CN112135624A - 抗cd63抗体、缀合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了针对CD63的抗体、其部分和融合蛋白。还提供了编码所述抗体、其部分和融合蛋白的核酸序列。还提供了包含所述抗体、其部分和融合蛋白的组合物以及使用所述抗体、其部分和融合蛋白例如治疗有需要的患者的方法。

Description

抗CD63抗体、缀合物和其用途
发明领域
本申请大体上是针对结合人CD63的人抗体和人抗体的抗原结合片段，以及其例如在治疗有需要的患者的病症中的方法。本申请还涉及包含抗CD63抗体的至少抗原结合片段的抗原结合分子，其中抗原结合分子与CD63的络合介导抗原结合分子/CD63络合物的内化。本申请还涉及包含抗CD63抗体(或包含抗CD63抗体的抗原结合片段的抗原结合分子)和治疗剂(例如替代酶、细胞毒性药物等)的缀合物，所述缀合物可用于治疗疾病。
背景技术
人抗原CD63，也称为溶酶体相关糖蛋白3(LAMP3)，是四跨膜蛋白超家族的成员。它的细胞表达无处不在，尽管在细胞表面可以看到一些表达，但主要在细胞内的内体或溶酶体区室中表达。CD63是一种内化蛋白，当靶标以某种方式，例如通过与有效负载缀合的抗原结合蛋白或结合靶标和CD63的双特异性抗原结合蛋白与CD63物理连接时，CD63能够介导靶标的内化和转运到内体/溶酶体区室。
本领域需要新的用于双特异性结合蛋白的抗人CD63抗体，包括其单价抗原结合片段，所述抗体能够结合CD63并实现它的内化。
发明内容
本发明提供了结合于人CD63的抗体和其抗原结合片段。根据本发明的这方面的抗体尤其可用于特异性地指导靶蛋白、酶(例如GAA或GLA)、药物缀合物等的内化和/或溶酶体运输。因而，本发明的这方面还提供了结合人CD63的双特异性抗体、其抗原结合片段、抗体-蛋白融合构建体(参见例如图1)和抗体药物缀合物。
表1中列出了本发明的示例性抗CD63抗体。表1阐述了示例性抗CD63抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸和核酸序列标识符。
本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或其具有与所述HCVR氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或其具有与所述LCVR氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ IDNO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ IDNO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ ID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1包含选自表1中所列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2包含选自表1中所列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3包含选自表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1包含选自表1中所列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2包含选自表1中所列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3包含选自表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:8/16、SEQ IDNO:24/32、SEQ ID NO:40/48、SEQ ID NO:56/64、SEQ ID NO:72/80、SEQ ID NO:88/96、SEQID NO:104/112、SEQ ID NO:120/128、SEQ ID NO:136/144、SEQ ID NOs；152/160、SEQ IDNO:168/176、SEQ ID NO:184/192、SEQ ID NO:200/208；SEQ ID NO:216/224；SEQ ID NO:232/240；SEQ ID NO:248/256；SEQ ID NO:264/272；SEQ ID NO:280/288；SEQ ID NO:296/288；SEQ ID NO:304/288；SEQ ID NO:312/288；SEQ ID NO:320/288；SEQ ID NO:328/288；SEQ ID NO:336/288。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种内所含的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、SEQ ID NO:20-22-24-26-28-30-32、SEQ ID NO:36-38-40-44-46-48、SEQ ID NO:52-54-56-60-62-64；SEQ ID NO:68-70-72-76-78-80；SEQ ID NO:84-86-88-92-94-96；SEQ ID NO:100-102-104-108-110-112；SEQ ID NO:116-118-120-124-126-128；SEQ ID NO:132-134-136-140-142-144；SEQ IDNO:148-150-152-156-158-160；SEQ ID NO:164-166-168-172-174-176；SEQ ID NO:180-182-184-188-190-192；SEQ ID NO:196-198-200-204-206-208；SEQ ID NO:212-214-216-220-222-224；SEQ ID NO:228-230-232-236-238-240；SEQ ID NO:244-246-248-252-254-256；SEQ ID NO:260-262-264-268-270-272；SEQ ID NO:276-278-280-284-286-288；SEQID NO:292-294-296-284-286-288；SEQ ID NO:300-302-304-284-286-288；SEQ ID NO:308-310-312-284-286-288；SEQ ID NO:316-318-320-284-286-288；SEQ ID NO:324-326-328-284-286-288和SEQ ID NO:332-334-336-284-286-288。
在一相关实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含如通过表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。举例来说，本发明包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ ID NO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQ ID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ ID NO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ IDNO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域中众所周知的并且可以用于鉴定本文公开的指定HCVR LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴定CDR边界的示例性规约包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般地说，Kabat定义是基于序列变化性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，并且AbM定义是Kabat法与Chothia法在之间的折衷。参见例如Kabat,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。还可以利用公共数据库来鉴定抗体内的CDR序列。
本发明还提供了编码抗CD63抗体或其部分的核酸分子。举例来说，本发明提供了编码表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述HCVR核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述LCVR核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的HCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述HCDR1核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的HCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述HCDR2核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的HCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述HCDR3核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的LCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述LCDR1核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的LCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述LCDR2核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的LCDR3核酸序列中的任一者，或其具有与所述LCDR3核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列的多核苷酸序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含一组三个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种所定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含一组三个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中所列出的示例性抗CD63抗体中的任一种所定义。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR二者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述HCVR核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列；和选自表1中所列出的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其具有与所述LCVR核酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列。在根据本发明的这方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR两个都源自于表1中列出的相同抗CD63抗体。
本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体能够表达包含抗CD63抗体的重链或轻链可变区的多肽。举例来说，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包含以上提及的核酸分子中的任一种，即编码如表1中所示的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。在本发明的范围内还包括引入此类载体的宿主细胞，以及产生抗体或其部分的方法，所述方法是通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收由此所产生的抗体和抗体片段。
在一些方面，本发明包括具有改变的糖基化模式的抗体或其抗原结合片段，例如抗CD63抗体。在一些实施方案中，去除不合需要的糖基化位点的修饰是有用的，或者在需要细胞毒性下，缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体是有用的，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shields等人(2002)JBC 277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含特异性地结合CD63的重组人抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一相关方面，本发明的特征是一种组合物，所述组合物是抗CD63抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂是宜与抗CD63抗体组合的任何剂。本文中的其它地方公开了涉及本发明的抗CD63抗体的另外的组合疗法和共制剂。
在另一方面，本发明提供了使用本发明的抗CD63抗体靶向/杀死表达CD63的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的抗CD63抗体的药物组合物。在一些情况下，抗CD63抗体(或其抗原结合片段)可以通过包括但不限于以下的方法修饰成具有更强细胞毒性；为增加ADCC而修饰的Fc结构域(参见例如Shields,R.L.等人(2002)JBC 277:26733)、放射性免疫疗法、抗体药物缀合物或用于提高肿瘤消融效率的其它方法。
本发明还包括本发明的抗CD63抗体的用途，所述抗体用于制造供治疗与表达CD63的细胞有关或由表达CD63的细胞所引起的疾病或病症(例如癌症)的药物。在一方面，本发明一种化合物，所述化合物包含抗CD63抗体或抗原结合片段或者双特异性抗TAA×CD63抗体，所述化合物用于药物中。在一方面，本发明涉及一种化合物，所述化合物包含如本文公开的抗体药物缀合物(ADC)，所述化合物用于药物中。
在又一方面，本发明提供了用于诊断应用的单特异性抗CD63抗体，例如成像试剂。
在又一方面，本发明提供了用于增强CD63内化至溶酶体中和/或溶酶体降解CD63的治疗方法，所述治疗方法是使用抗CD63抗体或本发明抗体的抗原结合部分，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，如通过表面等离子体共振或等效测定所测量，所述抗体或其抗原结合片段以超过100nM的KD结合表达CD63的细胞。在另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，如通过FACS分析所测量，所述抗体或其抗原结合片段以超过100nM的EC50结合表达CD63的细胞。在另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合表达CD63的细胞并内化至表达CD63的细胞的溶酶体中，其中抗体还结合于在相同细胞上表达的CD63。
本发明还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与包含如表1中所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人CD63。在另一方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人CD63：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ ID NO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQ ID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ ID NO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ ID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ IDNO:330/282。
本发明还提供了一种抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合于人CD63上与包含如表2中所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体相同的表位。在另一方面，抗体或抗原结合片段结合于人CD63上与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体相同的表位：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ ID NO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQ ID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ ID NO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ ID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。
本发明还提供了一种结合人CD63的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：具有如表1中所示的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；和具有如表1中所示的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一方面，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ ID NO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQ ID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ ID NO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ IDNO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。在另一方面，分离的抗体或抗原结合片段包含分别选自由以下组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：SEQID NO:4-6-8-12-14-16、SEQ ID NO:20-22-24-26-28-30-32、SEQ ID NO:36-38-40-44-46-48、SEQ ID NO:52-54-56-60-62-64；SEQ ID NO:68-70-72-76-78-80；SEQ ID NO:84-86-88-92-94-96；SEQ ID NO:100-102-104-108-110-112；SEQ ID NO:116-118-120-124-126-128；SEQ ID NO:132-134-136-140-142-144；SEQ ID NO:148-150-152-156-158-160；SEQID NO:164-166-168-172-174-176；SEQ ID NO:180-182-184-188-190-192；SEQ ID NO:196-198-200-204-206-208；SEQ ID NO:212-214-216-220-222-224；SEQ ID NO:228-230-232-236-238-240；SEQ ID NO:244-246-248-252-254-256；SEQ ID NO:260-262-264-268-270-272；SEQ ID NO:276-278-280-284-286-288；SEQ ID NO:292-294-296-284-286-288；SEQ ID NO:300-302-304-284-286-288；SEQ ID NO:308-310-312-284-286-288；SEQ IDNO:316-318-320-284-286-288；SEQ ID NO:324-326-328-284-286-288和SEQ ID NO:332-334-336-284-286-288。在另一方面，本发明提供了一种结合人CD63的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、298、306、314、322和330；和(b)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266和282。在另一方面，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由以下SEQID NO组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ IDNO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ IDNO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ ID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。
根据另一方面，本发明提供了抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物包含如本文所述的抗CD63抗体、其抗原结合片段或包含所述其抗原结合片段的多特异性结合蛋白和治疗剂(例如细胞毒性剂)。在一些实施方案中，(a)抗CD63抗体、抗原结合片段和/或多特异性结合蛋白和(b)细胞毒性剂通过接头共价附连，如本文中所论述。在多个实施方案中，抗CD63抗体或抗原结合片段可以是本文所述的抗CD63抗体中或片段的任一种。
在一些实施方案中，细胞毒性剂选自奥利司他汀(auristatin)、美登素类(maytansinoid)、微管溶解素(tubulysin)、托马霉素(tomaymycin)、卡奇霉素(calicheamicin)或多拉司他汀(dolastatin)衍生物。在一些情况下，细胞毒性剂是选自MMAE或MMAF的奥利司他汀或选自DM1或DM4的美登素类。在一些实施方案中，细胞毒性剂是具有如本文中所论述的式的结构的美登素类。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是具有以下结构的美登素类：
Figure BDA0002779893380000131
在一些实施方案中，细胞毒性剂是具有以下结构的美登素类：
Figure BDA0002779893380000132
在一些实施方案中，抗体药物缀合物包含抗原结合蛋白，包括多特异性结合蛋白，包含抗CD63抗原结合蛋白或其抗原结合部分，和
Figure BDA0002779893380000133
其中
Figure BDA0002779893380000134
是与抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，抗体药物缀合物包含抗原结合蛋白，包括多特异性结合蛋白，包含抗CD63抗原结合蛋白或其抗原结合部分，和
Figure BDA0002779893380000141
其中
Figure BDA0002779893380000142
是与抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，抗体药物缀合物包含抗原结合蛋白，包括多特异性结合蛋白，包含抗CD63抗原结合蛋白或其抗原结合部分，和
Figure BDA0002779893380000143
或
它们的混合物，
其中
Figure BDA0002779893380000144
是与抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，键通过半胱氨酸残基的硫成分接触抗体或其片段。
在一些实施方案中，键通过赖氨酸残基的氮成分接触抗体或其片段。
在上文或本文中论述的抗体药物缀合物的各个实施方案中的任一个中，抗体药物缀合物可以每个抗原结合蛋白包含1至10个细胞毒性剂，所述抗原结合蛋白包括包含抗CD63抗原结合蛋白或其抗原结合部分的多特异性结合蛋白。
附图说明
图1示意性地表示多结构域治疗蛋白。图A描绘了多结构域治疗蛋白，所述多结构域治疗蛋白包含双特异性抗体(ii)和替代酶(i)。图B描绘了酶-Fc融合多肽(i)，所述多肽与内化效应子特异性半体(ii)缔合，形成所述多结构域治疗蛋白。图C描绘了与抗内化效应子抗体的重链C端共价连接的替代酶(六边形)。图D描绘了与抗内化效应子抗体的重链N端共价连接的替代酶(六边形)。图E描绘了与抗内化效应子抗体的轻链C端共价连接的替代酶(六边形)。图F描绘了与抗内化效应子抗体的轻链N端共价连接的替代酶(六边形)。图G描绘了与含有VH区(阴影条)和VL区(空白条)的单链可变片段(scFv)的C端共价连接的替代酶(六边形)。图H描绘了与两个scFv结构域共价连接的替代酶(六边形)，第一scFv(i)充当第一递送结构域，而第二scFv(ii)充当第二递送结构域。表1中提供了示例性抗CD63 VH和VL氨基酸序列(和编码其的核苷酸序列)，所述氨基酸序列可以用于构建包含抗CD63抗体或其抗原结合部分的多结构域治疗蛋白。
图2是AAV基因疗法载体的非限制性示例性图，所述载体编码图中表示的多结构域治疗蛋白，其中scFv是抗人CD63 scFv并且替代法酶是GAA(例如抗hCD63scFv::hGAA；参见例如如SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列，其中抗hCD63scFv源自于H4H12450N抗体。SEQ IDNO:364的氨基酸1-117提供H4H12450N抗体的重链可变域(VH)的氨基酸序列，SEQ ID NO:364的氨基酸118-132提供在H4H12450N的重链与轻链可变域之间的氨基酸接头序列；SEQID NO:364的氨基酸133-240提供H4H12450N抗体的轻链可变域(VL)的氨基酸序列；SEQ IDNO:364的氨基酸241-245提供抗在hCD63scFv与GAA之间的氨基酸接头序列；并且SEQ IDNO:364的氨基酸246-1128提供了替代酶GAA或其生物活性部分的氨基酸序列。示例性5'ITR和3'ITR序列分别如SEQ ID NO:365和SEQ ID NO:366所示。示例性肝脏特异性增强子(serpina 1)如SEQ ID NO:367所示。示例性肝脏特异性启动子(TTR)如SEQ ID NO:368所示。表1中提供了另外的示例性抗CD63 VH和VL氨基酸序列(和编码其的核苷酸序列)，所述氨基酸序列可以用于构建包含抗CD63抗体或其抗原结合部分的多结构域治疗蛋白，所述多结构域治疗蛋白例如用于治疗有需要的患者的庞贝病(Pompe disease)。
具体实施方式
本文提供了新颖的抗人CD63抗体和其单价抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段可用于介导CD63的内化。抗人CD63抗体和其单价抗原结合片段可用于例如治疗疾病，作为多特异性抗原结合蛋白和/或多结构域治疗蛋白的一部分，和/或作为抗体药物缀合物。
本发明不局限于所描述的具体的实施方案、组合物、方法和实验条件，因而实施方案、组合物、方法和条件可以变化。本文中使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而不是意图限制，因为本发明的范围仅仅受随附权利要求书限制。
虽然与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但是现在描述一些优选的方法和材料。本文中引用的所有公布都以引用的方式併入本文中，整体进行描述。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。术语“约”在提及具体的叙述的数值时使用时，意指所述值可以相对于所叙述的值变化至多1％。举例来说，表述“约100”包括99和101以及之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但是现在描述优选的方法和材料。本说明书中所提及的所有专利、申请和非专利公布以引用的方式整体并入本文中。
“CD63”包括一种在人中由CD63基因编码并且具有如SEQ ID NO:337所示的氨基酸序列的蛋白质。CD63是跨越细胞膜四次的细胞表面蛋白的四跨膜蛋白超家族的成员。CD63实际上在所有组织中都表达，并且认为它与形成和稳定信号传导络合物有关。CD63定位于细胞膜、溶酶体膜和晚期核内体膜。已知CD63与整合素缔合并且可能与上皮-间质转化有关。参见H.Maecker等人,“The tetraspanin superfamily:molecular facilitators,”11(6)FASEB J.428-42,1997年5月；和M.Metzelaar等人,“CD63 antigen.A novel lysosomalmembrane glycoprotein,cloned by a screening procedure for intracellularantigens in eukaryotic cells,”266J.Biol.Chem.3239-3245,1991。CD63展现出内化效应子的生物活性。除非明确地指出来自非人物种，否则本文中所有对蛋白质、多肽和蛋白质片段的提及都意图指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，表述“CD63”意指人CD63，除非指出来自非人物种，例如“小鼠CD63”、“猴CD63”等。
“内化效应子”包括一种能够内化至细胞中或以其它方式参与或促进逆行膜运输的蛋白质。在一些情况下，内化效应子是经历胞吞转运的蛋白质；也就是说，蛋白质在细胞的一侧上内化并被转运至细胞的另一侧(例如顶点至基部)。在许多实施方案中，内化效应子蛋白质是细胞表面表达的蛋白质或可溶性的胞外蛋白质。然而，本发明还涵盖以下实施方案，其中内化效应子蛋白质在例如核内体、内质网、高尔基体、溶酶体等胞内区室内表达。举例来说，在本发明的多个实施方案中，与逆行膜运输(例如从早/再循环核内体至反面高尔基网状结构的通路)有关的蛋白质可以充当内化效应子蛋白质。无论怎样，抗体或其抗原结合部分，包括包含所述抗体或其抗原结合部分的多结构域治疗蛋白和多特异性结合蛋白与内化效应子蛋白质的结合都引起整个抗体或其抗原结合部分，包括包含所述抗体或其抗原结合部分的多结构域治疗蛋白和多特异性结合蛋白以及与之缔合的任何分子(例如酶、靶分子、药物缀合物)也变得内化至细胞中。如以下所说明，内化效应子蛋白质包括直接内化至细胞中的蛋白质以及间接内化至细胞中的蛋白质。直接内化至细胞中的内化效应子蛋白质包括具有至少一个胞外结构域的膜相关分子(例如跨膜蛋白、GPI锚定蛋白等)，所述膜相关分子经历细胞内化，并且优选通过胞内降解和/或再循环通路加工。
短语“结合CD63的抗体”或“抗CD63抗体”包括特异性地识别单一CD63分子的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可以结合可溶性CD63和/或细胞表面表达的CD63。可溶性CD63包括天然CD63蛋白以及缺乏跨膜域或在其它方面不与细胞膜相关的重组CD63蛋白变体，例如但不限于重组C端Myc-Myc-六组氨酸(hCD63 EC环2-MMH；SEQ IDNO:338)或与C端人Fc标签一起表达的重组人CD63胞外环2(hCD63 EC环2-hFc；SEQ ID NO:339)。
表述“细胞表面表达的CD63”是指一种或多种CD63蛋白，其在体外或体内在细胞表面上表达，使得CD63蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的胞外侧并且能够接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的CD63”包括在细胞膜中的功能T细胞受体的环境内所含有的CD63蛋白。“细胞表面表达的CD63”可以包含在通常表达CD63蛋白的细胞的表面上表达的CD63蛋白或由所述CD63蛋白组成。可替代地，“细胞表面表达的CD63”可以包含在通常在表面上不表达人CD63但已经被人工工程化成在表面上表达CD63的细胞的表面上表达的CD63蛋白或由所述CD63蛋白组成。
术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。
术语“亲合力”是指抗原结合分子达到靶接合阈值以实现所需作用的能力。在多个靶抗原和多特异性抗原结合分子的背景下短语“亲合力驱动的结合”或“亲合力驱动的配对”是指如下作用机制，其中多特异性抗原结合分子提供至少两个单价结合臂，并且第一个结合臂以高亲和力结合于第一靶抗原。第二结合臂以低亲和力结合第二靶抗原，使得第二结合臂不结合第二靶抗原，除非两种抗原彼此接近，例如存在于同一细胞上。因此，高亲和力结合于第一靶抗原增加低亲和力臂对第二结合臂的亲合力并且介导与第二靶标的结合(Rhoden,J.J.等人,2016年5月20日,J Biol Chem.291,11337-11347,于2016年3月28日首次公布doi:10.1074/jbc.M116.714287；Jarantow,S.W.等人,2015年10月9日,J BiolChem.290(41):24689-704.doi:10.1074/jbc.M115.651653.Epub 2015年8月10日)。
术语“抗体”是指包含至少一个特异性地结合于具体抗原(例如CD63)或与具体抗原(例如CD63)相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子络合物。如本文所用，术语“抗体”包括包含四条多肽链-由二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。每条重链都包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，所述CDR和FR从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以缩写成HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以缩写成LCDR1、LCDR2和LCDR3。术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子体共振，例如BIACORETM或溶液亲和性ELISA所测量，对靶标的结合亲和力达至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M的那些抗体。术语“抗体”可以涵盖任何抗体类型，例如单克隆或多克隆。此外，抗体可以是或任何来源，例如哺乳动物或非哺乳动物。在一个实施方案中，抗体可以是哺乳动物或鸟类。在另一实施方案中，抗体可以是或人来源并且还可以是人单克隆抗体。
术语“抗体”还包括完全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性地结合抗原而形成络合物的任何天然存在的、可通过酶获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。可以使用任何合适的标准技术从例如完全抗体分子获得抗体的抗原结合片段，所述标准技术例如蛋白水解消化或重组基因工程技术，涉及对编码抗体可变和任选地恒定结构域的DNA的操控和表达。已知这种DNA，和/或容易例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以对DNA进行测序，并且以化学方法或者通过使用分子生物学技术进行操控，例如以将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的配置，或者引入密码子，建立半胱氨酸残基，修饰、加入或除去氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最低识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)，或受限FR3-CDR3-FR4肽。表述“抗原结合片段”内还涵盖其它工程化分子，例如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段典型地包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成，并且通常包含与一个或多个框架序列相邻或同框的至少一个CDR。在VH结构域与VL结构域缔合的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以呈任何合适的排列相对于彼此定位。举例来说，可变区可以是二聚的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的非限制性的示例性配置包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何配置、包括以上所列出的示例性配置中的任一者中，可变和恒定结构域可以直接彼此连接，或者可以通过完全或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含以上所列出的可变和恒定结构域配置中的任一者彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如通过二硫键)呈非共价缔合所形成的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。
