CN116041520B

CN116041520B - 针对Human CD63的兔单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116041520B
Application number: CN202211701563.4A
Authority: CN
Inventors: 盛飞; 胡文娟; 张云; 李倩倩; 代海艳; 黄谧; 程朝霞; 吴海
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2022-12-28
Filing date: 2022-12-28
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-12-28
Also published as: CN116041520A

Abstract

本发明提供针对Human CD63的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供针对Human CD63的高亲和力兔单克隆抗体对3C5和2G11，并利用该兔单克隆抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测方法，具有特异性高、热稳定性好、检测灵敏度高等优点。

Description

针对Human CD63的兔单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种针对Human CD63的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

CD63(LAMP-3，溶酶体相关的膜糖蛋白3)是一种四次跨膜蛋白超家族的膜糖蛋白，其包含4个跨膜域与2个胞外域，广泛表达于活化的嗜碱粒细胞膜表面、血小板、内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞以及中性粒细胞膜表面，与细胞的活化、黏附、变异及肿瘤的侵袭、转移等多种生命过程相关。

CD63为血小板溶酶体完整膜糖蛋白，在静止血小板表面仅有极少量表达，而在活化血小板表面可大量表达，在血小板活化后易位至质膜，可作为血小板的活化标记物。嗜碱性粒细胞发挥其生物学功能依赖于其活化，检测胞膜CD63的表达量可评估嗜碱性粒细胞的活化情况。CD63的表达在肺癌发生及发展的各个阶段均不同，与肺癌进展、临床生物学及预后密切相关，对评估肺癌等恶性肿瘤预后有着重要意义。CD63在人黑色素瘤中可能起着肿瘤抑制基因的作用，限制黑色素瘤的侵袭和进展，与其侵袭和转移发生呈负相关，与黑色素瘤相关抗原ME491和血小板抗原PTLGP40相同。CD63在TIMP-1与细胞表面结合中具有重要的作用，通过TIMP-1对CD63/整联蛋白β1复合物的调节控制细胞活性，从而抑制肿瘤的侵润转移。最近的研究还表明，CD63的抗体可以阻碍HIV-1进入巨噬细胞，因此推测CD63可能参与HIV-1病毒间相互识别并促进病毒与细胞小泡结合以利于融合和释放，抑制CXCR4在细胞表面的表达水平，进而抑制HIV-1的感染。此外，CD63的糖基化增高能调节主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ类分子的重新分布，与树突状细胞(DCs)的成熟过程相关，且CD63在特异性IgE介导的肥大细胞的脱颗粒与过敏反应中具有重要作用。

CD63作为血小板及嗜碱性粒细胞分化标志物之一，在某些相应部位的特异表达异常以及血清中CD63的浓度异常来对疾病作出评估预后。目前，几种基于流式细胞术的嗜碱粒细胞及血小板活化检测试验已被广泛应用于过敏性疾病的辅助诊断，故CD63在基础研究和临床诊断方面具有重要价值。除此之外，CD63还与病毒感染、肿瘤的浸润与侵袭、免疫及生殖功能等具有密切的关系。因此，开发一种高灵敏度高性能的Human CD63蛋白检测方法及抗体，具有深远的意义。

目前，针对CD63蛋白的抗体检测方案已有一定的研究。例如通过偶联物或标记物进行识别，采用的免疫原大多是非人源的CD63重组蛋白；且大部分现有公开的单克隆抗体对或多单克隆抗体与单克隆抗体结合检测的特异性偏低。

发明内容

基于此，有必要提供针对Human CD63的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供兔单克隆抗体对3C5和2G11，与Human CD63的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强。

本发明采用如下技术方案：

本发明提针对Human CD63的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体3C5或兔单克隆抗体2G11，分别结合Human CD63表面的不同抗原决定簇。

其中，所述兔单克隆抗体3C5的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体3C5的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。所述兔单克隆抗体3C5的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.6所示。

所述兔单克隆抗体2G11的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。所述兔单克隆抗体2G11的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ IDNO.17所示。所述兔单克隆抗体2G11的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ IDNO.16所示。

本发明还可以提供编码上述针对Human CD63的兔单克隆抗体的基因序列，或者包含该基因序列的表达载体或者宿主。

本发明还可以提供一种标记抗体偶联物，主要由上述针对Human CD63的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。

本发明提供针对Human CD63的高亲和力兔单克隆抗体对在建立高灵敏度的HumanCD63的酶联免疫检测方法中的应用。

所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体3C5，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体2G11。

本发明还可以提供一种检测Human CD63的试剂或者试剂盒，包含针对人CD63的兔单克隆抗体3C5和2G11。所述人CD63包括重组表达的人CD63，或细胞分泌的人CD63，或人血清中的人CD63。

