CN117143234B - 抗大鼠白细胞介素-4蛋白的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗大鼠白细胞介素-4蛋白的单克隆抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗大鼠白细胞介素‑4蛋白的单克隆抗体及其用途。该单克隆抗体能够特异性结合大鼠白细胞介素‑4蛋白，并且与大鼠白细胞介素‑4蛋白具有一定亲缘性蛋白不产生交叉反应，特异性高。这些单克隆抗体10A10和3H7还能被制备成为双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒以检测大鼠白细胞介素‑4蛋白。该试剂盒具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等特性。以该试剂盒检测白细胞介素‑4蛋白，本发明提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平大鼠白细胞介素‑4蛋白(IL‑4)的试剂盒，在临床诊断应用上具有重要的意义。

Description

抗大鼠白细胞介素-4蛋白的单克隆抗体及其用途
技术领域
本申请涉及抗大鼠白细胞介素-4蛋白具有特异性的抗体领域，还涉及抗大鼠白细胞介素-4蛋白的单克隆抗体及其用途。
背景技术
白细胞介素（IL-4）是介导2型免疫反应的重要细胞因子，主要由活化的T淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞产生，在多种免疫细胞的功能调节上起着重要的作用。
大鼠IL-4基因长约6kb，成熟IL-4分子由120氨基酸残基组成，分子量为14kDa，有3个糖基化点，经糖基化后IL-4分子量为30kDa。IL-4能够刺激活化B细胞和T细胞增殖，促进CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞，并且在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。IL-4对B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造血细胞都有免疫调节作用。IL-4能够促进B细胞MHCⅡ类抗原、CD23和CD40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。能够诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调第二型主要组织兼容性复合体的产生。IL-4能够刺激肥大细胞增殖，并与IL-3有协同作用，尤其对于黏膜和结缔组织型肥大细胞体外生长来说是必需的；促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞；协同CSF刺激造血细胞的增殖，与G-CSF协同增强粒细胞集落形成，协同红细胞生成素增强BFU-E的形成。
因此开发一种高灵敏度的IL-4的检测方法，能够对IL-4涉及的生物功能进行分析和感知，具有非常重要的临床意义。
发明内容
实施例提供一类高特异性的白细胞介素-4蛋白兔单克隆抗体，对大鼠白细胞介素-4蛋白具有高亲和力。并且通过单个B细胞筛选和培养技术成功开发的两种高亲和力的抗白细胞介素-4蛋白兔单克隆抗体，可以识别大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，能够高特异性、高抗干扰能力、高检测灵敏度和高稳定性检测体外样本中的白细胞介素-4蛋白含量。该利用该兔单克隆抗体提供双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，能够稳定地检测血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4），在临床诊断应用上具有重要的意义。
为此，实施例至少公开了如下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种抗体10A10和3H7，所述抗体特异性结合白细胞介素-4蛋白，所述抗体包含：
3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区（VL)，所述轻链可变区具有：
VL CDR1，其由SEQ ID NO:3或13所示序列组成；
VL CDR2，其由SEQ ID NO:4或14所示序列组成；以及
VL CDR3，其由SEQ ID NO:5或15所示序列组成；
和/或
3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区 (CDRs)的重链可变区（VH)，所述重链可变区具有：
VH CDR1，其由SEQ ID NO:8或18所示序列组成；
VH CDR2，其由SEQ ID NO:9或19所示序列组成；以及
VH CDR3，其由SEQ ID NO:10或20所示序列组成。
第二方面，实施例公开了一种抗体10A10和3H7，特异性结合白细胞介素-4蛋白，所述抗体包含：由SEQ ID NO:2所示序列组成的轻链可变区（VL）及由SEQ ID NO:7所示序列组成的重链可变区（VH）。
第三方面，实施例公开了一种抗体10A10和3H7，特异性结合白细胞介素-4蛋白，所述抗体包含由SEQ ID NO:1所示序列组成的轻链及由SEQ ID NO:6所示序列组成的重链。
第四方面，实施例公开了一种抗体10A10和3H7，特异性结合白细胞介素-4蛋白，所述抗体包含由SEQ ID NO:12所示序列组成的轻链可变区（VL）及由SEQ ID NO:17所示序列组成的重链可变区（VH）。
第五方面，实施例公开了一种抗体10A10和3H7，特异性结合白细胞介素-4蛋白，所述抗体包含由SEQ ID NO:11所示序列组成的轻链及由SEQ ID NO:16所示序列组成的重链。
第六方面，实施例公开了一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包含第一至五方面任一所述的抗体以及与所述抗体连接的缀合物。