如同完全抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段典型地包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合于单独的抗原或同一抗原上不同的表位。使用本领域中可利用的常规技术，可以将任何多特异性抗体格式，包括本文公开的示例性双特异性抗体格式修改以适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况。
本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)起作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体存在下本发明的抗体溶解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”(ADCC)是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特定细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，由此使靶细胞溶解。CDC和ADCC可以使用本领域中众所周知和可利用的测定来测量。(参见例如美国专利No 5,500,362和5,821,337，以及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体并介导细胞依赖性细胞毒性的能力来说是重要的。因此，抗体同种型可以根据抗体是否需要介导细胞毒性来选择。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗CD63抗体是人抗体。术语“人抗体”是指具有源自于人生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如CDR和尤其CDR3中未由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异性诱变或由体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不意图包括源自于另一哺乳动物物种如小鼠的生殖系的CDR序列已经被移植至人框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是重组人抗体。术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(以下进一步描述)、从重组的组合人抗体文库分离的抗体(以下进一步描述)、从针对人类免疫球蛋白基因进行转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、建立或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自于人生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。在某些实施方案中，然而，此类重组人抗体进行体外诱变(或当使用针对人Ig序列进行转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自于人生殖系VH和VL序列并与人生殖系VH和VL序列有关，但在体内在人抗体生殖系谱系内不天然存在的序列。
人抗体可以呈与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的由共价偶合的轻链和重链构成的分子(半抗体)。这些形式即使在亲和力纯化之后也非常难以分离。
各种完整IgG同种型中第二种形式的出现频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以显著地减少第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30:105)至典型地使用人IgG1铰链所观察到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，这些突变例如在生产中是合乎需要的，以提供所需抗体形式的产率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。“分离的抗体”是指已经从自然环境的至少一种组分鉴定和分离和/或回收的抗体。举例来说，对本发明来说，已经从生物体的至少一种组分分离或去除，或从天然存在或天然产生抗体的组织或细胞分离或去除的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括在重组细胞内原位的抗体。分离的抗体是已经经受至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
本发明还包括结合CD63的单臂抗体。术语“单臂抗体”是指包含单个抗体重链和单个抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可以包含如表1中所示的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一种。
本文公开的抗CD63抗体与抗体所源自的对应生殖系序列相比，可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这样的突变容易通过比较本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的生殖系序列来确定。本发明包括源自于本文公开的氨基酸序列中的任一者的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成抗体所源自的生殖系序列的对应残基，或突变成另一人生殖系序列的对应残基，或突变成对应生殖系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中总称为“生殖系突变”)。本领域的普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，容易产生包含一个或多个单独生殖系突变或它们的组合的许多抗体和其抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基都突变回在抗体所源自的原始生殖系序列中发现的残基。在其它实施方案中，只有某些残基突变回原始生殖系序列，例如只有在FR1的头8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或者只有在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其它实施方案中，框架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同生殖系序列(即与抗体最初源自的生殖系序列不同的生殖系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可以在框架和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些单独的残基突变成特定生殖系序列的对应残基，而与原始生殖系序列不同的某些其它残基保持或突变成不同生殖系序列的对应残基。含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段一旦获得，就容易测试一种或多种所需特性，例如改良的结合特异性、增加的结合亲和力、改良或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种通用方法获得的抗体和抗原结合片段涵盖于本发明内。
本发明还包括包含本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的具有一个或多个保守取代的变体的抗CD63抗体。举例来说，本发明包括具有相对于本文中的表1中所示的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗CD63抗体。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体通常包含两个不同的重链，其中每个重链特异性地结合不同表位—在两个不同的分子(例如抗原)上或者在相同的分子上(例如在相同的抗原上)。如果双特异性抗体能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，那么第一重链对第一表位的亲和力通常将比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之亦然。双特异性抗体所识别的表位可以在相同或不同的靶标上(例如在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别相同抗原的不同表位的重链来制成。举例来说，编码识别相同抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达此类序列。典型的双特异性抗体具有：两条重链，每条重链具有三个重链CDR、接着(N端至C端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域；和免疫球蛋白轻链，所述轻链不赋予抗原结合特异性，但可以与每条重链缔合，或者可以与每条重链缔合并且可以结合重链抗原结合区所结合的表位中的一个或多个，或者可以与每条重链缔合并且使重链中的一条或两条能够结合于一个或两个表位。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另作说明，否则包括重链可变结构域。除非另作说明，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR以及它们的组合。典型的重链在可变结构域(从N端至C端)后具有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能片段包括能够特异性地识别抗原(例如以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别抗原)、能够表达和从细胞分泌以及包含至少一个CDR的片段。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另作说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另作说明，否则轻链可变(VL)结构域典型地包括三个轻链CDR和四个框架(FR)区。通常，全长轻链从氨基端至羧基端包括VL结构域和轻链恒定结构域，所述VL结构域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可以用于本发明的轻链包括例如不选择性地结合抗原结合蛋白所选择性地结合的第一或第二抗原的轻链。合适的轻链包括可以通过针对现存的抗体文库(湿文库或计算机)中最常采用的轻链进行筛选来鉴定，其中轻链基本上不干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。合适的轻链包括可以结合抗原结合蛋白的抗原结合区所结合的一个或两个表位。
短语“可变结构域”包括在序列上从N端至C端(除非另外指示)包含以下氨基酸区域的免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(根据需要修饰)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“可变结构域”包括能够折叠成具有双重β片状结构的规范结构域(VH或VL)的氨基酸序列，其中β片通过第一β片与第二β片的残基之间的二硫键连接。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间的氨基酸序列。CDR可以由例如生殖系序列或重排或未重排的序列，并且例如由未处理或成熟B细胞或T细胞编码。在一些情况下(例如对于CDR3)，CDR可以由两个或更多个不相连(例如在未重排的核酸序列中)但在B细胞核酸序列中例如由于剪接或连接序列(例如V-D-J重组，形成重链CDR3)而相连的序列(例如生殖系序列)编码。
术语“抗体片段”是指保留特异性地结合于抗原的能力的抗体的一个或多个片段。术语“抗体片段”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 241:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的CDR；以及(vii)scFv，其由Fv片段的两个结构域VL和VH组成，所述两个结构域由合成接头接合以形成VL和VH区配对，从而形成单价分子的单个蛋白质链。术语“抗体”还涵盖单链抗体的其它形式，例如双功能抗体(参见例如Holliger等人(1993)PNAS USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2:1121-1123)。
短语“含Fc的蛋白质”包括抗体、双特异性抗体、免疫粘附素和包含至少免疫球蛋白CH2和CH3区的功能部分的其它结合蛋白。“功能部分”是指可以结合Fc受体(例如FcyR；或FcRn，即新生儿Fc受体)和/或可以参与补体活化的CH2和CH3区。如果CH2和CH3区含有缺失、取代和/或插入或使其不能结合任何Fc受体以及不能活化补体的其它修饰，那么CH2和CH3区不是功能性的。
含Fc的蛋白质可以在免疫球蛋白结构域中包含修饰，包括其中修饰影响结合蛋白的一个或多个效应功能(例如影响FcyR结合、FcRn结合、因此半衰期和/或CDC活性的修饰)。此类修饰包括(但不限于)以下修饰和它们的组合，参考免疫球蛋白恒定区的EU编号：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
举例来说并且不限制，结合蛋白是含有Fc的蛋白质并且展现增强的血清半衰期(与没有所述修饰的相同的含有Fc的蛋白质比较)并且在以下位置具有修饰：250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)；或在428和/或433(例如L/R/SI/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在250和/或428的修饰；或在307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在另一个实例中，修饰可以包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L,2591(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；307和/或308修饰(例如308F或308P)。
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指特异性地识别抗原、例如细胞特异性抗原和/或本发明的靶抗原上的表位的多肽或蛋白质(在功能单元中络合的一种或多种多肽)。抗原结合蛋白可以是多特异性的。在提及抗原结合蛋白时术语“多特异性”意指蛋白质识别相同抗原上或不同抗原上的不同表位。本发明的多特异性抗原结合蛋白可以是单一多功能多肽，或其可以是两种或更多种多肽彼此共价或非共价缔合的多聚体络合物。术语“抗原结合蛋白”包括可以与另一官能分子、例如另一肽或蛋白质连接或共同表达的本发明的抗体或其片段。举例来说，抗体或其片段可以在功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或以其它方式)至一种或多种其它分子实体，例如蛋白质或其片段，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。
“多结构域治疗蛋白”包括(i)含有超过一个功能结构域的单一蛋白质；(ii)含有超过一条多肽链的蛋白质；和(iii)超过一种蛋白质或超过一种多肽的混合物。术语多肽通常用以意指通过肽键连接在一起的氨基酸的单链。术语蛋白质涵盖术语多肽，而且还包括更复杂的结构。也就是说，单一多肽是蛋白质，并且蛋白质可以含有缔合更高级结构的一种或多种多肽。举例来说，血红蛋白是含有四种多肽的蛋白质：两种α球蛋白多肽和两种β球蛋白多肽。肌红蛋白也是一种蛋白质，但只含有单一肌红蛋白多肽。
多结构域治疗蛋白包含一种或多种多肽和至少两个提供两种功能的结构域。那些结构域之一是“酶结构域”，所述结构域提供与酶缺乏症相关的缺陷蛋白活性的替代。那些结构域中的另一个是“递送结构域”，所述递送结构域提供与例如CD63的内化效应子的结合，例如如本文公开的抗CD63抗体或其抗原结合片段。因此，提供酶替代活性和结合于内化效应子的能力(也叫做内化效应子结合蛋白(递送结构域活性)的单一多肽是多结构域治疗蛋白。此外，一种蛋白质提供酶功能并且另一种蛋白质提供内化效应子结合活性的蛋白质混合物是多结构域治疗蛋白。
术语“蛋白质”意指具有超过约20个通过酰胺键共价连接的氨基酸的任何氨基酸聚合物。蛋白质含有一个或多个氨基酸聚合物链，通常在本领域中称为“多肽”。因此，多肽可以是蛋白质，并且蛋白质可以含有多种多肽以形成单一功能性生物分子。二硫键(即在半胱氨酸残基之间以形成胱氨酸)可以存在于一些蛋白质中。这些共价连接可以在单个多肽链内，或在两个单独的多肽链之间。举例来说，二硫键对胰岛素、免疫球蛋白、鱼精蛋白等的适当结构和功能来说是必不可少的。关于二硫键形成的近期评述，参见Oka和Bulleid,“Forming disulfides in the endoplasmic reticulum,”1833(11)Biochim BiophysActa 2425-9(2013)。
如本文所用，“蛋白质”包括生物治疗蛋白、用于研究或疗法中的重组蛋白、捕集蛋白和其它Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scFv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等等。蛋白质可以使用基于重组细胞的产生系统产生，所述系统例如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤氏酵母属(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。关于论述生物治疗蛋白和其产生的近期评述，参见Ghaderi等人,“Production platforms forbiotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-humansialylation,”28Biotechnol Genet Eng Rev.147-75(2012)。
如本文所用，术语“表位”是指由多特异性抗原结合多肽识别的抗原部分。单一抗原(例如抗原性多肽)可能具有超过一个表位。表位可以被定义为结构或功能性的。功能性表位通常是结构表位的子集并且定义为直接促进抗原结合多肽与抗原之间的相互作用的亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸构成。在某些实施方案中，表位可以包括决定子，所述决定子是例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面分组，并且在某些实施方案中，可具有特异性三维结构特性和/或特定电荷特征。由相连氨基酸形成的表位典型地在暴露于变性溶剂后保留，而由三级折叠形成的表位典型地在用变性溶剂处理后失去。
术语“结构域”是指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何一部分。优选地，本发明的结构域结合于细胞特异性或靶抗原。如本文所用，细胞特异性抗原或靶抗原结合结构域包括特异性地结合抗原的任何天然存在的、可通过酶获得、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。
术语“半体”或“半抗体”是可互换使用的，是指抗体的一半，其基本上含有一条重链和一条轻链。抗体重链可以形成二聚体，因此一个半体的重链可以与同与不同分子(例如另一个半体)或另一含有Fc的多肽缔合的重链进行缔合。两个稍有不同的Fc结构域可以“异二聚”，如双特异性抗体或其它的异二聚体、异三聚体、异四聚体的形成中等等。参见Vincent和Murini,“Current strategies in antibody engineering:Fc engineeringand pH-dependent antigen binding,bispecific antibodies and antibody drugconjugates,”7 Biotechnol.J.1444-1450(20912)；和Shimamoto等人,“Peptibodies:Aflexible alternative format to antibodies,”4(5)MAbs 586-91(2012)。
在一个实施方案中，半体可变结构域特异性地识别内化效应子并且半体Fc结构域与包含替代酶(例如肽体)Id 586的Fc融合蛋白二聚。
术语“单链可变片段”或“scFv”包括含有免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的单链融合多肽。在一些实施方案中，VH和VL通过10至25个氨基酸的接头序列连接。ScFv多肽还可以包括其它氨基酸序列，例如CL或CH1区。ScFv分子可以通过噬菌体呈现制造，或通过直接从杂交瘤或B细胞亚克隆来制成。关于通过噬菌体呈现和抗体结构域克隆制造scFv片段的方法，Ahmad等人,Clinical and Developmental Immunology,第2012期,论文ID 98025以引用的方式并入本文中。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或可以含有对超过一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)可以与另一功能分子、例如另一肽或蛋白质连接或共同表达。举例来说，抗体或其片段可以在功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、单价缔合或以其它方式)至一种或多种其它分子实体，例如另一抗体或抗体片段，以产生具有第二或另外的结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本文中使用表述“抗CD63抗体”意图包括单特异性抗CD63抗体以及包含CD63结合臂和“靶”结合臂的双特异性抗体。因此，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人CD63，并且免疫球蛋白的另一个臂对另一靶分子具有特异性。CD63结合臂可以包含如本文中的表1中所示的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者。
在某些实施方案中，CD63结合臂结合于人CD63并且诱发CD63和结合其的抗体的内化。在某些实施方案中，CD63结合臂微弱地结合于人CD63并且诱发CD63和结合其的抗体的内化。在其它实施方案中，CD63结合臂微弱地结合于人CD63，并且在例如包含CD63结合臂和“靶”结合臂的双特异性或多特异性抗体的环境下诱发表达肿瘤相关抗原的细胞杀死，其中“靶”结合臂是肿瘤相关抗原(TAA)。特定肿瘤相关抗原的非限制性实例包括例如AFP、ALK、BAGE蛋白、β-链蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、胱天蛋白酶-8、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、存活素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3。在其它实施方案中，CD63结合臂微弱地与人和食蟹猕猴(猴)CD63结合或缔合，但结合相互作用无法通过本领域中已知的体外测定检测到。
在本发明的某些示例性实施方案中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在包含第一和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的背景下，第一抗原结合结构域的CDR可以用字首“A1”表示并且第二抗原结合结构域的CDR可以用字首“A2”表示。因此，第一抗原结合结构域的CDR可以在本文中称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；并且第二抗原结合结构域的CDR可以在本文中称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以直接或间接地彼此连接，形成本发明的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自连接至单独的多聚结构域。一个多聚结构域与另一个多聚结构域缔合促进两个抗原结合结构域之间的缔合，由此形成双特异性抗原结合分子。“多聚结构域”是能够与相同或类似结构或构成的第二多聚结构域缔合的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。举例来说，多聚结构域可以是包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚组分的一非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分(包含CH2-CH3结构域)，例如选自同型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG的Fc结构域，以及每个同型组内的任何异型。
本发明的双特异性抗原结合分子典型地包含两个多聚结构域，例如各自单独作为单独抗体重链的一部分的两个Fc结构域。第一和第二多聚结构域可以属于相同IgG同型，例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。可替代地，第一和第二多聚结构域可以属于不同IgG同型，例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施方案中，多聚结构域是Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的含有至少一个半胱氨酸残基的氨基酸序列。在其它实施方案中，多聚结构域是半胱氨酸残基或短的含半胱氨酸的肽。其它多聚结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋环基元或卷曲螺旋基元或由其组成的肽或多肽。
任何双特异性抗体格式或技术都可以用于制造本发明的双特异性抗原结合分子。举例来说，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以在功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、单价缔合或以其它方式)至一种或多种其它分子实体，例如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗体片段，以产生双特异性抗原结合分子。在本发明的背景下可以使用的特定示例性双特异性格式包括不限于例如基于scFv或双功能抗体双特异性格式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、杵-臼结构、通用轻链(例如具有杵-臼结构的通用轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(关于上述格式的评述，参见例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11，和其中引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的背景下，多聚结构域，例如Fc结构域，与Fc结构域的野生型、天然存在的型式相比，可以包含一个或多个氨基酸变化(例如插入、缺失或取代)。举例来说，本发明包括在Fc结构域中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，所述修饰产生使Fc与FcRn之间的结合相互作用改变(例如增强或减少)的修饰Fc结构域。在一个实施方案中，双特异性抗原结合分子在CH2或CH3区中包含修饰，其中修饰增加酸性环境中(例如pH在约5.5至约6.0范围内的核内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)、250和428(例如L或F)、252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明还包括包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此的不同之处在于至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异抗体相比，至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(通过IMGT外显子编码；通过EU编码，H435R)。第二CH3还可以包含Y96F修饰(通过IMGT；通过EU，Y436F)。参见例如美国专利No.8,586,713。可以在第二CH3内发现的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT；通过EU，D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下N44S、K52N和V82I(IMGT；通过EU，N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT；通过EU，Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在某些实施方案中，Fc结构域可以是嵌合的，将源自于超过一种免疫球蛋白同型的Fc序列组合。举例来说，嵌合Fc结构域可以包含源自于人IgG1、人IgG2或人IgG4 CH2区的CH2序列的部分或全部，和源自于人IgG1、人IgG2或人IgG4的CH3序列的部分或全部。嵌合Fc结构域还可以含有嵌合铰链区。举例来说，嵌合铰链可以包含源自于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，联合源自于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列。可以包括在本文中所示的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的一具体实例从N至C端包含：[IgG4 CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可以包括在本文中所示的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的另一个实例从N至C端包含：[IgG1 CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。可以包括在本发明的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的这些和其它实例描述于2014年8月28日公布的美国公布2014/0243504中，所述公布整体并入本文中。具有这些通用结构布置的嵌合Fc结构域和其变体可以具有改变的Fc受体结合，这又影响Fc效应功能。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抗体重链，其中重链恒定区(CH)包含与SEQID NO:340、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:349、SEQ ID NO:350或SEQ ID NO:351中的任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区(CH)包含是选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ IDNO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:349、SEQ ID NO:350或SEQ ID NO:351。
在其它实施方案中，本发明提供了一种抗体重链，其中Fc结构域包含与SEQ IDNO:352、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362或SEQ IDNO:363中的任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:352、SEQID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362或SEQ ID NO:363。
多结构域治疗蛋白
图1描绘了多结构域治疗蛋白的各种范例。在一个实例中(图1图A)，多结构域治疗蛋白含有酶(由六边形表示)和结合酶(阴影线)和内化效应子(实线)的双特异性抗体(IE-BP)。这里，双特异性抗体的一个臂非共价地结合于酶，并且另一个臂非共价地结合于内化效应子，由此使替代酶能够内化至细胞或亚细胞区室中。在另一个实例中(图B)，多结构域治疗蛋白包含含有两种多肽的单一蛋白质，一种多肽具有酶功能并且另一种多肽具有递送结构域功能。这里，酶与免疫球蛋白Fc结构域或重链恒定区融合，再与酶半抗体的Fc结构域缔合，形成双官能多结构域治疗蛋白。除了酶共价连接于半抗体之一，而不是通过半抗体的免疫球蛋白可变结构域处的抗原-抗体相互作用之外，图B中所描绘的实施方案类似于图A中。
在其它实例中，多结构域治疗蛋白由共价连接(直接或间接通过接头)于递送结构域的酶组成。在一个实施方案中，酶连接于免疫球蛋白分子(例如重链或可替代地轻链)的C端。在另一个实施方案中，酶连接于免疫球蛋白分子(例如重N端或可替代地轻N端)的N端。在这些范例中，免疫球蛋白分子是递送结构域。在又一个实施方案中，酶连接于结合内化效应子的scFv分子的C端。
在一个实施方案中，多结构域治疗蛋白包含两个递送结构域。在一个实施方案中，第一递送结构域结合于溶酶体运输分子或其它的内化效应子(例如CD63)。在另一个实施方案中，第二递送结构域结合于胞吞转运效应子，以促进多结构域治疗蛋白的跨细胞转运。在一个实施方案中，胞吞转运效应子尤其是LDL受体、IgA受体、转铁蛋白受体或新生儿Fc受体(FcRn)。在一特定实施方案中，胞吞转运递送结构域包含结合于转铁蛋白受体的分子，例如抗转铁蛋白受体抗体或抗转铁蛋白受体scFv分子。Tuma和Hubbard,“Transcytosis:Crossing Cellular Barriers,”Physiological Reviews,83(3):871-935(2003年7月1日)关于介导胞吞转运的可用于本发明实施中的细胞表面受体以引用的方式并入本文中。
“酶结构域”或“酶”表示与酶缺乏症的病因或生理效应相关的任何蛋白质。酶包括实际酶、转运蛋白、受体或其它欠缺并且属于引起疾病的分子损害的蛋白质。酶还包括可以提供能替换或绕过疾病的分子损害的类似或足够的生物化学或生理活性的任何蛋白质。举例来说，“同工酶”可以用作酶。
在一些实施方案中，酶是水解酶，包括酯酶、糖基化酶、作用于醚键的水解酶、肽酶、线性酰胺酶、二磷酸酶、酮水解酶、卤代酶、磷酸酰胺酶、磺基氢化酶、硫苷酶、脱硫苷酶等等。在一些实施方案中，酶是糖苷酶，包括糖苷酶和N-糖基化酶。在一些实施方案中，酶是糖苷酶，包括α-淀粉酶、β－淀粉酶、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶、纤维素、内-1,3(4)-β-葡聚糖酶、菊粉酶、内-1,4-β-木聚糖酶、内-1,4-b-木聚糖酶、葡聚糖酶、壳多糖酶、聚半乳糖醛酸糖苷酶、溶菌酶、外-α-唾液酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α,α-海藻糖、β-葡萄糖醛酸苷酶、木聚糖内-1,3-β-木糖苷酶、淀粉-α-1,6-葡糖苷酶、透明质酸葡糖胺酶、透明质酸葡糖苷酸酶等等。
