CN116675768B - 针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供针对人NEFL的高亲和力兔单克隆抗体对，并利用该兔单克隆抗体对开发的双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。

Description

针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
神经丝蛋白(Neuroflaments,NF)是构成神经元轴突中间纤维的特异性分子蛋白，是神经元细胞骨架的重要成分，主要定位在成熟神经元的胞体和突起中，负责轴浆运输，维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性，防止断裂。
NF包括神经丝三联蛋白(Neuroflaments triplet proteins)、α-内切蛋白(α-internexin)、III型外周蛋白(Type III peripherin)。神经丝三联蛋白由神经丝轻链(又称为“轻肽神经细丝蛋白”，Neuroflament light，NEFL)、神经丝中链(Neuroflamentmiddle,NFM)、神经丝重链(Neuroflament heavy，NFH)构成。
NEFL被认为是神经丝三联蛋白中最重要的一部分，主要因为NEFL是唯一可以自我组装成功能性纤维的神经丝蛋白，而神经丝中链和重链蛋白则不能，而且NEFL的异常表达及人类NEFL基因的突变均会引起多种疾病的发生，大量临床及实验研究指出在多种疾病神经系统的发生、发展过程中NEFL的改变更为显著，提示NEFL是神经元与轴突损伤的分子标志物，对临床多种疾病的诊断及预后判断有重要指导意义。
目前临床研究发现：阿尔兹海默症(AD)患者脑脊液与尿液中NEFL水平是升高的，NEFL可作为AD的辅助诊断标记物；横断面研究结果表明在症状出现之前，家族性老年痴呆患者血清中NEFL浓度是增加的；在阿尔兹海默症和血管性痴呆患者中也发现NEFL水平均升高，并且NEFL水平与疾病进程呈正相关，血清中NEFL可能是早期AD相关神经变性的标志物。
除阿尔兹海默症之外，目前研究显示在多数神经受损性疾病中NEFL浓度是升高的，如脱髓鞘疾病、创伤性脑损伤、多发性硬化等。
在正常人的血清中，人轻肽神经细丝蛋白(NEFL)水平的参考范围为pg/mL，属于一个比较低的水平，针对人体样本中人轻肽神经细丝蛋白(NEFL)的直接测定具有挑战性，因此开发一种高灵敏度的人轻肽神经细丝蛋白(NEFL)检测方法学，具有非常重要的意义。
发明内容
基于此，有必要提供针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供兔单克隆抗体对1H8和2G10，与人NEFL蛋白的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强。
本发明采用如下技术方案：
本发明提针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体1H8或兔单克隆抗体2G10，分别结合人NEFL蛋白表面的不同抗原决定簇。
其中，所述兔单克隆抗体1H8的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体1H8的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。所述兔单克隆抗体1H8的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.6所示。
所述兔单克隆抗体2G10的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。所述兔单克隆抗体2G10的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ IDNO.17所示。所述兔单克隆抗体2G10的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还可以提供编码上述针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体的基因序列，或者包含该基因序列的表达载体或者宿主。
本发明还可以提供一种标记抗体偶联物，主要由上述针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。
本发明提供针对人神经丝蛋白的高亲和力兔单克隆抗体对在建立高灵敏度的人NEFL的酶联免疫检测方法中的应用。所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体1H8，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体2G10。
本发明还可以提供一种检测人NEFL蛋白的试剂或者试剂盒，包含针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体1H8和2G10。所述人NEFL蛋白包括重组表达的人神经丝蛋白，或细胞分泌的人神经丝蛋白，或人血清中的人神经丝蛋白。
本发明还可以提供针对人NEFL兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对1H8和2G10的上清液；纯化，即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明用单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人NEFL的兔单克隆抗体1H8和2G10，抗体1H8和重组表达人NEFL结合的亲和常数为2.03×10-9，抗体2G10和重组表达人NEFL结合的亲和常数为3.20×10-9。上述两种抗体可以识别人NEFL蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人NEFL蛋白的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
附图说明
图1为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图；
图2为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图；
图3为人NEFL蛋白与兔单克隆抗体1H8和2G10的亲和力测定结果图；
图4为人NEFL蛋白批次稳定等优势兔单克隆抗体1H8和2G10的抗原决定簇测定结果图；
图5为本发明实施例2中使用兔单克隆抗体1H8与兔单克隆抗体2G10对人NEFL蛋白进行双抗夹心酶联免疫检测的结果图；
