CN108728526B

CN108728526B - 神经自身免疫疾病的诊断

Info

Publication number: CN108728526B
Application number: CN201810360369.1A
Authority: CN
Inventors: W·斯托克尔; L·科莫罗思奇; R·米斯科; Y·登诺; M·沙甫; C·普罗伯斯特
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: US20180306787A1; EP3392657A1; EP3392656A1; US10466239B2; CN108728526A

Abstract

本发明涉及包括检测来自患者的包含抗体的样品中与RGS8相结合的抗体的步骤的用于诊断疾病的方法，包括检测来自患者的样品中RGS8的水平或活性的步骤的用于诊断疾病的方法，包含RGS8或其变体的多肽，一组多肽用于诊断疾病的用途，与RGS8相结合的抗体，该抗体用于诊断该疾病的用途，用于分离与RGS8相结合的自身抗体的方法，包含根据本发明的多肽的药物组合物或医学装置，包含所述多肽或根据本发明的医学装置的用于诊断疾病的试剂盒，以及该多肽、抗体或自身抗体在制备试剂盒或医学装置中的用途。

Description

神经自身免疫疾病的诊断

技术领域

背景技术

开发用于神经系统疾病的诊断系统是生物医学科学中的一项持续的挑战，这在较大程度上是因为所遇到的许多症状可以由极其多样的原因(包括基因遗传疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神性疾病、免疫缺陷和癌症)来解释说明。

由于神经系统疾病很少与临床症状的独特的特征性模式相关联，所以通常难以仅基于受影响的患者的观察和检查或者其医疗史来提供可靠的诊断。

早期诊断的重要性怎么强调都不为过。许多神经系统病症，最显著地，阿尔茨海默病和帕金森病以及多发性硬化，不能被治愈，但是可以用于减缓其进展的药物是可得的。此外，某些罕见类型的癌症与神经系统症状有关。诊断得越早，为了患者的充分益处而利用可得的治疗谱的机会就越好。

这在与自身抗体相关的神经系统疾病的情况下更是如此。在一些情况下，特异性的可检测的自身抗体与病况之间的关联足够强从而允许进行即刻的诊断。

但是，即使不是这样，自身抗体的检测可以向主治医师指明可以用于改善患者病况的治疗手段。存在各种各样的广泛使用的免疫抑制剂，其可以不管自身抗体靶标的性质而进行使用。备选地，单采血液成分术可以用于从患者的血液中除去自身抗体。在许多情况下，患者在神经系统的自身免疫疾病的早期诊断和治疗后继续过正常的生活。

基于自身抗体检测的诊断测定还可以确证除了与自身抗体相关的那些疾病之外的其他疾病的诊断。如果结果是血液样品没有特异性自身抗体，这可能帮助主治医师排除一系列的可能性并因此缩小似乎可能的病况的范围。

与自身抗体的出现相一致的神经系统病况的实例包括：视神经脊髓炎(一种以视觉和脊髓功能的丧失为特征的疾病)，和抗-NMDA受体脑炎(其与自主神经功能障碍相关)，通气不足，小脑性共济失调，轻偏瘫，意识丧失，或紧张症。虽然自身抗体的参与和这些病况本身的性质以前了解得很少，但是由于基于自身抗体检测的测定的可得性，此类疾病中的许多现在可以被诊断和有效地治疗。

因此，最重要的是开发新的方法来区分与自身抗体相关的神经系统疾病和非自身抗体相关的神经系统疾病。

US 2008/0254482A1公开了与类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的生物标志物。在表10中，RGS8被列为与来自一个SLE患者的抗体结合的>100个蛋白之一。没有这种抗体的确凿的实验数据或关于这种抗体的存在的指导，更不用说这种抗体的诊断有用性。

US 7,087,716B2公开了包含RGS8的分离的多肽，但没有包含任何实验数据。没有披露针对RGS8的自身抗体的存在，更不用说针对RGS8的自身抗体的诊断有用性。

发明内容

作为本发明之基础的问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于支持神经系统疾病的诊断和治疗，特别是神经系统疾病、优选神经系统的自身免疫疾病的诊断和治疗，更优选选自包含小脑综合征、小脑炎和PNS(副肿瘤性神经系统综合征)的组的诊断和治疗，优选PNS的诊断和治疗。

作为本发明之基础的另一个问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于区分自身免疫疾病(特别是神经系统的自身免疫疾病)和除了自身免疫疾病之外的其他疾病，这在较大程度上是为了确定最有希望的治疗方案，更特别地，免疫抑制治疗是否适当。

作为本发明之基础的问题通过所附的独立权利要求和从属权利要求的主题而得到解决。

在第一个方面，作为本发明之基础的问题通过用于诊断疾病的方法而得到解决，所述方法包括检测来自患者的包含抗体的样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤。

在第二个方面，作为本发明之基础的问题通过用于诊断疾病的方法而得到解决，所述方法包括检测来自患者的表达RGS8的样品或组织中RGS8的水平或活性的步骤，优选暴露于抗体的RGS8的水平或活性。

在第三个方面，作为本发明之基础的问题通过包含RGS8或者其变体的多肽而得到解决，所述多肽优选被固定化，更优选在固体载体上。

在第四个方面，作为本发明之基础的问题通过根据本发明的多肽用于诊断疾病的用途而得到解决，优选包括检测样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤。

在优选实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗疾病。

在第五个方面，作为本发明之基础的问题通过抗体、优选分离的自身抗体、更优选与RGS8相结合的分离的自身抗体而得到解决，其中所述自身抗体优选与根据本发明的多肽复合。

在第六个方面，作为本发明之基础的问题通过根据本发明的抗体、优选自身抗体用于诊断疾病的用途而得到解决。

在第七个方面，作为本发明之基础的问题通过用于分离与RGS8相结合的自身抗体的方法而得到解决，所述方法包括下列步骤：

a)使包含该自身抗体的样品与根据本发明的多肽在与复合物形成相容的条件下相接触，其中所述自身抗体与所述多肽相结合，

b)分离在步骤a)中形成的复合物，

c)解离步骤b)中分离的复合物，以及

d)将该自身抗体与该多肽分开。

在第七个实施方案中，作为本发明之基础的问题通过包含根据本发明的多肽的药物组合物、或医学装置、优选诊断装置而得到解决。

在第八个方面，作为本发明之基础的问题通过用于疾病诊断的试剂盒而得到解决，所述试剂盒包含根据根据本发明的多肽或本发明的医学装置，

其中所述试剂盒优选还包含用于检测复合物的工具，所述复合物包含根据本发明的多肽和与RGS8相结合的抗体。

在优选实施方案中，患者具有以下症状或者患有与以下一种或多种、优选两种或更多种症状相关的疾病，所述症状选自包含构音障碍、吞咽困难、眼球震颤、振动幻视、眩晕、恶心、共济失调、头晕、惊厥、癫痫和震颤的组。

在第九个方面，作为本发明之基础的问题通过根据本发明的多肽、根据本发明的抗体或根据本发明的医学装置在制备用于疾病诊断的试剂盒、医学装置、优选诊断装置中的用途而得到解决。

在优选实施方案中，疾病是神经系统疾病，优选神经系统的自身免疫疾病，更优选选自包含小脑综合征、小脑炎和PNS的组，优选PNS。

在优选实施方案中，疾病是癌症，优选选自包含霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌和乳腺癌的组的癌症，优选淋巴瘤或小细胞肺癌，更优选小细胞肺癌。

在优选实施方案中，样品是包含抗体的体液，其优选选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组，或者所述样品是肿瘤活检组织。

本发明还包括但不限于以下项目：

1.诊断疾病的方法，其包括检测来自患者的包含抗体的样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤。

2.诊断疾病的方法，其包括检测来自患者的表达RGS8的样品或组织中RGS8的水平或活性的步骤，优选暴露于抗体的RGS8的水平或活性。

3.包含RGS8或者其变体的多肽，其优选被固定化，更优选在固体载体上。

4.根据项目3所述的多肽用于诊断疾病的用途，优选包括检测样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤。

5.根据项目3所述的多肽，其用于治疗疾病。

6.与RGS8相结合的抗体、优选分离的抗体、更优选分离的自身抗体，其中所述抗体优选与根据项目3所述的多肽复合。

7.根据项目7所述的抗体、优选自身抗体用于诊断疾病的用途。

8.分离与RGS8相结合的自身抗体的方法，包括以下步骤

a)使包含所述自身抗体的样品与根据项目3所述的多肽在与形成复合物相容的条件下接触，其中所述自身抗体与所述多肽相结合，

b)分离步骤a)中形成的复合物，

c)解离步骤b)中分离的复合物，以及

d)将该自身抗体与该多肽分开。

9.药物组合物或医学装置、优选诊断装置，其包含根据项目3所述的多肽。

10.用于诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包含根据项目3所述的多肽或根据项目9所述的医学装置，