本发明还可以提供针对Human CD63兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将针对Human CD63的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对3C5和2G11的上清液；纯化，即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明用来制备Human CD63兔单克隆抗体的免疫原是利用哺乳表达系统在体外重组表达的、经验证具有生物活性的重组Human CD63；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。

本发明开发了高亲和力的抗Human CD63的兔单克隆抗体3C5和2G11，上述两种抗体可以识别Human CD63表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、检测灵敏度高等优点，检测灵敏度为0.08ng/mL。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人Human CD63的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

附图说明

图1为检测CD63蛋白表达在上清的SDS-PAGE胶图。

图2为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图。

图3为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图。

图4为兔单克隆抗体3C5和2G11的重链可变区序列对比图。

图5为兔单克隆抗体3C5和2G11的轻链可变区序列对比图。

图6为基于兔单克隆抗体3C5和2G11与建立的双抗夹心酶联免疫(ELISA)检测Human CD63的方法的标准曲线图。

图7为基于兔单克隆抗体3C5和2G11的热稳定性测试结果统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明开发了高亲和力的抗Human CD63的兔单克隆抗体3C5和2G11，利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。

其中，兔单克隆抗体3C5抗体相关序列为：

3C5轻链氨基酸序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASESVYNNDDLAWLQQKPGQPPKVLIYSASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAASYYCVGLFDGDYFAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:1)。

3C5轻链可变区的氨基酸序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASESVYNNDDL AWLQQKPGQPPKVLIYSASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAASYYCVGLF DGDYFAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:2)。

3C5轻链互补决定区CDR1的序列：

ESVYNNDDLAW(SEQ ID NO:3)。

3C5轻链互补决定区CDR2的序列：

LIYSASKLASGV(SEQ ID NO:4)。

3C5轻链互补决定区CDR3的序列：

VGLFDGDYFAF(SEQ ID NO:5)。

3C5重链氨基酸序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFTFSTAWMSWVRQAPGKGLEWIGIINTGGTGKTYYASWAKGRFTCSKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARETADFNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:6)。

3C5重链可变区的氨基酸序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFTFSTAWMSWVRQ APGKGLEWIGIINTGGTGKTYYASWAKGRFTCSKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCAR ETADFNLWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:7)。

3C5重链互补决定区CDR1的序列：

FTFSTAWMS(SEQ ID NO:8)。

3C5重链互补决定区CDR2的序列：

WIGIINTGGTGKTYYASWAK(SEQ ID NO:9)。

3C5重链互补决定区CDR3的序列：

YFCARETADFNL(SEQ ID NO:10)。

兔单克隆抗体2G11抗体相关序列：

2G11轻链氨基酸序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASPVSAPVGGTVTINCQASQSVYKNKNLAWYQQKLGQPPKLLIYDTSTLASGVSSRFSGGGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCQGEFSCTSAEMTTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:11)。

2G11轻链可变区的氨基酸序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASPVSAPVGGTVTINCQASQSVYKNK NLAWYQQKLGQPPKLLIYDTSTLASGVSSRFSGGGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCQ GEFSCTSAEMTTFGGGTEVVVK(SEQ IDNO:12)。

2G11轻链互补决定区CDR1的序列：

QSVYKNKNLAW(SEQ ID NO:13)。

2G11轻链互补决定区CDR2的序列：

LIYDTSTLASGV(SEQ ID NO:14)。

2G11轻链互补决定区CDR3的序列：

QGEFSCTSAEMTTF(SEQ ID NO:15)。

2G11重链氨基酸序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGGLVQPGGSLTLTCTISGFSFSHRHYLNWVRQAPGKGLEWIGAIYIDDSDTAYASWAKDRLTISRTSSTTVTLQMTSLTAADTAIYFCARMDMTVLINSLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ IDNO:16)。

2G11重链可变区的氨基酸序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGGLVQPGGSLTLTCTISGFSFSHRHYLNWVR QAPGKGLEWIGAIYIDDSDTAYASWAKDRLTISRTSSTTVTLQMTSLTAADTAIYFCARM DMTVLINSLWGQGTLVTVSS(SEQID NO:17)。

2G11重链互补决定区CDR1的序列：

FSFSHRHYLN(SEQ ID NO:18)。

2G11重链互补决定区CDR2的序列：

WIGAIYIDDSDTAYASWAK(SEQ ID NO:19)。

2G11重链互补决定区CDR3的序列：

YFCARMDMTVLINSL(SEQ ID NO:20)。

实施例1

本实施例提供重组CD63蛋白的表达制备方法，具体步骤为：

(1)蛋白表达质粒构建：

使用Human CD63 NP_001771.1(Uniprot ID：P08962)蛋白序列对应NM_001780.6基因编码序列cDNA为模板，以一对特异性引物扩增人CD63蛋白第103位至第203位氨基酸片段(Ala103-Val203)，其中PCR反应体系如下：2μL模板，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，25μL2×Gloria Hi-FiPCRMasterMixwithGCBuffer(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，22μL N.F H₂O。