图6为本发明实施例3中对兔单克隆抗体1H8与兔单克隆抗体2G10特异性检测的结果图；
图7为实施例3中对兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10热稳定性测试的结果图。
具体实施方式
本发明的技术构思在于提供针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供兔单克隆抗体对1H8和2G10，与人NEFL蛋白的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强。
其中，兔单克隆抗体1H8的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFDPVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQNVYGNNWLAWYQKKPGQSPKLLIISASSLPSGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGGYSGYIYTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID No.1)；
兔单克隆抗体1H8的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
DPVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQNVYGNNWLAWYQKKPGQSP KLLIISASSLPSGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGGYSGYI YTFGGGTEVVVK(SEQ ID No.2)；
兔单克隆抗体1H8的轻链可变区的三个互补决定区(CDR区)分别为：
VL1H8CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：
QNVYGNNWLAW(SEQ ID No.3)；
VL1H8CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：
LIISASSLPSGV(SEQ ID No.4)；
VL1H8CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示：
AGGYSGYIYTF(SEQ ID No.5)。
兔单克隆抗体1H8的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCAVSGIDLSRYGIDWVRQAPGKGLEWIGTVSAGGDSWYASWAKGRFTISKTSSTTVDLEVTSPTTEDTATYFCAKGATLNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID No.6)；
兔单克隆抗体1H8的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCAVSGIDLSRYGIDWVRQAPGKGLEWIG TVSAGGDSWYASWAKGRFTISKTSSTTVDLEVTSPTTEDTATYFCAKGAT LNLWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.7)；
兔单克隆抗体1H8的重链可变区的三个互补决定区(CDR区)分别为：
VH1H8CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示：
IDLSRYGID(SEQ ID No.8)；
VH1H8CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示：
WIGTVSAGGDSWYASWAK(SEQ ID No.9)；
VH1H8CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示：
YFCAKGATLNL(SEQ ID No.10)。
兔单克隆抗体2G10的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIGVTLAWYQQKPGQPPKLLIYKASNLASGVSSRFKGSRSGTEYTLTISDLECADAATYYCQCTWYGPSFVGAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ IDNo.11)；
兔单克隆抗体2G10的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示：
DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIGVTLAWYQQKPGQPPKLLIYKASNLASGVSSRFKGSRSGTEYTLTISDLECADAATYYCQCTWYGPSFVGAFGGGTEVVVK(SEQ ID No.12)；
兔单克隆抗体的2G10的轻链可变区的三个互补决定区(CDR区)分别为：
VL2G10CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示：
QSIGVTLAW(SEQ ID No.13)；
VL2G10CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示：
LIYKASNLASGV(SEQ ID No.14)；
VL2G10CDR3的氨基酸序列如SEQ ID SEQ ID No.15所示：
QCTWYGPSFVGAF(SEQ ID No.15)。
兔单克隆抗体2G10的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTRLTLTCTVSGFSLGRYAMGWVRQAPGKGLEWIGIINSYGTTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDGYEDYGDYYNAFDPWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID No.16)；
兔单克隆抗体2G10的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示：
QSLEESGGRLVTPGTRLTLTCTVSGFSLGRYAMGWVRQAPGKGLEWI GIINSYGTTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDGYED YGDYYNAFDPWGPGTLVTVSS(SEQ ID No.17)；
