BR112020023145A2 - anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína terapêutica de múltiplos domínios, polinucleotídeo composição farmacêutica, e, composto - Google Patents

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Abstract

  Anticorpos, porções e suas proteínas de fusão para CD63 são fornecidos. Também são fornecidas sequências de ácido nucleico que os codificam. Também são fornecidas composições compreendendo e seus métodos de uso, por exemplo, para o tratamento de um paciente com necessidade delas.

Description

1 / 144 ANTICORPO ANTI-CD63 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, PROTEÍNA TERAPÊUTICA DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, POLINUCLEOTÍDEO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E,
COMPOSTO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] Este pedido é geralmente dirigido a anticorpos humanos e fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos humanos que se ligam a CD63 humano e métodos de uso dos mesmos, por exemplo, em métodos de tratamento de um distúrbio em um paciente com necessidade do mesmo. O pedido também se refere a moléculas de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD63, em que a complexação da molécula de ligação ao antígeno com CD63 medeia a internalização do complexo da molécula de ligação ao antígeno/CD63. O pedido refere-se adicionalmente a conjugados compreendendo um anticorpo anti-CD63 (ou moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD63) e um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição, droga citotóxica, etc.), que os conjugados podem ser úteis no tratamento de doenças.
FUNDAMENTOS
[002] O antígeno humano CD63, também referido como glicoproteína 3 associada ao lisossoma (LAMP3), é um membro da superfamília da tetraspanina. Sua expressão celular é ubíqua e primeiramente no interior de compartimentos endossômicos ou lisossomais intracelulares, embora alguma expressão seja observada na superfície celular. O CD63 é uma proteína de internalização capaz de mediar a internalização e o transporte de alvos em compartimentos endossomais/lisossomais quando tais alvos estão fisicamente ligados ao CD63 de alguma maneira, por exemplo, através de uma proteína de ligação ao antígeno conjugada a uma carga útil ou uma
2 / 144 proteína de ligação ao antígeno bioespecífica que se liga ao alvo e CD63.
[003] Existe uma necessidade na técnica de novos anticorpos anti- CD63 humano, incluindo seus fragmentos de ligação ao antígeno monovalente, para uso em proteínas de ligação biespecíficas, capazes de se ligar ao CD63 e efetuar sua internalização.
SUMÁRIO
[004] A presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD63 humano. Os anticorpos de acordo com este aspecto da invenção são úteis, inter alia, para direcionar especificamente a internalização e/ou o tráfego lisossomal de uma proteína alvo, uma enzima (por exemplo, GAA ou GLA), um conjugado de droga, etc. Como tal, este aspecto da invenção também fornece anticorpos biespecíficos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD63 humano, construtos de fusão anticorpo-proteína (ver, por exemplo, Figura 1) e conjugados de anticorpo-droga.
[005] Os anticorpos anti-CD63 exemplares da presente invenção estão listados na Tabela 1. A Tabela 1 estabelece os identificadores de sequência de aminoácidos e ácidos nucleicos das regiões variáveis da cadeia pesada (HCVRs) e regiões variáveis da cadeia leve (LCVRs), bem como as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) dos anticorpos anti-CD63 exemplares.
[006] A presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, sendo que compreende um HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesmo.
3 / 144
[007] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma. A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um HCVR e um par de sequência de aminoácidos LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 emparelhadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos LCVR listado na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR contido em qualquer um dos anticorpos anti-CD63 exemplares listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282.
[008] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos de
4 / 144 HCDR1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[009] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0010] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0011] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma cadeia leve CDR1 (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos LCDR1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0012] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante
5 / 144 da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0013] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma cadeia leve CDR3 (LCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos LCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0014] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um HCDR3 e um par de sequência de aminoácidos LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos HCDR3 listadas na Tabela 1 emparelhadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos LCDR3 listado na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contido em qualquer um dos anticorpos anti-CD63 exemplares listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8/16, SEQ ID NOs: 24/32, SEQ ID NOs: 40/48, SEQ ID NOs: 56/64, SEQ ID NOs: 72/80, SEQ ID NOs:88/96, SEQ ID NOs: 104/112, SEQ ID NOs:120/128, SEQ ID NOs:136/144, SEQ ID NOs; 152/160, SEQ ID NOs:168/176, SEQ ID NOs: 184/192, SEQ ID NOs:200/208; SEQ ID NOs:216/224; SEQ ID NOs:232/240; SEQ ID NOs:248/256; SEQ ID NOs:264/272; SEQ ID NOs:280/288; SEQ ID NOs:296/288; SEQ ID NOs: 304/288; SEQ ID NOs: 312/288; SEQ ID NOs: 320/288; SEQ ID NOs: 328/288; SEQ ID NOs:336/288.
[0015] A presente invenção também fornece anticorpos, ou
6 / 144 fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidos em qualquer um dos anticorpos anti-CD63 exemplares listados na Tabela 1 Em certas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4-6-8-12-14-16, SEQ ID NOs: 20-22-24- 26-28-30-32, SEQ ID NOs:36-38-40-44-46-48, SEQ ID NOs:52-54-56-60- 62-64; SEQ ID NOs: 68-70-72-76-78-80; SEQ ID NOs: 84-86-88-92-94-96; SEQ ID NOs: 100-102-104-108-110-112; SEQ ID NOs: 116-118-120-124- 126-128; SEQ ID NOs:132-134-136-140-142-144; SEQ ID NOs: 148-150- 152-156-158-160; SEQ ID NOs:164-166-168-172-174-176; SEQ ID NOs:180-182-184-188-190-192; SEQ ID NOs: 196-198-200-204-206-208; SEQ ID NOs: 212-214-216-220-222-224; SEQ ID NOs: 228-230-232-236- 238-240; SEQ ID NOs: 244-246-248-252-254-256; SEQ ID NOs: 260-262- 264-268-270-272; SEQ ID NOs: 276-278-280-284-286-288; SEQ ID NOs: 292-294-296-284-286-288; SEQ ID NOs:300-302-304-284-286-288; SEQ ID NOs: 308-310-312-284-286-288; SEQ ID NOs: 316-318-320-284-286-288; SEQ ID NOs:324-326-328-284-286-288, e SEQ ID NOs:332-334-336-284- 286-288. Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR definido por qualquer um dos anticorpos anti-CD63 exemplares listados na Tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo as sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contidas dentro um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs:
7 / 144 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282. Métodos e técnicas para a identificação de CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas neste documento. Convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites dos CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat é baseada na variabilidade de sequência, a definição de Chothia é baseada na localização das regiões de loop estruturais, e a definição AbM é uma harmonização entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Os bancos de dados públicos também estão disponíveis para a identificação de sequências de CDR no interior de um anticorpo.
[0016] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-CD63 ou porções dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência
8 / 144 substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0017] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0018] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico HCDR1, listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0019] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCDR2 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0020] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido
9 / 144 nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCDR3 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0021] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR1 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0022] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR2 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0023] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR3 listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
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[0024] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam um HCVR, em que o HCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 é conforme definido por qualquer um dos exemplos anticorpos anti-CD63 listados na Tabela 1.
[0025] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam um LCVR, em que o LCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, LCDR1-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 é conforme definido por qualquer um dos exemplos anticorpos anti-CD63 listados na Tabela 1.
[0026] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam um HCVR e um LCVR, em que o HCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1, e em que o LCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma e uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma. Em certas modalidades, de acordo com este aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico codifica um HCVR e LCVR, em que o HCVR e LCVR são ambos derivados a partir do mesmo anticorpo anti-CD63 listado na Tabela 1.
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[0027] A presente invenção também fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo compreendendo uma região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD63. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, isto é, moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR e/ou CDR, conforme estabelecido na Tabela 1. Também são incluídas no escopo da presente invenção células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção de anticorpos ou porções com as mesmas por cultura das células hospedeiras sob condições que permitem a produção dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos e que recuperem os anticorpos e fragmentos de anticorpos conforme produzido.
[0028] Em alguns aspectos, a presente invenção inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como anticorpos anti- CD63, tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shields et al. (2002) JBC 277:26733), onde a citotoxicidade é desejável. Em outras aplicações, a modificação de galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo o qual se liga especificamente a CD63 e a um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti- CD63 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo
12 / 144 agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-CD63. Terapias de combinação adicionais e coformulações envolvendo os anticorpos anti-CD63 da presente invenção são divulgadas em outro lugar neste documento.
[0030] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para direcionar/matar células tumorais que expressam CD63 usando um anticorpo anti-CD63 da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD63 da invenção a um sujeito em necessidade da mesma. Em alguns casos, os anticorpos anti-CD63 (ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser modificados para serem mais citotóxicos por métodos, incluindo, mas não se limitando a, domínios Fc modificados para aumentar ADCC (ver, por exemplo, Shields, RL et al. (2002) JBC 277: 26733), radioimunoterapia, conjugados anticorpo-droga ou outros métodos para aumentar a eficiência da ablação tumoral.
[0031] A presente invenção também inclui o uso de um anticorpo anti-CD63 da invenção na fabricação de uma droga para o tratamento de uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) relacionado ou causado por células que expressam CD63. Em um aspecto, a invenção se refere a um composto que compreende um anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno, ou um anticorpo biespecífico anti-TAAxCD63, para uso em medicina. Em um aspecto, a invenção se refere a um composto que compreende um conjugado anticorpo-droga (ADC), conforme divulgado neste documento, para uso em medicina.
[0032] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece anticorpos anti- CD63 monoespecíficos para aplicações de diagnóstico, tais como, por exemplo, reagentes de imagem.
[0033] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece métodos
13 / 144 terapêuticos para aumentar a internalização de CD63 em e/ou degradação por um lisossoma usando um anticorpo anti-CD63 ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo.
[0034] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga às células que expressam CD63 com um KD maior do que 100 nM, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície ou ensaio equivalente. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga às células que expressam CD63 com um EC50 maior do que 100 nM, conforme medido por análise FACS. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga e é internalizado em lisossomas de células que expressam CD63, no caso do anticorpo também se ligar a CD63 expresso na mesma célula.
[0035] A invenção fornece adicionalmente um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação ao CD63 humano com um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR, conforme estabelecido na Tabela 1. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou antígeno fragmento de ligação que compete para ligar o CD63 humano com um anticorpo de referência que compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID
14 / 144 NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282.
[0036] A invenção fornece, além disso, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo em CD63 humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR, conforme estabelecido na Tabela 2. Em outro aspecto, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo no CD63 humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282.
[0037] A invenção fornece adicionalmente um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao CD63 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1; e os CDRs de uma região variável da cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1. Em outro aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende os CDRs da cadeia pesada e leve de um par de sequências de aminoácido HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42,
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SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282. Em ainda outro aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende os domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16, SEQ ID NOs: 20-22-24-26-28-30-32, SEQ ID NOs:36- 38-40-44-46-48, SEQ ID NOs:52-54-56-60-62-64; SEQ ID NOs: 68-70-72- 76-78-80; SEQ ID NOs: 84-86-88-92-94-96; SEQ ID NOs: 100-102-104-108- 110-112; SEQ ID NOs: 116-118-120-124-126-128; SEQ ID NOs:132-134- 136-140-142-144; SEQ ID NOs: 148-150-152-156-158-160; SEQ ID NOs:164-166-168-172-174-176; SEQ ID NOs:180-182-184-188-190-192; SEQ ID NOs: 196-198-200-204-206-208; SEQ ID NOs: 212-214-216-220- 222-224; SEQ ID NOs: 228-230-232-236-238-240; SEQ ID NOs: 244-246- 248-252-254-256; SEQ ID NOs: 260-262-264-268-270-272; SEQ ID NOs: 276-278-280-284-286-288; SEQ ID NOs: 292-294-296-284-286-288; SEQ ID NOs:300-302-304-284-286-288; SEQ ID NOs: 308-310-312-284-286-288; SEQ ID NOs: 316-318-320-284-286-288; SEQ ID NOs:324-326-328-284- 286-288 e SEQ ID NOs:332-334-336-284-286-288. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao CD63 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 298, 306, 314, 322 e 330; e (b) uma
16 / 144 região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 e 282. Em um outro aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs:290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282 e SEQ ID NOs: 330/282.
[0038] De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece conjugados anticorpo-droga compreendendo um anticorpo anti-CD63, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo o referido fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito neste documento e um agente terapêutico (por exemplo, um agente citotóxico). Em algumas modalidades, (a) o anticorpo anti-CD63, fragmento de ligação ao antígeno e/ou proteína de ligação multiespecífica e (b) o agente citotóxico são covalentemente ligado por meio de um ligante peptídico, como discutido neste documento. Em várias modalidades, o anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser qualquer um dos anticorpos ou fragmentos anti-CD63 descritos neste documento.
[0039] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é selecionado a partir de uma auristatina, um maitansinoide, uma tubulisina, uma tomaimicina, caliqueamicina ou um derivado de dolastatina. Em alguns casos, o agente citotóxico é uma auristatina selecionada de MMAE ou MMAF, ou
17 / 144 um maitansinoide selecionado de DM1 ou DM4. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide com a estrutura das Fórmulas, conforme discutido neste documento.
[0040] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide que possui a estrutura: .
[0041] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide que possui a estrutura: .