第七方面，实施例公开了一种试剂盒，用于检测白细胞介素-4蛋白，所述试剂盒包括：第一至五方面任一所述抗体或第六方面所述抗体衍生物。
附图说明
图1为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10的K assay曲线。
图2为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆3H7的K assay曲线。
图3为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10和3H7的EPassay曲线。
图4为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10 抗体和3H7抗体的夹心ELISA曲线。
图5为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10 抗体和3H7抗体的交叉反应结果图。
图6为实施例提供的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10 抗体和3H7抗体的稳定性实验(热破)数据稳定性实验结果图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
术语解释
在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与白细胞介素-4蛋白特异性结合的能力。
在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库、B细胞筛选和培养以及类似的方法制得。
在本申请中，术语“兔抗体”或“抗白细胞介素-4蛋白兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，抗白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，抗白细胞介素-4蛋白的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。
在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。
重链的V区和轻链的V区分别称为VH和VL。VL和VH中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)， 包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VL和VH的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用 FR1、FR2、FR3和FR4表示。
重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
抗体
实施例公开了一种抗体10A10和3H7，所述抗体特异性结合白细胞介素-4蛋白。所述抗体包含根据3个Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区（VL)，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和/或3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区 (CDRs)的重链可变区（VH)，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。VLCDR1由SEQ ID NO:3或13所示序列组成。VL CDR2由SEQ ID NO:4或14所示序列组成。VLCDR3由SEQ ID NO:5或15所示序列组成。VH CDR1，其由SEQ ID NO:8或18所示序列组成。VH CDR2，其由SEQ ID NO:9或19所示序列组成。VH CDR3，其由SEQ ID NO:10或20所示序列组成。
在某些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:3所示的VLCDR1、由SEQ ID NO:4所示的VL CDR2、由SEQ ID NO:5所示的VLCDR3、由SEQ ID NO:8所示的VHCDR1、由SEQ ID NO:9所示的VHCDR2和由SEQ ID NO:10所示的VHCDR3。
在某些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:3所示的VLCDR1、由SEQ ID NO:4所示的VL CDR2、由SEQ ID NO:5所示的VLCDR3、由SEQ ID NO:18所示的VHCDR1、由SEQ ID NO:19所示的VHCDR2和由SEQ ID NO:20所示的VHCDR3。
在某些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:13所示的VLCDR1、由SEQ ID NO:14所示的VL CDR2、由SEQ ID NO:15所示的VLCDR3、由SEQ ID NO:8所示的VHCDR1、由SEQ IDNO:9所示的VHCDR2和由SEQ ID NO:10所示的VHCDR3。
在某些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:13所示的VLCDR1、由SEQ ID NO:14所示的VL CDR2、由SEQ ID NO:15所示的VLCDR3、由SEQ ID NO:18所示的VHCDR1、由SEQ IDNO:19所示的VHCDR2和由SEQ ID NO:20所示的VHCDR3。
在某些实施方式中，该抗白细胞介素-4蛋白的抗体可以具有Y型分子结构。在一个实施例中，抗白细胞介素-4蛋白的抗体可以包括一对重链和一对轻链。重链可以包括一个重链可变区和一个或多个重链恒定区。哺乳动物的抗体一般包括五种类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，相对应组成的抗体就称为IgG，IgD，IgA，IgM和IgE五种抗体。轻链可以是一个相对于重链更小的一个多肽亚基。轻链可以包括一个轻链可变区和一个轻链恒定区。VL通常是轻链的N端部分，在氨基酸序列上表现出更高的变异性。不同抗体之间的VL具有特异的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区VH和轻链可变区VL可均用于识别和结合白细胞介素-4蛋白。在一个实施例中，抗体的轻链恒定区为κ链，抗体的重链恒定区为IgG1型。