兔单克隆抗体2G10的重链可变区的三个互补决定区(CDR区)分别为：
VH2G10CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示：
FSLGRYAMG(SEQ ID No.18)；
VH2G10CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示：
WIGIINSYGTTYYASWAK(SEQ ID No.19)；
VH2G10CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示：
YFCARDGYEDYGDYYNAFDP(SEQ ID No.20)。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供抗人NEFL蛋白的兔单克隆抗体的制备方法，制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，具体包括以下步骤：
1.1免疫原制备：
获取重组人NEFL蛋白，其氨基酸序列为：
LSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD。
将目的序列构建在原核表达载体pET-28a-sumo上，构建成功后转化Rosetta(DE3)原核大肠杆菌表达菌株，挑取单克隆后扩大至400mL液体LB培养基培养，于37℃、220rpm条件下培养3h，使用终浓度0.8mM的IPTG、37℃条件下220rpm诱导表达4h，离心收菌。通过超声破菌裂解大肠杆菌，Ni柱纯化获取得上述重组人NEFL蛋白，作为后续应用的免疫原。
1.2、动物免疫：
以重组人NEFL蛋白(浓度为0.5mg/mL，纯度为90％)为免疫原，免疫3只新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人NEFL蛋白的滴度，取血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
1.3、分离脾细胞：
在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
1.4、B淋巴细胞分选：
采用中国专利CN110016462B(专利名称：从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法)说明书中第[0030]～[0044]段的方法。
1.5、编码兔单克隆抗体基因的克隆：
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
其中，PCR反应体系如下：4μLcDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL2×GloriaHiFi，6.5μL N.F H2O。其中，轻链可变区引物对为：
VL-Primer-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'；
VL-Primer-R：5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'；
重链可变区引物对为：
VH-Primer-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'；
VH-Primer-R：5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'。
PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
1.6、单克隆抗体制备和纯化
为了获得多株识别人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，将步骤1.5中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图1和图2。图1和图2中，pRB322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，图1中Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图2中Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
将含兔单克隆抗体重链恒定区(图1)和轻链恒定区(图2)的哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)表达载体分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
将步骤1.5中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染72～96小时，获得培养上清中含有重组的识别人NEFL蛋白的兔单克隆抗体。
使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，使用12％ SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
1.7、单克隆抗体筛选及鉴定
获得多株抗人NEFL蛋白的兔单克隆抗体后，首先对兔单克隆抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，具体方法如下：
1)单克隆抗体的筛选：
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定。其中使用到的材料为重组人NEFL蛋白，使用浓度为150nM、75nM，兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和常数在10-9范围的抗体。
2)抗原识别表位的鉴定：
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中使用到的材料为重组人NEFL蛋白，使用浓度为20μg/mL，第一兔单克隆抗体的浓度为2.35μg/mL，第二兔单克隆抗体的浓度为3.54μg/mL。
通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体，分别命名为兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10。
其中，对兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10的亲和力进行测定，测定结果见图3；二者的抗原决定簇测定结果见图4。图3中“1H8”表示兔单克隆抗体1H8，“2G10”表示兔单克隆抗体2G10，根据图3计算出的亲和力常数见下表1。从图4中可以看出，兔单克隆抗体1H8和2G10分别识别的是不同的抗原表位，因此二者可用于ELISA配对。