其中，人CD63蛋白第103位至第203位氨基酸片段序列如下：

AGYVFRDKVMSEFNNNFRQQMENYPKNNHTASILDRMQADFKCCGAANYTDW EKIPSMSKNRVPDSCCINVTVGCGINFNEKAIHKEGCVEKIGGWLRKNV(SEQ IDNO:21)。

引物对序列为：

CD63-Primer-F：

5'-GGTTCCGCGTGGATCCCCGGAAGCTGGCTATGTGTTTAGAGATAAGG-3'(SEQ ID NO:22)；

CD63-Primer-R：

5'-TGGTGATGATGATGCGGCCGCTCCACATTTTTCCTCAGCCAGCC-3'(SEQ IDNO:23)。

PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

将扩增的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式装载在表达载体上，所使用的真核表达载体为pBR322(市售：武汉爱博泰克生物科技有限公司)，经测序验证之后保存质粒，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。

(2)蛋白表达纯化

将包含有CD63 103-203aa序列的pBR322质粒加入到10mL无内毒素离心管内的OPM293培养基中，加完后混匀质粒悬液；将PEImax转染试剂缓慢滴加到加有质粒的离心管中，并混合均匀，并用Timer计时15分钟；将DNA和转染试剂的混合液，缓慢滴加到293F细胞中，一边滴加，一边摇晃细胞培养瓶，使混合物与细胞充分均匀接触；转染四天后取样计数，若细胞活率降到70％以下，则用50mL无内毒素离心管收取细胞上清，于4℃、3500rpm/min离心10min，收取上清；若细胞活率高于70％，继续等待1天，待细胞活率达到要求后收样。

加入0.1mM终浓度的AEBSF(母液浓度为0.1M)，盖上离心管盖，轻轻上下翻转离心管混匀AEBSF，然后将细胞上清倒入无内毒素50mL离心管中，于3000rpm、4℃条件下离心15min，将上清倒入新的50mL离心管中，加入0.1～0.3mM AEBSF。向上清中补加5M NaCl至终浓度为250mM,补加5M咪唑至终浓度为10mM。吸取20μL上清及20μL2*loading(组成：SDS，EDTA，溴酚蓝，二甲苯青和去离子甲酰胺)混匀，制上清样。平衡填料后进行孵育，加完基质的上清管用封口膜封口，置于旋转培养器上，于4℃、20rpm/min离心4小时。孵育结束后，将离心后的上清倒入新的上清管中，即流穿，每管留约5mL上清用于悬浮基质，将基质转入纯化柱中，向上清管中加入10mL Binding Buffer(组成：20mM Tris，250mM NaCl，10mMImidazole，10％甘油)，用无内毒素的巴氏吸管将上清管壁上吸附的填料颗粒冲洗下来。再将Binding Buffer(组成：20mM Tris，250mM NaCl，10mM Imidazole，10％甘油)转移到纯化柱管中，洗下基质上结合能力稍弱的杂蛋白，重力流，用灭菌的10mL EP管收集流出液，收集管需要插在冰上保持低温。

加入0.5mL(与基质体积相等)洗杂缓冲液(Washing Buffer A，组成：20mM Tris，250mM NaCl，40mM Imidazole，10％甘油)洗柱，洗下基质上结合能力稍弱的杂蛋白，重力流，用无内毒素1.5ml EP管收集流出液(每0.5ml为一管，EP管要放置在冰盒上保持低温)，流完后用G250检测(取100μL G250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束洗杂，将上述收集的流穿、洗杂液及洗脱液制样(一般为2*制样，即20μL蛋白+20μL 2*loading)，进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。

获得具有生物活性的重组Human CD63成熟蛋白。

实施例2

本实施例提供兔单克隆抗体的制备及纯化方法，具体包括如下步骤：

(2)动物免疫：

以具有生物活性的重组Human CD63成熟蛋白(实施例1制备)为免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后用ELISA方法测定其针对CD63的滴度，取血清效价高的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

(3)分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

(4)B淋巴细胞分选：方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞。

(5)编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。

其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL2×GloriaHiFi，6.5μL H₂O。2×GloriaHiFi试剂由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供。

其中，轻链VH扩增引物对为：

5’-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3’(SEQ ID NO:24)；

5’-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3’(SEQ ID NO:25)。

重链VH扩增引物对为：

5’-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3’(SEQ ID NO:26)；

5’-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3’(SEQ ID NO:27)。

PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

(6)单克隆抗体制备和纯化：

对扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体pBR322见图2、图3。经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻、重链基因的表达质粒一起转染到293细胞中；转染72-96小时后，离心除去细胞，对获得的培养上清用protein A亲和凝胶树脂进行纯化，清洗Protein A基质，用Binding Buffer(PBS，pH7.4)平衡填料，封口过夜进行孵育，配平离心收集流穿，最后进行洗杂和洗脱，即获得重组兔抗人CD63单克隆抗体3C5和2G11，经鉴定之后分装，并于-20℃低温保存备用。