[0042] Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende uma proteína de ligação ao antígeno, incluindo uma proteína de ligação multiespecífica, compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno anti-CD63 ou porção de ligação ao antígeno da mesma, e em que é uma ligação ao anticorpo ou fragmento do mesmo.
[0043] Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende uma proteína de ligação ao antígeno, incluindo uma proteína de ligação multiespecífica, compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno
18 / 144 anti-CD63 ou porção de ligação ao antígeno da mesma, e em que é uma ligação ao anticorpo ou fragmento do mesmo.
[0044] Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga compreende uma proteína de ligação ao antígeno, incluindo uma proteína de ligação multiespecífica, compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno anti-CD63 ou porção de ligação ao antígeno da mesma, e , ou , ou uma mistura dos mesmos, em que é uma ligação ao anticorpo ou fragmento do mesmo.
[0045] Em algumas modalidades, a ligação entra em contato com o anticorpo ou fragmento do mesmo por meio de um constituinte de enxofre de
19 / 144 um resíduo de cisteína.
[0046] Em algumas modalidades, a ligação entra em contato com o anticorpo ou fragmento do mesmo através de um constituinte de nitrogênio de um resíduo de lisina.
[0047] Em qualquer uma das várias modalidades dos conjugados anticorpo-droga discutidos acima ou neste documento, o conjugado anticorpo- droga pode compreender de 1 a 10 agentes citotóxicos por proteína de ligação ao antígeno, incluindo uma proteína de ligação multiespecífica, compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno anti-CD63 ou a porção de ligação ao antígeno da mesma.
DESENHOS
[0048] A Figura 1 representa esquematicamente proteínas terapêuticas de múltiplos domínios. O painel A representa uma proteína terapêutica de múltiplos domínios que compreende um anticorpo biespecífico (ii) e uma enzima de substituição (i). O painel B representa um polipeptídeo de fusão enzima-Fc (i) associado a um meio-corpo específico do efetor de internalização (ii) para formar a proteína terapêutica de múltiplos domínios. O painel C representa uma enzima de substituição (hexágono) covalentemente ligada ao C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo efetor anti- internalização. O painel D representa uma enzima de substituição (hexágono) covalentemente ligada ao N-terminal da cadeia pesada de um anticorpo efetor anti-internalização. O painel E representa uma enzima de substituição (hexágono) covalentemente ligada ao C-terminal da cadeia leve de um anticorpo efetor anti-internalização. O painel F representa uma enzima de substituição (hexágono) ligada covalentemente ao N-terminal da cadeia leve de um anticorpo efetor anti-internalização. O painel G representa uma enzima de substituição (hexágono) covalentemente ligada ao C-terminal de um fragmento variável de cadeia única (scFv) contendo uma região VH (barra sombreada) e uma região VL (barra aberta). O painel H representa uma
20 / 144 enzima de substituição (hexágono) covalentemente ligada a dois domínios de scFv, o primeiro scFv (i) que serve como um primeiro domínio de entrega e o segundo scFv (ii) que serve como um segundo domínio de entrega. As sequências de aminoácidos VH e VL de anti-CD63 exemplares (e sequências nucleotídicas que codificam as mesmas) que podem ser usadas para construir uma proteína terapêutica de múltiplos domínios que compreende um anticorpo anti-CD63 ou porção de ligação ao antígeno da mesmo são fornecidas na Tabela 1.
[0049] A Figura 2 é uma ilustração exemplar não limitativa de um vetor de terapia gênica AAV que codifica uma proteína terapêutica de múltiplos domínios representada no painel, em que o scFv é um scFv CD63 anti-humano e a enzima de substituição é GAA (por exemplo, anti- hCD63scFv::hGAA; ver, por exemplo, a sequência de aminoácidos estabelecida conforme a SEQ ID NO: 364, em que o anti-hCD63scFv é derivado a partir do anticorpo H4H12450N. Os aminoácidos 1-117 da SEQ ID NO:364 fornecem a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo H4H12450N; os aminoácidos 118-132 da SEQ ID NO:364 fornecem uma sequência de ligante peptídico de aminoácidos entre os domínios variáveis da cadeia pesada e leve de H4H12450N; os aminoácidos 133-240 da SEQ ID NO:364 fornecem a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo H4H12450N; os aminoácidos 241-245 da SEQ ID NO:364 fornecem uma sequência de ligante peptídico de aminoácidos entre o anti- hCD63scFv e o GAA; e os aminoácidos 246-1128 de SEQ ID NO: 364 fornecem a sequência de aminoácidos da enzima de substituição GAA, ou a porção biologicamente ativa da mesma. As sequências 5'ITR e 3 'ITR exemplares são estabelecidas respectivamente como na SEQ ID NO:365 e SEQ ID NO:366. Um exemplo de potencializador específico do fígado (serpina 1) é estabelecido como na SEQ ID NO: 367. Um exemplo de
21 / 144 promotor específico do fígado (TTR) é estabelecido como na SEQ ID NO:368. Sequências de aminoácidos VH e VL de anti-CD63 exemplares adicionais (e sequências de nucleotídeos que as codificam) que podem ser usadas para construir uma proteína terapêutica de múltiplos domínios, por exemplo, para o tratamento da doença de Pompe em um paciente em necessidade da mesma, compreendendo um anticorpo anti-CD63 ou a porção de ligação ao antígeno da mesma são fornecidas na Tabela 1.
DESCRIÇÃO
[0050] São fornecidos neste documento novos anticorpos anti-CD63 humano e seus fragmentos de ligação ao antígeno monovalente, que são úteis na mediação da internalização de CD63. Os anticorpos CD63 anti-humanos e os fragmentos de ligação ao antígeno monovalente dos mesmos podem ser úteis, por exemplo, no tratamento de doenças, como parte de proteína de ligação a antígeno multiespecífica e/ou proteína terapêutica de múltiplos domínios e/ou como um conjugado de droga de anticorpo.
[0051] Esta invenção não está limitada a modalidades, composições, métodos e condições experimentais particulares descritas, visto que tais modalidades, composições, métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexas.
[0052] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência para serem descritas em sua totalidade. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente
22 / 144 entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence.
[0053] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. O termo "cerca de", quando usado em referência a um valor numérico recitado particular, significa que o valor pode variar do valor recitado em não mais do que 1%. Por exemplo, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores intermediários (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.). Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as patentes, pedidos e publicações não patentárias mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência em suas totalidades.
[0054] O “CD63” inclui uma proteína que em humanos é codificada pelo geneCD63 e tem uma sequência de aminoácidos estabelecida como na SEQ ID NO:337. O CD63 é um membro da superfamília da tetraspanina de proteínas da superfície celular que se espalham pela membrana celular quatro vezes. O CD63 é expresso em praticamente todos os tecidos e acredita-se que esteja envolvido na formação e estabilização de complexos de sinalização. O CD63 localiza-se na membrana celular, membrana lisossomal e membrana endossomal tardia. O CD63 é conhecido por se associar às integrinas e pode estar envolvido na transição epitelial-mesenquimal. Ver H. Maecker et al., "The tetraspanin superfamily: molecular facilitators", 11 (6) FASEB J. 428- 42, maio de 1997; e M. Metzelaar et al., “CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells,” 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991. O CD63 exibe atividades biológicas de um efetor de internalização. Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteínas neste
23 / 144 documento se destinam a se referir à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão "CD63" significa CD63 humano, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, "CD63 de camundongo", "CD63 de macaco", etc.
[0055] Um "efetor de internalização" inclui uma proteína que é capaz de ser internalizada em uma célula ou que, de outra forma, participa ou contribui para o tráfego retrógrado da membrana. Em alguns casos, o efetor de internalização é uma proteína que sofre transcitose; ou seja, a proteína é internalizada em um lado da célula e transportada para o outro lado da célula (por exemplo, apical-basal). Em muitas modalidades, a proteína efetora de internalização é uma proteína expressa na superfície celular ou uma proteína extracelular solúvel. No entanto, a presente invenção também contempla modalidades nas quais a proteína efetora de internalização é expressa dentro de um compartimento intracelular, como o endossoma, retículo endoplasmático, Golgi, lisossoma, etc. Por exemplo, as proteínas envolvidas no tráfego de membrana retrógrada (por exemplo, vias de endossomas precoces/de reciclagem para a rede trans-Golgi) podem servir como proteínas efetoras de internalização em várias modalidades da presente invenção. Em qualquer caso, a ligação de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo proteínas terapêuticas de múltiplos domínios e proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo as mesmas, a uma proteína efetora de internalização faz com que todo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo proteínas terapêuticas de múltiplos domínios e ligação multiespecífica proteínas compreendendo as mesmas, e quaisquer moléculas a elas associadas (por exemplo, enzima, molécula alvo, conjugado de droga), para também serem internalizadas na célula. Conforme explicado abaixo, proteínas efetoras de internalização incluem proteínas que são
24 / 144 internalizadas diretamente em uma célula, bem como proteínas que são internalizadas indiretamente em uma célula. Proteínas efetoras de internalização que são internalizadas diretamente em uma célula incluem moléculas associadas à membrana com pelo menos um domínio extracelular (por exemplo, proteínas transmembrana, proteínas ancoradas em GPI, etc.), que sofrem internalização celular e são preferencialmente processadas por meio de um degradativo intracelular e/ou via de reciclagem.
[0056] A frase "um anticorpo que se liga a CD63" ou um "anticorpo anti-CD63" inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente uma única molécula de CD63. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem se ligar ao CD63 solúvel e/ou CD63 expresso na superfície celular. O CD63 solúvel inclui proteínas CD63 naturais, bem como variantes de proteínas CD63 recombinantes que não possuem um domínio transmembranar ou não estão associadas a uma membrana celular, por exemplo, mas não se limitam a um Myc-Myc-hexahistidina C-terminal recombinante (hCD63 EC loop 2- MMH; SEQ ID NO:338) ou loop 2 extracelular de CD63 humano recombinante expressa com uma tag Fc humana do C-terminal (loop 2-hFc de hCD63 EC; SEQ ID NO:339).
[0057] A expressão "CD63 expresso na superfície celular" refere-se a uma ou mais proteína(s) CD63 que é/são expressas na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma proteína CD63 seja exposta na lateral extracelular da membrana celular e é acessível a uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. O "CD63 expresso na superfície celular" inclui proteínas CD63 contidas no contexto de um receptor funcional de células T na membrana de uma célula. Um "CD63 expresso na superfície celular" pode compreender ou consistir em uma proteína CD63 expressa na superfície de uma célula que normalmente expressa a proteína CD63. Alternativamente, "CD63 expresso na superfície
25 / 144 celular" pode compreender ou consistir em proteína CD63 expressa na superfície de uma célula que normalmente não expressa CD63 humano em sua superfície, mas foi artificialmente projetada para expressar CD63 em sua superfície.
[0058] O termo "molécula de ligação a antígeno" inclui anticorpos e fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno, incluindo, por exemplo, anticorpos biespecíficos.
[0059] O termo "avidez" refere-se à capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno para atingir um limite de engajamento do alvo a fim de atingir seu efeito desejado. A frase "ligação orientada por avidez" ou "emparelhamento orientado por avidez" no contexto de vários antígenos alvo e uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica se refere ao mecanismo de ação em que a molécula de ligação a antígeno multiespecífica fornece pelo menos dois braços de ligação monovalentes, e um primeiro braço de ligação (ou braços) se liga a um primeiro antígeno alvo com alta afinidade. Um segundo braço de ligação (ou braços) liga um segundo antígeno alvo com baixa afinidade, de modo que o segundo braço de ligação não se liga ao segundo antígeno alvo, a menos que ambos os antígenos estejam próximos um do outro, tal como presentes na mesma célula. Assim, a ligação de alta afinidade ao primeiro antígeno alvo aumenta a avidez do braço de baixa afinidade para o segundo braço de ligação e medeia a ligação ao segundo alvo (Rhoden, JJ, et al., 20 de maio de 2016, J Biol Chem. 291, 11337-11347, publicado pela primeira vez em 28 de março de 2016 doi:
10.1074/jbc.M116.714287; Jarantow, SW, et al., 9 de outubro de 2015, J Biol Chem. 290 (41): 24689-704. Doi: 10.1074/jbc.M115.651653. Epub, 10 de agosto de 2015).
[0060] O termo "anticorpo" refere-se a qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga especificamente a ou
26 / 144 interage com um antígeno particular (por exemplo, CD63). O termo "anticorpo", tal como utilizado neste documento, inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada.
A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2, e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve.
A região constante da cadeia leve compreende um domínio, CL.
As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, arranjadas desde o terminal amino até o terminal carboxil na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviados como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; os CDRs de cadeia leve podem ser abreviados como LCDR1, LCDR2 e LCDR3). O termo anticorpo de "alta afinidade" refere-se aos anticorpos que têm uma afinidade de ligação ao seu alvo de pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-10 M; pelo menos 10-11 M; ou pelo menos 10-12 M, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORETM ou ELISA de afinidade de solução.
O termo "anticorpo" pode abranger qualquer tipo de anticorpo, como, por exemplo, monoclonal ou policlonal.
Além disso, o anticorpo pode ser de qualquer origem, tal como, por exemplo, mamífero ou não mamífero.
Em uma modalidade, o anticorpo pode ser mamífero ou ave.
Em uma outra modalidade, o anticorpo pode ser de origem humana e pode ainda ser um anticorpo monoclonal humano.