其中优选所述试剂盒另外包含用于检测包含根据项目3所述的多肽和与RGS8相结合的抗体的复合物的工具。

11.根据项目1至10中任一项所述的方法、多肽、用途、自身抗体、药物组合物、装置或试剂盒，

其中所述患者具有以下一种或多种、优选两种或更多种症状或者疾病与以下一种或多种、优选两种或更多种症状相关，所述症状选自包含构音障碍、吞咽困难、眼球震颤、振动幻视、眩晕、恶心、共济失调、头晕、惊厥、癫痫和震颤的组。

12.根据项目3所述的多肽或根据项目5所述的抗体或根据项目9所述的医学装置用于制造优选用于诊断疾病的试剂盒、医学装置、优选诊断装置的用途。

13.根据项目1至12中任一项所述的方法、多肽、用途、自身抗体、药物组合物、装置或试剂盒，

其中所述疾病是神经系统疾病，优选神经系统的自身免疫疾病，更优选选自包含副肿瘤性小脑变性(Paraneoplastic cerebellar degeneration，PCD)、小脑炎和PNS的组，优选PNS。

14.根据项目1至13中任一项所述的方法、多肽、用途、自身抗体、药物组合物、装置或试剂盒，

其中所述疾病是癌症，优选选自包含霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌和乳腺癌的组的癌症，优选淋巴瘤或小细胞肺癌，更优选小细胞肺癌。

15.根据项目1、4、5、8、11、12和14中任一项所述的方法或用途，其中所述样品是包含抗体的体液，其优选选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组，或者所述样品是肿瘤活检组织。

本发明基于本发明人的下述令人惊讶的发现：存在与针对RGS8的自身抗体相关的与癌症相关的神经系统的自身免疫疾病。

此外，本发明基于本发明人的下述令人惊讶的发现：存在针对RGS8的自身抗体，并且所述自身抗体可以在来自许多遭受神经系统症状和/或癌症的患者的样品中检测到，但不在从健康受试者获得的样品中检测到。

此外，本发明基于本发明人的下述令人惊讶的发现：可以通过检测针对RGS8的自身抗体来诊断新的神经系统疾病和/或癌症。

此外，本发明基于本发明人的下述令人惊讶的发现：可以通过检测表达RGS8的组织中RGS8的水平或活性，优选暴露于抗体的RGS8的水平或活性来诊断癌症。

在不希望束缚于任何理论的情形下，此类自身抗体的存在暗示，RGS8和/或下游效应子的活性和功能在具有此类自身抗体的患者中受到损害，以致于出现了神经系统症状，或发生癌症。

G蛋白信号传导调节因子8(RGS8)是细胞内外周膜蛋白。它通过刺激G-蛋白α-i/o和α-q亚单位的GTP酶活性来调节异三聚体G蛋白，驱动它们成为其无活性的GDP结合形式。因此，RGS8影响G蛋白偶联受体信号传导，包括通过毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)的信号传导。然而，RGS8的过表达不仅导致G蛋白偶联通道的增加的“关闭(off)”动力学，而且导致更快的激活动力学，这表明RGS8不仅仅是简单的负调节因子(Saitoh O.,Kubo Y.,MiyataniY,Asano T,Nakata H.,1997,RGS8accelerates G-protein-mediated modulation of K+currents,Nature,390(6659):525-9；Itoh M,Nagatomo K,Kubo Y,Saitoh O.,2006,Alternative splicing of RGS8gene changes the binding property to theM1muscarinic receptor to confer receptor type-specific Gq regulation.,JNeurochem.99(6):1505-16)。

RGS8主要在脑中表达，特别是在小脑浦肯野细胞的细胞体和树突中。(LarminieC,Murdock P,Walhin JP,Duckworth M,Blumer KJ,Scheideler MA,Garnier M.,2004,Selective expression of regulators of G-protein signaling(RGS)in the humancentral nervous system.Brain Res Mol Brain Res.122(1):24–34)。在用RGS8cDNA转染的非神经细胞中，该蛋白定位于细胞核中。在共表达组成性活化的Gαo后，RGS8蛋白转位至质膜(Saitoh O,Masuho I,Itoh M,Abe H,Komori K,Odagiri M.,2003,Distribution ofregulator of G protein signaling 8(RGS8)protein in thecerebellum.Cerebellum.2(2):154–160)。此外，已显示RGS8在大鼠自然杀伤(NK)细胞以及胰腺祖细胞和内分泌细胞中表达(Kveberg L,Ryan JC,Rolstad B,Inngjerdingen M.,2005,Expression of regulator of G protein signalling proteins in naturalkiller cells,and their modulation by Ly49A and Ly49D,Immunology；115(3):358-65.；Villasenor A,Wang ZV,Rivera LB,Ocal O,Asterholm IW,Scherer PE,Brekken RA,Cleaver O,Wilkie TM,2010,Rgs16and Rgs8in embryonic endocrine pancreas andmouse models of diabetes,Dis Model Mech.,3(9-10):567-80.)

RGS8是含有180个氨基酸的21kDa蛋白质。像所有22种鉴定的RGS蛋白一样，RGS8含有RGS结构域，其介导G-α亚单位结合。它属于RGS蛋白的B/R4亚家族。该亚家族的成员的特征在于N-末端PDZ结构域，其后是富含脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸(PEST)区域、酸性氨基酸和C-末端RGS结构域，其分配为RGS8的氨基酸56-171(综述于Geetanjali B.,KirkMD.,Zhihui X.,2007,R4RGS Proteins:Regulation of G Protein Signaling andBeyond,Pharmacol Ther.；116(3):473–495中)

本发明涉及包含哺乳动物、优选人的RGS8或其变体的多肽，所述变体优选为对与RGS8或其变体相结合的自身抗体具有反应性的免疫原性变体。哺乳动物RGS8的实例包括来自人、猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或猪的RGS8。在最优选的实施方案中，RGS8是由数据库代码P57771-1或P57771-2、优选P57771-1所编码的多肽。对应的cDNA的数据库代码分别是BC069677(NCBI)和SEQ ID NO 18。在本申请全文中，任何所引用的数据库代码均指Uniprot数据库，更具体地是本申请或其最早的优先权申请的申请日的版本。

本发明的教导不仅可以通过使用多肽，特别是包含RGS8的天然序列的多肽，或具有在本申请中明确地(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含地提到的准确序列的核酸来实施，而且可以通过使用这样的多肽或核酸的变体来实施。

在优选实施方案中，本文所使用的术语“变体”可以是指所提到的全长序列的至少一种片段，更具体地一种或多种相对于全长序列而言在一个或两个末端处截短了一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。

在另一优选实施方案中，术语“变体”不仅是指至少一种片段，而且还是指这样的多肽或其片段，所述多肽或其片段包含与所提到的参考氨基酸序列或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，其中删除或置换除了对于生物学活性(例如，抗原结合(自身)抗体的能力)或者多肽的折叠或结构来说必需的那些氨基酸之外的其他氨基酸，和/或以保守的方式替换一个或多个这样的必需氨基酸和/或添加氨基酸，从而使得多肽的生物学活性得到保留。现有技术包括可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种不同的方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,OxfordUniversity Press,2008,3^rd edition。在优选实施方案中，使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，其中采用缺省设置。

在优选实施方案中，所述变体是线性、非折叠的片段。

在优选实施方案中，所述多肽和其变体还可以包含化学修饰，例如同位素标记，或者共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。对任何修饰如此地进行设计，从而使得其不消除变体的生物学活性。

此外，变体还可以通过与其他已知多肽或其变体相融合来产生，并且包含具有活性的部分或结构域，优选地，所述具有活性的部分或结构域当与参考序列的具有活性的部分进行比对时，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中本文所使用的术语“具有活性的部分”是指比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，或在核酸序列的情况下编码比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，和/或是天然序列的变体，但保留了至少一些生物学活性。

在优选实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸，所述核酸的互补链与参考核酸或野生型核酸杂交，优选在严紧条件下杂交。杂交反应的严紧性是本领域普通技术人员可容易地确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的根据经验的计算。通常，较长的探针需要较高的用于适当退火的温度，而较短的探针则需较低的温度。杂交通常取决于变性的DNA与在环境中存在的互补链在低于其解链温度的温度下再退火的能力：探针和可杂交序列之间的所希望的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。因此，较高的相对温度将会倾向于使反应条件更严紧，而较低的反应温度将会更不严紧。关于杂交反应的严紧性的另外的细节和解释，参见Ausubel,F.M.(1995),Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley&Sons,Inc。此外，本领域技术人员可以遵循在手册Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for FilterHybridization,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany中和在Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.,and Schleifer,K.H.(1991)International Journal ofSystematic Bacteriology 41:255-260中所给出的关于如何借助于杂交来鉴定DNA序列的指导。在优选实施方案中，将严紧条件应用于任何杂交，即只有如果探针与靶序列具有70％或更高的同一性的情况下，杂交才出现。相对于靶序列而言具有较低的同一性程度的探针可以杂交，但此类杂交体是不稳定的并且将会在严紧条件下的洗涤步骤中被去除，例如降低盐浓度至2×SSC或，任选地和随后，至0.5×SSC，而温度为(以优选度渐增的顺序)大约50℃-68℃，大约52℃-68℃，大约54℃-68℃，大约56℃-68℃，大约58℃-68℃，大约60℃-68℃，大约62℃-68℃，大约64℃-68℃，大约66℃-68℃。在特别优选的实施方案中，温度为大约64℃-68℃或大约66℃-68℃。可能的是，调节盐浓度至0.2×SSC，或甚至0.1×SSC。可以分离出具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相对于参考序列或野生型序列而言的同一性程度的核酸序列。在优选实施方案中，本文所使用的术语核酸序列的变体是指任何这样的核酸序列，其按照遗传密码的简并性而编码与参考核酸序列所编码的相同的氨基酸序列及其变体。

