat IL-10兔单克隆第二抗体(11E3)配成1mg/ml的溶液，用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/ml的溶液；取1mg/ml的抗Rat IL-10兔单克隆第二抗体(11E3)溶液200μL，加入10μL、60mg/ml的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50μg、500mM、PH9.0的Tris溶液中止反应；加入大量pH7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

(2)双抗夹心法酶联免疫检测

包被：将第一抗体(6E12)用1×PBS稀释成1μg/ml，涡旋仪混匀后，以100μl/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h；

洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；

封闭：将封闭液(1×PBS中含2％BSA+5％蔗糖+0.05％Tween20+0.1％proclin300，PH7.2)以200μl/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用；

加蛋白：将Rat IL10蛋白用稀释液(1×PBS中含2％BSA+0.05％Tween20+0.1％proclin300，PH7.2)进行稀释，稀释至浓度分别为：1000,500,250,125,62.5,31.25,15.63,0pg/ml，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；

洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；

加检测抗体：将抗Rat IL-10兔单克隆第二抗体(11E3)-biotin稀释成0.025μg/ml后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；

加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；

加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/LHCL)，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

以重组Rat IL-10蛋白浓度为横坐标，吸光值的校正值(OD450-OD630)为纵坐标作图。以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低重组Rat IL-10蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度。

结果如图6所示，第一抗体作为捕获抗体，第二抗体作为检测抗体，对大鼠白细胞介素10进行ELISA检测，体现出良好的线性，使检测具备良好的灵敏度和准确性。

4、第一抗体和第二抗体的交叉反应测试(特异性检测)

本申请实施例中，抗大鼠白细胞介素10蛋白兔单克隆第一抗体和第二抗体的交叉反应测试的具体步骤包括：用多种与Rat IL-10相近的蛋白对抗Rat IL-10的兔单克隆第一抗体(6E12)和兔单克隆第二抗体(11E3)的特异性进行检测，采用前述实施例中的双抗夹心法酶联免疫检测方法进行检测，其中，标准品蛋白的浓度均为1000pg/ml。

如图7所示，使用本申请实施例提供的兔单克隆第一抗体(6E12)和兔单克隆第二抗体(11E3)对多种蛋白进行双抗夹心酶联免疫检测时，兔单克隆第一抗体(6E12)和兔单克隆第二抗体(11E3)只与Rat IL-10结合，不与其他蛋白产生任何交叉反应；说明本申请实施例提供的兔单克隆第一抗体(6E12)和兔单克隆第二抗体(11E3)对Rat IL-10蛋白具有高度的特异性。

5、第一抗体和第二抗体的热稳定性测试

本申请实施例中，具体步骤包被：将兔第一抗体(6E12)用1×PBS稀释成2μg/ml，涡旋仪混匀后，以100μl/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样350μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；封闭：将封闭液以200μl/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h；热破坏：将包被好的酶标板、冻干蛋白、100X浓缩的检测抗体分成两份，分别置于-20℃、37℃密封保存，7天后取出测试；加蛋白：将不同条件下保存的Rat IL-10蛋白用稀释液稀释成1000pg/ml，然后以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加检测抗体：将不同条件下保存的11E3-biotin进行100倍稀释后，以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加TMB显色液：将TMB显色液以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；

孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

统计结果如图8所示，兔单克隆第一抗体(6E12)和兔单克隆第二抗体(11E3)经-20℃处理后，测定大鼠白介素IL-10浓度的结果使用Logistic曲线四参数建立的标准曲线方程为：Y2＝0.100+4.98X₂ ^1.205/(X₂ ^1.205+297.82)(R²＝0.9966)；Y2为-20℃下吸光度值的校正值(Y2＝OD450nm-OD630nm)，X2为Rat IL-10的浓度。

经37℃处理后建立的标准曲线方程为：Y4＝0.092+75.65X₂ ^0.960/(X₂ ^0.960+2591.89)(R²＝0.9984)；Y4为37℃下吸光度值的校正值(Y4＝OD450nm-OD630nm)；X2为Rat IL-10的浓度。

如表2所示，分别经过-20℃、37℃处理的兔单克隆第一抗体(6E12)和第二抗体(11E3)检测Rat IL-10蛋白浓度的变异系数小于15％，说明本申请实施例提供的抗Rat IL-10兔单克隆第一抗体(6E12)和第二抗体(11E3)的热稳定性较强。