在一些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:2所示序列组成的轻链可变区（VL）及由SEQ ID NO:7所示序列组成的重链可变区（VH）。
在一些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:1所示序列组成的轻链及由SEQ IDNO:6所示序列组成的重链。
在一些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:12所示序列组成的轻链可变区（VL）及由SEQ ID NO:17所示序列组成的重链可变区（VH）。
在一些实施例中，所述抗体包含由SEQ ID NO:11所示序列组成的轻链及由SEQ IDNO:16所示序列组成的重链。
抗体制备
另外一方面，实施例还公开了上述抗体的制备方法。本申请的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，如通过基因工程重组技术来获得；通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。
在某些实施方式中，制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。在一些实施例中，所述制备方法包括：以重组大鼠白细胞介素-4成熟蛋白作为免疫原，免疫新西兰大白兔；从大白兔的脾脏细胞中分选B淋巴细胞并进行培养；提取B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA；cDNA经PCR扩增获得天然配对的兔单克隆抗体；将天然配对的兔单克隆抗体的重链可变区（VH)基因和轻链可变区（VL)基因分别装载至表达载体上，并将载体转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从宿主细胞的培养液分离，纯化获得所述的单克隆抗体。
一个该兔源单克隆抗体的制备实施过程包括：
（1）分选B淋巴细胞
以重组大鼠白细胞介素-4蛋白（RP01567，ABclonal）为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫量为200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用酶联免疫吸附剂（ELISA）方法测定其抗白细胞介素-4蛋白的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后从脾脏细胞分选B淋巴细胞，并培养单个B淋巴细胞。B淋巴细胞筛选方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法（公开号：CN110016462A）”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用（公开号：CN111518765A）”。
（2）筛选B淋巴细胞并获取编码抗体的核酸序列
用抗原包被的酶联免疫吸附剂（ELISA）检测其阳性克隆并收集阳性克隆，裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻、重链可变区（VL和VH）基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。
（3）单克隆抗体的生产和纯化：
为了获得识别白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体，一些实施例将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72~96小时获得培养上清中含有重组的识别白细胞介素-4蛋白且不识别人白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
一个该兔源单克隆抗体的筛选及鉴定过程包括：
获得多株大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆抗体后，对抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定。
抗体亲和力的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体的亲和力进行初步测定。其中使用到的材料为重组大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4），使用浓度为3 ug/mL，使用所获得抗体的浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择解离常数≤1×10-9 M的抗体。如图1为所得抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10的K assay。如图2为所得抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆3H7的K assay。
抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中使用到的材料为重组大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4），使用浓度为3μg/mL，第一抗体的浓度为3μg/mL，第二抗体的浓度为2μg/mL；结果显示，固化 Rat IL-4 后的探针在结合10A10 后能明显结合作为第二抗体的3H7，此时shift值为0.2439通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体。如图3为抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10和3H7的EP assay数据。