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[0061] O termo "anticorpo" também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo completas. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo e semelhantes incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido enzimaticamente, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpos completas utilizando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de manipulação genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpos. Esse DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pela utilização de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para arranjar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[0062] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab') 2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas modificadas, como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio excluído, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos,
28 / 144 minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imunofármacos modulares (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão também estão incluídos na expressão "fragmento de ligação ao antígeno".
[0063] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá geralmente pelo menos uma CDR que é adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências framework. Em fragmentos de ligação ao antígeno com um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[0064] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante. As configurações exemplares não limitativas de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH- CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL- CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados através de uma região de dobradiça ou de ligante peptídico completa ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios
29 / 144 variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula polipeptídica. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uma com a outra e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) dissulfeto(s)).
[0065] Tal como acontece com as moléculas de anticorpo completo, os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpos biespecíficos exemplares divulgados neste documento, pode ser adaptado para utilização no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção utilizando técnicas de rotina disponíveis na técnica.
[0066] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar através da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo (ADCC). A "citotoxicidade dependente do complemento" (CDC) se refere à lise de células que expressam o antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento. A "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula-alvo e, assim, levar à lise da célula-alvo. A CDC e ADCC podem ser medidas utilizando ensaios que são bem conhecidos e disponíveis na
30 / 144 técnica. (Ver, por exemplo, Patentes US 5.500.362 e 5.821.337 e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 95: 652-656). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo em fixar o complemento e mediar a citotoxicidade dependente de célula. Assim, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo medeie a citotoxicidade.
[0067] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-CD63 da invenção são anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano" refere-se a anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese ao acaso ou específica por sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano" não se destina a incluir anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas a partir da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.
[0068] Os anticorpos da invenção podem, em algumas modalidades, ser anticorpos humanos recombinantes. O termo "anticorpo humano recombinante" pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito mais abaixo), anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios recombinantes (descritos mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287 - 6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer
31 / 144 outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do recombinante os anticorpos são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no interior do repertório da linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.
[0069] Os anticorpos humanos podem existir em duas formas que são associadas com a heterogeneidade da dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um construto estável de quatro cadeias de aproximadamente 150-160 kDa no qual os dímeros são mantidos juntas por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada intercadeias. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados através de ligações dissulfeto intercadeias e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composta por uma cadeia pesada e uma cadeia leve acopladas covalentemente (meio anticorpo). Essas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo depois de purificação por afinidade.
[0070] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isotipos de IgG intactos é devida a, mas não limitada a, diferenças estruturais associadas com o isotipo de região de dobradiça do anticorpo. Uma única substituição de aminoácido na região de dobradiça da dobradiça de IgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) para níveis tipicamente observados usando uma dobradiça de IgG1 humana. A presente invenção abrange anticorpos possuindo uma ou mais mutações na dobradiça, região
32 / 144 CH2ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.
[0071] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que tenha sido separado ou removido a partir de pelo menos um componente de um organismo ou de um tecido ou célula no qual o anticorpo existe naturalmente ou é produzido naturalmente é um "anticorpo isolado" para os fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou substâncias químicas.
[0072] A presente invenção também inclui anticorpos de um braço que se ligam a CD63. O termo "anticorpo de um braço" refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma única cadeia pesada de anticorpo e uma única cadeia leve de anticorpo. Os anticorpos de um braço da presente invenção podem compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1.
[0073] Os anticorpos anti-CD63 divulgados neste documento podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos no framework e/ou regiões CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada em comparação com as sequências da linhagem germinativa correspondentes das quais os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser facilmente determinadas através da comparação das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento com sequências de linhagem germinativa disponíveis a partir, por exemplo, de bases de dados públicas de sequências de anticorpos. A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos
33 / 144 de ligação ao antígeno dos mesmos, os quais são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões framework e/ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linhagem germinativa humana, ou para uma substituição de aminoácidos conservativa do(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente(s) (tais mudanças de sequência são referidas neste documento coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Uma pessoa de competência comum na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia leve e pesada divulgadas neste documento, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendam uma ou mais mutações de linhagem germinativa individuais ou combinações das mesmas.
Em certas modalidades, todos os resíduos framework e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta aos resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado.
Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados foram encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou no interior dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais resíduo(s) de framework e/ou de CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência da linhagem germinativa diferente (ou seja, uma sequência da linhagem germinativa que é diferente da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa nas regiões framework e/ou CDR, por exemplo, em que certos
34 / 144 resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa particular, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações germinativas podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou antagonistas melhoradas ou aumentadas (conforme o caso ser), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídos na presente invenção.
[0074] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD63 compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD63 com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservativas de aminoácidos relativas a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR apresentadas na Tabela 1 neste documento.
[0075] A frase “anticorpo biespecífico” inclui um anticorpo capaz de se ligar seletivamente a dois ou mais epítopos. Os anticorpos biespecíficos geralmente compreendem duas cadeias pesadas diferentes, com cada cadeia pesada se ligando especificamente a um epítopo diferente - em duas moléculas diferentes (por exemplo, antígenos) ou na mesma molécula (por exemplo, no mesmo antígeno). Se um anticorpo biespecífico capaz de se ligar seletivamente a dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada para o primeiro epítopo será
35 / 144 geralmente pelo menos uma a duas ou três ou quatro ordens de magnitude inferior a afinidade da primeira cadeia pesada para o segundo epítopo e vice- versa. Os epítopos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico podem estar no mesmo ou em um alvo diferente (por exemplo, na mesma proteína ou em uma proteína diferente). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos, por exemplo, combinando cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes do mesmo antígeno. Por exemplo, sequências de ácido nucleico que codificam sequências varieis de cadeia pesada que reconhecem diferentes epítopos do mesmo antígeno podem ser fundidas com sequências de ácido nucleico codificando diferentes regiões constantes de cadeia pesada, e essas sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas, cada uma possuindo CDRs de cadeia pesada, seguidas de (terminal N para terminal C) um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3 e uma cadeia leve de imunoglobulina que não conferem especificidade de ligação ao antígeno, mas que pode se associar com cada cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e que pode ligar um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação ao antígeno de cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia e permitem a ligação ou uma ou ambas das cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos.
[0076] A frase "cadeia pesada" ou "imunoglobulina da cadeia pesada", inclui a sequência da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina a partir de qualquer organismo, e a menos que especificado de outro modo inclui um domínio variável de cadeia pesada. Domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDR de cadeia pesada e quatro regiões FR, a menos que especificado de outra forma. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDR, CDR e FRs e combinações dos mesmos. Uma cadeia pesada típica tem, após o domínio variável (partir do terminal N para terminal C), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2 e um
36 / 144 domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um antígeno (por exemplo, reconhecer o antígeno com uma KD na faixa micromolar, nanomolar ou picomolar), que capaz de expressar e segregar a partir de uma célula e que compreende pelo menos uma CDR.
[0077] A frase “cadeia leve” Inclui uma sequência da região constante da cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo e, a menos que especificado de outro modo, inclui cadeias leves kappa e lambda humanas. Domínios variáveis de cadeia leve (VL) incluem, normalmente, três CDR de cadeia leve e quatro regiões estruturais FR, a menos que especificado de outra forma. Geralmente, uma cadeia leve de tamanho completo inclui, do terminal amino ao terminal carboxil, um domínio VL que inclui FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 e um domínio constante da cadeia leve. As cadeias leves que podem ser usadas com esta invenção incluem, por exemplo, aquelas que não se ligam seletivamente ao primeiro ou ao segundo antígeno seletivamente ligado pela proteína de ligação ao antígeno. Cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem ser identificadas por triagem das cadeias leves mais comumente utilizadas em bibliotecas de anticorpos existentes (bibliotecas molhadas ou in silico), onde as cadeias leves não interferem substancialmente com a afinidade e/ou seletividade da ligação ao antígeno domínios das proteínas de ligação ao antígeno. As cadeias leves adequadas incluem aquelas que se podem ligar a um ou ambos os epítopos que são ligados pelas regiões de ligação a antígeno da proteína de ligação a antígeno.
[0078] A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (modificada conforme desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácidos, na sequência do N-terminal ao C-terminal (a menos que indicado de outra forma): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Um “domínio variável”
37 / 144 inclui uma sequência de aminoácidos capaz de se dobrar em um domínio canônico (VH ou VL) com uma estrutura dupla de folhas beta onde as folhas beta são conectadas por uma ligação dissulfeto entre um resíduo de uma primeira folha beta e uma segunda folha beta.
[0079] A frase "região determinante de complementaridade" ou o termo "CDR" inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico dos genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal de tipo selvagem) aparece entre duas regiões de framework em uma região variável de uma cadeia leve ou pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou por uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B ou célula T madura ou não exposta. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para um CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências da linhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico não rearranjada), mas são contíguas em uma sequência de ácido nucleico de célula B, por exemplo, como o resultado de splicing ou conectar as sequências (por exemplo, recombinação VDJ para formar uma CDR3 de cadeia pesada).
[0080] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "fragmento de anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab ')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um
38 / 144 anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), que consiste em um domínio VH, (vi) um CDR isolado e (vii) um scFv, que consiste nos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacorpos, também estão abrangidas pelo termo "anticorpo" (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121- 1123).
[0081] O termo "proteína contendo Fc" inclui anticorpos, anticorpos biespecíficos, imunoadesinas e outras proteínas de ligação que compreendem pelo menos uma porção funcional de uma região CH2 e CH3 de imunoglobulina. Uma "porção funcional" refere-se a uma região CH2 e CH3 que podem se ligar a um receptor Fc (por exemplo, um FcyR; ou um FcRn, ou seja, um receptor Fc neonatal) e/ou que podem participar da ativação do complemento. Se a região CH2 e CH3 contiver exclusões, substituições e/ou inserções ou outras modificações que a tornem incapaz de se ligar a qualquer receptor Fc e também incapaz de ativar o complemento, a região CH2 e CH3 não são funcionais.
[0082] As proteínas contendo Fc podem compreender modificações nos domínios de imunoglobulina, incluindo quando as modificações afetam uma ou mais funções efetoras da proteína de ligação (por exemplo, modificações que afetam a ligação de FcyR, ligação de FcRn e, portanto, a meia-vida e/ou a atividade de CDC). Tais modificações incluem, entre outras, as seguintes modificações e combinações das mesmas, com referência à numeração EU de uma região constante de imunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359,
39 / 144 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, e 439.
[0083] Por exemplo, e não a título de limitação, a proteína de ligação é uma proteína contendo Fc e exibe meia-vida sérica aumentada (em comparação com a mesma proteína contendo Fc sem a(s) modificação(ões) citada (s)) e tem uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação em 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/SI/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação em 250 e/ou 428; ou uma modificação em 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em outro exemplo, a modificação pode compreender uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S) modificação; uma 428L, 2591 (por exemplo, V259I), e uma 308F (por exemplo, V308F) modificação; uma 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y) modificação; uma 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E) modificação; uma 250Q e 428L modificação (por exemplo, T250Q e M428L); uma 307 e/ou 308 modificação (por exemplo, 308F ou 308P).
[0084] O termo "proteína de ligação ao antígeno", tal como utilizado neste documento, refere-se a um polipeptídeo ou proteína (um ou mais polipeptídeos complexados em uma unidade funcional) que reconhece especificamente um epítopo em um antígeno, como um antígeno específico de célula e/ou um antígeno alvo da presente invenção. Uma proteína de ligação ao antígeno pode ser multiespecífica. O termo "multiespecífico" com referência a uma proteína de ligação ao antígeno significa que a proteína reconhece epítopos diferentes, seja no mesmo antígeno ou em antígenos diferentes. Uma proteína de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção pode ser um único polipeptídeo multifuncional, ou pode ser um complexo multimérico de dois ou mais polipeptídeos que estão
40 / 144 covalentemente ou não covalentemente associados um ao outro. O termo "proteína de ligação ao antígeno" inclui anticorpos ou fragmentos dos mesmos da presente invenção que podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outro) a uma ou mais outras entidades moleculares, como uma proteína ou fragmento do mesmo para produzir um biespecífico ou um molécula de ligação a antígeno multiespecífica com uma segunda especificidade de ligação.
[0085] "Proteína terapêutica de múltiplos domínios" inclui (i) uma única proteína que contém mais de um domínio funcional, (ii) uma proteína que contém mais de uma cadeia polipeptídica e (iii) uma mistura de mais de uma proteína ou mais de um polipeptídeo. O termo polipeptídeo é geralmente considerado como significando uma única cadeia de aminoácidos ligados entre si por meio de ligações peptídicas. O termo proteína abrange o termo polipeptídeo, mas também inclui estruturas mais complexas. Ou seja, um único polipeptídeo é uma proteína, e uma proteína pode conter um ou mais polipeptídeos associados em uma estrutura de ordem superior. Por exemplo, a hemoglobina é uma proteína contendo quatro polipeptídeos: dois polipeptídeos de alfa globina e dois polipeptídeos de beta globina. A mioglobina também é uma proteína, mas contém apenas um único polipeptídeo de mioglobina.