在分子缺陷是α-葡糖苷酶活性缺陷的庞贝病的情况下，酶包括人α-葡糖苷酶(GAA)，和“同工酶”，例如其它α-葡糖苷酶、工程化的重组α-葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、重组葡糖苷酶、被工程化成水解末端非还原1-4连接的α-葡萄糖残基以释放单个α-葡萄糖分子的任何蛋白质、任何EC3.2.1.20酶、肝糖或淀粉的天然或重组低pH值碳水化合物水解酶和葡糖基水解酶，例如蔗糖酶异麦芽糖酶、麦芽糖酶葡糖淀粉酶、葡糖苷酶II和中性α-葡糖苷酶。示例性基因疗法载体
生殖系突变
本文公开的抗CD63抗体与抗体所源自的对应生殖系序列相比，可以在重链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。
本发明还包括本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段源自于本文公开的氨基酸序列中的任一种，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成所述抗体所源自的生殖系序列的对应残基，或突变成另一人生殖系序列的对应残基，或突变成对应生殖系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)，并且与CD63抗原的结合微弱或无法检测到。本文在表1中描述了识别CD63的数种此类示例性抗体。
此外，本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)可以在框架和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些单独的残基突变成特定生殖系序列的对应残基，而与原始生殖系序列不同的某些其它残基保持或突变成不同的生殖系序列的对应残基。含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段一旦获得，就可以测试一种或多种所需特性，例如改良的结合特异性、弱的或降低的结合亲和力、改良或增强的药物动力学特性、降低的免疫原性等。基于本公开的指导，以这种通用方法获得的抗体和抗原结合片段涵盖于本发明内。
本发明还包括抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段包含具有一个或多个保守取代的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体。举例来说，本发明包括抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段具有相对于本文表1中所示的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。本发明的抗体、其抗原结合片段、多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白与单独的抗原结合结构域所源自的对应生殖系序列相比，可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时保持或改良所需的弱至无法检测的与例如CD63的结合。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般说来，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性，即在抗CD63结合分子的情况下所述氨基酸取代保持或改良所需的弱至无法检测的结合亲和力。侧链具有类似化学特性的氨基酸的组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“中度保守取代”是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
本发明还包括抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段包含HCVR和/或CDR氨基酸序列与本文公开的HCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一种基本上同一的抗原结合结构域，同时保持或改良所需的弱的对CD63抗原的亲和力。在提及氨基酸序列时术语“基本上同一性”或“基本上同一”意指两个氨基酸序列在例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空位权重进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性，甚至更优选地，至少98％或99％序列同一性。优选地，不同一的残基位置的差异是保守氨基酸取代。如果两个或更多个氨基酸序列彼此的差异是保守取代，那么序列同一性或相似度百分比可以向上调整以校正取代的保守性。用于进行这种调整的方式是本领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。
多肽的序列相似性又称为序列同一性，典型地使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包括保守氨基酸取代的相似性量度来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有例如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以与缺省参数一起用于确定密切相关的多肽、例如来自生物体的不同物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。还可以使用FASTA使用缺省或推荐参数(GCG 6.1版中的程序)比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)上述)。当比较本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库时另一个优选的算法是计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
含有一个或多个生殖系突变的抗原结合结构域一旦获得，就利用一种或多种体外测定测试降低的结合亲和力。虽然典型地通过测试高的(即强烈的)针对抗原的结合亲和力来筛选识别特定抗原的抗体以达成其目的，但是本发明的抗体展现弱的结合或无法检测到的结合。包含用这种通用方式获得的一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子也涵盖于本发明内并且发现其宜作为亲合力驱动的肿瘤疗法。
通过本文所述的方法进一步修饰本发明的抗体，可以实现意外的益处，例如提高的药物动力学特性和对患者的低毒性。
抗体的结合特性
在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含Fc的蛋白质与例如预先确定的抗原如细胞表面蛋白或其片段的结合的背景下，术语“结合”典型地是指最少两个实体或分子结构之间的相互作用或缔合，例如抗体-抗原相互作用。
举例来说，当在BIAcore 3000仪器中，使用抗原作为配体以及抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc的蛋白质作为分析物(或抗配体)，通过例如表面等离子体共振(SPR)技术测定时，结合亲和力典型地与约10-7M或更少，例如约10-8M或更少，例如约10-9M或更少的KD值对应。通常还使用基于细胞的结合策略，例如荧光活化细胞分选(FACS)结合测定，并且提供关于细胞表面表达的蛋白质的结合表征数据。FACS数据与例如放射性配体竞争结合和SPR的其它方法极为相符(Benedict,CA,J Immunol Methods.1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等人,J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)结合于预先确定的抗原或细胞表面分子(受体)，亲和力与比其结合于非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少十倍的KD值相对应。根据本发明，与比非特异性抗原低十倍或小于十倍的KD值相对应的抗体的亲和力可以被视为是无法检测到的结合，然而，此类抗体可以与第二抗原结合臂配对，产生本发明的双特异性抗体。
以摩尔浓度(M)为单位的术语“KD”或“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片段与抗原结合的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在反比关系，因此，KD值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高亲和力”或“较强亲和力”是指形成相互作用的能力较高，因此KD值较小，相反地，术语“较低亲和力”或“较弱亲和力”是指形成相互作用的能力较低，因此，KD值较大。在一些情况下，特定分子(例如抗体)对其相互作用搭配物分子(例如抗原X)的结合亲和力(或KD)与分子(例如抗体)对另一相互作用搭配物分子(例如抗原Y)的结合亲和力相比更高可以表示为通过将较大KD值(较低或较弱亲和力)除以较小KD(较高或较强亲和力)所确定的结合比，例如表示为大5倍或10倍的结合亲和力，视情况而定。
在一些实施方案中，本发明的双特异性抗原结合分子或其缀合物以超过其对CD63的结合亲和力10倍的结合亲和力(KD值)结合于靶分子。因而，双特异性分子对靶分子的结合亲和力比其对CD63的结合亲和力强得多。在一些情况下，通过表面等离子体共振测定在37℃下或等效测定来测量结合亲和力。
术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率常数，或抗体或抗体结合片段的离解速率常数。所述值又称为koff值。
术语“ka”(M-1×sec-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，或抗体或抗体结合片段的缔合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的缔合平衡常数。通过将ka除以kd获得缔合平衡常数。
术语“EC50”或“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后抗体诱发基线与最大值之间的一半反应的浓度。EC50基本上表示观察到抗体最大作用的50％的抗体浓度。在某些实施方案中，EC50值等于使本发明抗体与表达CD63或肿瘤相关抗原的细胞半最大结合的浓度，如通过例如FACS结合测定所测定。因此，在EC50或半最大有效浓度值增加下观察到减少或较弱的结合。
在一个实施方案中，结合减少可以定义为能够结合于半最大量的靶细胞的EC50抗体浓度增加。
序列变体
本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)与单独的抗原结合结构域所源自的对应生殖系序列相比，可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这样的突变容易通过比较本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的生殖系序列来确定。本发明的抗原结合分子可以包含源自于本文公开的示例性氨基酸序列中的任一者的抗原结合结构域，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成抗体所源自的生殖系序列的对应残基，或突变成另一人生殖系序列的对应残基，或突变成对应生殖系残基的保守氨基酸取代(此类序列改变在本文中统称为“生殖系突变”)。本领域技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列为起始物质，可容易地产生许多包含一个或多个个别生殖系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基都突变回在抗原结合结构域最初所源自的原始生殖系序列中发现的残基。在其它实施方案中，只有某些残基突变回原始生殖系序列，例如只有在FR1的头8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或者只有在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其它实施方案中，框架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同生殖系序列(即与抗原结合结构域最初源自的生殖系序列不同的生殖系序列)的对应残基。此外，抗原结合结构域可以在框架和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些单独的残基突变成特定生殖系序列的对应残基，而与原始生殖系序列不同的某些其它残基保持或突变成不同生殖系序列的对应残基。含有一个或多个生殖系突变的抗原结合结构域一旦获得，就容易测试一种或多种所需特性，例如改良的结合特异性、增加的结合亲和力、改良或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。包含以这种通用方法获得的一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子涵盖于本发明内。
本发明还包括抗原结合分子，其中一个或两个抗原结合结构域包含具有一个或多个保守取代的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体。举例来说，本发明包括抗原结合分子，所述抗原结合分子包含具有相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般说来，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。侧链具有类似化学特性的氨基酸的组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“中度保守取代”是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
本发明还包括抗原结合分子，所述抗原结合分子包含具有基本上与本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者同一的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域。在提及氨基酸序列时术语“基本上同一性”或“基本上同一”意指两个氨基酸序列在例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空位权重进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性，甚至更优选地，至少98％或99％序列同一性。优选地，不同一的残基位置的差异是保守氨基酸取代。如果两个或更多个氨基酸序列彼此的差异是保守取代，那么序列同一性或相似度百分比可以向上调整以校正取代的保守性。用于进行这种调整的方式是本领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，以引用的方式并入本文中。
多肽的序列相似性又称为序列同一性，典型地使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包括保守氨基酸取代的相似性量度来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有例如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以与缺省参数一起用于确定密切相关的多肽、例如来自生物体的不同物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。还可以使用FASTA使用缺省或推荐参数(GCG 6.1版中的程序)比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)上述)。当比较本发明的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库时另一个优选的算法是计算机程序BLAST，尤其BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，各以引用的方式并入本文中。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特征的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)。举例来说，本发明的抗CD63抗体可能展现出与中性pH值相比在酸性pH值下减少的与CD63的结合。可替代地，本发明的抗CD63抗体可能展现出与中性pH值相比在酸性pH值下增强的与CD63的结合。表述“酸性pH值”包括小于约6.2，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小的pH值。表述“中性pH值”意指约7.0至约7.4的pH值。表述“中性pH值”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些情况下，“与中性pH值相比在酸性pH值下减少的”是根据在酸性pH值下抗体与其抗原结合的KD值与在中性pH值下抗体与其抗原结合的KD值的比率(或反之亦然)。举例来说，如果抗体或其抗原结合片段展现出约3.0或更大的酸性/中性KD比率，那么可以认为对本发明来说所述抗体或其抗原结合片段展现出“与中性pH值相比在酸性pH值下减少的与CD63的结合”。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比率可以为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
例如通过针对与中性pH值相比在酸性pH值下减少(或增强)的与特定抗原的结合筛选抗体群体，可以获得具有pH依赖性结合特征的抗体。另外，在氨基酸层面对抗原结合结构域的修饰可能产生具有pH依赖性特征的抗体。举例来说，通过用组氨酸残基取代抗原结合结构域(例如CDR内)的一个或多个氨基酸，可以获得具有相对于中性pH值在酸性pH值下减少的抗原结合的抗体。
包含Fc变体的抗体
根据本发明的某些实施方案，提供了抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段包含包括一个或多个突变的Fc结构域，例如与中性pH值相比在酸性pH值下所述突变增强或减少抗体与FcRn受体的结合。举例来说，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗体，其中在酸性环境中(例如在pH值在约5.5至约6.0范围内的核内体中)所述突变增加Fc结构域对FcRn的亲和力。当向动物施用抗体时，这样的突变可能增加抗体的血清半衰期。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在以下位置的修饰：250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如308F或308P)。
举例来说，本发明包括抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)，所述抗CD63抗体和其抗原结合片段包含包括一对或多对或一组或多组选自由以下组成的组的突变的Fc结构域：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。上述Fc结构域突变的所有可能组合和本文公开的抗体可变结构域内的其它突变均涵盖在本发明的范围内。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物学特征
本发明包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段以高的、中等的或低的亲和力结合人CD63，取决于治疗背景和所需的具体目标特性。举例来说，在一个臂结合CD63并且另一个臂结合靶抗原(例如肿瘤相关抗原)的双特异性抗原结合分子的背景下，可能需要靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原，同时抗CD63臂以只以中等的或低的亲和力结合CD63。以这种方式，可以实现抗原结合分子优先靶向表达靶抗原的细胞，同时避免全身/非靶向性CD63结合和与此相关的后续不良副作用。
本发明包括以弱的(即低的)乃至无法检测到的亲和力结合人CD63的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。根据某些实施方案，本发明包括以如通过表面等离子体共振所测量，超过约100nM的KD结合人CD63(例如在37℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以如通过表面等离子体共振(例如mAb-捕获或抗原-捕获格式)或基本上类似的测定所测量，超过约超过约110nM、至少120nM、超过约130nM、超过约140nM、超过约150nM、至少160nM、超过约170nM、超过约180nM、超过约190nM、超过约200nM、超过约250nM、超过约300nM、超过约400nM、超过约500nM、超过约600nM、超过约700nM、超过约800nM、超过约900nM或超过约1μM的KD或无法检测到的亲和力结合CD63。
本发明包括以弱的(即低的)乃至无法检测到的亲和力结合猴(即食蟹猕猴)CD63的抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体。
表位定位和相关技术
本发明的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)结合的CD63上的表位可以由CD63蛋白的3个或更多个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单一相连序列组成。可替代地，表位可以由CD63的多个不相连氨基酸(或氨基酸序列)组成。术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定子。单个抗原可具有超过一个表位。因此，不同的抗体可以结合于一种抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象或线性的。构象表位是由将来自线性多肽链的不同区段的在空间上并置的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以在抗原上包括糖部分、磷酰基或磺酰基。
本领域的普通技术人员已知的多种技术可以用于确定抗体的抗原结合结构域是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定，例如Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述；丙氨酸扫描突变分析；肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)；以及肽裂解分析。另外，可以采用例如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。可以用于鉴定多肽内抗体的抗原结合结构域进行相互作用的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般地说，氢/氘交换方法涉及将所关注的蛋白质进行氘标记，接着使抗体结合于氘标记的蛋白质。然后，将蛋白质/抗体络合物转移至水以允许在除被抗体保护的残基(其仍然是氘标记的)外的所有残基处发生氢氘交换。在抗体解离之后，靶蛋白经受蛋白酶裂解和质谱分析，由此暴露出与抗体进行相互作用的特定氨基酸对应的氘标记的残基。参见例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗体络合物的X射线结晶学也可以用于达成表位定位的目的。
本发明还包括与本文所述的特定示例性抗体中的任一种(例如包含如本文表1中所示的氨基酸序列中的任一者的抗体)结合于相同表位的抗CD63抗体。同样地，本发明也包括与本文所述的特定示例性抗体中的任一种(例如包含如本文表1中所示的氨基酸序列中的任一者的抗体)竞争结合于CD63的抗CD63抗体。
容易通过使用本领域中已知的常规方法确定具体的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合结构域是否与本发明的参考抗原结合分子结合于相同表位或竞争结合。举例来说，为了确定测试抗体是否与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合于CD63上的相同表位，首先允许参考双特异性分子结合于CD63蛋白。然后，评定测试抗体结合于CD63分子的能力。如果测试抗体在参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够结合于CD63，那么可以推断，测试抗体结合于CD63的与参考双特异性抗原结合分子不同的表位。另一方面，如果测试抗体在参考双特异性抗原结合分子饱和结合后不能结合于CD63，那么测试抗体可能结合于CD63的与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合的表位相同的表位。接着可以进行另外的常规实验(例如肽突变和结合分析)以证实观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是因为与参考双特异性抗原结合分子结合于相同的表位，或是否空间阻断(或另一现象)引起观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可利用的任何其它定量或定性的抗体结合测定进行这类实验。根据本发明的某些实施方案，如果如在竞争性结合测定(参见例如Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)中所测量，例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗原结合蛋白抑制另一种抗原结合蛋白的结合达至少50％，但优选75％、90％乃至99％，那么这两种抗原结合蛋白结合于相同(或重叠)表位。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，那么认为所述两种抗原结合蛋白结合于相同表位。如果减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变中只有一定子集减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，那么认为所述两种抗原结合蛋白具有“重叠表位”。
为了确定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，以两个方向进行上述结合方法：在第一个方向上，在饱和条件下允许参考抗原结合分子结合于CD63蛋白，接着评定测试抗体与CD63分子的结合。在第二个方向上，在饱和条件下允许测试抗体结合于CD63分子，接着评定参考抗原结合分子与CD63分子的结合。如果在两个方向上，只有第一(饱和)抗原结合分子能够结合于CD63分子，那么推断，测试抗体和参考抗原结合分子竞争结合于CD63。如本领域的普通技术人员所了解，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体不一定与参考抗体结合于相同表位，而是可能通过结合重叠或相邻表位在空间上阻断参考抗体的结合。
抗原结合结构域的制备和双特异性分子的构建
对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域可以通过本领域中已知的任何抗体产生技术制备。对两种不同抗原(例如CD63和靶抗原)具有特异性的两种不同抗原结合结构域一旦获得，就可以使用常规方法相对于彼此适当地排列，以产生本发明的双特异性抗原结合分子。(本文中其它地方提供了关于可以用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体格式的论述)。在某些实施方案中，本发明的多特异性抗原结合分子的单独组分(例如重链和轻链)中的一个或多个源自于嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。用于制造此类抗体的方法是本领域中众所周知的。举例来说，本发明的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一个或多个可以使用VELOCIMMUNETM技术制备。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其它的人抗体产生技术)，最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的对特定抗原(例如CD63)具有高亲和力的嵌合抗体。对抗体进行表征并针对合乎需要的特征，包括亲和力、选择性、表位等进行选择。小鼠恒定区替换为所需人恒定区以产生可以并入本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
基因工程化动物可以用于制造人双特异性抗原结合分子。举例来说，可以使用基因修饰的小鼠，所述小鼠不能重排和表达内源小鼠免疫球蛋白轻链可变序列，其中所述小鼠只表达一个或两个由人免疫球蛋白序列编码的人轻链可变结构域，所述人轻链可变结构域在内源小鼠κ基因座处可操作地连接于小鼠κ恒定基因。此类基因修饰的小鼠可以用于分离重链和轻链可变区以产生完全人双特异性抗原结合分子。因而，完全人双特异性抗原结合分子包含两个与相同轻链缔合的不同重链。(参见例如US 2011/0195454)。完全人是指在抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的每种多肽的整个长度上包含由源自于人序列的DNA编码的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域。在一些情况下，完全人序列源自于人内源性蛋白质。在其它情况下，完全人蛋白质或蛋白质序列包含每个组分序列源自于人序列的嵌合序列。虽然不受任一理论束缚，但嵌合蛋白或嵌合序列通常被设计成例如与任何野生型人免疫球蛋白区或结构域相比，将组分序列的接合处免疫原性表位的产生减至最少。
双特异性抗原结合分子可以用具有消除了与蛋白A的结合的修饰Fc结构域的一条重链构建，因此使得纯化方法能够产生杂二聚体蛋白质。参见例如美国专利No.8,586,713。因而，双特异性抗原结合分子包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二IgCH3结构域彼此的不同之处在于至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异抗体相比，至少一个氨基酸的差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变/修饰，例如H95R修饰(通过IMGT外显子编码；通过EU编码，H435R)。第二CH3还可以包含Y96F修饰(通过IMGT；通过EU，Y436F)。
生物等效物
本发明涵盖氨基酸序列不同于本文公开的示例性分子的氨基酸序列但保留结合CD63的能力的抗原结合分子。当与亲本序列相比时，此类变异分子可以包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但展现出基本上与所述双特异性抗原结合分子的生物活性等效的生物活性。
本发明包括与本文所述的示例性抗原结合分子中的任一种生物等效的抗原结合分子。如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是在类似实验条件下以相同摩尔剂量单剂或多剂施用时吸收速率和程度未显示显著差异的药物等效物或药物替代物，那么它们被视为是生物等效的。如果一些抗原结合蛋白在吸收程度上相等，但其吸收速率不等，那么它们将被视为是等效物或药物替代物，然而由于吸收速率的此类差异是有意的并且反映在标记上，例如在长期使用后对实现有效身体药物浓度来说不是很重要，并且被认为对所研究的特定药品是医学上无关紧要的，所以可以被视为是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力没有临床上有意义的差异，那么它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者在参考产品与生物产品之间转换一次或多次，并且与没有进行转换的持续疗法相比，包括免疫原性的临床显著变化的副作用风险未如预期般增加或有效性降低，那么两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白面对条件或利用条件通过共同的机制或作用机制起作用(在已知此类机制的程度上)，那么它们是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外方法来证明。生物等效测量包括例如(a)人或其它哺乳动物中的体外测试，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物随时间而变的浓度；(b)与体内生物利用率数据相关并合理预报人体内生物利用率数据的体外测试；(c)人或其它哺乳动物中的体外测试，其中测量随时间而变的抗体(或其靶标)的适当急性药理学作用；和(d)良好控制的临床试验，其建立抗原结合蛋白的安全性、功效或生物利用率或生物等效性。
本文所述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体可以通过例如进行残基或序列的多种取代或者删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来构建。举例来说，对生物活性来说可有可无的半胱氨酸残基可以删除或替换为其它氨基酸，以防止复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其它情形下，生物等效的抗原结合蛋白可以包括包含修饰分子的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变的氨基酸改变的本文所述的示例性双特异性抗原结合分子的变体。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案，提供结合于人CD63但不结合于来自其它物种的CD63的抗原结合分子。本发明还包括结合于人CD63和来自一种或多种非人物种的CD63的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施方案，提供结合于人CD63的抗原结合分子，视情况而定，其可结合于或不结合于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、犬、兔、山羊、绵羊、母牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨、恒河猴或黑猩猩CD63中的一种或多种。
抗体药物缀合物(ADC)
本发明提供了抗体药物缀合物(ADC)，所述抗体药物缀合物包含与例如细胞毒性剂、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素缀合的治疗性部分缀合的抗CD63抗体和其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性抗原结合分子和多结构域治疗蛋白)。还提供了与治疗性部分缀合的抗CD63抗体或其抗原结合片段。一般地说，ADC包含：A–[L–P]y，其中A是抗原结合分子，例如抗CD63抗体或其片段(例如至少包含选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的HCDR3的片段)，L是接头，P是有效载荷或治疗性部分(例如细胞毒性剂)，并且y是1至30的整数。