经过测序可知，实施例所得的一种抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）的兔单克隆抗体，命名为10A10。10A10的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:2，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。重链氨基酸序列为SEQ ID NO:6，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
经过测序可知，实施例所得的一种抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）的兔单克隆抗体，命名为3H7。3H7的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:11，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:12，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。重链氨基酸序列为SEQ ID NO:16，重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:17，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
进一步地，所述兔单克隆10A10和3H7，轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。
进一步地，所述兔单克隆10A10及兔单克隆3H7结合于大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）表面的不同抗原决定簇。
抗体应用
实施例提供的白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体还可以具有从上述实施例提供的抗体衍生形成的结构及其通过化学修饰产生的抗原结合部分（例如缀合物）。
在一些实施例公开了一种抗体衍生物，其包含实施例提供的白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体以及与所述抗体连接的缀合物。在一个实施例中，所述化学修饰可以是化学交联。在一个实施例中，一个或多个缀合物可以共价连接到抗体或非共价连接到抗体上。在一个实施例中，该缀合物可以是共价附着到该抗体上的分子标记，以便于检测其抗原。该缀合物可以是任何合适的小分子。所述小分子可以包括但不限于，例如，生物素、链霉亲和素，和/或荧光染料。所述荧光染料可以是任何合适的荧光染料，包括但不限于Alexa Flour染料、氨基香豆素(AMCA)、Atto染料、花菁染料、DyLight 染料、FITC、荧光探针647H、罗丹明和德克萨斯红。所述Alexa Flour染料包括但不限于Alexa Flour488、Alexa Flour 555、Alexa Flour568、Alexa Flour594、Alexa Flour647和Alexa Flour700。所述Atto染料可以包括但不限于Atto390、Atto488、Atto565、Atto633和Atto700。所述花菁染料可以包括但不限于Cy3、Cy5和Cy5.5。DyLight染料可以包括但不限于DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594、DyLight633、DyLight650、DyLight680、DyLight755和DyLight800。在一个实施例中，所述缀合物可以是具有两个共价连接的荧光分子的串联染料。在实施例中，一个荧光分子作为供体，另一个作为受体。在一个实施例中，所述供体具有供体激发特性，而所述受体具有受体发射特性，二者可以进行独特荧光激发和发射反应。所述串联染料可包括但不限于异藻蓝蛋白-Cy5.5、异藻蓝蛋白-Cy7、PE-Atto594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、PE-AlexaFluor647、PE-AlexaFluor700，PE-AlexaFluor750、APC-AlexaFluor750和PerCP-Cy5.5。
上述实施例中的缀合物也可以是大分子。在一个实施例中，该大分子可以是一种酶。该酶可包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(Gox)、辣根过氧化酶(HRP)。在一个实施例中，该大分子可以是荧光蛋白。该荧光蛋白可包括但不限于异藻蓝蛋白(APC)、B-藻红蛋白（BPER-藻红蛋白（R-PE）、PerCP和R-藻蓝蛋白(RPC)。在一个实施例中，大分子也可以是一种具有不同白细胞介素-4蛋白兔单克隆抗体特异性的抗体，形成一个具有多种特异性的多价抗体。
实施例提供的白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体具有于体内和于体外的用途。该用途包括但不限于制备免疫分析的试剂盒、制备免疫染色的试剂盒、制备免疫化学的试剂盒和制备白细胞介素-4蛋白的检测试剂盒，以及于体外进行免疫分析、免疫染色、免疫化学反应和白细胞介素-4蛋白检测。其中，所述的免疫分析方法可以包括酶联免疫吸附剂分析方法(ELISA)，实施例提供的白细胞介素-4蛋白的单抗可用于不同形式的ELISA。在一个实施例中，所公开的白细胞介素-4蛋白的兔单克隆抗体可用于直接ELISA。所述直接ELISA可以是一种基于平板的免疫吸附试验，用于检测和量化来自复杂生物样本或在复杂生物样本内的特定抗原，可以采用多种方法实现直接ELISA。在一个实施例中，所述抗原，例如，白细胞介素-4蛋白可以被固定化或吸附在塑料板的表面上。在一个实施例中，所述塑料板可以是一个多孔微量滴定板。在一个实施例中，多孔微量滴定平面可以是96孔聚苯乙烯板。在该实施例中，可以在表面添加过量的阻断蛋白以阻断所有其他结合位点。在一个实施例中，阻断蛋白是牛血清白蛋白。在一个实施例中，针对抗原（例如，白细胞介素-4蛋白）的抗体，可以与偶联在表面上的抗原形成复合物。在一个实施例中，该抗体可以与一种酶偶联。在一个实施例中，该酶可以是HRP。在多余的缀合抗体被洗去后，与抗原结合的缀合抗体继续停留在表面上。在一个实施例中，共轭抗体催化与添加的底物的反应，以产生可由分光光度计或吸光度酶标仪测量的可见比色输出。直接ELISA检测由于仅使用了一种抗体，使得其相较于其他形式的ELISA检测具有更少的检测步骤和更高的检测效率。在一个实施例中，直接ELISA可以测试特异性抗体-抗原反应，并有助于消除与其他抗体之间的交叉反应。直接ELISA适用于目标样本的定性和定量应用于抗原检测、抗体筛选和抗原表位定位。