[0086] A proteína terapêutica de múltiplos domínios compreende um ou mais polipeptídeo(s) e pelo menos dois domínios fornecendo duas funções. Um desses domínios é o “domínio enzimático”, que fornece a substituição de uma atividade proteica defeituosa associada a uma doença por deficiência enzimática. O outro desses domínios é o "domínio de entrega" que fornece ligação a um efetor de internalização, por exemplo, CD63, tal como um
41 / 144 anticorpo anti-CD63 como divulgado neste documento ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Assim, um único polipeptídeo que fornece uma atividade de substituição de enzima e a capacidade de se ligar a um efetor de internalização (também conhecido como proteína de ligação de efetor de internalização (atividade de domínio de entrega) é uma proteína terapêutica de múltiplos domínios. Além disso, uma mistura de proteínas, em que uma proteína fornece a função de enzima e outra proteína fornece a atividade de ligação do efetor de internalização, é uma proteína terapêutica de múltiplos domínios
[0087] O termo "proteína" denota todo polímero de aminoácidos com mais de cerca de 20 aminoácidos ligados covalentemente através de ligações de amido. As proteínas contêm uma ou mais cadeias poliméricas de aminoácidos, geralmente conhecidas na técnica como "polipeptídeos". Assim, um polipeptídeo pode ser uma proteína e uma proteína pode conter vários polipeptídeos para formar uma única biomolécula funcional. Pontes de dissulfeto (isto é, entre resíduos de cisteína para formar cistina) podem estar presentes em algumas proteínas. Essas ligações covalentes podem estar dentro de uma única cadeia polipeptídica, ou entre duas cadeias polipeptídicas individuais. Por exemplo, as pontes de dissulfeto são essenciais para a estrutura e função adequadas da insulina, imunoglobulinas, protamina e semelhantes. Para uma revisão recente da formação de ligações dissulfeto, veja Oka and Bulleid, “Forming disulfides in the endoplasmic reticulum,” 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013).
[0088] Tal como utilizado neste documento, "proteína" inclui proteínas bioterapêuticas, proteínas recombinantes usadas em pesquisa ou terapia, proteínas de armadilha e outras proteínas de fusão Fc, proteínas quiméricas, anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos biespecíficos, fragmentos de anticorpos, nanocorpos, quimeras de anticorpos recombinantes, proteínas de fusão scFv, citocinas, quimiocinas,
42 / 144 hormônios peptídicos e semelhantes. As proteínas podem ser produzidas usando sistemas de produção baseados em células recombinantes, como o sistema de bacculovírus de inseto, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.), Sistemas de mamíferos (por exemplo, células CHO e derivados de CHO como células CHO-K1). Para uma revisão recente que discute as proteínas bioterapêuticas e sua produção, consulte Ghaderi et al., “Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non- human sialylation,” 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012).
[0089] Tal como utilizado neste documento, o termo "epítopo" refere- se à porção do antígeno que é reconhecida pelo polipeptídeo de ligação ao antígeno multiespecífico. Um único antígeno (como um polipeptídeo antigênico) pode ter mais de um epítopo. Os epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto de epítopos estruturais e são definidos como aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação entre o polipeptídeo de ligação ao antígeno e o antígeno. Os epítopos podem também ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não lineares. Em certas modalidades, o epítopo pode incluir determinantes que são agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em certas modalidades, podem ter três características estruturais dimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por um dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes.
[0090] O termo "domínio" refere-se a qualquer parte de uma proteína ou polipeptídeo tendo uma função ou estrutura particular. De preferência, os domínios da presente invenção ligam-se a antígenos específicos de células ou
43 / 144 alvo. Antígeno específico da célula ou domínios de ligação ao antígeno alvo e semelhantes, como utilizado neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido enzimaticamente, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno.
[0091] O termo "meio corpo" ou "semianticorpo", que é usado indistintamente, refere-se a metade de um anticorpo, que contém essencialmente uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As cadeias pesadas de anticorpos podem formar dímeros, portanto, a cadeia pesada de um meio corpo pode se associar com a cadeia pesada associada a uma molécula diferente (por exemplo, outro meio corpo) ou outro polipeptídeo contendo Fc. Dois domínios Fc ligeiramente diferentes podem "heterodimerizar" como na formação de anticorpos biespecíficos ou outros heterodímeros, trímeros, tetrâmeros e semelhantes. Consulte Vincent e Murini, “Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and. pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates,” 7 Biotechnol. J. 1444- 1450 (20912); and Shimamoto et al., “Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies,” 4(5) MAbs 586-91 (2012).
[0092] Em uma modalidade, o domínio variável de meio corpo reconhece especificamente o efetor de internalização e o domínio Fc de meio corpo se dimeriza com uma proteína de fusão Fc que compreende uma enzima de substituição (por exemplo, um pepticorpo) Id, 586.
[0093] O termo "fragmento variável de cadeia única" ou "scFv" inclui um polipeptídeo de fusão de cadeia única contendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL). Em algumas modalidades, o VH e VL são conectados por uma sequência de ligante peptídico de 10 a 25 aminoácidos. Os polipeptídeos ScFv também podem incluir outras sequências de aminoácidos, como as regiões CL ou CH1. As moléculas de ScFv podem ser fabricadas por exibição de fago ou feitas por subclonagem direta das cadeias
44 / 144 pesadas e leves de um hibridoma ou célula B. Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology, volume 2012, artigo ID 98025 é incorporado neste documento por referência para métodos de produção de fragmentos scFv por exibição de fago e clonagem de domínio de anticorpo. Moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno
[0094] Os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti- CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais do que um polipeptídeo alvo. Ver, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti- CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda ou especificidade de ligação adicional.
[0095] O uso da expressão "anticorpo anti-CD63" neste documento se destina a incluir anticorpos anti-CD63 monoespecíficos, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um braço de ligação a CD63 e um braço de ligação ao "alvo". Assim, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos
45 / 144 em que um braço de uma imunoglobulina se liga ao CD63 humano e o outro braço da imunoglobulina é específico para outra molécula alvo. O braço de ligação ao CD63 pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1 neste documento.
[0096] Em certas modalidades, o braço de ligação ao CD63 se liga ao CD63 humano e induz a internalização do CD63 e do anticorpo ligado a ele. Em certas modalidades, o braço de ligação ao CD63 se liga fracamente ao CD63 humano e induz a internalização de CD63 e o anticorpo ligado a ele. Em outras modalidades, o braço de ligação a CD63 se liga fracamente ao CD63 humano e induz a morte celular de expressão de antígeno associado ao tumor no contexto de um anticorpo biespecífico ou multiespecífico, por exemplo, compreendendo um braço de ligação a CD63 e um braço de ligação a "alvo", onde o braço de ligação ao "alvo" é um antígeno associado a tumor (TAA). Exemplos não limitativos de antígenos associados aos tumores específicos incluem, por exemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, β-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anidrase carbônica IX, caspase-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por exemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glypican-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por exemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6, e -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP- 1, TRP-2, tirosinase e uroplakin-3. Em outras modalidades, o braço de ligação ao CD63 se liga ou se associa fracamente com CD63 humano e de cynomolgus (macaco), mas a interação de ligação não é detectável por ensaios
46 / 144 in vitro conhecidos na técnica.
[0097] Em certas modalidades exemplares da presente invenção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífico é um anticorpo biespecífico. Cada domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico compreende um domínio variável da cadeia pesada (HCVR) e um domínio variável da cadeia leve (LCVR). No contexto de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico compreendendo um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo biespecífico), os CDRs do primeiro domínio de ligação ao antígeno podem ser designados com o prefixo "A1" e os CDRs de o segundo domínio de ligação ao antígeno pode ser designado com o prefixo "A2". Assim, os CDRs do primeiro domínio de ligação ao antígeno podem ser referidos neste documento como A1-HCDR1, A1-HCDR2 e A1-HCDR3; e os CDRs do segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser referidos neste documento como A2-HCDR1, A2- HCDR2 e A2-HCDR3.
[0098] O primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser direta ou indiretamente conectados um ao outro para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção. Alternativamente, o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem, cada um, ser conectados a um domínio de multimerização separado. A associação de um domínio de multimerização com outro domínio de multimerização facilita a associação entre os dois domínios de ligação ao antígeno, formando assim uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Um "domínio de multimerização" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tem a capacidade de se associar a um segundo domínio de multimerização da mesma estrutura ou constituição ou semelhante. Por exemplo, um domínio de multimerização pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não
47 / 144 limitativo de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina (compreendendo um domínio CH2-CH3), por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada a partir dos isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como qualquer alótipo dentro de cada grupo de isotipos.
[0099] As moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção compreenderão tipicamente dois domínios de multimerização, por exemplo, dois domínios Fc que são cada um individualmente parte de uma cadeia pesada de anticorpo separada. O primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser do mesmo isotipo IgG como, por exemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativamente, o primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser de diferentes isotipos de IgG, tais como, por exemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.
[00100] Em certas modalidades, o domínio de multimerização é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em outras modalidades, o domínio de multimerização é um resíduo de cisteína, ou um peptídeo contendo cisteína curta. Outros domínios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo por um zipper de leucina, um motivo de hélice-loop, ou um motivo de espiral enrolada.
[00101] Qualquer formato ou tecnologia de anticorpo biespecífico pode ser usado para fazer as moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo uma especificidade de ligação ao primeiro antígeno pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um segunda especificidade de ligação ao antígeno para produzir uma molécula de ligação biespecífica ao antígeno. Formatos biespecíficos exemplares específicos que
48 / 144 podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos baseados em scFv ou diacorpo, fusões IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, knobs-into-holes, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com knobs-into-holes, etc.), CrossMab, CrossFab, corpo (SEED), zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de dupla ação (DAF)-IgG, e formatos biespecíficos de Mab2 (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 e referências aí citadas, para uma revisão dos formatos anteriores).
[00102] No contexto das moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção, os domínios de multimerização, por exemplo, domínios Fc, podem compreender uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, inserções, deleções ou substituições) em comparação com o tipo selvagem, de ocorrência natural versão do domínio Fc. Por exemplo, a invenção inclui moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno compreendendo uma ou mais modificações no domínio Fc que resulta em um domínio Fc modificado com uma interação de ligação modificada (por exemplo, aumentada ou diminuída) entre Fc e FcRn. Em uma modalidade, a molécula de ligação biespecífica ao antígeno compreende uma modificação em uma região CH2ou CH3, em que a modificação aumenta a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por
49 / 144 exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[00103] A presente invenção também inclui moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno compreendendo um primeiro domínio CH3 e um segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e o segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácidos reduz ligação do anticorpo biespecífico à proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácidos. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou suprime a ligação à Proteína A, tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 pode compreender adicionalmente uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Ver, por exemplo, Patente US N°. 8.586.713. Modificações adicionais que podem ser encontradas no segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG4.
[00104] Em certas modalidades, o domínio Fc pode ser quimérico, combinando sequências de Fc derivadas de mais do que um isotipo de imunoglobulinas. Por exemplo, um domínio Fc quimérico pode compreender parte ou a totalidade de uma sequência CH2 derivada de uma região CH2 de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, e parte ou a totalidade de uma sequência CH3 derivada de uma IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4
50 / 144 humana. Um domínio Fc quimérico pode também conter uma região de braçadeira quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de "dobradiça superior", derivada de uma IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma região de dobradiça de IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior", derivada de uma IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma região de dobradiça de IgG4 humana. Um exemplo particular de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno estabelecidas neste documento compreende, de terminal N ao C: [IgG4 CH1] - [IgG4 dobradiça superior] - [IgG2 dobradiça inferior] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Outro exemplo de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno estabelecidas neste documento compreende, do terminal N ao C: [IgG1 CH1] - [IgG1 dobradiça superior] - [IgG2 dobradiça inferior] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Estes e outros exemplos de domínios Fc quiméricos que podem ser incluídos em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são descritos na Publicação US 2014/0243504, publicada em 28 de agosto de 2014, que é incorporada neste documento em sua totalidade. Os domínios Fc quiméricos com estes arranjos estruturais gerais, e suas variantes, podem ter a ligação ao receptor Fc alterada, que por sua vez afeta a função efetora de Fc.
[00105] Em certas modalidades, a invenção fornece uma cadeia pesada de anticorpo em que a região da região constante da cadeia pesada (CH) compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350 ou SEQ ID NO:
351. Em algumas modalidades, a região da região constante da cadeia pesada (CH) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo
51 / 144 consistindo em SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350 ou SEQ ID NO: 351.
[00106] Em outras modalidades, a invenção fornece uma cadeia pesada de anticorpo em que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 362 ou SEQ ID NO: 363. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 362 ou SEQ ID NO: 363. Proteínas Terapêuticas de Multidomínio
[00107] A Figura 1 representa vários exemplos de proteínas terapêuticas de multidomínios. Em um exemplo (Figura 1, painel A), a proteína terapêutica de multidomínios contém uma enzima (representada pelo hexágono) e um anticorpo biespecífico (o IE-BP) que se liga à enzima (linhas hachuradas) e um efetor de internalização (linhas sólidas). Neste documento, um braço do anticorpo biespecífico se liga de forma não covalente à enzima e o outro braço se liga de forma não covalente ao efetor de internalização, permitindo assim a internalização da enzima de substituição na célula ou compartimento subcelular. Em outro exemplo (painel B), a proteína terapêutica de multidomínios compreende uma única proteína contendo dois polipeptídeos, um polipeptídeo tendo função de enzima e o outro tendo função de domínio de distribuição. Neste documento, a enzima é fundida a
52 / 144 um domínio Fc de imunoglobulina ou região constante de cadeia pesada, que se associa ao domínio Fc do semianticorpo da enzima para formar a proteína terapêutica de multidomínio bifuncional. A modalidade representada no painel B é semelhante à do painel A, exceto que a enzima é covalentemente ligada a um dos semianticorpos, em vez de por meio da interação antígeno- anticorpo no domínio variável de imunoglobulina do semianticorpo.