表1兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10亲和力常数
单克隆抗体 koff(1/s) kon(1/Ms) KD(M)
1H8 5.04×10-4 2.48×105 2.03×10-9
2G10 4.30×10-4 1.34×105 3.20×10-9
对筛选出的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B分别进行核苷酸测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
测得的兔单克隆抗体1H8的轻链可变区的核苷酸序列为：
GATCCTGTGCTGACTCAGACTCCTAGCAGCACCTCCGCGGCCGTCGGCGGTACAGTGACTATTAACTGTCAGAGCTCACAGAACGTCTACGGCAACAACTGGCTCGCTTGGTACCAAAAGAAGCCAGGCCAGTCTCCCAAGCTTCTTATCATCTCAGCCTCCTCACTCCCATCAGGAGTCCCCTCTAGATTTAAAGGTTCCGGCAGCGGAACTCAATTTACCCTGACCATTTCCGACCTTGAATGCGACGATGCCGCCACATATTACTGTGCCGGTGGATATTCAGGGTATATATATACTTTCGGTGGCGGGACAGAGGTCGTGGTCAAG；
兔单克隆抗体1H8的重链可变区的核苷酸序列为：
CAGAGCCTCGAAGAGTCAGGAGGGAGACTGGTCACACCTGGCACCCCACTGACCCTGACTTGCGCAGTGAGTGGCATCGATCTCAGTAGGTACGGCATCGATTGGGTAAGACAGGCCCCCGGAAAGGGTCTGGAATGGATCGGGACTGTCAGCGCTGGCGGAGACAGTTGGTATGCGAGCTGGGCAAAAGGAAGGTTTACTATCTCCAAGACTTCTTCTACTACTGTTGACCTGGAGGTTACTAGCCCTACCACCGAGGACACAGCGACGTACTTCTGCGCCAAAGGAGCGACCCTTAATCTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTAACTGTGAGTTCC；
兔单克隆抗体2G10的轻链可变区的核苷酸序列为：GATGTGGTGATGACCCAGACACCTGCCAGCGTCTCTGAGCCGGTGGGCGGCACAGTCACCATTAAATGCCAGGCCTCACAATCCATAGGGGTGACTCTGGCCTGGTATCAACAAAAGCCCGGTCAGCCCCCAAAGCTTTTGATTTATAAAGCCTCTAACCTTGCGTCCGGAGTTAGTAGTAGGTTTAAGGGAAGTCGTTCTGGGACTGAGTATACCCTTACAATTAGCGATTTGGAGTGTGCCGATGCCGCGACCTATTATTGTCAGTGCACGTGGTACGGACCTTCATTCGTCGGCGCATTCGGAGGTGGTACAGAAGTGGTGGTCAAG；
兔单克隆抗体2G10的重链可变区的核苷酸序列为：CAGTCTCTGGAAGAATCCGGCGGCCGCCTCGTTACTCCTGGCACAAGACTGACGCTGACATGTACTGTGAGTGGCTTTTCCCTGGGCAGGTACGCTATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGTCTGGAGTGGATCGGGATCATTAACAGCTATGGCACCACATATTACGCCAGCTGGGCTAAGGGGAGATTCACGATCTCCAAGACCAGCACTACCGTGGATCTCAAAATCACTTCCCCTACTACAGAGGACACCGCAACTTACTTCTGCGCTCGGGACGGATATGAGGATTACGGCGACTACTATAATGCCTTTGACCCATGGGGGCCGGGCACACTGGTGACCGTTAGCTCA。
根据核苷酸序列翻译推导出兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10的氨基酸序列。
实施例2
本实施例提供了基于抗人NEFL蛋白的兔单克隆抗体对1H8和2G10建立的双抗夹心酶联免疫检测方法，具体包括以下步骤：
2.1、包被：
将兔单克隆抗体1H8(捕获抗体)用1×PBS稀释成1μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。
2.2、洗板：
孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.3、封闭：
将E013封闭液(1×PBS中含2％ BSA+5％蔗糖+0.05％ Tween 20+0.1％proclin300，pH＝7.2)以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用。
2.4、加蛋白：
将样品重组人NEFL蛋白用pH＝7.2的含2％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20、0.1％proclin 300的磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释浓度：2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、0pg/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
2.5、洗板：
孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.6、加检测抗体：
将2G10-biotin(检测抗体)稀释成0.041μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。
其中，生物素标记兔单克隆抗体2G10制备2G10-biotin(检测抗体)的方法为：将抗人NEFL蛋白兔单克隆抗体2G10配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液。取200μL1mg/mL的抗人NEFL蛋白兔单克隆抗体2G10溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50μg 500mM pH9.0的Tris溶液中止反应。最后加入4mLpH 7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。