另外，本申请还公开了一种试剂盒，用于检测白细胞介素-4蛋白，所述试剂盒包括：所述抗体或所述抗体衍生物。
在某些实施例中，所述试剂盒包含特异性识别本申请所述单克隆抗体的第二抗体；其中，所述第二抗体包括可检测的标记，如酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在某些实施例中，所述第二抗体对本申请所述的单克隆抗体所包含的恒定区所来自的物种(如兔或人)的抗体是特异的。
在某些实施例中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(如兔的免疫球蛋白)抗体，如抗IgG抗体。
在某些实施方式中，所述第二抗体是抗兔IgG抗体。
在某些实施方式中，本申请的试剂盒包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。如当所述可检测的标记为化学发光试剂(如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
在一个实验例中，将10A10抗体作为捕获抗体、将3H7抗体作为检测抗体进行双抗夹心ELISA实验，具体实验步骤包括：
包被：将兔抗体10A10用pH7.4 PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪温柔混匀后，以100μL/孔加入到96孔微孔板中，盖上封板膜，置于4℃冰箱孵育16~20h后。
洗板：弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
封闭：将封闭液以200μl/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5~2h，取出备用。
加抗原：将兔白细胞介素-4蛋白用抗原稀释液（购自SurModics）进行稀释，稀释后的梯度浓度分别为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL和15.62pg/mL，以0pg/mL作为对照。然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用pH7.4、1×PBST，洗板三次，加样300μL，静置40秒后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
加检测抗体：将3H7-biotin用抗原稀释液（购自SurModics）稀释成0.05μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1小时。
洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST，pH7.4洗板三次，加样300μL，静置40秒后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
加SA-HRP：将100 SA-HRP浓缩液用抗原稀释液（购自SurModics）100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5小时。
洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1× PBST，pH7.4洗板三次，加样300μL，静置40秒后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
显色：将TMB显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃避光孵育15分钟。
读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(2M HCl) ，立即用酶标仪在450nm下进行读数，并在630nm下获取背景读数，用于校正450nm读数。
其中，3H7-biotin的制备方法包括：将抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆3H7配成1mg/mL的溶液，用DMSO将EZ-Link™NHS-LC-biotin（货号: 21343，ThermoScientific™）配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL、1mg/mL的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆3H7溶液，加入10μL、60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50μg、500mM ph9.0的Tris溶液中止反应；最后加入大量pH7.4的1X PBS缓冲液，用排阻极限为 30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。
双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度：以大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）（840233，RD）浓度为横坐标，吸光值的校正值(OD450-OD630)为纵坐标作图。以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度。如图4所示，以10A10作为捕捉抗体、以3H7作为检测抗体构建的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒检测兔白细胞介素-4蛋白的检测灵敏度达到0.036pg/mL。