多肽的变体具有生物学活性。在优选实施方案中，这样的生物学活性是结合与患有与针对RGS8的自身抗体有关的自身免疫疾病，优选与神经系统疾病如小脑综合征、小脑炎和PNS或癌症，优选来自包含霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌和乳腺癌的组，优选淋巴瘤或小细胞肺癌，更优选小细胞肺癌，优选与针对RGS8的自身抗体相关的PNS的患者中发现的结合与RGS8相结合的自身抗体的能力。

当用于实施本发明的教导时，包含RGS8或其变体的本发明的多肽，或者本发明的自身抗体，可以以任何形式和以任何纯化程度来提供，从以内源形式包含所述多肽的液体样品、组织或细胞，更优选地，过表达所述多肽的细胞，此类细胞的粗制的或经富集的裂解物，直至经纯化的和/或分离的多肽，其任选地是基本上纯的。在优选实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中本文所使用的术语“天然多肽”是指经折叠的多肽，更优选是指从组织或细胞中，更优选从哺乳动物细胞或组织中，任选地从非重组的组织或细胞中纯化出的经折叠的多肽。在另一优选实施方案中，所述多肽是重组的蛋白质，其中本文所使用的术语“重组的”是指通过使用基因工程方法在生产过程的任何阶段而产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与用于在细胞或组织中过表达的强启动子相融合或者通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH中或在BrownT.A.(1986),Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中所描述的)和用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如，由GE Healthcare Life Sciences公开的手册“Strategies for Protein Purification”,“Antibody Purification”,“PurifyingChallenging Proteins”(2009/2010)，其在Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009),Guideto Protein Purification中)。在优选实施方案中，多肽是纯的，如果在各自样品中至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及随后的考马斯蓝染色和可视化检定所判断的。

如果本发明的多肽以组织的形式来提供，那么优选的是，所述组织为哺乳动物组织，例如人、大鼠、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛，更优选脑组织，最优选小脑。如果使用细胞裂解物，那么优选的是，所述细胞裂解物包含与细胞表面相关的膜。如果所述多肽以重组细胞的形式来提供，那么优选的是，所述重组细胞为真核细胞例如酵母细胞，更优选来自多细胞真核生物例如植物、哺乳动物、蛙或昆虫，最优选来自哺乳动物例如大鼠、人、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛的细胞。

优选地，对用于实施本发明的教导的多肽(包括任何变体)如此地进行设计，从而使得其包含至少一个识别和/或特异性结合与RGS8相结合的自身抗体的表位。与除针对RGS8的自身抗体以外的抗体相比，任何表位更优选是仅由这样的自身抗体识别的表位。在一个实施方案中，这样的多肽包含由来自RGS8的6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个，优选至少9个但不多于16个连续氨基酸构成的链段。本领域技术人员熟悉用于设计具有足够的免疫原性的肽的指导方针，例如在Jackson,D.C.,Fitzmaurice,C.J.,Brown,L.E.,Zeng,W.(1999),Preparation and properties oftotally synthetic immunogenes,Vaccine,第18卷,第3-4期,1999年9月,第355-361页；和Black,M.,Trent,A.,Tirrell,M.和Olive,C.(2010),Advances in the design anddelivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptoragonists,Expert Rev Vaccines,2010年2月,9(2):157-173中所描述的那些。简而言之，合乎希望的是，所述肽尽可能多地符合下列要求：(a)它具有高的亲水性程度；(b)它包含一个或多个选自包含天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的组的残基；(c)为了更高的特异性，它与其他已知的肽或多肽不具有同源性或具有很低的同源性；(d)它需要是足够可溶的；和(e)它不包含糖基化或磷酸化位点，除非由于特殊原因而需要。备选地，可以遵循生物信息学方法，例如由Moreau,V.,Fleury,C.,Piquer,D.,Nguyen,C.,Novali,N.,Villard,S.,Laune,D.,Granier,C.和Molina,F.(2008),PEPOP:Computational design ofimmunogenic peptides,BMC Bioinformatics 2008,9:71所描述的那些。SEQ ID NO4,SEQID NO5,SEQ ID NO6,SEQ ID NO7,SEQ ID NO8,SEQ ID NO9,SEQ ID NO10,SEQ ID NO11,SEQ ID NO12,SEQ ID NO13,SEQ ID NO14和SEQ ID NO15代表RGS8的主要表位。

当根据本发明进行使用时，可以以任何种类的构象来提供包含RGS8或其变体的本发明的多肽。例如，所述多肽可以是基本上未折叠的、部分折叠的或完全折叠的多肽。在优选实施方案中，所述多肽在这样的意义上进行折叠，即对于与本发明的自身抗体的结合来说必需的表位，或者该蛋白质或其变体以其整体，采取由天然蛋白质在其天然环境中所采取的折叠。本领域技术人员熟悉适合于测定多肽是否是折叠的，和如果是折叠的，那么它具有哪种结构的方法，例如有限蛋白酶解、核磁共振波谱、圆二色光谱或X射线晶体学(参见例如Banaszak L.J.(2008),Foundations of Structural Biology,Academics Press；或Teng Q.(2013),Structural Biology:Practical Applications,Springer)，优选地，使用圆二色光谱。

本发明的多肽可以是融合蛋白，其包含除了取自RGS8的那些之外的其他氨基酸序列，特别是C-末端或N-末端标签，优选C-末端标签，其在优选实施方案中如本文所使用的为具有功能的额外的序列基元或多肽，其具有一些生物学或物理功能和可以例如用于纯化、固定化、沉淀或鉴定本发明的多肽。在更优选的实施方案中，所述标签是能够与配体特异性地结合的序列或结构域，例如选自包含His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶的标签、荧光标签的组，其例如选自包含绿色荧光蛋白的组。

本发明的多肽可以是经固定化的多肽。在优选实施方案中，本文所使用的术语“经固定化的”是指结合至在水溶液中不可溶的固体载体的分子，更优选通过共价键、静电相互作用、包囊或包载(例如通过使球状多肽在凝胶中变性)，或通过疏水相互作用，最优选通过一个或多个共价键。各种不同的合适载体，例如纸、聚苯乙烯、金属、硅或玻璃表面、微流控通道、膜、珠粒例如磁珠、柱色谱法介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等等，已在文献中进行了描述，例如在Kim,D.和Herr,A.E.(2013),Protein immobilization techniques formicrofluidic assays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。如此，可以以直截了当的方式将经固定化的分子连同不可溶的载体一起与水溶液分开，例如通过过滤、离心或滗析。经固定化的分子可以是以可逆或不可逆的方式进行固定化的。例如，如果分子与载体通过可以经由添加高浓度的盐而掩蔽的离子相互作用来进行相互作用，或如果分子通过可裂开的共价键例如二硫桥(其可以通过添加含巯基的试剂来进行裂开)进行结合，那么固定化是可逆的。相反地，如果分子通过不能在水溶液中裂开的共价键(例如，通过经常用于将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的环氧化物基团和胺基团的反应而形成的键)而拴系至载体，那么固定化是不可逆的。蛋白质可以间接地进行固定化，例如通过使抗体或其他对于该分子具有亲和力的实体固定化，随后是复合物的形成，以致于分子-抗体复合物被固定化。各种不同的用于使分子固定化的方式描述在文献中，例如在Kim,D.,Herr和A.E.(2013),Proteinimmobilizsation techniques for microfluidic assays,Biomicrofluidics7(4),041501中。另外，各种不同的用于固定化反应的试剂和试剂盒是商购可得的，例如购自Pierce Biotechnology。

必要的是，用于按照根据本发明的自身抗体的检测进行诊断的样品包含抗体，其也称为免疫球蛋白。典型地，体液样品包含代表性的一全套受试者的免疫球蛋白。但是，一旦提供了，可以使样品经历进一步的加工，其可以包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全体免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，这可以影响各种不同类别的免疫球蛋白的相对分布。