[00108] Em outros exemplos, a proteína terapêutica de múltiplos domínios consiste na enzima ligada covalentemente (direta ou indiretamente através de um ligante peptídico) ao domínio de distribuição. Em uma modalidade, a enzima é ligada ao terminal C de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, a cadeia pesada ou, alternativamente, a cadeia leve). Em outra modalidade, a enzima é ligada ao terminal N da molécula de imunoglobulina (por exemplo, a cadeia pesada ou, alternativamente, a cadeia leve). Nestes exemplos, a molécula de imunoglobulina é o domínio de distribuição. Em ainda outra modalidade, a enzima é ligada ao terminal C de uma molécula de scFv que se liga ao efetor de internalização.
[00109] Em uma modalidade, a proteína terapêutica de múltiplos domínios compreende dois domínios de distribuição. Em uma modalidade, o primeiro domínio de entrega se liga a uma molécula de tráfego lisossomal ou outro efetor de internalização (por exemplo, CD63). Em outra modalidade, o segundo domínio de distribuição se liga a um efetor de transcitose para facilitar o transporte transcelular da proteína terapêutica de multidomínios. Em uma modalidade, o efetor da transcitose é, inter alia, um receptor de LDL, um receptor de IgA, um receptor de transferrina ou um receptor Fc neonatal (FcRn). Em uma modalidade específica, o domínio de distribuição de transcitose compreende uma molécula que se liga a um receptor de transferrina, tal como por exemplo, um anticorpo anti-receptor de transferrina ou uma molécula scFv de receptor anti-transferrina. Tuma e Hubbard, “Transcytosis: Crossing Cellular Barriers,” Physiological Reviews, 83(3):
53 / 144 871-935 (1 de julho de 2003) é incorporado neste documento por referência para receptores de superfície celular que medeiam a transcitose que são úteis na prática da presente invenção.
[00110] “Domínio de enzima” ou “enzima” denota qualquer proteína associada à etiologia ou efeito fisiológico de uma doença por deficiência de enzima. Uma enzima inclui a enzima, a proteína de transporte, o receptor ou outra proteína real que está defeituosa e que é atribuída como a lesão molecular que causou a doença. Uma enzima também inclui qualquer proteína que pode fornecer uma atividade bioquímica ou fisiológica semelhante ou suficiente que substitui ou contorna a lesão molecular da doença. Por exemplo, uma "isozima" pode ser usada como uma enzima.
[00111] Em algumas modalidades, a enzima é uma hidrolase, incluindo esterases, glicosilases, hidrolases que atuam em ligações éter, peptidases, amidases lineares, difosfatases, cetona hidrolases, halogenases, fosfoamidases, sulfo-hidrolases, sulfinases, dessulfinases e semelhantes. Em algumas modalidades, a enzima é uma glicosilase, incluindo glicosidases e N- glicosilases. Em algumas modalidades, a enzima é uma glicosidase, incluindo alfa-amilase, beta-amilase, glucano 1,4-alfa-glucosidase, celulose, endo- 1,3(4)-beta-glucanase, inulinase, endo-1,4 -beta-xilanase, endo-1,4-b- xilanase, dextranase, quitinase, poligalacturonidase, lisozima, exo-alfa- sialidase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, alfa-manosidase, beta-manosidase, beta-frutofuranosidase, alfa, alfa-trealose, beta-glucuronidase, xilano endo-1,3-beta-xilosidase, amilo-alfa- 1,6-glucosidase, hialuronoglucosaminidase, hialuronoglucuronidase e semelhantes.
[00112] No caso da doença de Pompe, em que o defeito molecular é um defeito na atividade da α-glucosidase, as enzimas incluem alfa- glucosidase humana (GAA) e "isoenzimas", como outras alfa-glucosidases, alfa-glucosidase recombinante projetada, outras glucosidases, glucosidases
54 / 144 recombinantes, qualquer proteína projetada para hidrolisar um resíduo terminal não redutor de alfa-glicose 1-4 ligado para liberar uma única molécula de alfa-glicose, qualquer enzima EC 3.2.1.20, hidrolases de carboidratos de baixo pH naturais ou recombinantes para glicogênio ou amidos, e glucosil hidrolases tais como sacarase isomaltase, maltase glucoamilase, glucosidase II e alfa-glucosidase neutra. Um vetor de terapia gênica exemplar Mutações da linhagem germinativa
[00113] Os anticorpos anti-CD63 divulgados neste documento podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada em comparação com as sequências da linhagem germinativa correspondentes das quais os anticorpos foram derivados.
[00114] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou CDR são mutados para o (s) resíduo (s) correspondente (s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou para o (s) resíduo (s) correspondente (s) de outra sequência de linhagem germinativa humana, ou para uma substituição de aminoácido conservadora do (s) resíduo (s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas neste documento coletivamente como "mutações da linhagem germinativa") e tendo ligação fraca ou nenhuma ligação detectável a um antígeno CD63. Vários desses anticorpos exemplares que reconhecem CD63 são descritos na Tabela 1 neste documento.
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[00115] Além disso, os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro do framework e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma determinada sequência da linhagem germinativa, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como, especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação fraca ou reduzida, propriedades farmacocinéticas melhoradas ou aumentadas, imunogenicidade reduzida, etc. e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral, dada a orientação da presente divulgação, estão incluídos na presente invenção.
[00116] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) compreendendo variantes de qualquer um dos HCVR, LCVR e/ou sequências de aminoácidos CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos)
56 / 144 tendo sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservadoras de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR estabelecidas na Tabela 1 neste documento.
Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios da presente invenção podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções no framework e/ou regiões CDR do pesado e leve domínios variáveis de cadeia em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes a partir das quais os domínios de ligação ao antígeno individuais foram derivados, enquanto mantém ou melhora a ligação detectável fraca a nenhuma desejada ao, por exemplo, CD63. Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácidos não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína, isto é, a substituição de aminoácidos mantém ou melhora a afinidade de ligação fraca a nenhuma detectável desejada no caso de moléculas de ligação anti-CD63. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais hidroxilas alifáticas: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina.
Grupos de aminoácidos de substituição conservativa são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina,
57 / 144 glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança com um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança com um valor não negativo na matriz de probabilidade logarítmica PAM250.
[00117] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com um HCVR e/ou sequência de aminoácidos de CDR que é substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou CDR divulgadas neste documento, enquanto mantém ou melhora a afinidade fraca desejada para o antígeno CD63. O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando se refere a uma sequência de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem em substituições de aminoácidos conservativas. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos dos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
[00118] A semelhança de sequência para polipeptídeos, que também é
58 / 144 referida como identidade de sequência, é tipicamente medida utilizando software de análise de sequência. O software de análise de proteína faz correspondências entre sequências semelhantes utilizando medidas de semelhança atribuída a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como Gap e Bestfit que podem ser utilizados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas utilizando FASTA utilizando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade sequencial percentual das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial ao se comparar uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, utilizando os parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
[00119] Uma vez obtidos, os domínios de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa foram testados quanto à diminuição da afinidade de ligação utilizando um ou mais ensaios in vitro. Embora os anticorpos que reconhecem um determinado antígeno sejam tipicamente rastreados para seu propósito por meio de testes de afinidade de ligação alta (isto é, forte) para o antígeno, os anticorpos da presente invenção exibem ligação fraca ou nenhuma ligação detectável. Moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno compreendendo um ou mais domínios de ligação a
59 / 144 antígeno obtidos desta maneira geral também estão incluídas na presente invenção e foram consideradas vantajosas como terapias de tumor induzidas por avidez.
[00120] Benefícios inesperados, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas e baixa toxicidade para o paciente podem ser realizados a partir da modificação adicional dos anticorpos da invenção pelos métodos descritos neste documento. Propriedades de ligação dos anticorpos
[00121] O termo "ligação" no contexto da ligação de um anticorpo, imunoglobulina, fragmento de ligação ao anticorpo ou proteína contendo Fc a qualquer um, por exemplo, um antígeno predeterminado, tal como uma proteína da superfície celular ou seu fragmento, normalmente se refere a um interação ou associação entre um mínimo de duas entidades ou estruturas moleculares, como uma interação anticorpo-antígeno.
[00122] Por exemplo, a afinidade de ligação normalmente corresponde a um valor KD de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos quando determinado por, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície (Tecnologia SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo, Ig, fragmento de ligação ao anticorpo ou proteína contendo Fc como analito (ou antiligante). Estratégias de ligação baseadas em células, tais como ensaios de ligação de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), também são rotineiramente usadas e fornecem dados de caracterização de ligação em relação a proteínas expressas na superfície celular. Os dados FACS correlacionam-se bem com outros métodos, tais como ligação de competição de radioligando e SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).
[00123] Por conseguinte, os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de
60 / 144 ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da invenção se ligam ao antígeno predeterminado ou molécula de superfície celular (receptor) tendo uma afinidade correspondente a um valor KD que é pelo menos dez vezes menor do que sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). De acordo com a presente invenção, a afinidade de um anticorpo correspondente a um valor KD que é igual ou inferior a dez vezes menor do que um antígeno não específico pode ser considerada ligação não detectável, no entanto, tal anticorpo pode ser emparelhado com um segundo braço de ligação ao antígeno para a produção de um anticorpo biespecífico da invenção.
[00124] O termo "KD" ou "KD" em molar (M) refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante de equilíbrio de dissociação de um anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo a um antígeno. Existe uma relação inversa entre KD e afinidade de ligação, portanto, quanto menor o valor de KD, quanto maior, ou seja, mais forte, a afinidade. Assim, os termos "afinidade mais alta" ou "afinidade mais forte" se referem a uma capacidade mais alta de formar uma interação e, portanto, um valor KD menor e, inversamente, os termos "afinidade mais baixa" ou "afinidade mais fraca" se referem a uma capacidade mais baixa de formar interação e, portanto, um valor de KD maior. Em algumas circunstâncias, uma maior afinidade de ligação (ou KD) de uma molécula particular (por exemplo , anticorpo) para sua molécula parceira interativa (por exemplo, antígeno X) em comparação com a afinidade de ligação da molécula (por exemplo , anticorpo) para outra molécula parceira interativa (por exemplo , antígeno Y) pode ser expresso como uma razão de ligação determinada dividindo o maior valor de KD (menor ou mais fraca afinidade) pelo menor KD (maior ou mais forte afinidade), por exemplo
61 / 144 expresso como ligação 5 vezes ou 10 vezes maior afinidade, conforme o caso.
[00125] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico da invenção, ou seu conjugado, se liga a uma molécula alvo com uma afinidade de ligação (valor KD) maior do que 10 vezes sua afinidade de ligação para CD63. Como tal, a molécula biespecífica tem uma afinidade de ligação muito mais forte para a molécula alvo do que sua afinidade de ligação para CD63. Em alguns casos, a afinidade de ligação é medida por um ensaio de ressonância de plasma de superfície a 37 °C ou ensaio equivalente.
[00126] O termo "kd"; (sec -1 ou 1/s) refere-se à constante de taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante de taxa de dissociação de um anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo. O referido valor é também referido como valor koff.
[00127] O termo "ka" (M-1 x sec-1 ou 1/M) refere-se à constante de taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante de taxa de associação de um anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo.
[00128] O termo "KA"; (M-1 ou 1/M) refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular ou à constante de equilíbrio de associação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao anticorpo. A constante de equilíbrio de associação é obtida dividindo a ka por kd.
[00129] O termo "EC50" ou “EC50” refere-se à metade da concentração efetiva máxima, que inclui a concentração de um anticorpo que induz uma resposta a meio caminho entre a linhagem de base e o máximo após um tempo de exposição especificado. A EC50 essencialmente representa a concentração de um anticorpo onde é observado 50% do seu efeito máximo. Em certas modalidades, o valor de EC50 é igual à concentração de um anticorpo da invenção que dá meia ligação máxima a células que expressam CD63 ou
62 / 144 antígeno associado a tumor, conforme determinado por, por exemplo, um ensaio de ligação FACS. Assim, a ligação reduzida ou mais fraca é observada com um EC50 aumentado, ou metade do valor máximo da concentração eficaz.
[00130] Em uma modalidade, a ligação diminuída pode ser definida como uma concentração aumentada de anticorpo EC50 que permite a ligação à metade da quantidade máxima de células alvo. Variantes de Sequência
[00131] Os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti- CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções nas regiões de framework e/ou CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve em comparação com as sequências da linhagem germinativa correspondentes das quais os domínios de ligação ao antígeno individuais foram derivados. Tais mutações podem ser facilmente determinadas através da comparação das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento com sequências de linhagem germinativa disponíveis a partir, por exemplo, de bases de dados públicas de sequências de anticorpos. As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem compreender domínios de ligação ao antígeno que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos exemplares divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões framework e/ou CDR são mutadas para os resíduos correspondentes da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou ao (s) resíduo (s) correspondente (s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou a uma substituição conservativa de aminoácidos do (s) resíduo (s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas neste documento coletivamente como "mutações da linhagem
63 / 144 germinativa"). Uma pessoa de competência comum na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia leve e pesada divulgadas neste documento, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendam uma ou mais mutações de linhagem germinativa individuais ou combinações das mesmas.