序列测序比对结果见图4和图5，兔单克隆抗体3C5以及兔单克隆抗体2G11的重链可变区以及轻链可变区序列一致性分别为76.26％以及74.81％。

实施例3

本实施例针对Human CD63蛋白的兔单克隆抗体3C5和2G11，建立双抗夹心法酶联免疫检测方法，包括如下步骤：

1)包被：将兔单克隆抗体3C5(捕获抗体，实施例2制备)用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。

2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

3)封闭：将E013封闭液(在烧杯中加入90mL配置好的PBS试剂，分别加入5g Skimmilk、1g BSA和0.05mL Tween-20充分混匀，补充ddH2O至总体积100mL，室温或4℃存放使用，现配现用)以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5～2h，取出备用。

4)加蛋白：将Human CD63蛋白(实施例1来源)用稀释液(pH7.2的PBS缓冲液)进行稀释，稀释浓度：10,5,2.5,1.25,0.625,0.312,0.156,0ng/mL，然后以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

6)加检测抗体：将2G11-biotin稀释成0.2μg/mL后，以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。

其中，2G11-biotin(检测抗体)的标记处理方法为：将抗Human CD63兔单克隆抗体2G11配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液。取200μL 1mg/mL的抗Human CD63兔单克隆抗体2G11溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μL500mM pH＝9.0的Tris-HCl溶液终止反应。最后加入4mL pH＝7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30kDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

8)加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

10)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

11)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

以Human CD63蛋白的浓度为横坐标，吸光值的校正值OD₄₅₀为纵坐标作图，统计结果绘制的线性曲线见图6。

实验结果显示：基于Human CD63蛋白的兔单克隆抗体对3C5和2G11建立双抗夹心法酶联免疫检测方法的检测灵敏度可以达0.08ng/mL。

实施例4

本实施例参照实施例3的方法步骤进行抗体对稳定性实验(热破)测试，包括如下步骤：

1)包被：将兔单克隆抗体3C5用1*PBS稀释成2μg/ml，涡旋仪混匀后，以100μl/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。

2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1*PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

3)封闭：将E013封闭液以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h。

4)热破坏：将包被好的酶标板、冻干蛋白、100X浓缩的检测抗体分成三份，分别置于-20℃、4℃、37℃密封保存，7天后取出测试。

5)加蛋白：将将不同条件下保存的Human CD63蛋白用稀释液进行稀释，稀释浓度：10,5,2.5,1.25,0.625,0.312,0.156,0ng/mL，然后以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

6)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1*PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

7)加检测抗体：将不同条件下保存的2G11-biotin进行100倍稀释后，以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。

8)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1*PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

9)加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

10)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1*PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

11)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

12)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数，统计结果见图7。

实验结果显示：基于Human CD63蛋白的兔单克隆抗体对以2μg/mL的浓度包被，检测抗体配制100×浓缩液，蛋白冻干状态，置于37℃热加速破坏7天，测试检测抗体较稳定，酶标板与4℃保存条件下对比CV为15.5％；蛋白与4℃保存条件下对比CV为9.89％，全组分37℃考评，与4℃保存条件下对比CV为19.48％。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种针对Human CD63的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体3C5或兔单克隆抗体2G11，分别结合Human CD63表面的不同抗原决定簇；

所述兔单克隆抗体3C5的轻链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示，重链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10所示；

所述兔单克隆抗体2G11的轻链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15所示，重链互补决定区1-3的序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体3C5的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；和/或

所述兔单克隆抗体2G11的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求2所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体3C5的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示；和/或

所述兔单克隆抗体2G11的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。

4.编码权利要求1至3任一项所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体的基因。

5.一种包含权利要求4所述基因的表达载体。

6.一种包含权利要求4所述基因的宿主。

7.一种标记抗体偶联物，其特征在于，主要由权利要求1至3任一项所述的针对HumanCD63的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。

8.如权利要求1至3任一项所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体在制备检测HumanCD63的试剂或者试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测Human CD63，其中所述兔单克隆抗体3C5作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体2G11用作标记抗体。

10.一种检测Human CD63的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体3C5和2G11。

11.根据权利要求10所述的检测Human CD63的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述Human CD63选自重组Human CD63、细胞分泌的Human CD63、血清中的Human CD63的中的至少一种。

12.一种权利要求1至3任一项所述的针对Human CD63兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1至3任一项所述的针对Human CD63的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；

培养获得包含兔单克隆抗体3C5和2G11的上清液；

纯化，即得。