在本申请全文中所描述的试剂、装置、方法和用途可以用于疾病诊断。在优选实施方案中，所述疾病为神经系统疾病。在更优选的实施方案中，本文所使用的术语“神经系统疾病”是指任何与神经系统的缺陷相关的疾病，在另一优选实施方案中，如本文所用，术语“PNS”(副肿瘤性神经综合征的缩写)是指由于存在肿瘤而间接引起的全身性病症，例如由于物质如通常不产生的激素或细胞因子的产生释放通过肿瘤起源的细胞或以增加的浓度产生或产生和释放生物活性细胞。

在另一优选实施方案中，所述疾病是癌症，优选选自包含淋巴瘤的组，优选胃的B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，小细胞肺癌和隐匿性肿瘤乳腺癌，卵巢癌例如畸胎瘤。

在优选实施方案中，本文所使用的术语“诊断”是指任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或病症之中有帮助的信息；发现疾病如何正在进展或在未来可能如何进展；或者评价患者对于某一治疗(例如，施用免疫抑制药物)的应答性。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。

在许多情况下，单纯的检测(换言之，测定样品中是否存在可检测水平的抗体)对于诊断来说是足够的。如果可以检测到自身抗体，那么这将是对于临床医师的诊断来说有帮助的信息，并且指明了增加的患者罹患疾病的可能性。在优选实施方案中，可以测定相比于在平均健康受试者中可以发现的水平而言的在血清中抗体的相对浓度。尽管在许多情况下测定自身抗体在样品中是否存在或可检测可以是足够的，但是为了获得对于诊断来说有帮助的信息而实施的方法可以包括测定浓度是否以至少0.1倍，优选以0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍比在平均健康受试者中所发现的浓度高。

本领域技术人员将会意识到，临床医师通常并不仅仅基于单一的诊断参数来对患者是否罹患或可能罹患疾病、病况或病症作出结论，而是需要考虑其他方面，例如其他自身抗体、标志物的存在、血液参数、患者症状的临床评估或者医学成像或其他非侵入性方法(例如，多导睡眠描记法)的结果，以便达到结论性的诊断。参见Baenkler H.W.(2012),General aspects of autoimmune diagnostics,Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter，第3页。诊断试剂或方法的价值也可以在于可能排除一种疾病，因此允许间接诊断另一种疾病。在优选实施方案中，在本申请全文中所提到的任何症状或疾病的含义与到2015年5月29日为止本领域技术人员的理解相一致，如由教科书和科学出版物所证明的。

因此，术语“诊断”优选不是暗示，根据本发明的诊断方法或试剂对于基于单一测试(更不必说参数)来完成诊断来说将会是确定的和足够的，而是可以是指对于所谓的“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑了一系列可能病况的可能性的系统诊断程序)的贡献。因此，本发明的方法、多肽或用途(其任选地用于确定患者是否罹患疾病)可以包括：从患者(优选人患者)中获得样品；测定在所述样品中是否存在与RGS8相结合的自身抗体，其中所述测定通过下述方式来进行，使样品与本发明的多肽相接触并检测在所述多肽和所述自身抗体之间是否出现结合，优选通过使用经标记的二抗来进行检测，其中所述自身抗体如果存在于样品中则与所述多肽相结合；和如果测定到自身抗体存在于样品中，则将患者诊断为罹患或更可能罹患所述神经系统病症或癌症。在优选实施方案中，本发明的方法可以考虑下述步骤：检测针对a)SOX1的抗体，和针对b)RGS8的抗体，优选以该顺序。

术语“诊断”还可以是指用于在两个或更多个与相似或相同的症状相关的病况之间进行区分的方法或试剂。

术语“诊断”还可以是指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者挑选治疗方案。例如，检测到自身抗体可以表明，将会选择免疫抑制疗法，其可以包括向患者施用一种或多种免疫抑制药物。

本发明涉及包含与本发明的多肽相结合的抗体(优选地，自身抗体)的复合物。作为用于诊断疾病的方法的一部分，可以使用或检测这样的复合物。如果待检测针对RGS8的自身抗体，来自受试者的包含抗体的液体样品可以用于实施所述方法。这样的液体样品可以是任何来自受试者的包含具有代表性的一组抗体的体液，优选来自受试者的包含IgG免疫球蛋白类别的抗体的样品。例如，样品可以是脑脊液(CSF)、血液或血清、淋巴、组织液，优选是血清或CSF，更优选是血清。

在优选实施方案中，检测样品例如血清样品中或表达RGS8的组织例如肿瘤活检组织中的RGS8水平。本文所用的术语“水平”可以指RGS8的浓度、表达或活性。浓度可以通过ELISA、半定量蛋白质印迹或定量免疫组化染色，优选ELISA来使用。表达可以通过定量mRNA的浓度例如通过RT PCR来检测。可以通过Saitoh et al.(2000)Regulator of G ProteinSignaling(RGS8)Requires its NH2terminus for subcellular localization andacute desensitization of G-Protein gated K+Channels,J.Biol.Chem.276,5052-5058中所述的G蛋白结合测定来定量RGS8的活性。在另一优选实施方案中，在血液中检测RGS8浓度或活性或表达RGS8的细胞例如循环肿瘤细胞的存在。

使包含抗体的液体样品与本发明的多肽相接触的步骤可以通过下述方式来进行：在包含抗体的样品存在下，在与包含所述多肽和结合本发明多肽的抗体(优选自身抗体)的复合物形成相容的条件下，孵育固定化形式的所述多肽。随后，可以移除在那时耗尽了与本发明的多肽相结合的抗体的液体样品，接着是一个或多个洗涤步骤。最后，可以检测包含所述抗体和所述多肽的复合物。在优选实施方案中，术语“与复合物形成相容的条件”是这样的条件，其允许特异性的抗原-抗体相互作用从而建立包含所述多肽和所述抗体的复合物。在优选实施方案中，此类条件可以包括将所述多肽在于PBS缓冲液中以1:100稀释的样品中在25℃下孵育30分钟。在优选实施方案中，本文所使用的术语“自身抗体”是指与产生所述自身抗体的动物(优选哺乳动物)的内源性分子特异性地结合的抗体，其中此类抗体的水平更优选相比于任何与此类内源性分子特异性地结合的其他抗体的平均值而言是升高的。在最优选的实施方案中，所述自身抗体为与RGS8相结合的自身抗体。

根据本发明的方法优选为体外方法。

在优选实施方案中，用于根据本发明的预后、诊断、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用选自包含下列的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，光散射免疫测定，凝集技术，标记免疫测定例如选自包含放射性标记免疫测定、酶免疫测定、化学发光免疫测定和免疫荧光技术的组的那些。本领域技术人员熟悉这些方法，其也描述在现有技术中，例如在Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&PracticalConcepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，特别是在第14章中。

备选地，可以使用除了液体样品之外的包括包含本发明多肽的组织的样品。所述组织样品优选来自表达内源性RGS8的组织。然后，可以使这样的样品(其可以以固定在载体例如用于显微分析的载玻片上的组织切片的形式)与结合本发明多肽的本发明抗体(优选自身抗体)相接触。优选地，对所述抗体进行标记以允许与结合本发明多肽的内源性抗体相区分，从而使得可以对新形成的复合物进行检测，和任选地进行定量。如果所形成的复合物的量低于在取自健康受试者的样品中所发现的量，那么受检查样品所取自的受试者可能罹患疾病。

可以将任何证明包含抗体和本发明多肽的复合物存在或不存在的数据与参考数据相关联。例如，检测到所述复合物指示，提供所分析样品的患者已经罹患、正在罹患或在未来可能罹患疾病。如果患者以前已被诊断并且再次运行用于获得在诊断上有关的信息的方法，那么可以将在这两次运行中检测到的复合物的量相关联以获悉有关疾病进展和/或治疗成功的信息。例如，如果发现复合物的量增加，那么这暗示病症正在进展从而可能在未来显现，和/或所尝试的任何治疗是不成功的。

在优选实施方案中，使用微滴定板、膜ELISA、斑点印迹或线性斑点印迹(lineblot)来实施根据本发明的诊断方法。本领域技术人员熟悉实验设置，其描述在现有技术(Raoult,D.和Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal andother antibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)中。

在另一优选实施方案中，按照本发明教导的预后、诊断、方法或测试试剂盒考虑使用间接免疫荧光。本领域技术人员熟悉此类技术和合适样品的制备，其描述在现有技术(US4647543；Voigt,J.,Krause,C.,

E,Saschenbrecker,S.,Hahn,M.,Danckwardt,M.,Feirer,C.,Ens,K,Fechner,K,Barth,E,Martinetz,T.和

W.(2012),Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of AntinuclearAutoantibodies on HEp-2Cells,”Clinical and Developmental Immunology,vol.2012,doi:10.1155/2012/65105；Bonilla,E.,Francis,L.,Allam,F.et al.,Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection ofantinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients,Clinical Immunology,vol.124,no.1,pp.18–21,2007)中。合适的试剂、装置和软件包是商购可得的，例如购自EUROIMMUN,Lübeck,Germany。