Em certas modalidades, todos os resíduos de framework e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado.
Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados foram encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais resíduo(s) de framework e/ou de CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência da linhagem germinativa diferente (ou seja, uma sequência da linhagem germinativa que é diferente da sequência da linhagem germinativa do qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado). Além disso, os domínios de ligação ao antígeno podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro do framework e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência particular da linhagem germinativa, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original é mantida ou sofre mutação no resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente.
Uma vez obtidos, os domínios de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou
64 / 144 antagonistas melhoradas ou aumentadas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno compreendendo um ou mais domínios de ligação a antígeno obtidos desta maneira geral são abrangidas pela presente invenção.
[00132] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno em que um ou ambos os domínios de ligação ao antígeno compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc., substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas nestes documento. Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácidos conservativa não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais hidroxilas alifáticas: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de aminoácidos de substituição conservativa são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
65 / 144 Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança com um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, neste documento incorporado por referência. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança com um valor não negativo na matriz de probabilidade logarítmica PAM250.
[00133] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma sequência de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR que é substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento. O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando se refere a uma sequência de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem em substituições de aminoácidos conservativas. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos dos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, neste documento incorporado por referência.
[00134] A semelhança de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida utilizando software de análise de sequência. O software de análise de proteína faz correspondências entre sequências semelhantes utilizando medidas de
66 / 144 semelhança atribuída a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como Gap e Bestfit que podem ser utilizados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas utilizando FASTA utilizando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade sequencial percentual das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial ao se comparar uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, utilizando os parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, cada um incorporado por referência neste documento. Ligação Dependente de pH
[00135] A presente invenção inclui anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) com características de ligação dependentes do pH. Por exemplo, um anticorpo anti-CD63 da presente invenção pode exibir ligação reduzida ao CD63 em pH ácido em comparação com pH neutro. Alternativamente, os anticorpos anti-CD63 da invenção podem exibir ligação aumentada ao CD63 em pH ácido em comparação com pH neutro. A expressão "pH ácido" inclui
67 / 144 valores de pH inferiores a cerca de 6,2, por exemplo, cerca de 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 ou menos. A expressão "pH neutro" significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de cerca de 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 e 7,4.
[00136] Em certos casos, "ligação reduzida... em pH ácido em comparação com pH neutro" é expressa em termos de uma razão do valor KD da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH ácido para o valor KD da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH neutro (ou vice-versa). Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser considerado como exibindo "ligação reduzida a CD63 em pH ácido em comparação com pH neutro" para os fins da presente invenção se o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibir uma razão de KD ácido/neutro de cerca de 3,0 ou superior. Em certas modalidades exemplares, a razão KD ácida/neutra para um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser cerca de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ou superior.
[00137] Os anticorpos com características de ligação dependentes do pH podem ser obtidos, por exemplo, por triagem de uma população de anticorpos para ligação reduzida (ou aumentada) a um antígeno particular em pH ácido em comparação com pH neutro. Além disso, as modificações do domínio de ligação ao antígeno no nível do aminoácido podem produzir anticorpos com características dependentes do pH. Por exemplo, substituindo- se um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, dentro de uma CDR) por um resíduo de histidina, um anticorpo com ligação ao antígeno reduzida em pH ácido em relação ao pH neutro pode ser obtido.
68 / 144 Anticorpos Compreendendo Variantes Fc
[00138] De acordo com certas modalidades da presente invenção, anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de múltiplos domínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) são fornecidos compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que aumentam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos que compreendem uma mutação no CH2 ou uma região CH3 do domínio Fc, em que a (s) mutação (ões) aumenta (m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[00139] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD63
69 / 144 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações do domínio Fc anteriores e outras mutações nos domínios variáveis do anticorpo divulgados neste documento, estão contempladas no âmbito da presente invenção. Características biológicas dos anticorpos e moléculas de ligação a antígenos biespecíficos
[00140] A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD63 humano com afinidade alta, média ou baixa, dependendo do contexto terapêutico e propriedades de direcionamento particulares que são desejadas. Por exemplo, no contexto de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico, em que um braço se liga a CD63 e outro braço se liga a um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno associado a tumor), pode ser desejável que o braço de ligação ao antígeno alvo se ligue ao alvo antígeno com alta afinidade, enquanto o braço anti- CD63 se liga ao CD63 com afinidade apenas moderada ou baixa. Desta forma, o direcionamento preferencial da molécula de ligação ao antígeno para células que expressam o antígeno alvo pode ser alcançado, evitando a ligação de CD63 geral/não direcionada e os consequentes efeitos colaterais adversos associados a ela.
[00141] A presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e seus anticorpos biespecíficos que se ligam ao CD63 humano com afinidade fraca (isto é, baixa) ou mesmo nenhuma afinidade detectável.
70 / 144 De acordo com certas modalidades, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam ao CD63 humano (por exemplo, a 37ºC) com um KD maior do que cerca de 100 nM conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção ligam CD63 com um KD maior que cerca de maior que cerca de 110 nM, pelo menos 120 nM, maior que cerca de 130 nM, maior que cerca de 140 nM, maior que cerca de 150 nM, pelo menos 160 nM, maior do que cerca de 170 nM, maior do que cerca de 180 nM, maior do que cerca de 190 nM, maior do que cerca de 200 nM, maior do que cerca de 250 nM, maior do que cerca de 300 nM, maior do que cerca de 400 nM, maior do que cerca de 500 nM, maior do que cerca de 600 nM, maior do que cerca de 700 nM, maior do que cerca de 800 nM, maior do que cerca de 900 nM ou maior do que cerca de 1 µM, ou sem afinidade detectável, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, formato de captura de mAb ou de captura de antígeno), ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00142] A presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e seus anticorpos biespecíficos que se ligam ao CD63 de macaco (ou seja, cynomolgus) com fraca (isto é, baixa) ou mesmo nenhuma afinidade detectável. Mapeamento do Epítopo e Tecnologias Relacionadas
[00143] O epítopo em CD63 ao qual os anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) da presente invenção se ligam, pode consistir em um único contíguo sequência de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos de um Proteína CD63. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma
71 / 144 pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) de CD63. O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais do que um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.
[00144] Várias técnicas conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para determinar se um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), alanine scanning mutational analysis, peptide blots analysis (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443- 463), e análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos tais como a excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo interage é a troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a marcação da proteína de interesse com deutério, seguida pela ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/anticorpo é transferido para água para permitir que a troca
72 / 144 hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto nos resíduos protegidos pelo anticorpo (que continuam marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e análise por espectrometria de massas, revelando, desse modo, os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A- 265A. A cristalografia de raios X do complexo antígeno/anticorpo também pode ser usada para fins de mapeamento de epítopos.
[00145] A presente invenção inclui ainda anticorpos anti-CD63 que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1 neste documento). Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticorpos anti-CD63 que competem pela ligação ao CD63 com qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1 neste documento).
[00146] Pode-se facilmente determinar se uma determinada molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo ou compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência da presente invenção, usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo em CD63 como uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno de referência da presente invenção, a molécula biespecífica de referência é primeiro permitida a se ligar a uma proteína CD63. Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à molécula de CD63 é avaliada. Se o anticorpo de teste for capaz de
73 / 144 se ligar ao CD63 após a ligação de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência, pode-se concluir que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente de CD63 do que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência.
Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula de CD63 após a ligação de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência, o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo de CD63 como o epítopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência da invenção.
Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) pode então ser realizada para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epítopo que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada.
Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio quantitativo ou qualitativo de ligação ao anticorpo disponível na técnica.
De acordo com certas modalidades da presente invenção, duas proteínas de ligação ao antígeno ligam-se ao mesmo (ou sobreposição) epítopo se, por exemplo, um excesso de 1-, 5-, 10-, 20- ou 100- vezes de uma ligação à proteína de ligação ao antígeno inibe da outra em pelo menos 50%, mas de preferência 75%, 90% ou mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495-1502). Alternativamente, duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como ligando-se ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzem ou eliminam a ligação da outra.
Duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como tendo "epítopos sobrepostos" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno
74 / 144 reduzem ou eliminam a ligação da outra.
[00147] Para determinar se um anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, a molécula de ligação ao antígeno de referência pode se ligar a uma proteína CD63 em condições de saturação seguida pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula CD63. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste pode se ligar a uma molécula de CD63 em condições de saturação, seguido pela avaliação da ligação da molécula de ligação ao antígeno de referência à molécula de CD63. Se, em ambas as orientações, apenas a primeira molécula de ligação ao antígeno (saturante) é capaz de se ligar à molécula de CD63, então conclui-se que o anticorpo de teste e a molécula de ligação ao antígeno de referência competem pela ligação ao CD63. Como será apreciado por um versado na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência por ligar um epítopo sobreposto ou adjacente. Preparação de domínios de ligação ao antígeno e construção de moléculas biespecíficas
[00148] Os domínios de ligação ao antígeno específicos para antígenos particulares podem ser preparados por qualquer tecnologia de geração de anticorpos conhecida na técnica. Uma vez obtidos, dois domínios de ligação ao antígeno diferentes, específicos para dois antígenos diferentes (por exemplo, CD63 e um antígeno alvo), podem ser adequadamente arranjados um em relação ao outro para produzir uma molécula de ligação biespecífica ao antígeno da presente invenção usando métodos de rotina. (Uma discussão de formatos de anticorpos biespecíficos exemplares que podem ser usados
75 / 144 para construir as moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção é fornecida em outro lugar neste documento). Em certas modalidades, um ou mais dos componentes individuais (por exemplo, cadeias pesadas e leves) das moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno da invenção são derivados de anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanos. Os métodos para produzir tais anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma ou mais das cadeias pesadas e/ou leves das moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção podem ser preparadas usando a tecnologia VELOCIMMUNE™. Usando a tecnologia VELOCIMMUNE™ (ou qualquer outra tecnologia de geração de anticorpo humano), anticorpos quiméricos de alta afinidade para um antígeno particular (por exemplo, CD63) são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Os anticorpos são caracterizados e selecionados por características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar cadeias pesadas e/ou leves totalmente humanas que podem ser incorporadas nas moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno da presente invenção.
[00149] Animais geneticamente modificados podem ser usados para fazer moléculas de ligação biespecíficas humanas ao antígeno. Por exemplo, um camundongo geneticamente modificado pode ser usado que é incapaz de reorganizar e expressar uma sequência variável de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena, em que o camundongo expressa apenas um ou dois domínios variáveis de cadeia leve humana codificados por sequências de imunoglobulina humana operacionalmente ligado ao gene constante kappa de camundongo no lócus kappa de camundongo endógeno. Esses camundongos geneticamente modificados podem ser usados para isolar regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve para produzir moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno totalmente humanas. Como tal, as
76 / 144 moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno totalmente humanas compreendem duas cadeias pesadas diferentes que se associam à mesma cadeia leve. (Ver, por exemplo, US 2011/0195454). Totalmente humano refere-se a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno ou domínio de imunoglobulina do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por um DNA derivado de uma sequência humana ao longo de todo o comprimento de cada polipeptídeo do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ou domínio de imunoglobulina do mesmo. Em alguns casos, a sequência totalmente humana é derivada de uma proteína endógena a um humano. Em outros casos, a proteína ou sequência de proteína totalmente humana compreende uma sequência quimérica em que cada sequência de componente é derivada de sequência humana. Embora não sejam limitadas por nenhuma teoria, proteínas quiméricas ou sequências quiméricas são geralmente projetadas para minimizar a criação de epítopos imunogênicos nas junções de sequências componentes, por exemplo, em comparação com quaisquer regiões ou domínios de imunoglobulina humana de tipo selvagem.
[00150] Moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno podem ser construídas com uma cadeia pesada possuindo um domínio Fc modificado que anula sua ligação à Proteína A, permitindo assim um método de purificação que produz uma proteína heterodimérica. Ver, por exemplo, Patente US N°. 8.586.713. Como tal, as moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno compreendem um primeiro domínio CH3 e um segundo domínio CH3 de lg, em que o primeiro e o segundo domínios CH3 de lg diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico para a Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácidos. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação/modificação que reduz ou suprime a ligação à Proteína A, tal como uma modificação H95R (por
77 / 144 numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 pode compreender adicionalmente uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Bioequivalentes
[00151] A presente invenção abrange moléculas de ligação ao antígeno com sequências de aminoácidos que variam daquelas das moléculas exemplares divulgadas neste documento, mas que retêm a capacidade de se ligar ao CD63. Essas moléculas variantes podem compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas com a sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à das moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno descritas.
[00152] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno que são bioequivalentes a qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno exemplares estabelecidas neste documento. Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais semelhantes, de dose única ou dose múltipla. Algumas proteínas de ligação ao antígeno serão consideradas equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão da sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e estão refletidas na rotulagem, não são essenciais para a obtenção de concentrações efetivas de fármacos no corpo mediante, por exemplo, uso crônico, e são consideradas clinicamente insignificantes para o produto farmacêutico em particular estudado.
[00153] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas na
78 / 144 sua segurança, pureza e potência.