在多个实施方案中，ADC包含抗CD63抗体或其抗原结合片段(例如抗靶标(TAA)×抗CD63抗体)，所述抗CD63抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所示的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、298、306、314、322、330、10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266和282)的氨基酸序列的HCVR或LCVR的CDR，或特定HCVR/LCVR对(例如SEQ IDNO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/282、298/282、306/282、314/282、322/282和330/282)。在一些情况下，抗CD63抗体或片段包含具有表1中所示的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-26-28-30-32、36-38-40-44-46-48、52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80 84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112、116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-204-206-208；212-214-216-220-222-224；228-230-232-236-238-240；244-246-248-252-254-256；260-262-264-268-270-272；276-278-280-284-286-288；292-294-296-284-286-288；300-302-304-284-286-288；308-310-312-284-286-288；316-318-320-284-286-288；324-326-328-284-286-288和332-334-336-284-286-288)的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，抗CD63抗体或片段包含具有表1中所示的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、298、306、314、322、330、10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266和282)的氨基酸序列的HCVR和LCVR，或特定氨基酸序列对(例如SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/282、298/282、306/282、314/282、322/282和330/282)。
细胞毒性剂包括对细胞的生长、活力或繁殖有害的任何剂，包括(但不限于)微管蛋白相互作用剂和DNA损伤剂。根据本公开的这方面可以缀合于抗CD63抗体的合适细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包括例如1-(2氯乙基)-1,2-二甲烷磺酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-去氢睾酮、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin)、放线菌素D(actinomycin D)、鹅膏菌素(amanitins)、氨基喋呤(aminopterin)、蛇形菌素(anguidine)、蒽环类药物(anthracycline)、氨茴霉素(anthramycin，AMC)、奥利司他汀(auristatins)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、丁酸、卡奇霉素(calicheamicins)(例如卡奇霉素γ1)、喜树碱(camptothecin)、洋红霉素(carminomycins)、卡莫司汀(carmustine)、西马多丁(cemadotins)、顺铂(cisplatin)、秋水仙碱(colchicin)、考布他汀(combretastatins)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、细胞分裂抑素B(cytochalasin B)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、氮烯咪胺(decarbazine)、二乙酰氧基戊基多柔比星(diacetoxypentyldoxorubicin)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、地索拉唑(disorazoles)、多拉司他汀(dolastatin)(例如多拉司他汀10)、多柔比星(doxorubicin)、多米卡新(duocarmycin)、棘霉素(echinomycins)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、吐根碱(emetine)、埃坡霉素(epothilones)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、雌莫司汀(estramustines)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、格尔德霉素(geldanamycins)、短杆菌肽D(gramicidin D)、糖皮质素(glucocorticoids)、伊立替康(irinotecans)、纺锤体驱动蛋白(kinesin spindle protein，KSP)抑制剂、来普霉素(leptomycin)、环氧长春碱(leurosines)、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、美登素类(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercatopurine)、甲基叶酸(methopterins)、甲氨喋呤(methotrexate)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、N8-乙酰基亚精胺(N8-acetyl spermidine)、足叶草毒素(podophyllotoxins)、普鲁卡因(procaine)、普萘洛尔(propranolol)、蝶啶(pteridines)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine，PBD)、根霉素(rhizoxins)、链脲佐菌素(streptozotocin)、太利苏霉素(tallysomycin)、紫杉酚(taxol)、替尼泊苷(tenoposide)、丁卡因(tetracaine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、托马霉素(tomaymycins)、拓扑替康(topotecans)、微管溶解素(tubulysin)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)和上述任一者的衍生物。
根据某些实施方案，与抗CD63抗体缀合的细胞毒性剂是如DM1或DM4的美登素类、托马霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案，与抗CD63抗体缀合的细胞毒性剂是奥利司他汀，例如MMAE、MMAF或其衍生物。本领域中已知的其它细胞毒性剂涵盖于本公开的范围内，包括例如蛋白质毒素，如篦麻毒素、艰难梭菌(C.difficile)毒素、假单胞菌属(pseudomonas)外毒素、篦麻毒素、白喉毒素、肉毒毒素、异株泻根毒蛋白(bryodin)、皂草素(saporin)、美洲商陆毒素(即商陆毒素(phytolaccatoxin)和商陆皂甙(phytolaccigenin))等等，例如Sapra等人,Pharmacol.&Therapeutics,2013,138:452-469中所述的毒素。
在某些实施方案中，细胞毒性剂是美登素类，例如美登素的衍生物。合适的美登素类包括DM1、DM4或它们的衍生物、立体异构体或同位素体。合适的美登素类还包括(但不限于)以引用的方式整体并入本文中的WO 2014/145090A1、WO 2015/031396A1、US 2016/0375147A1和US 2017/0209591A1中所公开的美登素类。
在一些实施方案中，美登素类具有以下结构：
Figure BDA0002779893380000581
其中A是任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登素类具有以下结构：
Figure BDA0002779893380000582
其中A是任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登素类具有以下结构：
Figure BDA0002779893380000583
其中n是1-12的整数并且R1是烷基。
在一些实施方案中，美登素类是
Figure BDA0002779893380000591
Figure BDA0002779893380000601
Figure BDA0002779893380000611
Figure BDA0002779893380000621
在一些实施方案中，美登素类是：
Figure BDA0002779893380000622
在一些实施方案中，美登素类是：
Figure BDA0002779893380000623
本文还提供了抗体-放射性核素缀合物(ARC)，所述抗体-放射性核素缀合物包含与一种或多种放射性核素缀合的抗CD63抗体。在本公开的这方面的背景下可以使用的示例性放射性核素包括(但不限于)例如225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra和90Y。
在本文提供的某些实施方案中，提供了包含例如通过接头分子与细胞毒性剂(例如以上公开的细胞毒性剂中的任一种)缀合的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白的ADC。接头是将本文所述的抗体或抗原结合蛋白与治疗性部分如细胞毒性剂连接、连结或键结的任何基团或部分。合适的接头可以见于例如Antibody-Drug Conjugates andImmunotoxins；Phillips,G.L.编辑；Springer Verlag:New York,2013；Antibody-DrugConjugates；Ducry,L.编辑；Humana Press,2013；Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.和Zaro,J.L.编辑；Springer International Publishing,2015中，各自的内容以引用的方式整体并入本文中。通常，适用于本文所述的抗体缀合物的结合剂接头是足够稳定以利用抗体的循环半衰期，同时能够在抗原介导的缀合物内化之后释放其有效载荷的接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解的接头包括在内化后通过胞内代谢裂解，例如通过水解、还原或酶促反应裂解的接头。不可裂解的接头包括在内化后通过抗体的溶酶体降解而释放所附连的有效载荷的接头。合适的接头包括(但不限于)酸不稳定性接头、水解不稳定性接头、酶可裂解的接头、还原不稳定性接头、自分解性接头和不可裂解的接头。合适的接头还包括(但不限于)作为或包含肽、葡糖苷酸、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、马来酰亚胺-己酰基单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对氨基苯甲基(PAB)单元的接头。
本领域中已知的任何接头分子或接头技术可以用于建立或构建本公开的ADC。在某些实施方案中，接头是可裂解的接头。根据其它实施方案，接头是不可裂解的接头。在本公开的背景下可以使用的示例性接头包括包含以下或由以下组成的接头：例如MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、val-gly(缬氨酸-甘氨酸)、蛋白酶可裂解的接头中的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可裂解的接头中的二肽位点、PAB(对氨基苯甲酰氧基羰基)、SPP(N-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、SMCC(N-丁二酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)、SIAB(N-丁二酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，以及它们的变体和组合。在本公开的背景下可以使用的接头的另外的实例提供于例如US 7,754,681和Ducry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13，以及其中引用的参考文献中，所述参考文献的内容以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，接头在生理条件下是稳定的。在某些实施方案中，接头是可裂解的，例如能在酶存在下或在特定的pH范围或值下释放至少有效载荷部分。在一些实施方案中，接头包含酶可裂解的部分。例示性酶可裂解的部分包括(但不限于)肽键、酯键、腙和二硫键。在一些实施方案中，接头包含组织蛋白酶可裂解的接头。
在一些实施方案中，接头包含不可裂解的部分。
合适的接头还包括(但不限于)在化学上键结于单个结合剂、例如抗体的两个半胱氨酸残基的接头。这样的接头可以用来模拟因缀合过程而被破坏的抗体二硫键。
在一些实施方案中，接头包含一种或多种氨基酸。合适的氨基酸包括天然、非天然、标准、非标准、蛋白质、非蛋白质和L-或D-α-氨基酸。在一些实施方案中，接头包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸、它们的衍生物或它们的组合。在某些实施方案中，氨基酸的一个或多个侧链连接于以下描述的侧链基团。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，接头包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，接头包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和丙氨酸。
在一些实施方案中，接头包含自分解性基团。自分解性基团可以是熟练技术人员已知的任何这样的基团。在具体的实施方案中，自分解性基团是对氨基苯甲基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苯甲氧基羰基(PABC)。熟练技术人员将认识到自分解性基团能够进行化学反应，从有效载荷释放接头的剩余原子。
在一些实施方案中，接头是：
Figure BDA0002779893380000651
其中
Figure BDA0002779893380000652
是与抗体或抗原结合蛋白(例如通过赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002779893380000653
是与细胞毒性剂(例如DM1)的键。在一些实施方案中，接头是：
Figure BDA0002779893380000654
其中
Figure BDA0002779893380000655
是与抗体或抗原结合蛋白(例如通过赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002779893380000656
是与细胞毒性剂(例如DM1)的键。在某些实施方案中，接头是：
Figure BDA0002779893380000657
在某些实施方案中，接头是：
Figure BDA0002779893380000661
在一些实施方案中，接头衍生自马来酰亚胺基甲基-4-反式-环己烷羧基琥珀酸酯：
Figure BDA0002779893380000662
在一些实施方案中，接头是：
Figure BDA0002779893380000663
其中
Figure BDA0002779893380000664
是与抗体或抗原结合蛋白(例如通过赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002779893380000665
是与细胞毒性剂(例如具有下式的化合物
Figure BDA0002779893380000666
)的键。
本公开包含ADC，其中接头通过在抗体或抗原结合分子内的特定氨基酸处的附连将抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白连结至药物或细胞毒素。在这方面的背景下可以使用的示例性氨基酸附连为例如赖氨酸(参见例如US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人,Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；和US 2013/0101546)、半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039；和Hofer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如Carrico等人,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51；和Rabuka等人,Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO2012/166559)和酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。接头还可以通过附连于碳水化合物(参见例如US 2008/0305497、WO 2014/065661和Ryan等人,Food&AgricultureImmunol.,2001,13:127-130)和二硫化物接头(参见例如WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等人,Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)而与抗原结合蛋白缀合。位点特异性缀合技术也可以用以指导与抗体或抗原结合蛋白的特定残基的缀合(参见例如Schumacher等人J Clin Immunol(2016)36(增刊1):100)。位点特异性缀合技术包括(但不限于)通过转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合(参见例如Schibli,Angew Chemie国际版2010,49,9995)。
根据某些实施方案，本公开提供了ADC，其中如本文所述的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与如国际专利公布WO2014/145090中所述的接头-药物组合物(例如化合物“7”，本文中又称为“M0026”并且下文描绘)缀合，所述国际专利公布以引用的方式整体并入本文中：
Figure BDA0002779893380000681
本文还提供了包含抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白的抗体药物缀合物，其中所述抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与细胞毒性剂缀合。在某些实施方案中，细胞毒性剂是美登素类。在某些实施方案中，美登素类是具有下式的化合物：
Figure BDA0002779893380000682
其中n是1-12的整数并且R1是烷基。在某些实施方案中，美登素类是
Figure BDA0002779893380000683
在某些实施方案中，细胞毒性剂是美登素类，并且美登素类通过不可裂解的接头共价附连于抗体。在某些实施方案中，细胞毒性剂是美登素类，并且美登素类通过可裂解的接头共价附连于抗体。在一个实施方案中，抗体与以下缀合：
Figure BDA0002779893380000691
其中
Figure BDA0002779893380000692
是与抗体的键。
在一个实施方案中，抗体与以下缀合：
Figure BDA0002779893380000693
其中
Figure BDA0002779893380000694
是与抗体的键。
在一个实施方案中，抗体与以下缀合：
Figure BDA0002779893380000695
其中
Figure BDA0002779893380000701
是与抗体的键。
在一个实施方案中，抗体与以下缀合：
Figure BDA0002779893380000702
其中
Figure BDA0002779893380000703
是与抗体的键。
在一些实施方案中，缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是如本文所述的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白；
L是接头；
Pay是细胞毒性剂；以及
n为1-10的整数。
在一些实施方案中，Ab是表1中所述的抗体或抗原结合蛋白中的任一种。
在一些实施方案中，有效载荷是美登素类。
在一些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0002779893380000711
其中R1是烷基。
在一些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0002779893380000712
在一些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0002779893380000713
在一些实施方案中，n是2至5的整数。
在一些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0002779893380000721
其中
Figure BDA0002779893380000722
是与抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0002779893380000723
其中
Figure BDA0002779893380000724
是与抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0002779893380000725
其中
Figure BDA0002779893380000726
是与抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0002779893380000731
其中
Figure BDA0002779893380000732
是与抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0002779893380000733
其中
Figure BDA0002779893380000734
是与抗体的键。
本文所述的抗体药物缀合物可以使用本领域的一般技术人员已知的缀合条件制备(参见例如Doronina等人Nature Biotechnology 2003,21,7,778，其以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，通过使本文所述的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与包含所需接头和细胞毒性剂的化合物接触来制备抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白药物缀合物，其中所述接头具有例如在抗体或抗原结合蛋白的所需残基处与抗体或抗原结合蛋白反应的部分。
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所述的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与具有下式A1的化合物和水性稀释剂接触：
Figure BDA0002779893380000741
在一些实施方案中，式A1化合物以化学计量过量存在。在一些实施方案中，式A1化合物以5-6倍化学计量过量存在。在一些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在一些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。
在一些实施方案中，式A1化合物是式A2或A3的化合物：
Figure BDA0002779893380000742
Figure BDA0002779893380000751
在一些实施方案中，式A2或A3的化合物是立体异构体纯的。在一些实施方案中，式A1化合物包含式A1或A2的化合物，其中A1或A2的化合物以超过50％的非对映异构体过量存在。在某些实施方案中，非对映异构体过量超过70％。在某些实施方案中，非对映异构体过量超过90％。在某些实施方案中，非对映异构体过量超过95％。在某些实施方案中，结构A1、A2和A3单独或统一称为SMCC-DM1。
术语“非对映异构体过量”是指所需单一非对映异构体与组合物中的剩余非对映异构体相比的摩尔分数之间的差异。非对映异构体过量如下计算：(单一非对映异构体的量)-(其它非对映异构体的量)/1。举例来说，含有90％的1和10％的2、3、4或它们的混合物的组合物具有80％[(90-10)/1]的非对映异构体过量。含有95％的1和5％的2、3、4或它们的混合物的组合物具有90％[(95-5)/1]的非对映异构体过量。含有99％的1和1％的2、3、4或它们的混合物的组合物具有98％[(99-1)/1]的非对映异构体过量。可以类似地针对1、2、3或4中的任一者计算非对映异构体过量。
在一些实施方案中，式A1化合物是通过使式(a)化合物：
Figure BDA0002779893380000752
与式(b)化合物
Figure BDA0002779893380000761
在硅胶和稀释剂存在下接触来制备。在一些实施方案中，稀释剂包含有机溶剂和水。
本文还提供了通过以下方法制备的产物：
(i)使式(a)化合物：
Figure BDA0002779893380000762
与式(b)化合物：
Figure BDA0002779893380000763
在硅胶和稀释剂存在下接触以合成中间体；以及
(ii)使抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与中间体和水性稀释剂接触。
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所述的抗TAA×抗CD63双特异性抗原结合蛋白与具有下式B的化合物和水性稀释剂接触：
Figure BDA0002779893380000771
其中LG是离去基团。
在一些实施方案中，式B化合物以化学计量过量存在。在一些实施方案中，式B化合物以5-6倍化学计量过量存在。在一些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在一些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。在一些实施方案中，-C(O)-LG是酯，例如NHS或五氟苯基酯。
在一些实施方案中，式B化合物是被称为化合物I的式B1化合物：
Figure BDA0002779893380000772
B1(化合物I)。
在一些实施方案中，式C化合物被称为化合物II：
Figure BDA0002779893380000781
C(化合物II)。
药物抗体比率(DAR)是与抗体或抗原结合片段缀合的药物的平均数目，其对ADC的功效、效力和药物动力学具有很大影响。在多个实施方案中，DAR是每一抗体1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个药物分子。在一些实施方案中，DAR是1至4。在某些实施方案中，DAR是2至4。在一些情况下，DAR是2至3。在某些情况下，DAR是3至4。在一些实施方案中，DAR是1至10、1至20或1至30(即每一抗体或其抗原结合片段1至30个药物分子)。
治疗性制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物是用合适的载体、赋形剂和提供改良的转移、递送、耐受性等的其它剂配制。许多适当的制剂可见于所有药物化学家已知的药典中：Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、凝胶体、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的泡囊(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸附糊剂、水包油和油包水乳液、乳液卡包蜡(carbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡包蜡的半固体混合物。又见Powell等人"Compendium ofexcipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的抗原结合分子的剂量可以视患者的年龄和体型、目标疾病、状况、施用途径等变化。优选剂量典型地根据体重或体表面积计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于在成人患者中达成治疗目的时，宜通常以约0.01至约20毫克/公斤体重、更优选约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3毫克/公斤体重的单次剂量静脉内施用本发明的双特异性抗原结合分子。根据疾患的严重度，可以调整治疗的频率和持续时间。施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表可以凭经验确定；例如，可以通过定期评定来监测患者进展，并因此调整剂量。此外，可以使用本领域中众所周知的方法进行剂量的种间扩大(例如Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知多种递送系统并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如封装于脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何合宜的途径，例如通过输注或团注、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可以连同其它的生物活性剂一起施用。可以全身或局部施用。
本发明的药物组合物可以用标准针和注射器皮下或静脉内递送。另外，关于皮下递送，笔型递送装置容易应用于递送本发明的药物组合物。此类笔型递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔型递送装置通常利用含有药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都已经施用并且药筒是空的，容易丢弃空药筒并替换为含有药物组合物的新药筒。然后可以重新使用笔型递送装置。在一次性笔型递送装置中，没有可替换的滤筒。更确切些，一次性笔型递送装置预填充有被保持在装置内的储药器中的药物组合物。一旦储药器倒出药物组合物，即可丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔型和自动注射器式递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括(但不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford公司,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅仅举几个例子。应用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔型递送装置的实例包括(但不限于)SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅仅举几个例子。
在某些情形下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,上述；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施方案中，控制释放系统可以邻近组合物的靶标，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上述,第2卷,第115-138页)。其它控制释放系统论述于Langer,1990,Science 249:1527-1533的评述中。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公共已知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常注射用的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为注射用水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，其可以与例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]等适当增溶剂组合使用。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。由此制备的注射液优选填充在适当的安瓿中。
用于口服或肠胃外使用的上述药物组合物宜制备成呈适合于提供一剂活性成分的单位剂量的剂型。呈单位剂量的此类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常是单位剂量中每个剂型约5至约500mg；特别是注射液形式，优选地，上述抗体的含量是约5至约100mg和其它剂型约10至约250mg。
其治疗和诊断用途
本文还公开了方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含抗CD63抗体或其抗原结合片段(包括包含抗CD63抗体或其抗原结合片段的多特异性结合分子或多结构域治疗蛋白)或包含抗CD63抗体(例如包含如本文表1中所示的HCVR/LCVR或CDR序列中的任一者的抗CD63抗体或ADC)的抗体药物缀合物的治疗性组合物。治疗性组合物可以包含本文公开的抗CD63抗体、其抗原结合片段或ADC中的任一种和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的抗体、其抗原结合片段(包括包含抗体、其抗原结合片段的多特异性结合分子或多结构域治疗蛋白)或包含抗CD63抗体的抗体药物缀合物尤其可用于治疗、预防和/或改善与CD63相关或由CD63介导的任何疾病或病症。举例来说，本发明的抗体和ADC可用于治疗表达CD63和在一些实施方案中可以由本发明的双特异性抗体靶向的TAA的肿瘤。本发明的抗体、其抗原结合片段(包括包含抗体、其抗原结合片段的多特异性结合分子或多结构域治疗蛋白)或包含抗CD63抗体的抗体药物缀合物还可用于治疗肥大细胞(MC-)依赖性疾病、类风湿性关节炎、IgE依赖性过敏反应和Fc-ER1介导的过敏反应、哮喘、癌症和/或转移等。参见例如Kraft等人(2005)JEM 201:385；Valadi(2007)Nat.Cell Biol.9:654。
本发明的抗CD63抗体具有多种效用。在一个实施方案中，抗CD63抗体可用于外来体的亲和力纯化，例如其中本文公开的抗CD63抗体可以使用本领域中众所周知的方法固定在合适的载体如Sephadex树脂或滤纸上，接着与有待纯化的含有含CD63的所需外来体的样品接触，此后将载体用合适溶剂洗涤，所述溶剂将去除样品中除结合于固定抗体的外来体外的基本上所有的物质。最终，可以用另一种合适的溶剂洗涤载体，所述溶剂从抗体释放外来体。在另一个实施方案中，抗CD63抗体可以用于针对CD63的诊断测定中，例如检测CD63在特定细胞、组织或血清中的表达，例如作为鉴定/标记外来体的试剂。参见例如Valadi等人(2007)Nature Cell.Biol:9(6):654-9。可以使用本领域中已知的多种诊断和预后测定技术，例如竞争性结合测定、直接或间接夹心测定和以非均质相或均质相进行的免疫沉淀测定(Zola(1987)Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press公司,第147-1581页)。测定中所用的抗体可以用可检测部分标记。可检测部分能够直接或间接产生可检测信号。可以采用本领域中已知的用于使抗体缀合于可检测部分的任何方法。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗例如癌症的疾病的方法。本发明的方法优选包括向需要所述治疗的受试者提供如上所述的抗体或其CD63抗原结合片段。
使用抗体或抗体片段免疫靶向癌细胞的方法是本领域中众所周知的。美国专利No.6,306,393例如描述了抗CD22抗体在B细胞恶性病的免疫疗法中的用途，并且美国专利No.6,329,503描述了表达蛇纹石跨膜抗原的细胞的免疫靶向。本文所述的抗体(包括人源化或人单克隆抗体或其片段或其它修饰，任选地与细胞毒性或其它剂缀合)可以引入患者中，以使得抗体结合于癌细胞并介导细胞和肿瘤的破坏和/或抑制细胞或肿瘤的生长。
不意图限制本公开，此类抗体发挥治疗作用的机制可以包括例如补体介导的细胞溶解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、调节肿瘤抗原的生理功能、抑制结合或信号转导通路、调节肿瘤细胞分化、改变肿瘤血管生成因子概况、调节免疫刺激或肿瘤抑制细胞因子和生长因子的分泌、调节细胞粘附和/或诱发细胞凋亡。
实施例1：示例性CD63抗体
抗人CD63抗体的产生
通过用人CD63对小鼠(例如包含编码人免疫球蛋白重链和人κ轻链可变区的DNA的工程化小鼠)进行免疫接种来获得抗人CD63抗体。