使样品经历仅测定是否存在与RGS8相结合的自身抗体的测试，但是优选的是，诊断方法、测试、装置等考虑测定针对一种或多种涉及神经系统的自身免疫疾病的抗原或其变体的自身抗体的存在，所述抗原优选选自包含Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA1、PNMA2、DNER/Tr、ARHGAP26、ITPR1、ATP1A3、NBC1、神经软骨蛋白、CARPVIII、Zic4、Sox1、Ma、MAG、MP0、MBP、GAD65、双载蛋白、恢复蛋白、GABA A受体、GABA B受体、甘氨酸受体、桥连蛋白、IgLON5、DPPX、水通道蛋白-4、MOG、NMDA受体、AMPA受体、GRM1、GRM5、LGI1、VGCC和mGluR1和CASPR2的组，所述抗原优选是经固定化的，例如在医学装置例如线性斑点印迹上。在更优选的实施方案中，检测到针对RGS8的自身抗体和针对SOX1的自身抗体(US7314721)。在诊断上有关的标志物神经软骨蛋白(EP15001186)、ITPR1(EP14003703.7)、NBC1(EP14003958.7)、ATP1A3(也称为人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚单位)(EP14171561.5)和浮舰蛋白1/2(EP3101424)已经描述在现有技术中。

根据本发明的教导，提供与本发明的多肽相结合的抗体、优选自身抗体用于疾病诊断。本领域技术人员熟悉用于纯化抗体的方法，例如在Hermanson,G.T.,Mallia,A.K.和Smith,P.K.(1992),Immobilized Affinity Ligand Techniques,San Diego:AcademicPress中所描述的那些方法。简而言之，将与目的抗体(其抗原是本发明的多肽)特异性地结合的抗原固定化，并用于经由亲和色谱来从适当的来源中纯化出目的抗体。来自罹患由发明人所鉴定的神经系统病症的患者的包含抗体的液体样品可以用作来源。

根据本发明，提供能够与本发明的多肽特异性地结合的抗体，例如自身抗体。在优选实施方案中，本文所使用的术语“抗体”是指任何基于免疫球蛋白的结合部分，更优选包含至少一个免疫球蛋白重链和至少一个免疫球蛋白轻链的结合部分，其包括但不限于单克隆和多克隆抗体以及抗体的变体，特别是片段，所述结合部分能够与各自的抗原相结合，更优选与之特异性地结合。在优选实施方案中，本文所使用的术语“特异性地结合”表示，所述结合比以1×10^-5M，更优选1×10^-7M，更优选1×10^-8M，更优选1×10^-9M，更优选1×10^-10M，更优选1×10^-11M，更优选1×10^-12M的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中通过表面等离子体共振来测定。所述抗体可以是自身抗体制备物的一部分，所述自身抗体制备物是异源的或可以是同源的自身抗体，其中异源制备物包含许多不同的自身抗体种类，如通过从人供者血清进行制备而可获得的，例如通过使用经固定化的抗原进行亲和层析以纯化任何能够与所述抗原相结合的自身抗体。所述抗体可以是经糖基化的或非糖基化的。本领域技术人员熟悉可以用于鉴定、产生和纯化抗体及其变体的方法，例如在EP 2 423 226 A2以及其中的参考文献之中所描述的那些方法。所述抗体可以用作诊断试剂，单独地，或相组合地，例如与本发明的多肽复合。

本发明提供了用于分离与本发明的多肽相结合的抗体(优选自身抗体)的方法，其包括下列步骤：a)使包含该抗体的样品与本发明的多肽相接触，从而形成复合物，b)分离在步骤a)中形成的复合物，c)解离在步骤b)中分离的复合物，和d)将该抗体与本发明的多肽分开。可以将来自罹患由发明人所鉴定的新的神经系统病症的患者的样品用作抗体的来源。合适的方法描述在现有技术中，例如在由GE Healthcare Life Sciences公开的手册“Affinity chromatography”、“Strategies for Protein Purification”和“AntibodyPurification”(2009/2010)中，和在Philips,Terry,M.,Analytical techniques inimmunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc中。

本发明提供了包含本发明的多肽的药物组合物，所述组合物优选适合于向受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人进行施用。这样的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可以例如经口服途径、经肠胃外途径、通过吸入喷雾剂、经局部途径、通过滴眼剂、经直肠途径、经鼻途径、经颊途径、经阴道途径或经由植入型储器进行施用，其中本文所使用的术语“经肠胃外途径”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。所述药物组合物可以以合适的剂型来提供，例如胶囊、片剂以及水性悬浮液和溶液，优选以无菌的形式。它可以在治疗疾病的方法中进行使用，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。在优选实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的疫苗，其任选地包含辅助试剂例如佐剂或缓冲液；和本发明的多肽用于制备疫苗的用途。

在本发明的范围内，提供了包含，优选涂有本发明的(自身)抗体和/或本发明的多肽的医学或诊断装置。优选地，这样的医学或诊断装置以这样的形式包含本发明的多肽，所述形式允许使其与水溶液，更优选液体人样品以直截了当的方式相接触。特别地，可以将本发明的多肽固定化在载体的表面上，所述载体优选选自包含玻璃板或载玻片、生物芯片、微滴定板、珠粒例如磁珠、单采血液成分术装置、色谱柱、膜等的组。示例性的医学装置包括线性斑点印迹、微滴定板、用于显微术的载玻片、珠粒和生物芯片。除了本发明的多肽外，所述医学或诊断装置还可以包含额外的多肽，例如阳性或阴性对照或者已知的具有诊断价值的与自身抗体相结合的其他抗原，特别是与其他与一种或多种相同或相似症状相关的疾病有关的那些。

本发明的教导提供了试剂盒，其优选用于诊断疾病。这样的试剂盒可以包含详细说明如何使用该试剂盒的说明书，和用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品相接触的工具，例如线性斑点印迹，其中本发明的多肽被固定化在线性斑点印迹上。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如一批已知与本发明的多肽相结合的自身抗体或重组抗体；和阴性对照，例如与本发明的多肽不具有可检测的亲和力的蛋白质例如牛血清白蛋白。最后，这样的试剂盒可以包含用于制备校准曲线的抗体或抗原的标准溶液。

在优选实施方案中，所述试剂盒包含用于检测与本发明的多肽相结合的抗体(更优选自身抗体)的工具，所述检测优选通过检测包含本发明的多肽和与本发明的多肽相结合的抗体的复合物来进行。这样的工具优选是这样的试剂，所述试剂与所述复合物相结合并且修饰该复合物或者携带标记从而使得该复合物可检测。例如，所述工具可以是经标记的抗体，其在除了被一抗所识别的结合位点之外的其他结合位点处与所述多肽相结合或者与一抗的恒定区相结合。备选地，所述工具可以是与所述自身抗体的恒定区相结合的二抗，优选对于哺乳动物IgG类抗体来说特异的二抗。许多用于检测此类复合物的方法和工具在现有技术中已有描述，例如在Philips,Terry,M.,Analytical techniques inimmunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc中。

包含RGS8或其变体的本发明的多肽可以以包含和/或表达编码所述多肽的核酸的细胞的形式来产生或提供。如果使用包含编码本发明的多肽或其变体的序列的核酸，那么这样的核酸可以是未修饰的核酸。在优选实施方案中，所述核酸为这样的核酸，其本身不在自然界中出现，并且相比于天然核酸而言包含至少一个修饰，例如同位素内容物或化学修饰，例如甲基化、序列修饰、标记等，其指示了合成来源。在优选实施方案中，所述核酸为重组核酸或核酸的一部分，和在更优选的实施方案中，为载体的一部分，在所述载体中它可以与允许所述核酸表达(优选过表达)的启动子功能性地相连接。本领域技术人员熟悉各种各样的合适的载体，其是商购可得的，例如购自Origene。例如，可以使用编码具有C-末端GFP的融合构建体的载体。所述细胞可以是真核或原核细胞，优选真核细胞，例如酵母细胞，和更优选为哺乳动物细胞，更优选人细胞例如HEK293细胞。哺乳动物细胞的实例包括HEK293、CHO或COS-7细胞。包含编码本发明的多肽的核酸的细胞可以是重组细胞或分离的细胞，其中术语“分离的”表示，所述细胞是经富集的，从而使得相比于所述细胞的野生型的环境而言，存在很少的其他分化或种类的细胞或者实际上不存在这样的其他细胞。

本发明的教导可以不仅用于诊断，而且还用于预防或治疗疾病，更特别地，用于预防或治疗疾病的方法，其包括下列步骤：a)降低在受试者血液中与本发明的多肽相结合的自身抗体的浓度，和/或b)施用一种或多种免疫抑制药学物质，其优选选自包含利妥昔单抗、波尼松、甲波尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、静脉内免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤的组，和/或药物组合物。

本发明提供了用于检测针对RGS8或RGS8或其变体的自身抗体或检测编码RGS8或其变体的核酸或包含所述核酸的载体或细胞的工具用于制备用于诊断诸如PNS或癌症之类的疾病的试剂盒。