[00154] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se for possível alternar um paciente uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado do risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficácia diminuída, em comparação com a terapia continuada sem tal alternância.
[00155] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas agirem por um mecanismo ou mecanismos de ação em comum para a condição ou condições de uso, na medida em que esses mecanismos forem conhecidos.
[00156] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. Medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, no qual a concentração do anticorpo ou os seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro, ou outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que tenha sido correlacionado com e seja razoavelmente previsível de dados de biodisponibilidade humanos in vivo; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, no qual o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) seja medido como uma função do tempo; e (d) em um teste clínico bem controlado que estabeleça a segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de uma proteína de ligação ao antígeno.
[00157] Variantes bioequivalentes das moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno exemplares estabelecidas neste documento podem ser construídas, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para a atividade biológica. Por exemplo, os resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos
79 / 144 por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após a renaturação. Em outros contextos, proteínas de ligação a antígeno bioequivalente podem incluir variantes das moléculas de ligação biespecíficas ao antígeno exemplares estabelecidas neste documento, compreendendo alterações de aminoácidos que modificam as características de glicosilação das moléculas, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação. Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada de Espécies
[00158] De acordo com certas modalidades da invenção, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD63 humano, mas não ao CD63 de outras espécies. A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD63 humano e ao CD63 de uma ou mais espécies não humanas.
[00159] De acordo com certas modalidades exemplares da invenção, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD63 humano podem se ligar ou não, conforme o caso, a um ou mais de camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbil, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomolgus, sagui, rhesus ou chimpanzé CD63. Conjugados da Anticorpo-Droga (ADCs)
[00160] A presente invenção fornece conjugados da anticorpo-droga (ADCs) compreendendo anticorpos anti-CD63 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (incluindo moléculas de ligação multiespecíficas ao antígeno e proteínas terapêuticas de multidomínios compreendendo anticorpos anti-CD63 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) conjugados a um porção terapêutica, tal como um agente citotóxico, um fármaco quimioterapêutico, imunossupressor ou um radioisótopo. Anticorpos anti-CD63, ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, conjugados a uma fração terapêutica também são fornecidos. Em termos gerais, os ADCs
80 / 144 compreendem: A - [L - P]y, em que A é uma molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-CD63, ou um fragmento deste (por exemplo, um fragmento compreendendo pelo menos um HCDR3 selecionado a partir de qualquer uma das sequências de aminoácidos HCDR3 listadas na Tabela 1), L é um ligante peptídico, P é a carga útil ou fração terapêutica (por exemplo, agente citotóxico) e y é um número inteiro de 1 a 30.
[00161] Em várias modalidades, o ADC compreende um anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo xanti-CD63 anti-alvo (TAA)) que compreende os CDRs de um HCVR ou LCVR com as sequências de aminoácidos do SEQ ID NOs (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 298, 306, 314, 322, 330, 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 e 282) estabelecidas na Tabela 1, ou pares específicos de HCVR/LCVR (por exemplo, SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/282, 298/282, 306/282, 314/282, 322/282 e 330/282). Em alguns casos, o anticorpo anti-CD63 ou fragmento compreende CDRs com as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs (por exemplo, SEQ ID NOs: 4- 6-8-12-14-16, 20-22-24-26- 28-30-32, 36-38-40-44-46-48, 52-54-56-60-62- 64; 68-70-72-76-78-80 84-86-88-92-94 -96; 100-102-104-108-110-112, 116- 118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158- 160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200- 204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 228 -230-232-236-238-240; 244- 246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286- 288; 292-294 -296-284-286-288; 300-302-304-284-286-288; 308-310-312- 284-286-288; 316-318-320-284-286-288; 324-326-328 -284-286-288, e 332- 334-336-284-286-288) estabelecidas na Tabela 1. Em alguns casos, o anticorpo anti-CD63 ou fragmento compreende um HCVR e um LCVR tendo
81 / 144 as sequências de aminoácidos do SEQ ID NOs (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 298, 306, 314, 322, 330, 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 e 282) estabelecidas na Tabela 1, ou pares de sequência de aminoácidos específicos (por exemplo, SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/282, 298/282, 306/282, 314/282, 322/282 e 330/282).
[00162] Os agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial ao crescimento, viabilidade ou propagação de células, incluindo, mas não se limitando a, agentes que interagem com a tubulina e agentes que danificam o DNA. Exemplos de agentes citotóxicos adequados e agentes quimioterápicos que podem ser conjugados a anticorpos anti-CD63 de acordo com este aspecto da divulgação incluem, por exemplo, 1-(2cloroetil)-1,2- dimetanossulfonil hidrazida, 1,8-dihidroxi-biciclo[7.3.1]trideca-4,9-dieno-2,6- diino-13-ona, 1-desidrotestosterona, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, 9-amino camptotecina, actinomicina D, amanitinas, aminopterina, anguidina, antraciclina, antramicina (AMC), auristatinas, bleomicina, bussulfano, ácido butírico, caliqueamicinas (por exemplo, caliqueamicina γ1), camptotecina, carminomicinas, carmustina, cemadotinas, cisplatina, colchofoscinamida, cibetastinocentina, cicloctarinoclorotamina, combretastina, cicloctaricinacicloctaracinamida, cibretabinoctaricinacicloctarcinida, cicloctarcinida, cicloctarcinida, cibretabinoctaricina, combretabactomicina, decarbazina, diacetoxipentildoxorrubicina, dibromomanitol, dihidroxiantracina diona, disorazóis, dolastatina (por exemplo, dolastatina 10), doxorrubicina, duocarmicina, equinomicinas, eleuterobinas, emetina, epotourilonas, gustamida, etacotropósio, esperamicina, etacostamida, etacostamida eldanamicinas, gramicidina D, glicocorticoides, irinotecanos, inibidores da
82 / 144 proteína do fuso da cinesina (KSP), leptomicinas, leurosinas, lidocaína, lomustina (CCNU), maitansinoides, mecloretamina, melfalano, mercatopurinas, metopterinas, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, espermidina N8-acetila, podofilotoxinas, procaína, propranolol, pteridinas, puromicina, pirrolobenzodiazepinas (PBD), rizoxinas, estreptozotocina, talisomicinas, taxol, tenoposido, tetracaína, tioepa clorambucil, tomaimicinas, topotecanos, tubulisina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbinas e derivados de qualquer um dos anteriores.
[00163] De acordo com certas modalidades, o agente citotóxico que é conjugado a um anticorpo anti-CD63 é um maitansinoide, como DM1 ou DM4, um derivado de tomaimicina ou um derivado de dolastatina. De acordo com certas modalidades, o agente citotóxico que é conjugado a um anticorpo anti-CD63 é uma auristatina, como MMAE, MMAF ou seus derivados. Outros agentes citotóxicos conhecidos na técnica são contemplados dentro do escopo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, toxinas de proteínas, tais como ricina, toxina de C. difficile, exotoxina de pseudomonas, ricina, toxina da difteria, toxina botulínica, briodina, saporina, toxinas de pokeweed (isto é, fitolaccatoxina e fitolaccigenina), e outros, tais como os apresentados em Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138: 452-469.
[00164] Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide, por exemplo, derivado de maitansina. Os maitansinoides adequados incluem DM1, DM4 ou seus derivados, estereoisômeros ou isotopólogos. Os maitansinoides adequados também incluem, mas não estão limitados a, aqueles divulgados em WO 2014/145090A1, WO 2015/031396A1, US 2016/0375147A1, e US 2017/0209591A1, incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[00165] Em algumas modalidades, o maitansinoide tem a seguinte estrutura:
83 / 144 em que A é um arileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.
[00166] Em algumas modalidades, o maitansinoide tem a seguinte estrutura: CH3 H OH OCH3
O N
O O CH3
O H3C N OCH3 O H3C Cl H2N A N O
H em que A é um arileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.
[00167] Em algumas modalidades, o maitansinoide tem a seguinte estrutura: em que n é um número inteiro de 1-12 e R1 é alquil.
[00168] Em algumas modalidades, o maitansinoide é: , ,
84 / 144
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
85 / 144
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
86 / 144 , , , , , , , , , ou .
[00169] Em algumas modalidades, o maitansinoide é:
87 / 144 .
[00170] Em algumas modalidades, o maitansinoide é: .
[00171] Também são fornecidos neste documento conjugados de anticorpo-radionuclídeo (ARCs) compreendendo anticorpos anti-CD63 conjugados com um ou mais radionuclídeos. Os radionuclídeos exemplares que podem ser usados no contexto deste aspecto da divulgação incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 131I, 186Re, 227Th, 222Rn, 223 Ra, 224Ra, e 90Y.
[00172] Em certas modalidades fornecidas neste documento, os ADCs são fornecidos compreendendo, por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica anti-TAA x anti-CD63 conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, qualquer um dos agentes citotóxicos divulgados acima) através de uma molécula ligante peptídico. Ligantes peptídicos são qualquer grupo ou fração que liga, conecta ou liga o anticorpo ou proteínas de ligação ao antígeno descritos neste documento com uma fração terapêutica, por exemplo, agente citotóxico. Os ligantes peptídicos adequados podem ser encontrados, por exemplo, em Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins; Phillips, G. L., Ed.; Springer Verlag: New York, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Ducry, L., Ed.; Humana Press, 2013; Antibody-Drug Conjugates; Wang, J., Shen, W.-C., e Zaro, J. L., Eds.; Springer International Publishing,
88 / 144 2015, o conteúdo de cada um dos quais é incorporado neste documento em sua totalidade por referência. Geralmente, ligantes peptídicos de agente de ligação adequados para os conjugados de anticorpos descritos neste documento são aqueles que são suficientemente estáveis para explorar a meia- vida circulante do anticorpo e, ao mesmo tempo, capazes de liberar sua carga útil após a internalização mediada por antígeno do conjugado. Os ligantes peptídicos podem ser cliváveis ou não-cliváveis. Ligantes peptídicos cliváveis incluem ligantes peptídicos que são clivados pelo metabolismo intracelular após internalização, por exemplo, clivagem por hidrólise, redução ou reação enzimática. Ligantes peptídicos não cliváveis incluem ligantes peptídicos que liberam uma carga útil anexada por meio da degradação lisossomal do anticorpo após a internalização. Os ligantes peptídicos adequados incluem, mas não estão limitados a, ligantes peptídicos lábeis em ácido, ligantes peptídicos lábeis em hidrólise, ligantes peptídicos cliváveis enzimaticamente, ligantes peptídicos lábeis em redução, ligantes peptídicos autoimolantes e ligantes peptídicos não cliváveis. Ligantes peptídicos adequados também incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são ou compreendem peptídeos, glucuronídeos, succinimida-tioéteres, unidades de polietilenoglicol (PEG), hidrazonas, unidades mal-caproil, unidades dipeptídicas, unidades de valina-citrulina e unidades de para-aminobenzil (PAB).
[00173] Qualquer molécula de ligante peptídico ou tecnologia de ligante peptídico conhecida na técnica pode ser usada para criar ou construir um ADC da presente divulgação. Em certas formas de realização o ligante peptídico é um ligante peptídico clivável. De acordo com outras modalidades, o ligante peptídico é um ligante peptídico não clivável. ligantes peptídicos exemplares que podem ser usados no contexto da presente divulgação incluem ligantes peptídicos que compreendem ou consistem em, por exemplo, MC (6-maleimidocaproil), MP (maleimidopropanoil), val-cit (valina- citrulina), val-ala (valina- alanina), val-gly (valina-glicina), sítio dipeptídeo
89 / 144 em ligante peptídico clivável por protease, ala-phe (alanina-fenilalanina), sítio dipeptídeo em ligante peptídico clivável por protease, PAB (p- aminobenziloxicarbonil), SPP (N-Succinimidil 4 - (2-piridiltio) pentanoato), SMCC (N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato), SIAB (N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato) e variantes e combinações dos mesmos. Exemplos adicionais de ligantes peptídicos que podem ser usados no contexto da presente divulgação são fornecidos, por exemplo, em US 7.754.681 e em Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21: 5-13, e as referências aí citadas, cujos conteúdos são incorporado por referência neste documento em sua totalidade.
[00174] Em certas modalidades, os ligantes peptídicos são estáveis em condições fisiológicas. Em certas modalidades, os ligantes peptídicos são cliváveis, por exemplo, capazes de liberar pelo menos a porção de carga útil na presença de uma enzima ou em uma faixa ou valor de pH particular. Em algumas modalidades, um ligante peptídico compreende uma fração clivável por enzima. Frações cliváveis por enzima ilustrativas incluem, mas não estão limitadas a, ligações peptídicas, ligações éster, hidrazonas e ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende um ligante peptídico clivável por catepsina.
[00175] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende uma fração não clivável.
[00176] Ligantes peptídicos adequados também incluem, mas não estão limitados a, aqueles que estão quimicamente ligados a dois resíduos de cisteína de um único agente de ligação, por exemplo, anticorpo. Esses ligantes peptídicos podem servir para imitar as ligações dissulfeto do anticorpo que são rompidas como resultado do processo de conjugação.
[00177] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende um ou mais aminoácidos. Os aminoácidos adequados incluem naturais, não naturais, padrão, não padrão, proteinogênicos, não proteinogênicos e L- ou D-
90 / 144 α-aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina ou citrulina, um derivado desta ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, uma ou mais cadeias laterais dos aminoácidos estão ligadas a um grupo de cadeia lateral, descrito abaixo. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende valina e citrulina. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende lisina, valina e citrulina. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende lisina, valina e alanina. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende valina e alanina.