在免疫接种后，从每只小鼠收获脾细胞，并且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保存其活力并形成杂交瘤细胞，并且针对人CD63特异性进行筛选，或者(2)使用人CD63片段作为结合和鉴定反应性抗体(抗原阳性B细胞)的分选试剂进行B细胞分选(如US 2007/0280945A1中所述)。
最初使用例如如美国专利No.7,105,348、美国专利No.8,642,835和US 9,622,459(各自以引用的方式并入本文中)中所述的VELOCIMMUNE技术，分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对人CD63的嵌合抗体。
在一些抗体中，出于测试目的，小鼠恒定区并替换为所需人恒定区，例如野生型人CH或修饰人CH(例如IgG1、IgG2或IgG4同型)，和轻链恒定区(CL)，产生完全人抗hCD63，包括包含抗hCD63抗体或其抗原结合部分的完全人双特异性抗体。虽然所选的恒定区可以根据特定用途变化，但高亲和力抗原结合和靶标特异性特征仍属于可变区。
根据本实施例的方法产生的包含抗人CD63结合臂的示例性双特异性抗体的某些生物特性详细描述于以下所述的实施例中。
抗CD63抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
图1阐述了编码用于产生本文公开的多结构域治疗抗CD63蛋白的所选抗CD63抗体的重链或轻链可变区(分别HCVR或LCVR)或重链或轻链CDR(分别HCDR和LCDR)的核酸(NA)序列的序列标识符和括号中的氨基酸(AA)序列。
表1：抗CD63序列标识符
Figure BDA0002779893380000841
Figure BDA0002779893380000851
通过亲本抗人CD63抗体结合
抗CD63抗体与表达人CD63的细胞的相对细胞表面结合通过流式细胞术使用内源性表达人CD63的CD63阳性HEK293细胞(ATCC，目录号CRL-1573)和CD63阴性HEK293/CD63敲出细胞获得。对于测定，细胞于含有2％FBS(Saradigm目录号1500-500)(染色缓冲液)的无钙和镁的PBS(VWR，目录号45000-446)中涂铺在96孔V形底板(Axygen Scientific，目录号P-96-450-V-C-S)中。然后细胞与抗CD63抗体或同种型对照抗体一起在100nM至1.7pM范围内的浓度下冰上孵育30分钟。不含抗体的孔用作对照。HEK293/CD63KO细胞只用最高浓度(100nM)抗体染色。然后将细胞用染色缓冲液洗涤一次，并且与100nM的PE缀合的抗小鼠Fc二抗(Jackson ImmunoResearch，目录号115-115-164)一起在4℃下孵育30分钟。然后洗涤细胞并使用在PBS中稀释的Cytofix(BD Biosciences，目录号554655)的50％溶液固定。样品在Intellicyte Hypercyt流式细胞仪上跑动，并在ForeCyt软件(Intellicyte)中分析结果以计算平均荧光强度(MFI)。使用四参数逻辑斯蒂方程(logistic equation)在12点反应曲线上使用GraphPad Prism分析测量值，并且报告所得EC50值(表12)。通过计算抗CD63抗体或对照抗体MFI与不含抗体的细胞的比率来确定信噪比(S/N)(表12)。
如表2中所示，本发明的抗CD63抗体中的三种显示以在21.0至31.6范围内的S/N值和在0.5nM至1.9nM范围内的EC50值结合于HEK293细胞。非结合对照未显示结合于HEK293细胞(S/N≤1.5)。抗CD63抗体和同种型对照抗体均显示弱至几乎不结合于HEK293/CD63KO细胞(S/N≤4.4)。
表2：如通过流式细胞术测量的抗CD63抗体与HEK293和HEK293/CD63 KO细胞的结合
Figure BDA0002779893380000861
ND＝未测定
还使用基于电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)的检测测定来确定本发明的抗CD63单克隆抗体结合于表达人CD63的细胞的能力。
为了产生过表达的细胞，将小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞(ATCC，目录号CRL-1658)转染，以形成细胞系“NIH3T3/hCD63”，所述细胞系稳定地表达人CD63(hCD63；登录号NP_001771的氨基酸M1-M238；SEQ ID NO:337)。利用QuantumTMAlexa
Figure BDA0002779893380000862
647 MESF(Bangs Laboratories，目录号647B)和Simply
Figure BDA0002779893380000863
抗小鼠IgG(Bangs LaboratoriesInc，目录号815)，根据制造商的说明，分析人CD63在内源表达的细胞、人雄激素敏感性前列腺癌细胞系LNCAP(ATCC，目录号CRL-1740)和人原代胶质母细胞瘤细胞系U87MG(ATCC，目录号HTB-14)中的表达水平。测得LNCAP细胞的人CD63拷贝数低于U87MG细胞。包括通过荧光活化细胞分选术(FACS)无法检测到人CD63的表达的未转染NIH3T3细胞作为阴性对照。
简单地说，将细胞系在无Ca2+/Mg2+的PBS缓冲液中冲洗一次，并且在37℃下与无酶细胞解离溶液(Millipore，目录号S-004-C)一起孵育10分钟以脱离细胞。然后将细胞用具有Ca2+/Mg2+的PBS洗涤一次并用CellometerTM Auto T4细胞计数器(Nexcelom Bioscience有限公司)计数。将大约2.0×104NIH3T3/hCD63、LNCAP、U87MG或NIH3T3细胞分开接种至96孔碳电极板(Meso Scale Discovery，目录号L15XB-6)上并且然后在37℃下孵育一小时。在室温(RT)下将非特异性结合位点用含2％BSA(w/v)的具有Ca2+/Mg2+的PBS封闭一小时。含有在浓度范围(1.7pM至100nM)的抗CD63抗体或同种型对照抗体于含0.5％BSA(w/v)的具有Ca2+/Mg2+的PBS中以及仅仅对照缓冲液的溶液一式两份地加入至板结合NIH3T3/hCD63、LNCAP、U87MG或NIH3T3细胞中并在室温下孵育一小时。随后使用具有细胞洗涤头的AquaMax2000板式洗涤器(MDS Analytical Technologies)洗涤平板以去除未结合的抗体。在室温下用1μg/mL对Fcγ片段具有特异性的SULFO-TAGTM缀合的山羊多克隆抗人IgG抗体(Jackson Immunoresearch，目录号109-005-098)或对Fcγ具有特异性的SULFO-TAGTM缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch，目录号115-005-164)检测板结合的抗体一小时。洗涤平板，并接着与读取缓冲液(MSD，目录号R92TD-2)一起根据制造商的说明孵育。使用SECTOR成像器(MSD)测量发光信号传导。记录以相对光单位(RLU)测量的发光强度，以指示在所测试的浓度范围下每种抗体的结合强度。报告与相同浓度的抗体与阴性细胞的结合相比，在3.7nM抗体与表达人CD63的细胞的结合下检测到的信号的比率，作为CD63结合的特异性的指示。结合比超过3的抗体分类为特异性结合剂，并且结合比小于或等于3的抗体分类为非结合剂并且在表13中标记为NB。另外，分析随抗体浓度而变的直接结合信号(以RLU为单位)，并且使用GraphPad PrismTM软件用S形(四参数逻辑)剂量-反应模型拟合数据。确定与表达人CD63的细胞结合的EC50值以指示每种抗体的效力并在表3中报告，只针对特异性结合剂，EC50值被定义为检测到最大结合信号的50％时的抗体浓度。表3A和3B中报告了测试不同抗体的两个单独实验的数据。
如表3A所示，如本实施例中所述产生的四种抗CD63抗体和比较Ab(比较例1)特异性地结合于在工程化NIH3T3/hCD63细胞上表达以及在LNCAP和U87MG细胞系上内源表达的人CD63。本实施例中所述的四种抗CD63抗体以在280pM至970pM范围内的EC50值和在91至281倍范围内的相比于阴性细胞系的结合比结合于NIH3T3/hCD63细胞。本发明的四种抗CD63抗体以在500pM至1.4nM范围内的EC50值和在52至272倍范围内的相比于阴性细胞系的结合比结合于U87MG细胞。如本实施例中所述产生的四种抗CD63抗体以在210pM至1.7nM范围内的EC50值和在7至20倍范围内的相比于阴性细胞系的结合比结合于LNCAP细胞。与U87MG细胞相比，LNCAP细胞上较低的结合比与这些细胞上较低的CD63拷贝数一致。正如所料，同种型对照抗体是非结合剂，其中细胞结合比小于或等于3。
表3A.如通过基于电化学发光的检测所测量的抗CD63抗体与表达人CD63的细胞的结合
Figure BDA0002779893380000881
NB-非结合剂，结合比小于或等于3的抗体分类为非结合剂。
如表3B所示，测试的二十种抗CD63抗体中的十九种以及比较Ab(比较例1)特异性地结合于在工程化NIH3T3/hCD63细胞上表达以及在U87MG和LNCAP细胞系上内源表达的人CD63。一种抗CD63抗体H4H11998P2特异性地结合于NIH3T3/hCD63和U87MG,但不结合于LNCAP。测试的二十种抗CD63抗体以在0.320nM至7.4nM范围内的EC50值和在14倍至608倍范围内的相比于阴性细胞系的结合比结合于NIH3T3/hCD63细胞，并且以在0.29nM至17nM范围内的EC50值和在5倍至405倍范围内的结合比结合于U87MG细胞。十九种抗CD63抗体以在0.15pM至55nM范围内的EC50值和在4至51倍范围内的相比于阴性细胞系的结合比结合于LNCAP细胞。一种抗CD63抗体H4H11998P2是LNCAP细胞的非结合剂，细胞结合比为1。与U87MG细胞相比，LNCAP细胞上较低的结合比与这些细胞上较低的CD63拷贝数一致。正如所料，同种型对照抗体是非结合剂，在测试的人CD63细胞系上细胞结合比小于或等于3或结合信号小于100RLU。
表3B.如通过基于电化学发光的检测所测量的抗CD63抗体与表达人CD63的细胞的结合
Figure BDA0002779893380000891
Figure BDA0002779893380000901
NB-非结合剂；结合比小于或等于3或结合信号小于100RLU的抗体。
(*)–U87MG上的结合信号小于100RLU并且同种型对照被分类为非结合剂。
IC–不确定；未观察到S形拟合，无法计算EC50值。
通过亲本抗人CD63抗体介导的内化/细胞毒性
评定本文公开的抗CD63抗体在表达CD63的细胞上结合和内化的能力。对于测定，将T47D细胞(ATCC，目录号HTB-133)于含有10％FBS(ATCC，目录号30-2020)、青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Gibco，目录号10378-016)、100μM丙酮酸钠(Millipore，目录号TM5-005-C)、1mM HEPES(ThermoFisher，目录号15630080)、10μg/mL牛胰岛素(Gemini BioProducts，目录号700-912P)(生长培养基)的RPMI(Irvine Scientific，目录号#9160)中接种至96孔胶原蛋白包被的平板(Greiner，目录号655956)并且在5％CO2中在37℃下孵育过夜。为了染色，将一式四份的细胞平板与在含2％FBS的无钙和镁的PBS(Irving，目录号9240)(染色缓冲液)中稀释的10μg/mL的抗CD63抗体一起在4℃下孵育30分钟。将细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后与10μg/mL Alexa-Flour 488缀合的二抗(Jackson Immunoresearch，目录号115-547-003或Jackson Immunoresearch，目录号109-547-003)一起在4℃下孵育30分钟，随后用染色缓冲液再洗涤两次。将两个平板立即用含4％多聚甲醛(PFA；ThermoFisher，目录号28908)+5uM DRAQ5(ThermoFisher，目录号62251)的PBS固定并染色20分钟(非内化板)。将剩余两个平板与生长培养基一起在37℃下孵育2小时，接着使用在PBS中稀释的4％PFA+5μM DRAQ5的溶液固定和染色20分钟(内化平板)。在固定之后，将所有平板用PBS洗涤一次。将一个非内化平板和一个内化平板与PBS中的50μg/mL的抗Alexa Fluor 488抗体(Regeneron)一起在4℃下孵育过夜，以淬灭表面Alexa Fluor 488荧光。剩余平板只与PBS一起孵育。在Opera Phenix(Perkin Elmer)上在放大40倍下获得共焦图像。利用Harmony分析软件(Perkin Elmer)鉴定DRAQ5标记的细胞并确定每一细胞的总Alexa-Fluor 488相对荧光单元(RFU)。确定每种在4℃下的总结合(4℃未淬灭孔的RFU值)、在37℃下的总结合(37℃未淬灭孔的RFU值)、总内化RFU和内化％，如表1所示。对于所有计算，从每个孔减去来自只有二抗的对照孔的本底荧光。总内化RFU计算如下：在37℃下未淬灭样品的总RFU在37℃下表面RFU。表面RFU定义为在37℃下未淬灭RFU-在37℃下淬灭RFU)/QE。QE(淬灭效率)定义为：1-(4℃淬灭样品的总RFU/4℃未淬灭样品的总RFU)。从下式确定内化％：(在37℃下总内化RFU/在37℃下总RFU)×100。
如表4所示，本发明的所有4种抗CD63抗体显示内化至T47D细胞中，内化％在60.9％至73.7％范围内。同种型对照未显示任何可测量的内化。
表4：T47D细胞中抗CD63抗体的内化和表面结合
Figure BDA0002779893380000911
Figure BDA0002779893380000921
ND*：由于弱结合和/或不能确定淬灭效率而不能确定内化％
为了评定本文所述的抗CD63抗体在表达CD63的细胞中内化的能力，进行体外间接细胞毒性测定。将人CD63阳性T47D细胞(ATCC，目录号HTB-133)和人CD63阴性NIH3T3细胞(ATCC，目录号CRL-1658)分别于含有10％FBS(ATCC，目录号30-2020)、青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Gibco，目录号10378-016)、50uMβ-巯基乙醇(Sigma，目录号M7522)(生长培养基)、丙酮酸钠100mM(Millipore，目录号TMS-005-C)、HEPES 1M(Irvine Scientific，目录号9319)和牛胰岛素10ug/mL(Gemini BioProducts，目录号700-912P)的RPMI(IrvineScientific，目录号9160)中以每孔6,000个细胞或于DME高葡萄糖(Irvine Scientific，目录号9033)、10％小牛血清(Hyclone，目录号SH30072.03)+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Gibco，目录号10378-016)中以每孔2,000个细胞接种于PDL包被的96孔板(BD Biocoat，目录号356461)中，并在5％CO2中在37℃下生长过夜。对于细胞活力曲线，将细胞与浓度在3.0pM至2.2nM范围内的连续稀释的抗CD63抗体(H2M12450N)或非结合同种型对照抗体一起在37℃下孵育5分钟。然后将与细胞毒性有效载荷MMAF(Moradec，目录号AM-201AF-50)缀合的Fab抗mFc二抗以20nM加入至每个孔中。单独培养基充当阴性对照，并且33μM毛地黄皂苷(Promega，目录号G9441)用于确定最大细胞毒性。在孵育72小时后，使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo，目录号CK04)根据制造商方案测量细胞活力，孵育时间范围为1-3小时。在Envision板式读数器(PerkinElmer)上测量450nm下吸光度(OD450)。从所有孔中减去来自经过毛地黄皂苷处理的细胞的本底OD450水平，并且活力可以表示为未处理的对照的百分比(活力％)。从四参数逻辑斯谛方程(logistic equation)，在8点反应曲线上(GraphPadPrism)确定IC50值。所有IC50值都以nM浓度表示，并且报告在处理之后剩余的最低活细胞％。
如表5中所概述，在0.24nM的IC50值下抗CD63抗体H2M12450N将T47D活力减至21％，而同种型对照将活力减至仅64％。抗体对NIH3T3细胞系的活力几乎没有影响。
表5.在T47D和NIH3T3细胞中通过间接细胞毒性测定测量的抗CD63抗体内化
Figure BDA0002779893380000931
ND＝未确定
Biacore在25℃和37℃下测量的抗CD63单克隆抗体与CD63(EC2)环试剂的结合的结合动力学
使用基于实时表面等离子体共振的Biacore T200生物传感器或Biacore 2000生物传感器测定不同CD63(EC2)环试剂与纯化的抗CD63单克隆抗体的结合的平衡解离常数(KD)。在10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20pH 7.4(HBS-ET)运行缓冲液中在25℃和37℃下进行所有结合研究。首先通过与兔抗小鼠Fc特异性多克隆抗体(GE Healthcare，目录号BR100838)或抗人Fab试剂盒(GE Healthcare，目录号28958325)进行胺偶合，将Biacore CM5传感器芯片表面衍生化，以捕获抗CD63单克隆抗体。在与C端Myc-Myc-六组氨酸(hCD63 EC环2-MMH；SEQ ID NO:338)一起表达的重组人CD63胞外环2或与C端人Fc标签一起表达的重组人CD63胞外环2(hCD63 EC环2-hFc；SEQ ID NO:339)上进行结合研究。首先在HBS-ET运行缓冲液中制备不同浓度的hCD63 EC环2-MMH或hCD63 EC环2-hFc(4倍稀释中在50nM-12.5nM下或在3倍连续稀释中在90nM-0.37nM下测试)，并以35μL/分钟或50μL/分钟的流速注射在捕获的抗CD63单克隆抗体表面上注射4分钟，同时在HBS-ET运行缓冲液中监测单克隆抗体结合的CD63试剂的解离8或10分钟。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件在质量转移限制下将实时结合传感图线与1:1结合模型拟合来确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)。结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)是由动力学速率如下计算：
Figure BDA0002779893380000941
以及
Figure BDA0002779893380000942
表6至9中示出了在25℃和37℃下人CD63 EC环2蛋白结合与本发明的不同抗CD63单克隆抗体结合的结合动力学参数。
在25℃下，本发明的23种抗CD63单克隆抗体中的20种以在676pM至11.7uM范围内的KD值结合于人CD63 EC环2-MMH，如表6中所示。在37℃下，本发明的23种抗CD63单克隆抗体中的21种以在1.15nM至12.3μM范围内的KD值结合于人CD63 EC环2-MMH，如表7中所示。在25℃下，本发明的23种抗CD63单克隆抗体中的22种以在129pM至10.1nM范围内的KD值结合于人CD63 EC环2-Fc，如表8中所示。在37℃下，本发明的23种抗CD63单克隆抗体中的22种以在45.0pM至14.5nM范围内的KD值结合于人CD63 EC环2-Fc，如表9中所示。
表6：在25℃下人CD63 EC环2-MMH与抗CD63单克隆抗体结合的结合动力学参数
Figure BDA0002779893380000943
Figure BDA0002779893380000951
IC＝不确定结合
表7：在37℃下人CD63 EC环2-MMH与抗CD63单克隆抗体结合的结合动力学参数
Figure BDA0002779893380000952
Figure BDA0002779893380000961
IC＝不确定结合
NB＝没有结合
表8：在25℃下人CD63 EC环2-hFC与抗CD63单克隆抗体结合的结合动力学参数
Figure BDA0002779893380000962
Figure BDA0002779893380000971
IC＝不确定结合
表9：在37℃下人CD63 EC环2-hFC与抗CD63单克隆抗体结合的结合动力学参数
Figure BDA0002779893380000972
IC＝不确定结合
Octet不同的抗CD63单克隆抗体之间的交叉竞争
使用实时的无标记生物膜层干涉测定，在Octet HTX生物传感器平台(PallForteBio公司)上测定一组抗CD63单克隆抗体之间的结合竞争。整个实验在25℃下在10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20、1mg/mL BSA pH 7.4(HBS-EBT)缓冲液中并以1000rpm速度震荡平板下进行。为了评定2种抗体是否能够彼此竞争结合于与C端myc-myc-六组氨酸标签一起表达的重组人CD63 EC环2上其相应的表位(hCD63 EC环2-MMH；SEQ ID:xx)，首先通过将生物传感器尖端浸没在含有20μg/mL hCD63 EC环2-MMH溶液的孔中3分钟，将大约0.61nm的hCD63 EC环2-MMH捕获至抗Penta-His抗体包被的Octet生物传感器尖端(Fortebio公司，#18-5122)上。然后通过浸入含有50μg/mL第一抗CD63单克隆抗体(随后称为mAb-1)溶液的孔中210秒，使捕获抗原的生物传感器尖端饱和mAb-1。然后生物传感器尖端随后浸入含有50μg/mL第二抗CD63单克隆抗体(随后称为mAb-2)的孔中120秒。在实验的每个步骤之间，将生物传感器尖端在HBS-EBT缓冲液中洗涤。在整个实验过程期间监测实时结合反应，并且记录每个步骤结束时的结合反应。比较mAb-2与预先与mAb-1络合的hCD63 EC环2-MMH结合的反应，并且确定不同的抗CD63单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表10所示。
表10.抗CD63单克隆抗体之间的交叉竞争
Figure BDA0002779893380000981
Figure BDA0002779893380000991
Figure BDA0002779893380001001
Figure BDA0002779893380001011
Figure BDA0002779893380001021
Figure BDA0002779893380001031
Figure BDA0002779893380001041
Figure BDA0002779893380001051
Figure BDA0002779893380001061
Figure BDA0002779893380001071
Figure BDA0002779893380001081
为确定具有抗CD63结合臂的双特异性络合物的内化，产生双特异性抗体
为了评定如本实施例中所述产生的抗CD63抗体内化成双特异性抗原结合分子的一部分的能力，将所述抗体重新构建成双特异性格式，其中一个结合臂是抗CD63抗体VH/VL对(参见表1亲本抗体)并且另一个是不相干的结合臂。使用制造双特异性抗体的标准方法，并且示例性方法描述于例如各自以引用的方式并入本文中的美国申请公布No.2010/0331527和美国专利No.US5731168中。使用表达人CD63的细胞测试双特异性抗体内化的能力。对于测定，将内源表达人CD63的HEK293细胞于含有10％FBS和青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺的DMEM(Gibco，目录号10378016)中以10,000个细胞/孔的密度涂铺于透明底黑色多聚D-赖氨酸包被的96孔板(Greiner，目录号655946)中。两天后，培养基替换为新鲜培养基，所述新鲜培养基含有抗CD63双特异性抗体和阴性对照抗体，从10μg/mL开始2倍连续稀释至0.157μg/mL，以及单独培养基的对照。然后将细胞在37℃下孵育3小时以允许抗体内化。在孵育后，将细胞用PBS洗涤，在室温下固定在4％多聚甲醛(Thermo Scientific，目录号28908)中20分钟，并且随后用含0.2％Triton X-100(Spectrum Chemical，目录号TR135)的5％正常山羊血清(NGS)(Gibco，目录号PCN5000)在室温下渗透20分钟。然后将细胞与2ug/mL驴抗小鼠IgG Alexa Fluor-647Fab(Manufacture，目录号115-606-006)或2μg/mL山羊抗人IgG Alexa Fluor-647 Fab(Jackson ImmunoResearch，目录号115-606-006)一起在5％NGS中在室温下孵育1小时。去除二抗溶液，然后用PBS洗涤细胞，并且随后加入含有2滴/mLNucBlue(Invitrogen，目录号R37605)的新鲜PBS以将活细胞核染色。在ImageXpress高内涵成像系统(Molecular Devices)上以40x将抗体内化和细胞核成像，并使用MetaXpress软件Transfluor应用模块(Molecular Devices)定量抗体内化。抗体内化被报告为每一细胞的凹点累积强度±标准偏差(SD)。
如表11所示，并入了与人CD63结合的单臂(源自于H1M12451、H2M12450或H2M12395)和不相干的非结合臂的所有双特异性抗体显示有效内化至HEK293细胞中。并入了mAb12450的一个结合臂的双特异性抗体显示内化量比其它测试的双特异性抗体高。
表11：HEK293细胞对抗CD63双特异性抗体的内化
Figure BDA0002779893380001101
实施例2：构建抗hCD63 ScFv::GAA多核苷酸和基因疗法载体
使用标准三重转染方案产生AAV2/8病毒，所述病毒编码人GAA(hGAA；SEQ ID NO:369)或在C端与人GAA融合的抗人CD63单链可变片段(ScFv)(抗hCD63 ScFv-hGAA)的表达(Gray等人2011；又见“Production of recombinant adeno-associated viral vectorsand use in vitro and in vivo administration”,Current Protocols inNeuroscience,John Wiley&Sons,New York(1999),第4.17.1-4.17.25页,第1卷)。为了产生，将1×107个HEK293细胞涂铺至15cm平板上。第二天，使用PEIpro(Polyplustransfection,New York,NY目录号115-100)介导的转染，在1:1(1ul PEIpro:1μg DNA)比率下将细胞用以下转染：(A)8μg对照pAAV载体，所述对照载体包含肝脏特异性serpina 1增强子(SEQ ID NO:367)并编码TTR启动子(SEQ ID NO:368)驱动的人GAA，或测试pAAV，所述测试载体包含肝脏特异性serpina 1增强子(SEQ ID NO:367)并编码TTR启动子(SEQ IDNO:368)驱动的hCD63 ScFv-hGAA(参见例如图2)；和(B)pAAV RC2/8来源载体(Gao,2002)和16μg pHelper(Agilent，目录号240074)。在转染七十二小时之后，收集细胞并使用标准冻融法溶解在由20mM Tris-HCl、1mM MgCl2、2.5mM KCl、100mM NaCl组成的缓冲液中。然后，将全能核酸酶(Sigma，目录号E1014-25KU)加入样品中，最终浓度为0.5U/μL，接着在37℃下孵育60分钟。使用如(Zolotukhin等人,1999,Gene Ther 1999；6:973-985)中所述的碘克沙醇(iodixanol)梯度超速离心法纯化病毒，并随后通过qPCR滴定。
在37℃下将AAV样品用DNaseI(Thermofisher Scientific，目录号EN0525)处理一小时并使用DNA extract All试剂(Thermofisher Scientific目录号4403319)溶解。使用QuantStudio 3实时PCR系统(Thermofisher Scientific)使用针对AAV2 ITR的引物定量衣壳化病毒基因组。AAV2 ITR引物的序列是5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′(fwd ITR；SEQ IDNO:370)和5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′(rev ITR；SEQ ID NO:371)(Aurnhammer等人,2012)，分别获得AAV的左侧内部反向重复(ITR)序列(SEQ ID NO:365)和AAV的右侧内部反向重复(ITR)序列(SEQ ID NO:366)。AAV2 ITR探针的序列是5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3′(SEQ ID NO:372)(Aurnhammer C.,Haase M.,Muether N.等人,2012,Hum.GeneTher.Methods 23,18-28)。在10分钟95℃活化步骤之后，进行95℃下15秒和60℃下30秒的两步PCR循环，共40个循环。在qPCR中使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Thermofisher Scientific，目录号4304437)。DNA质粒(Agilent，目录号240074)用作标准以确定绝对滴度。
抗人CD63抗体和其融合物使用表1中所述的抗CD63可变结构域。抗体的ScFv型式与呈重-轻次序且两者之间具有甘氨酸-丝氨酸接头的可变结构域(5’-VH-Gly-Ser-VL-3’)一起克隆。
产生编码具有如SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列(图2)的抗-hCD63 scFv::GAA多结构域治疗剂的AAV，并测试在提供酶替代治疗中的功效。
实施例3：鼠类庞贝病模型后AAV中的肝糖含量
为了确定AAV递送的抗hCD63 ScFv-GAA融合物(SEQ ID NO:364)对比AAV递送的GAA的作用，在相关肝糖贮存体内模型中，两种疗法递送至庞贝病小鼠模型，其中小鼠针对小鼠GAA基因的缺失是同型接合的，并且针对代替小鼠CD63的人CD63的表达是同型接合的，品系背景为75％C57BL/6；25％129SvJ。这些小鼠在本文中称为CD63 HumIn GAA KO小鼠或可替代地称为CD63hu/hu；GAA-/-小鼠。
对于所述实验，通过尾静脉注射，向2月龄的CD63 HumIn GAA KO施用任一AAV2/8病毒，所述病毒含有具有驱动人GAA的TTR肝脏特异性启动子(AAV-hGAA；实施例2中所述)或驱动在C端与人GAA融合的抗人CD63 ScFv的TTR肝脏特异性启动子(AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA；实施例2中所述)的基因组。两种AAV2/8病毒均以两种剂量1e10 vg/小鼠或1e11 vg/小鼠中的任一者递送。作为对照，测定中包括未处理的CD63 HumIn GAA KO小鼠和未处理的具有完整小鼠GAA基因的CD63 HumIn。在处理后将小鼠圈养3个月，并在这期间递增抽血(每月)，以测量血清GAA水平和抗GAA抗体。在3个月之后，将所有小鼠处死，并收获单独的组织，用于测量肝糖、PAS-H染色、定量中央核、测量溶酶体增生和测量LC3b表达。表12中示出了各组小鼠的实验给药和处理方案。
表12：各组小鼠的实验给药和处理方案
Figure BDA0002779893380001131
实施例4：对GAA的免疫反应
为了测量抗人GAA抗体血清水平，使用血清分离管(BD Biosciences，目录号365967)根据制造商的说明书，从在终末抽血期间收集的血液分离来自所有处理组的血清。单独地，将96孔高蛋白结合板(ThermoFisher，目录号15041)用在PBS中稀释的20μg hGAA(R&D Systems、目录号8329-GH-025)包被过夜。将平板用PBS+0.05％Tween(PBS-T)洗涤3次。将平板用含0.5％BSA的PBS-T封闭，并将在1:300至1:5.1e7范围内的小鼠血清连续稀释液加入平板中过夜。使用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Immuno Research，目录号115-035-164)和BD Opt EIA底物试剂盒测量总抗小鼠IgG(子类1+2a+2b+3)。使用1N磷酸中止比色反应。然后在Spectramax i3板式读数器(Molecular Devices)上在450nm下读取吸光度。稀释曲线拟合成S形曲线，并且由曲线计算滴度。
在类似进行的实验中，在AAV施用之后较高水平的GAA或抗hCD63scFv::GAA(SEQID NO:364)与较低抗GAA滴度(数据未示)相关。在注射后三个月的过程中，针对抗GAA抗体，评定用高或低滴度的AAV-抗hCD63scFv::GAA(SEQ ID NO:364)或AAV-GAA处理的GAA敲除小鼠的血清。看到抗体滴度与血清暴露于GAA之间负相关，以及构建体剂量与抗GAA抗体滴度之间负相关(数据未示)。
实施例5：血清GAA
为了测量在实验过程中的人GAA血清水平，在每月时间点，通过尾部抽血收集样品。使用血清分离管(BD Biosciences，目录号365967)根据制造商的说明书从血液分离血清。然后将1μL分离的血清上样至4-20％Novex wedgewell预制凝胶上，在220V下跑动45分钟并使用标准程序在200mA下转移至硝化纤维素膜，历时1小时。然后将硝化纤维素膜用12mL的以1:2000稀释使用的抗GAA一抗(Abcam，#ab137068)和以1:1000稀释使用的抗GAPDH抗体(Abcam，#AB9484)探测，并在4℃下孵育过夜。在一抗孵育之后，用1x TBST洗涤膜三次，每次洗涤5分钟。然后将12mL的以1:15000稀释的抗兔IgG(LiCor,926-32211)和抗小鼠IgG(LiCor,925-68070)(LiCor,Lincoln,NE)二抗加入膜中并在室温下孵育1小时。在二抗孵育之后，用1x TBST洗涤膜两次，每次洗涤5分钟，并用1x TBS洗涤一次，历时5分钟。然后使用LiCor Odyssey仪器(LI-COR Biotechnology)将膜成像并定量。
在类似于上述实验的实验中，用高剂量(1011vg/小鼠)AAV-抗hCD63 ScFv-hGAA(SEQ ID NO:364)或AAV-hGAA处理的CD63HumIn GAA KO小鼠显示在实验过程期间血清中持续水平的GAA(数据未示)。
在注射后3个月对肝脏、心脏和四头肌溶解产物中的表达进行实时PCR定量。检测AAV构建体所有注射液的肝脏表达，并且还比较血清GAA水平与GAA的RNA表达水平。数据(未示)表明，编码如SEQ ID NO:364所示(并且表达由肝脏特异性启动子驱动)的融合蛋白的AAV实现提高的GAA分泌概况。
实施例6：肝糖的组织测量和肌肉组织的组织学表征
肝糖的组织测量：为了测量单独组织中的肝糖含量，在CO2窒息之后立即从来自所有组的小鼠解剖心脏、四头肌、腓肠肌、横隔膜、比目鱼肌和EDL组织，并接着快速冷冻在液氮中，并存储在-80℃下。在benchtop均质器上利用1mg比25μL水的比率的蒸馏水中不锈钢珠粒，将约50mg每个组织溶解，用于肝糖测量。将肝糖分析溶解产物在105℃下加热15分钟，并在21000×g下离心以清除碎片。使用肝糖测定试剂盒(Sigma-Aldrich，#MAK016)，根据制造商关于荧光测定的说明，进行肝糖测量。在荧光板式读数器(Molecular Devices，Spectramax i3)上在535nm激发和587nm发射下测量每个样品的荧光。使用制造商提供的下式计算肝糖的计算量。
Quadricep收获以用于组织病理学和定量：来自除低剂量(1e10vg/小鼠)处理组之外的各组的小鼠的Quadricep组织样品在解剖之后立即快速冷冻在液氮中，并存储在-80℃下，以用于LC3b表达的定量，或者放至含有O.C.T培养基(Tissue-Tek，#4583)的区块上。
O.C.T培养基中的组织样品被送至Histoserv公司(Germantown,MD)以进行切片并用希氏过碘酸(periodic acid Schiff，PAS)染色，以检测多糖。制备另外的切片并返回以进行中央核染色和溶酶体增生。
PAS染色：使用Leica幻灯片扫描器在20x放大率下使PAS染色切片成像。