附图说明

图1.小脑的免疫荧光染色。

在第一步中将冷冻切片与患者血清(1:32)一起孵育，并在第二步中与Alexa488标记的山羊抗人IgG一起孵育。通过与TO-PRO-3碘化物孵育使细胞核复染。获得对小脑分子层和浦肯野细胞的细颗粒染色，其中对浦肯野细胞的反应最强烈。

图2.免疫沉淀和抗原鉴定。

将大鼠小脑的裂解物与患者或对照血清(1:16.7)一起孵育。用蛋白G包被的磁珠分离免疫复合物，用SDS洗脱并进行SDS-PAGE分析，然后用胶体考马斯染色。箭头指示经免疫沉淀的抗原在约25kDa处的位置。

图3.用重组抗原通过间接免疫荧光和蛋白质印迹验证RGS8为新的自身抗原。

A：将使用丙酮固定的RGS8-His或模拟转染的HEK293细胞与患者1的1:10稀释的血清或健康对照一起孵育进行间接免疫荧光。B：将RGS8或模拟转染的HEK293细胞的裂解物与患者2的1:200稀释的血清或健康对照一起孵育进行蛋白质印迹。C：神经元组织免疫荧光反应的中和。将患者血清与用RGS8或用空载体作为对照转染的HEK293细胞提取物进行预孵育。含有RGS8的提取物消除了免疫反应。通过与TO-PRO-3碘化物孵育使细胞核复染。

在本申请中公开了许多序列，更具体地，SEQ ID NO1(RGS8融合至C末端His标签)和SEQ ID NO2(在实施例中表达的RGS8),SEQ ID NO3RGS8。SEQ ID NO4,SEQ ID NO5,SEQID NO6,SEQ ID NO7,SEQ ID NO8,SEQ ID NO9,SEQ ID NO10,SEQ ID NO11,SEQ ID NO12,SEQ ID NO13,SEQ ID NO14和SEQ ID NO15代表通过质谱鉴定的抗原性序列。

具体实施方式

实施例

概述

方法：两名患者(患者1：53岁，患者2：73岁)接受神经学、神经影像学和实验室检查。通过间接免疫荧光测定(IFA)和免疫印迹对血清和脑脊液(CSF)进行全面的自身抗体筛查。使用小脑裂解物的免疫沉淀接着质谱(MS)来鉴定自身抗原，其通过在HEK293细胞中的重组表达并在几种免疫测定中使用来验证。

结果：两名患者均患有小脑综合征并伴有胃的B细胞淋巴瘤(患者1)或霍奇金淋巴瘤(患者2)。IFA筛查显示血清(患者1/2：1:320)和脑脊液(患者1：1:100)与小脑浦肯野细胞和分子层而不是与一组30种重组表达的已建立的神经自身抗原具有强烈的IgG反应性。随后将G蛋白信号传导调节因子8(RGS8)鉴定为靶抗原。患者血清在IFA和免疫印迹中显示出与重组表达的人RGS8的特异性反应，而在42个疾病对照或48个健康对照中没有能够检测到这种反应。在中和实验中，重组RGS8能够中和自身抗体的组织反应。

这些结果表明，自身抗体的出现和检测特别与PNS(更具体而言是小脑综合征)和癌症(例如淋巴瘤)的出现有关，并因此在诊断上有用。

患者

对照集体包括48名健康供体，42名患者，其有神经症状和确定的抗神经自身抗体(5×抗NMDAR,5×抗Hu,2×抗Hu/抗Ri,6×抗Yo,2×抗Yo/抗Ri,3×抗Ri,5×抗AQP4,5×抗LGI1,3×抗CASPR2,1×抗mGluR5,5×抗SOX1)。

间接免疫荧光测定(IFA)

使用具有脑组织冰冻切片(大鼠的海马、大鼠和猴的小脑)的生物芯片阵列的载玻片与分别表达30种不同的脑抗原的重组HEK293细胞组合进行IFA，所述30种不同的脑抗原为Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA2、ITPR1、Homer 3、CARP VIII、ARHGAP26、ZIC4、DNER/Tr、GAD65、GAD67、双载蛋白、恢复蛋白、GABA_B受体、甘氨酸受体、DPPX、IgLON5、谷氨酸受体(类型NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5、GLURD2)、LGI1、CASPR2、AQP4(M1和M23)、MOG、ATP1A3、NCDN(EUROIMMUN,FA 111a-1003-51,FA 1112-1003-50,FA-1128-1003-50,FA112d-1003-1,FA112m-1003-50,FA 1151-1003-50,Miske R,Hahn S,Rosenkranz T,Müller M,DettmannIM,Mindorf S,Denno Y,Brakopp S,Scharf M,Teegen B,Probst C,Melzer N,Meinck HM,Terborg C,

W,Komorowski L.,2016,Autoantibodies against glutamatereceptorδ2after allogenic stem cell transplantation.Neurol NeuroimmunolNeuroinflamm.,3(4):e255；Scharf M,Miske R,Heidenreich F,Giess R,Landwehr P,

IM,Begemann N,Denno Y,Tiede S,

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W,Probst C,Komorowski L,2015,Neuronal Na+/K+ATPase is anautoantibody target in paraneoplastic neurologic syndrome,Neurology；84(16):1673-9；Miske R,Gross CC,Scharf M,Golombeck KS,Hartwig M,Bhatia U,Schulte-Mecklenbeck A,

K,Strippel C,

L,Synofzik M,Lohmann H,Dettmann IM,Deppe M,Mindorf S,Warnecke T,Denno Y,Teegen B,Probst C,Brakopp S,WandingerKP,Wiendl H,

W,Meuth SG,Komorowski L,Melzer N,2016,Neurochondrin is aneuronal target antigen in autoimmune cerebellar degeneration,NeurolNeuroimmunol Neuroinflamm.；4(1):e307))。将每个生物芯片镶嵌体(biochip mosaic)与70μL经PBS稀释的样品在室温下孵育30分钟，用PBS-Tween洗涤并浸入PBS-Tween中5分钟。在第二步中，应用Alexa488标记的山羊抗人IgG(Jackson Research,Suffolk,UnitedKingdom)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,Lübeck)室温孵育30分钟。用PBS-Tween冲洗再次洗涤载玻片，然后浸入PBS-Tween中5分钟。将载玻片埋在PBS缓冲的含甘油的DABCO(每个视野约20μL)中并通过荧光显微镜检查。包括阳性和阴性对照。与未转染的细胞和对照样品直接比较，根据转染细胞的荧光强度将样品分类为阳性或阴性。终点效价是指能够显示可见荧光的最后稀释度。

在竞争性抑制实验中，在IFA之前1h将重组RGS8与稀释的血清样品混合。两名独立观察员使用激光扫描显微镜(LSM700,Zeiss,Jena,Germany)评估结果。如果没有另外说明，试剂从Merck,Darmstadt,Germany或Sigma-Aldrich,Heidelberg,Germany获得。

免疫印迹

将0.1％Triton-X-100、1mM EDTA缓冲液、150mM NaCl、100mM Tris pH7.4中的表达SEQ ID NO2的HEK-RGS8细胞的裂解液与其中含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPage LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)在70℃下孵育10分钟，接着进行SDS-PAGE(NuPAGE,ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)。根据制造商的说明书，通过使用转移缓冲液(ThermoFisher Scientific)的罐式印迹将分离的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用Universal Blot Buffer plus(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,Lübeck)封闭膜15分钟，并与患者或对照血清(1:200稀释)在Universal Blot Buffer plus中孵育3小时，然后是用Universal Blot Buffer(EUROIMMUNMedizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)的3次洗涤步骤，用抗人IgG-AP(EUROIMMUNMedizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)进行第二次孵育30分钟，3次洗涤步骤，并用NBT/BCIP底物(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)染色。如果没有另外指定，试剂从Merck,Darmstadt,Germany或Sigma-Aldrich,Heidelberg,Germany获得。

为了检测抗SOX1反应性，根据制造商的说明书进行线性斑点印迹(EUROIMMUN,DL1111-1601-6G)。

抗原的鉴定

解剖大鼠的小脑并在液氮中快速冷冻。用Miccra D-8(Roth,Karlsruhe,Germany)和手动匀浆器(Sartorius,

Germany)在含有蛋白酶抑制剂(Complete mini,Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)的增溶缓冲液(100mmol/L tris-HCl pH 7.4、150mmol/L氯化钠、2.5mmol/L乙二胺四乙酸、0.5％(w/v)脱氧胆酸钠、1％(w/v)TritonX100)中将组织在4℃下匀浆。将组织裂解物在4℃下以21,000×g离心15分钟，并将澄清上清液与患者血清(1:16.7稀释)在4℃一起孵育过夜。然后将样品与蛋白G Dynabeads(ThermoFisher Scientific,Dreieich,Germany)在4℃孵育3小时以捕获免疫复合物。珠粒用PBS洗涤3次，并用含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPage LDS样品缓冲液(ThermoFisherScientific,Schwerte,Germany)在70℃洗脱10分钟。用59mM碘乙酰胺(Bio-Rad,Hamburg,Germany)进行脲甲基化(carbamidomethylation)，然后进行SDS-PAGE(NuPAGE,ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)。用考马斯亮蓝(G-250)(Merck)使分离的蛋白质可视化，并通过质谱分析对其进行鉴定。鉴定了由SEQ ID NO4,SEQ ID NO5,SEQ IDNO6,SEQ ID NO7,SEQ ID NO8,SEQ ID NO9,SEQ ID NO10,SEQ ID NO11,SEQ ID NO12,SEQID NO13,SEQ ID NO14和SEQ ID NO15组成的肽。