表2

保存基准值	单组分(破坏酶标板)值	单组分(破坏标准品)值	单组分(破坏检测抗体)值	全组份值
					0.0809	0.07405	0.0737	0.057	0.0585
0.15825	0.1415	0.1412	0.1243	0.1422
					0.21725	0.2981	0.1934	0.1778	0.36505
0.36755	0.32985	0.32205	0.2873	0.38725
					0.626	0.5714	0.55325	0.5394	0.7466
1.11235	1.01785	0.9301	0.9288	1.06505
					1.95435	1.8165	1.7069	1.8599	2.0021
3.2744	3.136	2.97715	2.7987	3.12335
					变异系数CV(％)	8.12	8.73	13.85	11.30

6、对抗Rat IL-10兔单克隆第一抗体和第二抗体灵敏度测试

本申请实施例具体步骤包被：将兔单克隆抗体6E12用1×PBS稀释成2μg/ml，涡旋仪混匀后，以100μl/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样350μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；封闭：将封闭液以200μl/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用；加蛋白：将Rat IL-10蛋白用稀释液进行稀释，稀释至浓度为：1000,500,250,125,62.5,31.25,15.63,0pg/ml，然后以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；加空白孔：将稀释液，以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加检测抗体：将11E34-biotin稀释成0.025μg/ml后，以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；加TMB显色液：将TMB显色液以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

表3为对抗Rat IL-10兔单克隆第一抗体和第二抗体灵敏度测试结果，从表3中可知，该抗体对的灵敏度为4.71pg/ml。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

表3

SEQ ID NO:1:"L-1"

SEQ ID NO:2:"VL-1"

SEQ ID NO:3:"VLCDR1-1"

SEQ ID NO:4:"VLCDR2-1"

SEQ ID NO:5:"VLCDR3-1"

SEQ ID NO:6:"H-1"

/>

SEQ ID NO:7:"VH-1"

SEQ ID NO:8:"VHCDR1-1"

SEQ ID NO:9:"VHCDR2-1"

SEQ ID NO:10:"VHCDR3-1"

SEQ ID NO:11:"L-2"

SEQ ID NO:12:"VL-2"

SEQ ID NO:13:"VLCDR1-2"

SEQ ID NO:14:"VLCDR2-2"

SEQ ID NO:15:"VLCDR3-2"

SEQ ID NO:16:"H-2"

SEQ ID NO:17:"VH-2"

SEQ ID NO:18:"VHCDR1-2"

SEQ ID NO:19:"VHCDR2-2"

SEQ ID NO:20:"VHCDR3-2"

SEQ ID NO:21:"VL-F"

SEQ ID NO:22:"VL-R"

SEQ ID NO:23:"VH-F"

SEQ ID NO:24:"VH-R"

/>

Claims

1.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:3所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:4所示的VLCDR2以及如SEQ ID NO:5所示的VLCDR3；

和/或

三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:8所示的VHCDR1、如SEQ ID NO:9所示的VHCDR2以及如SEQ ID NO:10所示的VHCDR3。

2.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

如SEQ ID NO:1所示的轻链；以及

如SEQ ID NO:6所示的重链。

3.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)；以及

如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(VH)。

4.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

三个根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:13所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:14所示的VLCDR2以及如SEQ ID NO:15所示的VLCDR3；

和/或

三个根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ ID NO:18所示的VHCDR1、如SEQ ID NO:19所示的VHCDR2以及如SEQ ID NO:20所示的VHCDR3。

5.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

如SEQ ID NO:11所示的轻链；以及

如SEQ ID NO:16所示的重链。

6.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素10，所述抗体包含：

如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区(VL)；以及

如SEQ ID NO:17所示的重链可变区(VH)。

7.一种抗体衍生物，其中，所述抗体衍生物包含如权利要求1～6任一项所述的抗体以及与所述抗体连接的缀合物。

8.一种试剂盒，用于检测大鼠白细胞介素10，所述试剂盒包括：如权利要求1～6任一项所述的抗体或如权利要求7所述的抗体衍生物。

9.一种检测白细胞介素10的方法，其包括：

获得如权利要求1～7任一所述的抗体；

以所述抗体作为捕获抗体，以经生物素标记的所述抗体作为检测抗体，构建双抗夹心酶联免疫检测的步骤。

10.权利要求1～6任一所述抗体或权利要求7所述抗体衍生物或权利要求8所述试剂盒在检测大鼠白细胞介素10的应用。