中央核定量和溶酶体增生：从冷冻机移出来自Histoserv的未染色的切片，并接着在染色室中用含4％多聚甲醛的PBS固定15分钟。然后在PBS中洗涤固定的载片两次，历时5分钟，并随后与封闭缓冲液(eBiosciences，00-4953-54)一起在室温下孵育1小时。然后同时在湿润染色室中，将载片用以下来染色：在封闭缓冲液中1:50稀释的大鼠抗anti-Lamp-1抗体(Abcam,#AB25245)、在封闭缓冲液中1:1000稀释的兔抗Laminin抗体(Sigma,#L9393)或没有加入抗体的封闭缓冲液，并接着转移至4℃，孵育过夜。第二天，然后在PBS中洗涤载片两次，历时5分钟，随后在染色室中用以下来染色：与Alexa Fluor 647缀合的山羊抗兔IgG(H+L)超克隆二抗(Life Tech Thermo，#A27040)，或者与Alexa Fluor 555缀合的山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗(Life Tech Thermo，#A21434)，然后在室温下孵育1小时。然后在PBS中洗涤染色的载片两次，历时5分钟，接着安装上具有DAPI的Fluoromount-G(LifeTech Thermo，#00-4959-52)并在Zeiss LSM710仪器(Carl Zeiss Microscopy GmbH)上成像。使用Halo软件(Indica Labs,NM)定量位于中央的核的数目。
LC3b表达的定量：为定量LC3b表达，使快速冷冻的样品解冻，均质化，接着通过珠粒碰撞，以1mg组织比25μL RIPA缓冲液比率溶解在RIPA缓冲液(150mM NaCl、1.0％
Figure BDA0002779893380001161
CA-630、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris pH 8.0，Sigma Aldrich,R0278)中，历时45秒(MP Biomedical)。通过在21,000×g下离心清除溶解产物中的不溶性物质，并接着将含300μg溶解产物的RIPA缓冲液上样在4-20％Novex wedgewell预制凝胶上，转移至硝化纤维素膜并通过蛋白质印迹法，使用如前针对血清GAA水平分析所述的类似方案，使用识别小鼠LC3b-I和LC3b-II的一抗(Sigma,#L7543)代替针对GAA的一抗进行分析。然后使用LiCor Odyssey仪器(LI-COR Biotechnology)将膜成像并定量。LC3b-I和LC3b-II水平表示为(平均值+/-标准偏差)，任意单位。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
K·席格纳
A·巴伊克
C·舍恩赫尔
A·J·莫菲
<120> 抗CD63抗体、缀合物和其用途
<130> 009108.473WO1/10473WO01
<150> 62/673,098
<151> 2018-05-17
<150> 62/681,563
<151> 2018-06-06
<150> 62/777,592
<151> 2018-12-10
<160> 372
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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ccctccctca agagtcgatt caccatatca attgacacgt ccaagaacct tttctccctg 240
aggctgaaat ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gatgggactg 300
gggagtgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca 354
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ggtggctcct tcagcagtta ctat 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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atccgttata gtggggacac c 21
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ile Arg Tyr Ser Gly Asp Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
gcgaggatgg gactggggag tgatgctttt gatatc 36
<210> 8
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Arg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac aacaattatt tagcctggta ccagcagaaa 120
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gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Val Phe Asn Arg Ala Thr Asn Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
cagagtgtta acaacaatta t 21
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Gln Ser Val Asn Asn Asn Tyr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
ggtgtattc 9
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Phe
1
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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cagcagtatg gtagttcacc ttggacg 27
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaaga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcattg tctctggtgg ctccatcagt aatttctact ggaactggat ccggcagtcc 120
ccagggaagg gactggaatg gattggatat ttcttttaca ctgggactat cgactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca ctggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aacctgcgtc ttctgaccgc cgcagacgcg gccgtttatt attgtgcgag gatggggctg 300
ggggctaatg cttttgacat ctggggccac gggacaatgg tcaccgtctc ttca 354
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Phe Tyr Thr Gly Thr Ile Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Arg Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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ggtggctcca tcagtaattt ctac 24
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Gly Ser Ile Ser Asn Phe Tyr
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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ttcttttaca ctgggactat c 21
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Phe Phe Tyr Thr Gly Thr Ile
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
gcgaggatgg ggctgggggc taatgctttt gacatc 36
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctcctggaga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gcatgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
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caagggacca aggtggaaat gaaa 324
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Ala Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Met Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
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ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc 180
tccctcagga gtcgcgtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgagg 240
atcagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcacaaat ggggtgggga 300
tcccatgctt ttgacatgtg gggccaaggg acaatggtcg ccgtctcttc a 351
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
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Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln
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Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met
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<211> 324
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
ggtgcatcc 9
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Gly Ala Ser
1
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<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 49
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaattggat ccgccagtcc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc 180
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<211> 117
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln
85 90 95
Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Ala Val Ser Ser
115
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ggtggctcca tcagtagtta ctac 24
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
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<212> DNA
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Lys Arg Gly Tyr Thr
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttaat agtaggtact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggtgca gtggcagtgg gtccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caggggacca aggtggaaat caaa 324
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Cys Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 9
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1 5
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caggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
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ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatat actagcagta gtggtagtac cacttattac 180
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<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Leu Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
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Val Arg Asp Leu Arg Tyr Asn Asp Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<400> 76
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Gln Gln Ser Tyr Asp Asn Pro Pro Ile Thr
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<400> 81
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<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Arg Met Gly Leu Gly Arg Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115
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<400> 83
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<400> 84
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
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<400> 86
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<400> 88
Ala Arg Met Gly Leu Gly Arg Glu Ala Phe Asp Ile
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<212> DNA
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<400> 89
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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<400> 92
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1
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cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<211> 357
<212> DNA
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<400> 97
caggtgcaac tggaggagtc tgggggaggc gtggtcaagg ctggagggtc cctgagactc 60
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ccagggaagg ggctggagtg ggtttcgtac attaataatg gtggttatac catttactac 180
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Glu Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
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Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
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<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 105
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggaatca gcagaaacca 120
gggaaagccc cgaagctcct gatctatgta gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg tctacaacct 240
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<211> 18
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<400> 108
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<400> 109
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<400> 111
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
Gln Gln Ser Tyr Ile Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
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<211> 357
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
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tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactattaca taaattggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcgtac attaataatg gtggttatac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatg tccagggaca acgccaagaa ctcagtatat 240
ctgcaaatga acggcctgag agccgaggac acggcctttt attactgtgt gagagaccca 300
cggagttatt atgggtttga ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 114
<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 24
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
ggattcacct tcagtgacta ttac 24
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<211> 8
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<400> 116
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1 5
<210> 117
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<211> 8
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<400> 118
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Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcac tctgcaacct 240
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
cagagtatta gcaggttt 18
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Gln Ser Ile Ser Arg Phe
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
ggtgcatcc 9
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
Gly Ala Ser
1
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<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
caacagagtt atagtacccc tccgatcact 30
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
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<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt catcttcagt gactactaca tgagctggat ccgacaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac atcagaggta gtggttataa cgcagactct 180
gtgcagggtc ggttcaccat ctccagggac aacgccaaga actcactgtt tctgcaaatg 240
aacagcctga gagccgagga cacggccgtg tattactgtg cgagaggata cagctttggt 300
tacggcttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
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<211> 117
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Arg Gly Ser Gly Tyr Asn Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Tyr Ser Phe Gly Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
ggattcatct tcagtgacta ctac 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
atcagaggta gtggttat 18
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Ile Arg Gly Ser Gly Tyr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
gcgagaggat acagctttgg ttacggcttc tttgactac 39
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Gly Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
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gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtc accctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 138
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser His Pro Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
cagagcatta gcagctat 18
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<212> DNA
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gctgcatcc 9
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<400> 142
Ala Ala Ser
1
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<400> 143
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
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1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
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<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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35 40 45
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50 55 60
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
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<400> 147
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Phe
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
attagtaata gtggtgctat aaaa 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 150
Ile Ser Asn Ser Gly Ala Ile Lys
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 151
gtgagagacc cacggagcta ctatgggttt gactat 36
<210> 152
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 153
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 153
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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caagggacac gactggagat taaa 324
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 155
cagagcatta ggaatttt 18
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 156
Gln Ser Ile Arg Asn Phe
1 5
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<211> 9
<212> DNA
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<400> 157
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<400> 158
Ala Ala Ser
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<400> 159
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 160
Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 161
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
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<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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115
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
ggattcacct tcagtgacta ttac 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
attaataatg gtggttatac cata 24
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile
1 5
<210> 167
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 167
gtgagagacc cacggagcta ttatgggttt gactac 36
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 169
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Phe
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 171
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
cagagtatta gcaggttt 18
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
Gln Ser Ile Ser Arg Phe
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<400> 173
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<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
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1
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<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 176
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 177
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
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<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
ggattcacct tcggtgacta ctac 24
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 181
attagtagta gtggtagtac caga 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 182
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Arg
1 5
<210> 183
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 184
Val Arg Asp Leu Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 185
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 185
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 186
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 186
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 187
cagagtgtta gcaacaacta c 21
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 188
Gln Ser Val Ser Asn Asn Tyr
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 189
ggtgcatcc 9
<210> 190
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 190
Gly Ala Ser
1
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 191
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 192
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 193