质谱

从考马斯亮蓝G-250染色凝胶中切下可见的蛋白条带。脱色和胰蛋白酶消化后，提取肽并用α-氰基-4-羟基肉桂酸点到MTP AnchorChip^TM384TF靶体上。

使用flexControl 3.4软件，使用Autoflex III smartbeam TOF/TOF200系统进行MALDI-TOF/TOF测量。以质量范围为600Da-4,000Da和以用4,000-10,000个轰击(shot)的正离子反射器模式记录肽质量指纹图谱(PMF)的质谱图。质谱用商购可得的PeptideCalibration Standard II进行外部校准，用flexAnalysis 3.4进行处理，峰值列表用BioTools 3.2进行分析。

Mascot检索引擎Mascot Server 2.3(Matrix Science，London，UK)用于通过对NCBI或SwissProt数据库限于哺乳动物(Mammalia)进行检索来进行蛋白质鉴定。检索参数如下：质量容忍度设定为80ppm，接受一个错过的切割位点，并且半胱氨酸残基的脲甲基化以及甲硫氨酸残基的氧化分别设定为固定和可变修饰。为了评估蛋白质命中，选择p<0.05的显著性阈值。

为了进一步确认PMF命中，使用BioTools的WARP反馈机制选择每个鉴定蛋白质的2至5个肽用于MS/MS测量。分别用400和1000个轰击记录母体和碎片质量。用0.7Da的碎片质量容忍度如上所述处理和分析质谱。

RGS8在HEK293中的重组表达

通过PCR对商购可得的cDNA(IRATp970H06133D,Source BioScience,Nottingham,UK)和引物ATACGTCTCACATGGCGGCCTTACTGATGCCACGC[有义RGS8]和ATACGTCTCCTCGAGACTGAGCCTCCTCTGGCTTTGGGAC[反义RGS8]或ATACGTCTCCTCGAGCTAACTGAGCCTCCTCTGGCTTTGG[反义RGS8-终止]获得人RGS8的编码DNA(UNIPROT acc.#P57771)。扩增产物用Esp3I和DpnI消化并与pTriEx-1(Merck，Darmstadt，Germany)连接。根据制造商的说明，在ExGen500介导的转染(ThermoFisher Scientific)后在人细胞系HEK293中表达RGS8-His或RGS8(dHis)。为了制备用于IFA的基底，将HEK293接种在无菌盖玻片上，进行转染，并且允许表达RGS8-His或RGS8(dHis)48小时。将盖玻片用PBS进行洗涤，用丙酮在室温下固定10分钟，风干，切成毫米大小的生物芯片，并且在所描述的IFA中用作基底。备选地，将细胞在标准的T-培养瓶中进行转染，并且在5天后收获细胞。将细胞沉淀物用增溶缓冲液进行提取。将提取物以等分试样贮存于-80℃直至进一步使用。

患者的自身抗体的表征

使用透化的小脑冷冻切片对患者血清和CSF的间接免疫荧光检测(IFA)显示浦肯野细胞和分子层的细颗粒IgG染色(图1)。如用大鼠小脑测定的，患者的血清效价为1:320(患者1和2)，CSF效价为1:100(患者1)。用表达30种神经自身抗原的重组HEK293细胞或用SOX1点的线性斑点印迹进行进一步的单特异性分析，所述30种神经自身抗原为Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA2、SOX1、ITPR1、Homer 3、CARP VIII、ARHGAP26、ZIC4、DNER/Tr、GAD65、GAD67、双载蛋白、恢复蛋白、GABAB受体、甘氨酸受体、DPPX、IgLON5、谷氨酸受体(类型NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5、GLURD2)、LGI1、CASPR2、AQP4(M1和M23)、MOG、ATP1A3和NCDN。在患者2中，但不是患者1中，检测到弱的抗Sox1反应性。没有观察到其他特异性反应性。

RGS8鉴定为靶神经元自身抗原

用患者血清获得的匀浆大鼠小脑的免疫沉淀物在SDS-PAGE中呈现大约25kDa的蛋白质，如果匀浆物与正常对照血清一起孵育则不存在(图2)。使用MALDI-TOF，25kDa蛋白级分被鉴定为来自褐家鼠(rattus norvegicus)的G蛋白信号传导调节因子8(RGS8)(UNIPROTacc.#P49804)。

作为抗原正确鉴定的证据，使用表达RGS8-His(SEQ ID NO1)的转染的HEK293细胞(图3A)通过IFA检测患者的样品。患者的血清和CSF与表达RGS8-His的细胞反应。所有样品还使用HEK293-RGS8裂解物在免疫印迹中与重组RGS8反应(图3B)。相反，模拟转染的细胞没有表现出任何特异性抗体结合。

通过与含有RGS8(SEQ ID NO2)的HEK293裂解物预孵育，可以消除患者的自身抗体对组织的反应(图3C)。当使用来自模拟转染的HEK293细胞的可比部分时，抗体结合不受影响。

抗RGS8自身抗体对自身免疫小脑变性的特异性

通过IFA分析来自42名患有各种神经自身抗体相关神经系统综合征(部分也涉及小脑和脑干)的患者(5×抗NMDAR,5×抗Hu,2×抗Hu/抗Ri,6×抗Yo,2×抗Yo/抗Ri,3×抗Ri,5×抗AQP4,5×抗LGI1,3×抗CASPR2,1×抗mGluR5,5×抗SOX1)和48名健康对照的血清并用HEK293-RGS8-His平行于患者的样品。没有一个对照血清产生与患者血清对大鼠脑组织的相似的免疫荧光模式，并且当对表达RGS8的HEK293细胞进行测试时，所有都是全阴性的。因此，我们认为针对RGS8的IgG抗体是副肿瘤性小脑变性(Paraneoplastic cerebellardegeneration，PCD)患者特异性的。

序列表

<110> 欧蒙医学诊断技术有限公司

<120> 神经自身免疫疾病的诊断

<130> 17PP036EP

<160> 21

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RGS8[human]-His

<400> 1

Met Ala Ala Leu Leu Met Pro Arg Arg Asn Lys Gly Met Arg Thr Arg

1 5 10 15

Leu Gly Cys Leu Ser His Lys Ser Asp Ser Cys Ser Asp Phe Thr Ala

20 25 30

Ile Leu Pro Asp Lys Pro Asn Arg Ala Leu Lys Arg Leu Ser Thr Glu

35 40 45

Glu Ala Thr Arg Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser His Lys

50 55 60

Tyr Gly Val Ala Ala Phe Arg Ala Phe Leu Lys Thr Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Glu Asn Leu Glu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Glu Phe Lys Lys Thr Arg

85 90 95

Ser Thr Ala Lys Leu Val Ser Lys Ala His Arg Ile Phe Glu Glu Phe

100 105 110

Val Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Val Asn Ile Asp Phe Gln Thr Arg

115 120 125

Glu Ala Thr Arg Lys Asn Leu Gln Glu Pro Ser Leu Thr Cys Phe Asp

130 135 140

Gln Ala Gln Gly Lys Val His Ser Leu Met Glu Lys Asp Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Phe Leu Arg Ser Lys Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Ser Gln

165 170 175

Arg Arg Leu Ser Leu Glu His His His His His His His His

180 185 190

<210> 2

<211> 180

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> RGS8[human]

<400> 2

Met Ala Ala Leu Leu Met Pro Arg Arg Asn Lys Gly Met Arg Thr Arg

1 5 10 15

Leu Gly Cys Leu Ser His Lys Ser Asp Ser Cys Ser Asp Phe Thr Ala

20 25 30

Ile Leu Pro Asp Lys Pro Asn Arg Ala Leu Lys Arg Leu Ser Thr Glu

35 40 45

Glu Ala Thr Arg Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser His Lys

50 55 60

Tyr Gly Val Ala Ala Phe Arg Ala Phe Leu Lys Thr Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Glu Asn Leu Glu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Glu Phe Lys Lys Thr Arg

85 90 95

Ser Thr Ala Lys Leu Val Ser Lys Ala His Arg Ile Phe Glu Glu Phe

100 105 110

Val Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Val Asn Ile Asp Phe Gln Thr Arg

115 120 125

Glu Ala Thr Arg Lys Asn Leu Gln Glu Pro Ser Leu Thr Cys Phe Asp

130 135 140

Gln Ala Gln Gly Lys Val His Ser Leu Met Glu Lys Asp Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Phe Leu Arg Ser Lys Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Ser Gln