2.7、洗板：
孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.8、加SA-HRP：
将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
2.9、洗板：
孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.10、加TMB显色液：
将TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
2.11、测试及分析：
孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm和630nm下测定吸光度值，用OD450nm减去OD630nm位校正后的吸光度值。
以重组人NEFL蛋白蛋白浓度为横坐标，吸光度值的校正值Y1(Y1＝OD450nm-OD630nm)为纵坐标作图，使用Logistic曲线四参数拟合得到的曲线图如图5所示。
图5中，吸光度差值(OD450nm-OD630nm)与重组人NEFL蛋白浓度X1之间的关系满足方程
Y1＝(4.99653-0.09134)/[1+(X1/2119.05913)-1.27373]+0.09134,R2＝0.99914。
以20个0孔平均值+2*SD值代入标准拟合曲线，回算得到灵敏度，计算出的基于抗人NEFL蛋白兔单克隆抗体1H8和2G10建立的双抗夹心酶联免疫检测方法的检测灵敏度为5.78pg/mL。
实施例3
本实施例中对抗人NEFL蛋白的兔单克隆抗体1H8和2G10进行了性能检测，具体方法如下：
1)对兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10特异性的检测
用人NEFL蛋白相近的人胶质纤维酸性蛋白GFAP对抗人NEFL蛋白的兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10的特异性进行检测，采用实施例2中的双抗夹心法酶联免疫检测方法，标准品蛋白的浓度均为2000pg/mL。检测结果如图6所示。
从图6中可以看出，使用本发明制备的兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10对重组人NEFL蛋白和人胶质纤维酸性蛋白GFAP进行双抗夹心酶联免疫检测时，兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10只与人NEFL蛋白结合，不与其他蛋白产生任何交叉反应；说明上述试验例制备筛选的兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10对人NEFL蛋白具有高度的特异性。
2)对单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10热稳定性的测试
将抗人NEFL蛋白兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10分别依次放置于-20℃、4℃、37℃下密封保存，7天后取出，采用与实施例2中相同的双抗夹心法酶联免疫检测方法对人NEFL蛋白标准品蛋白进行检测，结果如图7所示。
进一步可以计算经不同温度处理7天后的抗体样品在检测人NEFL蛋白标准品蛋白时的变异系数。
进一步地，兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10经-20℃处理后，以测定人NEFL蛋白浓度(X2)为横坐标，使用Logistic曲线四参数建立的标准曲线方程分别为：
Y2＝(9.64457-0.07043)/[1+(X2/7047.67477)-0.91718]+0.07043,R2＝0.99915，
Y2为-20℃下吸光度值的校正值(Y2＝OD450nm-OD630nm)；
经4℃处理后建立的标准曲线方程为
Y3＝(6.60147-0.09661)/[1+(X3/3542.97445)-1.06596]+0.09661,R2＝0.99145，
Y3为4℃下吸光度值的校正值(Y3＝OD450nm-OD630nm)；
经37℃处理后建立的标准曲线方程为
Y4＝(4.84356-0.08997)/[1+(X4/2090.12056)-1.10796]+0.08997,R2＝0.99996，
Y4为37℃下吸光度值的校正值(Y4＝OD450nm-OD630nm)。
通过数据计算，可以发现分别经过-20℃、4℃、37℃处理的兔单克隆抗体1H8和2G10检测重组人NEFL蛋白浓度的变异系数小于10％。
说明上述试验制备筛选的抗人NEFL蛋白兔单克隆抗体1H8和兔单克隆抗体2G10的热稳定性较强。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的三个互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，重链的三个互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；或者
所述兔单克隆抗体的轻链的三个互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15所示，重链的三个互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；或者
所述兔单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求2所述的针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.6所示；或者
所述兔单克隆抗体的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。
4.编码权利要求1至3任一项所述的针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体的基因。
5.一种包含权利要求4所述基因的表达载体或者宿主。
6.一种检测人NEFL蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的检测人NEFL蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述人NEFL选自重组人NEFL蛋白、细胞分泌的人NEFL蛋白、血清中的人NEFL蛋白中的至少一种。
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