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 193
caggtgcaac tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaactggat ccggcagtcc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat accaaaaaaa ggagtaccaa ctacaacccc 180
tccctcagga gtcgagtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 240
atgagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcaaaaat ggggtgggga 300
tcccatgctt ttgatatatg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Thr Lys Lys Arg Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
65 70 75 80
Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 195
ggtggctcca tcagtagtta ctac 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 196
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 197
accaaaaaaa ggagtacc 18
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
Thr Lys Lys Arg Ser Thr
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 199
gcaaaaatgg ggtggggatc ccatgctttt gatata 36
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 200
Ala Lys Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
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Gly Ala Ser
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
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acctgcattg tctctggtgg ctccatcagt ggtttctact ggaattggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggaatg gattggatat ttcctttaca gtgggactat cgactacaac 180
ccctccctca agagccgagt caccatatca gtggacacgt ccaaaaacca attctttctg 240
aagttgagtt ttgtgaccgc cgctgacacg gccgtttatt actgtgtgag gatgggactg 300
ggggctaatg cttttgacat ctggggccga gggacaatgg tcaccgtctc ttca 354
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Phe
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Leu Tyr Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
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Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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ggtggctcca tcagtggttt ctac 24
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Gly Gly Ser Ile Ser Gly Phe Tyr
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Phe Leu Tyr Ser Gly Thr Ile
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Val Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile
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<400> 217
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caagggacca aggtggaaat caaa 324
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Arg Ser
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Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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<400> 220
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Gly Pro Ser
1
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caacaatatg gtaactcacc ttggacg 27
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<211> 9
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Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr
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<212> DNA
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 226
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Tyr Thr Asp Tyr
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Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ala Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 232
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 233
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga cagagtcacc 60
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Asn Pro Pro
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 235
cagagcatta gtaacttt 18
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 236
Gln Ser Ile Ser Asn Phe
1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 240
Gln Gln Ser Phe Ser Asn Pro Pro Val Thr
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<211> 357
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 241
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<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 242
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Gly Asp Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
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Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
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Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115
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<212> DNA
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> DNA
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<400> 245
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<211> 8
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 324
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
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caagggacac gactggcgat taaa 324
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 250
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 251
cagaacattc gcacctat 18
<210> 252
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
Gln Asn Ile Arg Thr Tyr
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 253
gctgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 254
Ala Ala Ser
1
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 255
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 256
Gln Gln Ser Tyr Asp Asn Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 257
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 257
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tcctgtacag cctctggatt cacctttggt gatcatgcca tgcactgggt ccgacaagct 120
cccgggaagg gcctggaggg ggtctcaagt attaattgga atagtggtat cataggctat 180
gcggagtctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acaatctgag agctgaggac acgggcttat attactgtgc aagggatatt 300
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp His
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Ile Gly Val Ala Thr Leu Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 24
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 24
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<400> 261
attaattgga atagtggtat cata 24
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<211> 8
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 262
Ile Asn Trp Asn Ser Gly Ile Ile
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 263
gcaagggata ttggcgtggc aacgcttggt attgactac 39
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 264
Ala Arg Asp Ile Gly Val Ala Thr Leu Gly Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 265
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 265
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cagtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctactcaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agtcacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 266
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 266
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 267
cagagcatta gcagctac 18
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 268
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 269
gctgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 270
Ala Ala Ser
1
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 271
caacagagtc acagtacccc tccgatcacc 30
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 272
Gln Gln Ser His Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
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<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 273
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
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cgacaaatct acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
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<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 274
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Ile Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Pro Arg Gln Ile Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 275
ggattcacct tcactgacta cttc 24
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 276
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Phe
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 277
attagtaaca gtggttctat caga 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 278
Ile Ser Asn Ser Gly Ser Ile Arg
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 279
gtgagagatc cgcgacaaat ctacggtatg gacgtc 36
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 280
Val Arg Asp Pro Arg Gln Ile Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 281
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 282
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 282
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 283
cagagcatta gcagctat 18
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 284
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 285
gctgcatcc 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 286
Ala Ala Ser
1
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<400> 287
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 288
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 290
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
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Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Tyr Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 291
ggattcatct tcgatgacta cttc 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292
Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr Phe
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 293
attagtaata gtggtaatac caaa 24
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
Ile Ser Asn Ser Gly Asn Thr Lys
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
gtgagagatc ctagaagtta ctacggtatg gacgtc 36
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 296
Val Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 297
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
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<211> 39
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Ala Arg Asp Arg Arg Thr Thr Val Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
20 25 30
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
35
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
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<210> 300
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 301
attaatggtg gtggttatac catg 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
Ile Asn Gly Gly Gly Tyr Thr Met
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 303
gcgagagata gaaggactac agtatctatt gactac 36
<210> 304
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 304
Ala Arg Asp Arg Arg Thr Thr Val Ser Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 305
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 305
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ccagggaagg gcctagagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtac catgggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa gtccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgg aaaaggtcta 300
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<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 306
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Met Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 307
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 308
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 308
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 309
attagttgga atagtggtac catg 24
<210> 310
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 310
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Met
1 5
<210> 311
<211> 39
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 311
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<210> 312
<211> 13
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 312
Gly Lys Gly Leu Leu His Gln Trp Glu Val Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 313
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 313
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
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<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 314
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr
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Phe Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<210> 315
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 315
ggattcatct tcactgatta cttc 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 316
Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr Phe
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 317
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 318
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 319
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 320
Val Arg Asp Pro Arg Met Phe Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 321
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 321
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
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ccagggaagg gactggagtg gattacatac attaataatg gtggctatac caaatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcatcatc tccagggaca acaccaagaa ttcagtgcat 240
ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgt gagagatccc 300
cgtatgtatt atggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 322
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 322
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Val Arg Asp Pro Arg Met Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 323
ggattcacct tcagtgacta ctat 24
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 324
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 325
attaataatg gtggctatac caaa 24
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 326
Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Lys
1 5
<210> 327
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 327
gtgagagatc cccgtatgta ttatggtatg gacgtc 36
<210> 328
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 328
Val Arg Asp Pro Arg Met Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 329
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 329
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt gactactaca ttacctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attaatactg gtggttatac catgtattac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
cttcaaatga acaacctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtac gagagatagg 300
agatacaact ttggtcttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 330
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 330
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 331
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 331
ggattctcct tcagtgacta ctac 24
<210> 332
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 332
Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 333
attaatactg gtggttatac catg 24
<210> 334
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 334
Ile Asn Thr Gly Gly Tyr Thr Met
1 5
<210> 335
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 335
acgagagata ggagatacaa ctttggtctt gactac 36
<210> 336
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 336
Thr Arg Asp Arg Arg Tyr Asn Phe Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 337
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 337
Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly
20 25 30
Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr
35 40 45
Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu
50 55 60
Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr
65 70 75 80
Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val
85 90 95
Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val Met
100 105 110
Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro Lys
115 120 125
Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe Lys
130 135 140
Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser Met
145 150 155 160
Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn Val Thr Val Gly
165 170 175
Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys Val
180 185 190
Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala
210 215 220
Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met
225 230 235
<210> 338
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD63 EC环2 MMH
<400> 338
Arg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met
20 25 30
Gln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu
35 40 45
Lys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile
50 55 60
Asn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His
65 70 75 80