一个对抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10和3H7特异性的检测例包括：以10A10作为捕捉抗体，以3H7作为检测抗体，构建一种双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒以检测大鼠IL-4具有亲缘性的蛋白：大鼠GM-CSF（HY-P7094，MCE）、大鼠IL-1 β（DY501，RD）、大鼠 IL-1α（500-RL-005/CF，RD）、大鼠IL-2（840230，RD）、大鼠IL-6（506-RL-010/CF，RD）、大鼠 IL-10（840413，RD）、小鼠IL-4（840142，RD）分别进行检测，标准品蛋白大鼠IL-4（840233，RD）的浓度均为1000pg/mL。检测结果如图5所示，仅大鼠IL-4产生了较高的ΔOD值，而其他蛋白无明显ΔOD值。由此说明，以10A10和3H7构建的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，不与大鼠IL-4具有亲缘性的蛋白大鼠GM-CSF、大鼠IL-1 β、大鼠 IL-1α、大鼠IL-2、大鼠IL-6、大鼠 IL-10和小鼠IL-4产生交叉反应，具有高度特异性。
一个对抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆抗体10A10和3H7热稳定性的测试例包括：将抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆抗体10A10（包被抗体）和兔单克隆抗体3H7（检测抗体）分别依次放置于-20℃、4℃、37℃下密封保存，7天后取出，采用与实施例3中相同的双抗夹心法酶联免疫检测方法对大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）标准品蛋白进行检测（检测过程同上述实施例）数据如表1所示。并计算在不同条件下试剂盒中标准品的ΔOD，如图6所示。
另外，计算不同标准品蛋白梯度、不同保存条件下试剂盒测的OD值平均值（AV），不同标准品蛋白梯度、不同保存条件下试剂盒测的OD值的标准差（SD），并以此计算变异系数CV=AV/SD。结果可知，不同温度处理7天后的抗体样品在检测大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）标准品蛋白时的变异系数为13.3%，说明本发明制备的抗大鼠白细胞介素-4蛋白（IL-4）兔单克隆10A10和兔单克隆3H7的热稳定性较强。
表1
RatI L-4浓度(pg/ml) OD值450-630nm4℃ OD 值450-630nm-20℃ OD值450-630nm37℃
0 0.055 0.1399 0.0521
15.625 0.1811 0.2545 0.179
31.250 0.3068 0.3678 0.2919
62.500 0.5497 0.5898 0.5529
125.000 0.9889 0.9666 0.9264
250.000 1.8057 1.6891 1.7410
500.000 2.9416 2.7314 2.7977
1000.000 3.9534 3.9107 3.9600
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素-4蛋白，所述抗体的轻链如SEQ IDNO:1所示，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:2所示；
所述抗体的三个根据Kabat编号系统定义的轻链互补决定区为：如SEQ ID NO:3所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:4所示的VL CDR2以及如SEQ ID NO:5所示的VL CDR3；
所述抗体的重链如SEQ ID NO:6所示，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO:7所示；
所述抗体的三个根据Kabat编号系统定义的重链互补决定区为：如SEQ ID NO:8所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:9所示的VH CDR2以及如SEQ ID NO:10所示的VH CDR3。
2.一种抗体，所述抗体特异性结合大鼠白细胞介素-4蛋白，所述抗体的轻链如SEQ IDNO:11所示，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:12所示；
所述抗体的三个根据Kabat编号系统定义的轻链互补决定区为：如SEQ ID NO:13所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:14所示的VL CDR2以及如SEQ ID NO:15所示的VL CDR3；
所述抗体的重链如SEQ ID NO:16所示，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO:17所示；
所述抗体的三个根据Kabat编号系统定义的重链互补决定区为：如SEQ ID NO:18所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:19所示的VH CDR2以及如SEQ ID NO:20所示的VH CDR3。
3.一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包含如权利要求1~2任一所述的抗体以及与所述抗体连接的缀合物。
4.一种试剂盒，用于检测白细胞介素-4蛋白，所述试剂盒包括：如权利要求1~2任一所述的抗体或如权利要求3所述的抗体衍生物。
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