165 170 175

Arg Arg Leu Ser

180

<210> 3

<211> 180

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<220>

<223> RGS8[rat]

<400> 3

Met Ala Ala Leu Leu Met Pro Arg Arg Asn Lys Gly Met Arg Thr Arg

1 5 10 15

Leu Gly Cys Leu Ser His Lys Ser Asp Ser Cys Ser Asp Phe Thr Ala

20 25 30

Ile Leu Pro Asp Lys Pro Asn Arg Ala Leu Lys Arg Leu Ser Thr Glu

35 40 45

Glu Ala Thr Arg Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser His Lys

50 55 60

Tyr Gly Val Ala Ala Phe Arg Ala Phe Leu Lys Thr Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Glu Asn Leu Glu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Glu Phe Lys Lys Thr Arg

85 90 95

Ser Thr Ala Lys Leu Val Thr Lys Ala His Arg Ile Phe Glu Glu Phe

100 105 110

Val Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Val Asn Ile Asp Phe Gln Thr Arg

115 120 125

Glu Ala Thr Arg Lys Asn Met Gln Glu Pro Ser Leu Thr Cys Phe Asp

130 135 140

Gln Ala Gln Gly Lys Val His Ser Leu Met Glu Lys Asp Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Phe Leu Arg Ser Lys Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Ser Gln

165 170 175

Arg Arg Leu Ser

180

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 53 to aa 64 of SEQ ID NO 3

<400> 4

Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser His Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 53 to aa 71 of SEQ ID NO 3

<400> 5

Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser His Lys Tyr Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala Phe Arg

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 65 to aa 71 of SEQ ID NO 3

<400> 6

Tyr Gly Val Ala Ala Phe Arg

1 5

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 76 to aa 94 of SEQ ID NO 3

<400> 7

Thr Glu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Glu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Glu

1 5 10 15

Phe Lys Lys

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 105 to aa 119 of SEQ ID NO 3

<400> 8

Ala His Arg Ile Phe Glu Glu Phe Val Asp Val Gln Ala Pro Arg

1 5 10 15

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 108 to aa 119 of SEQ ID NO 3

<400> 9

Ile Phe Glu Glu Phe Val Asp Val Gln Ala Pro Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 108 to aa 128 of SEQ ID NO 3

<400> 10

Ile Phe Glu Glu Phe Val Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Val Asn Ile

1 5 10 15

Asp Phe Gln Thr Arg

20

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 120 to aa 128 of SEQ ID NO 3

<400> 11

Glu Val Asn Ile Asp Phe Gln Thr Arg

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 134 to aa 149 of SEQ ID NO 3

<400> 12

Asn Met Gln Glu Pro Ser Leu Thr Cys Phe Asp Gln Ala Gln Gly Lys

1 5 10 15

Val

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 150 to aa 161 of SEQ ID NO 3

<400> 13

Val His Ser Leu Met Glu Lys Asp Ser Tyr Pro Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 165 to aa 177 of SEQ ID NO 3

<400> 14

Ser Lys Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Ser Gln Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aa 167 to aa 177 of SEQ ID NO 3

<400> 15

Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln Ser Gln Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 198

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> RGS8[human] P57771-isoform 2

<400> 16

Met Trp Asn Thr Leu Thr Arg Ser Leu Ser Asp His Pro Val Gly Lys

1 5 10 15

Asp Pro Gln Ala Met Arg Thr Gly Gln Arg Gln Asn Lys Gly Met Arg

20 25 30

Thr Arg Leu Gly Cys Leu Ser His Lys Ser Asp Ser Cys Ser Asp Phe

35 40 45

Thr Ala Ile Leu Pro Asp Lys Pro Asn Arg Ala Leu Lys Arg Leu Ser

50 55 60

Thr Glu Glu Ala Thr Arg Trp Ala Asp Ser Phe Asp Val Leu Leu Ser

65 70 75 80

His Lys Tyr Gly Val Ala Ala Phe Arg Ala Phe Leu Lys Thr Glu Phe

85 90 95

Ser Glu Glu Asn Leu Glu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Glu Phe Lys Lys

100 105 110

Thr Arg Ser Thr Ala Lys Leu Val Ser Lys Ala His Arg Ile Phe Glu

115 120 125

Glu Phe Val Asp Val Gln Ala Pro Arg Glu Val Asn Ile Asp Phe Gln

130 135 140

Thr Arg Glu Ala Thr Arg Lys Asn Leu Gln Glu Pro Ser Leu Thr Cys

145 150 155 160

Phe Asp Gln Ala Gln Gly Lys Val His Ser Leu Met Glu Lys Asp Ser

165 170 175

Tyr Pro Arg Phe Leu Arg Ser Lys Met Tyr Leu Asp Leu Leu Ser Gln

180 185 190

Ser Gln Arg Arg Leu Ser

195

<210> 17

<211> 543

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of RGS8[human] isoform 1

<400> 17

atggcggcct tactgatgcc acgcaggaac aaagggatga ggactcgact gggatgcctg 60

tctcacaagt cagactcgtg tagtgatttc acagctattc ttccagacaa acccaaccgc 120

gctctcaaga gattatcgac agaagaagct acgaggtggg cagattcctt tgatgtgctt 180

ctctctcata agtatggggt ggctgcattc cgtgccttct tgaagacgga gttcagtgag 240

gagaacctgg aattctggtt ggcctgtgag gagttcaaga agaccaggtc aactgcaaaa 300

ctggtctcta aggcccatag gatctttgag gagtttgtgg atgtgcaggc tccacgggag 360

gtaaacattg acttccagac ccgagaagcc acgaggaaga acctgcagga gccatccctg 420

acttgctttg accaagccca aggaaaagta cacagcctca tggagaaaga ctcttacccc 480

aggttcctga ggtccaaaat gtacttagat ctgctgtccc aaagccagag gaggctcagt 540

tag 543

<210> 18

<211> 597

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of RGS8[human] isoform 2

<400> 18

atgtggaaca ccttaacccg aagcctctct gaccatccag ttggcaaaga ccctcaggcc 60

atgaggactg gccaaagaca gaacaaaggg atgaggactc gactgggatg cctgtctcac 120

aagtcagact cgtgtagtga tttcacagct attcttccag acaaacccaa ccgcgctctc 180

aagagattat cgacagaaga agctacgagg tgggcagatt cctttgatgt gcttctctct 240

cataagtatg gggtggctgc attccgtgcc ttcttgaaga cggagttcag tgaggagaac 300

ctggaattct ggttggcctg tgaggagttc aagaagacca ggtcaactgc aaaactggtc 360

tctaaggccc ataggatctt tgaggagttt gtggatgtgc aggctccacg ggaggtaaac 420

attgacttcc agacccgaga agccacgagg aagaacctgc aggagccatc cctgacttgc 480

tttgaccaag cccaaggaaa agtacacagc ctcatggaga aagactctta ccccaggttc 540

ctgaggtcca aaatgtactt agatctgctg tcccaaagcc agaggaggct cagttag 597

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer sense RGS8

<400> 19

atacgtctca catggcggcc ttactgatgc cacgc 35

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer asense RGS8

<400> 20

atacgtctcc tcgagactga gcctcctctg gctttgggac 40

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer asense RGS8-Stop

<400> 21

atacgtctcc tcgagctaac tgagcctcct ctggctttgg 40

Claims

1.包含RGS8的多肽在制备用于诊断疾病的试剂盒或诊断剂中的用途，诊断疾病包括检测样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤，并且所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述疾病是副肿瘤性小脑变性PCD。

2.包含RGS8的多肽在制备用于诊断疾病的试剂盒或诊断剂中的用途，诊断疾病包括检测样品中与RGS8相结合的自身抗体的步骤，并且所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述疾病是副肿瘤性神经系统综合征PNS。

3.与RGS8相结合的分离的人自身抗体在制备用于诊断疾病的试剂盒或诊断剂中的用途，其中所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述抗体与包含RGS8的多肽复合，其中所述疾病是副肿瘤性小脑变性PCD。

4.与RGS8相结合的分离的人自身抗体在制备用于诊断疾病的试剂盒或诊断剂中的用途，其中所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述抗体与包含RGS8的多肽复合，其中所述疾病是副肿瘤性神经系统综合征PNS。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，

其中所述疾病与以下一种或多种症状相关，所述症状选自包含构音障碍、吞咽困难、眼球震颤、振动幻视、眩晕、恶心、共济失调、头晕、惊厥、癫痫和震颤的组。

6.包含RGS8的多肽用于制造用于诊断疾病的试剂盒、医学装置的用途，其中所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述疾病是副肿瘤性小脑变性PCD。

7.包含RGS8的多肽用于制造用于诊断疾病的试剂盒、医学装置的用途，其中所述疾病是神经系统的自身免疫疾病，其中所述疾病是副肿瘤性神经系统综合征PNS。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，

其中所述疾病神经系统的自身免疫疾病与癌症相关。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自包含霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌和乳腺癌的组。