Lys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val
85 90 95
Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys
100 105 110
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
115 120 125
<210> 339
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD63 EC环2 hFC
<400> 339
Arg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met
20 25 30
Gln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu
35 40 45
Lys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile
50 55 60
Asn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His
65 70 75 80
Lys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val
85 90 95
Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
100 105 110
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
115 120 125
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
130 135 140
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
145 150 155 160
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
165 170 175
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
245 250 255
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
260 265 270
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
275 280 285
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
290 295 300
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 340
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 340
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 341
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 341
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 342
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 342
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 343
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 343
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 344
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 344
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 345
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 345
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 346
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 346
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 347
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 347
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 348
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH序列
<400> 348
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 349
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 349
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 350
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 350
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 351
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH序列
<400> 351
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 352
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 352
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 353
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 353
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 354
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 354
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 355
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 355
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 356
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 356
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 357
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 357
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 358
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 358
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 359
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 359
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 360
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 360
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 361
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 361
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 362
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 362
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 363
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 363
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 364
<211> 1128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv_H4H123450(VH-接头-VL)_接头_GAA
<400> 364
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln
85 90 95
Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Ala Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr
245 250 255
Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys
260 265 270
Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro
275 280 285
Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe
290 295 300
Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser
305 310 315 320
Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe
325 330 335
Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu
340 345 350
Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu
355 360 365
Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu
370 375 380
Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg
385 390 395 400
Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe
405 410 415
Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr
420 425 430
Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser
435 440 445
Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly
450 455 460
Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly
465 470 475 480
Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val
485 490 495
Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile
500 505 510
Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln
515 520 525
Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly
530 535 540
Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr
545 550 555 560
Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val
565 570 575
Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe
580 585 590
Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His
595 600 605
Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser
610 615 620
Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg
625 630 635 640
Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val
645 650 655
Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu
660 665 670
Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe
675 680 685
Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly
690 695 700
Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val
705 710 715 720
Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser
725 730 735
Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly
740 745 750
Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly
755 760 765
Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg
770 775 780
Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro
805 810 815
Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu
820 825 830
Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg
835 840 845
Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser
850 855 860
Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala
865 870 875 880
Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly
885 890 895
Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser
900 905 910
Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile
915 920 925
Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro
930 935 940
Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly
945 950 955 960
Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser
965 970 975
Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val
980 985 990
His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr
995 1000 1005
Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu
1010 1015 1020
Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly
1025 1030 1035
Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile
1040 1045 1050
Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val
1055 1060 1065
Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu
1070 1075 1080
Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro
1085 1090 1095
Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile
1100 1105 1110
Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
1115 1120 1125
<210> 365
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 365
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 366
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 366
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 367
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 367
gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60
ggctaagtcc ac 72
<210> 368
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 368
gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60
catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120
ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180
cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctga 224
<210> 369
<211> 952
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 369
Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu
20 25 30
His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val
35 40 45
Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly
50 55 60
Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr
65 70 75 80
Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys
85 90 95
Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro
100 105 110
Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser
130 135 140
Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu
165 170 175
Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu
180 185 190
Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu
195 200 205
Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg
210 215 220
Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe
225 230 235 240
Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr
245 250 255
Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser
260 265 270
Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly
275 280 285
Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly
290 295 300
Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val
305 310 315 320
Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile
325 330 335
Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln
340 345 350
Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly
355 360 365
Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr
370 375 380
Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val
385 390 395 400
Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe
405 410 415
Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His
420 425 430
Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser
435 440 445
Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg
450 455 460
Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val
465 470 475 480
Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu
485 490 495
Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe
500 505 510
Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly
515 520 525
Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val
530 535 540
Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser
545 550 555 560
Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly
565 570 575
Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly
580 585 590
Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg
595 600 605
Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu
610 615 620
Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro
625 630 635 640
Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu
645 650 655
Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg
660 665 670
Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser
675 680 685
Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala
690 695 700
Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly
705 710 715 720
Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser
725 730 735
Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile
740 745 750
Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro
755 760 765
Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly
770 775 780
Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser
785 790 795 800
Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val
805 810 815
His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr
820 825 830
Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr
835 840 845
Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser
850 855 860
Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala
865 870 875 880
Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly
885 890 895
Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala
900 905 910
Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr
915 920 925
Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly
930 935 940
Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
945 950
<210> 370
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 370
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 371
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 371
cggcctcagt gagcga 16
<210> 372
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成
<400> 372
cactccctct ctgcgcgctc g 21

Claims (25)

1.一种抗CD63抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如表中所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对或与包含如表1中所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人CD63。
2.如权利要求1所述的抗CD63抗体或抗原结合片段，其中所述参考抗体包含选自由如以下所示组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ IDNO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQ ID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ IDNO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQ ID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ ID NO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗CD63抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合于人CD63上与包含如表1中所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体相同的表位。
4.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合于人CD63上与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体相同的表位：SEQ ID NO:SEQ ID NO:2/10、SEQ ID NO:18/26、SEQ ID NO:34/42、SEQ ID NO:50/58、SEQID NO:66/74、SEQ ID NO:82/90、SEQ ID NO:98/106、SEQ ID NO:114/122、SEQ ID NO:130/138、SEQ ID NO:146/154、SEQ ID NO:162/170、SEQ ID NO:178/186、SEQ ID NO:194/202、SEQ ID NO:210/218、SEQ ID NO:226/234、SEQ ID NO:242/250、SEQ ID NO:258/266、SEQID NO:274/282、SEQ ID NO:290/282、SEQ ID NO:298/282、SEQ ID NO:306/282、SEQ IDNO:314/282、SEQ ID NO:322/282和SEQ ID NO:330/282。
5.一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域与根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗CD63抗体或其抗原结合片段竞争结合于人CD63；和第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域结合目标抗原。
6.如权利要求5所述的双特异性抗原结合分子，其中所述目标抗原是肿瘤相关抗原。
7.如权利要求5或权利要求6所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域不结合表达CD63而不表达所述目标抗原的人细胞，例如只结合表达CD63与所述目标抗原的人细胞。
8.如权利要求5-7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的每一个是完全人的抗原结合结构域。
9.如权利要求5-8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子结合在细胞上表达的人CD63与人目标抗原并且诱发所述细胞中的CD63内化和/或所述人目标抗原的降解。
10.如权利要求5-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体未被表达人CD63而不表达所述人目标抗原的细胞内化。
11.如权利要求5-10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体是完全人抗体。
12.如权利要求5-11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域以低结合亲和力结合人CD63，使得所述抗体不结合仅表达人CD63的细胞，而结合于表达人CD63与所述目标抗原的细胞。
13.一种多结构域治疗蛋白，所述多结构域治疗蛋白包含如权利要求1-4中任一项所述的抗CD63抗体或其抗原结合片段和酶结构域。
14.如权利要求13所述的多结构域治疗蛋白，其中所述酶结构域包含GAA或其生物活性部分。
15.如权利要求13或权利要求14所述的多结构域治疗蛋白，所述多结构域治疗蛋白包含如SEQ ID NO:364所示的氨基酸序列。
16.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1-4中任一项所述的抗CD63抗体或其抗原结合片段、如权利要求5-12中任一项所述的双特异性抗原结合分子或如权利要求13-15中任一项所述的多结构域治疗蛋白的序列。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是编码如权利要求13-15中任一项所述的多结构域治疗蛋白的AAV载体。
18.如权利要求16或权利要求17所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列还包含如SEQID NO:365和SEQ ID NO:366所示的序列。
19.如权利要求16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列还包含肝脏特异性增强子和/或肝脏特异性启动子。
20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中所述肝脏特异性增强子包含如SEQ ID NO:367所示的序列和/或所述肝脏特异性启动子包含如SEQ ID NO:368所示的序列。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-4中任一项所述的抗CD63抗体或其抗原结合片段、如权利要求5-12中任一项所述的双特异性抗原结合分子、如权利要求13-15中任一项所述的多结构域治疗蛋白或如权利要求16-20中任一项所述的多核苷酸，和药学上可接受的载体。
22.一种化合物，所述化合物包含如权利要求1-4中任一项所述的抗CD63抗体或其抗原结合片段、如权利要求5-12中任一项所述的双特异性抗原结合分子、如权利要求13-15中任一项所述的多结构域治疗蛋白或如权利要求16-20中任一项所述的多核苷酸，所述化合物用于药物中。
23.如权利要求22所述的化合物，所述化合物用于治疗CD63相关病症。
24.如权利要求23所述的化合物，其中所述CD63相关病症选自由以下组成的组：肥大细胞(MC)依赖性疾病、类风湿性关节炎、IgE依赖性过敏反应和Fc-ER1介导的过敏反应、哮喘、癌症和/或转移。
25.如权利要求22所述的化合物，所述化合物用于鉴定和/或分离外来体。
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