[00178] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende um grupo autoimolante. O grupo autoimolante pode ser qualquer grupo conhecido por aqueles versados na técnica. Em modalidades particulares, o grupo autoimolante é p-aminobenzil(PAB) ou um derivado do mesmo. Derivados úteis incluem p-aminobenziloxicarbonil (PABC). Aqueles versados na técnica reconhecerão que um grupo autoimolante é capaz de realizar uma reação química que libera os átomos restantes de um ligante peptídico de uma carga útil.
[00179] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é: em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, via resíduo de lisina) e é uma ligação ao agente citotóxico (por exemplo, DM1). Em algumas modalidades, o ligante peptídico é:
91 / 144 em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, via resíduo de lisina) e é uma ligação ao agente citotóxico (por exemplo, DM1). Em certas modalidades, o ligante peptídico é: .
[00180] Em certas modalidades, o ligante peptídico é: .
[00181] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é derivado de maleimidilmetil-4-trans-ciclo-hexanocarboxissuccinato: .
[00182] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é:
92 / 144 em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, via resíduo de lisina) e é uma ligação ao agente citotóxico (por exemplo, um composto com a seguinte fórmula: ).
[00183] A presente divulgação compreende ADCs em que um ligante peptídico conecta uma proteína biespecífica de ligação ao antígeno anti-TAA x anti-CD63 a um fármaco ou citotoxina através de uma ligação a um aminoácido particular dentro do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno. Anexos de aminoácidos exemplares que podem ser usados no contexto deste aspecto, por exemplo, lisina (ver, por exemplo, US 5.208.020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5.714.586; e US 2013/0101546), cisteína (ver, por exemplo, US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; e US
7.750.116), selenocisteína (ver, por exemplo, WO 2008/122039; e Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), formil glicina (ver, por exemplo, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3: 321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110: 46-51 e Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10: 1052-1067), aminoácidos não naturais (ver, por exemplo,
93 / 144 WO 2013/068874 e WO 2012/166559) e aminoácidos ácidos (ver, por exemplo, WO 2012/05982). Os ligantes peptídicos também podem ser conjugados a uma proteína de ligação ao antígeno através da ligação a carboidratos (ver, por exemplo, US 2008/0305497, WO 2014/065661 e Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13: 127-130) e ligantes peptídicos dissulfeto (ver, por exemplo, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, e Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2: 312-313). As técnicas de conjugação específicas ao sítio também podem ser empregadas para direcionar a conjugação a resíduos específicos do anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Schumacher et al. J Clin Immunol (2016) 36(Suppl 1): 100). As técnicas de conjugação específicas ao sítio incluem, mas não estão limitadas a, conjugação de glutamina via transglutaminase (ver, por exemplo, Schibli, Angew Chemie Inter Ed. 2010, 49, 9995).
[00184] De acordo com certas modalidades, a presente divulgação fornece ADCs, em que uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica anti- TAA x anti-CD63, conforme descrito neste documento, é conjugada a uma composição ligante peptídico-droga conforme estabelecido na Publicação de Patente Internacional WO2014/145090, (por exemplo, composto "7", também referido neste documento como "M0026" e descrito abaixo), a divulgação do qual é incorporada neste documento por referência em sua totalidade: .
[00185] São fornecidos neste documento também conjugados anticorpo-droga que compreendem as proteínas de ligação ao antígeno
94 / 144 biespecífico anti-TAA x anti-CD63, em que a referida proteína de ligação ao antígeno biespecífico anti-TAA x anti-CD63 é conjugada a um agente citotóxico. Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide. Em certas modalidades, o maitansinoide é um composto com a seguinte fórmula: em que n é um número inteiro de 1-12 e R1 é alquil. Em certas modalidades, o maitansinoide é ou .
[00186] Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide, e o maitansinoide é covalentemente ligado ao anticorpo por meio de um ligante peptídico não clivável. Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide e o maitansinoide é covalentemente ligado ao anticorpo por meio de um ligante peptídico clivável.
[00187] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a:
95 / 144 . em que é uma ligação ao anticorpo.
[00188] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a: em que é uma ligação ao anticorpo.
[00189] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a: em que é uma ligação ao anticorpo.
[00190] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a:
96 / 144 em que é uma ligação ao anticorpo.
[00191] Em algumas modalidades, os conjugados têm a seguinte estrutura: Ab-[L-Pay]n em que: Ab é uma proteína biespecífica de ligação ao antígeno anti- TAA x anti-CD63 conforme descrito neste documento; L é um ligante peptídico; Pay é um agente citotóxico; e n é um número inteiro de 1 a 10.
[00192] Em algumas modalidades, Ab é qualquer um dos anticorpos ou proteínas de ligação ao antígeno descritos na Tabela 1.
[00193] Em algumas modalidades, a carga útil é um maitansinoide.
[00194] Em algumas modalidades, Pay é: em que R1 é alquil.
[00195] Em algumas modalidades, Pay é:
97 / 144 .
[00196] Em algumas modalidades, Pay é: .
[00197] Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 2 a 5.
[00198] Em algumas modalidades, -L-Pay é: . em que é uma ligação ao anticorpo.
[00199] Em algumas modalidades, -L-Pay é:
98 / 144 em que é uma ligação ao anticorpo.
[00200] Em algumas modalidades, -L-Pay é em que é uma ligação ao anticorpo.
[00201] Em algumas modalidades, -L-Pay é: em que é uma ligação ao anticorpo.
[00202] Em algumas modalidades, -L-Pay é: em que é uma ligação ao anticorpo.
[00203] Os conjugados de anticorpo e droga descritos neste documento podem ser preparados usando condições de conjugação conhecidas por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Doronina et al. Nature Biotechnology 2003, 21, 7, 778, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Em algumas modalidades, um conjugado de
99 / 144 droga de proteína de ligação ao antígeno biespecífico anti-TAA x anti-CD63 é preparado pelo contato de uma proteína de ligação ao antígeno biespecífico anti-TAA x anti-CD63 descrito neste documento com um composto compreendendo o ligante peptídico desejado e o agente citotóxico, em que o referido o ligante peptídico possui uma fração que é reativa com o anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, no resíduo desejado do anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno.
[00204] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento processos para a preparação de um conjugado anticorpo-droga compreendendo o contato de uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica anti-TAA x anti-CD63 descrita neste documento com um composto com a seguinte fórmula A1: A1 e diluente aquoso.
[00205] Em algumas modalidades, o composto de fórmulaA1 está presente em excesso estequiométrico. Em algumas modalidades, o composto de fórmula A1 está presente em excesso estequiométrico de 5-6 vezes. Em algumas modalidades, o diluente aquoso compreende HEPES. Em algumas modalidades, o diluente aquoso compreende DMA.
[00206] Em algumas modalidades, o composto da fórmula A1 é um composto da fórmula A2 ou A3:
100 / 144 A2 A3.
[00207] Em algumas modalidades, o composto de fórmula A2 é A3 estereomericamente puro. Em algumas modalidades, o composto de fórmula A1 compreende um composto de fórmula A1 ou A2, em que o composto de A1 ou A2 presente em um excesso diastereomérico de mais de 50%. Em certas modalidades, o excesso diastereomérico é superior a 70%. Em certas modalidades, o excesso diastereomérico é superior a 90%. Em certas modalidades, o excesso diastereomérico é superior a 95%. As estruturas A1, A2 e A3 individualmente ou coletivamente são conhecidas como SMCC-DM1.
[00208] O termo "excesso diastereomérico" refere-se à diferença entre a fração molar do diastereômero único desejado em comparação com os diastereômeros restantes em uma composição. O excesso diastereomérico é calculado como segue: (quantidade de diastereômero único) - (quantidade de outros diastereômeros)/1. Por exemplo, uma composição que contém 90% de 1 e 10% de 2, 3, 4, ou uma mistura dos mesmos, tem um excesso diastereomérico de 80% [(90-10)/1]. Uma composição que contém 95% de 1
101 / 144 e 5% de 2, 3, 4 ou uma mistura dos mesmos tem um excesso diastereomérico de 90% [(95-5)/1]. Uma composição que contém 99% de 1 e 1% de 2, 3, 4 ou uma mistura dos mesmos tem um excesso diastereomérico de 98% [(99-1)/1]. O excesso diastereomérico pode ser calculado de forma semelhante para qualquer um de 1, 2, 3 ou 4.
[00209] Em algumas modalidades, o composto de fórmula A1 é preparado pelo contato de um composto de fórmula (a): (a) com um composto de fórmula (b) (b) na presença de sílica gel e diluente. Em algumas modalidades, o diluente compreende um solvente orgânico e água.
[00210] É fornecido neste documento também o produto preparado pelo processo de: (i) contatar um composto de fórmula (a):
102 / 144 (a) com um composto de fórmula (b): (b) na presença de sílica gel e diluente para sintetizar um intermediário; e (ii) contatar uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica anti-TAA x anti-CD63 com o intermediário e diluente aquoso.
[00211] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento processos para a preparação de um conjugado anticorpo-droga compreendendo o contato de uma proteína de ligação ao antígeno biespecífica anti-TAA x anti-CD63 descrita neste documento com um composto com a seguinte fórmula B:
B em que LG é um grupo lábil e diluente aquoso.
103 / 144
[00212] Em algumas modalidades, o composto de fórmula B está presente em excesso estequiométrico. Em algumas modalidades, o composto de fórmula B está presente em excesso estequiométrico de 5-6 vezes. Em algumas modalidades, o diluente aquoso compreende HEPES. Em algumas modalidades, o diluente aquoso compreende DMA. Em algumas modalidades, o -C(O)-LG é um éster, por exemplo, NHS ou éster pentafluorofenil.
[00213] Em algumas modalidades, o composto de fórmula B é um composto de fórmula B1 conhecido como Composto I: . B1 (Composto I).
[00214] Em algumas modalidades, o composto de fórmula C é conhecido como Composto II: C (Composto II)
[00215] A razão droga-anticorpo (DAR) é o número médio de drogas conjugadas ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que tem um efeito importante na eficácia, potência e farmacocinética do ADC. Em várias modalidades, o DAR é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 moléculas de droga por anticorpo. Em algumas modalidades, o DAR é de 1 a 4. Em certas modalidades, o DAR é de 2 a 4. Em alguns casos, o DAR é de 2 a 3. Em certos casos, o DAR é de 3 a 4. Em alguns modalidades, o DAR é de 1 a 10, 1
104 / 144 a 20 ou 1 a 30 (ou seja, de 1 a 30 moléculas de droga por anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo). Formulação e Administração Terapêutica
[00216] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com veículos adequados, excipientes, e outros agentes que proveem transferência, entrega, tolerância melhoradas e semelhantes. Uma grande variedade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (catiônicos ou aniônicos) (tais como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Ver também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[00217] A dose de molécula de ligação ao antígeno administrada a um paciente pode variar, dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença alvo, condições, via de administração e semelhantes. A dose preferencial é tipicamente calculada de acordo com o peso corporal ou área de superfície corporal. Quando uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da presente invenção é usada para fins terapêuticos em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar por via intravenosa a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca
105 / 144 de 3 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. As dosagens e horários efetivos para administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser determinados empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado através de avaliação periódica, e a dose, ajustada em conformidade. Além disso, o escalonamento interespécies de dosagens pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
[00218] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, peridural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por injeção de infusão ou bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser local ou sistêmica.
[00219] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser transmitida por via subcutânea ou por via intravenosa com uma agulha e seringa padrão. Além disso, com respeito à distribuição subcutânea, um dispositivo de distribuição do tipo caneta prontamente tem aplicações na distribuição de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de distribuição do tipo caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de distribuição do tipo caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez
106 / 144 que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tenha sido administrada e o cartucho estiver vazio, o cartucho vazio pode ser facilmente descartado e substituído por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de distribuição do tipo caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de distribuição do tipo caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de distribuição do tipo caneta descartável vem pré-cheio com a composição farmacêutica contida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.
[00220] Inúmeros dispositivos de distribuição autoinjetores e do tipo caneta reutilizáveis têm aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas não estão limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly e Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar apenas alguns. Exemplos de dispositivos de distribuição do tipo caneta descartáveis com aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, caneta SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), a FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e a KWIKPEN™ (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICKTM (Amgen, Thousand Oaks, CA), a PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), a EPIPEN™ (Dey, L.P.) e a caneta HUMIRATM (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar apenas alguns.
[00221] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser
107 / 144 transmitida em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser utilizada uma bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados (ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Flórida. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
[00222] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões gota a gota etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsionando o anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente utilizado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante apropriado, como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um surfactante não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferencialmente colocada em uma ampola apropriada.
108 / 144
[00223] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para utilização oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para conter uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo supracitado contido é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferencial que o anticorpo acima mencionado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. Seus usos terapêuticos e diagnósticos
[00224] São divulgados neste documento também métodos que compreendem a administração a um sujeito em necessidade de uma composição terapêutica compreendendo um anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (incluindo uma molécula de ligação multiespecífica ou proteína terapêutica de múltiplos domínios compreendendo a mesma) ou um conjugado anticorpo-droga compreendendo um anti Anticorpo -CD63 (por exemplo, um anticorpo anti-CD63 ou ADC compreendendo qualquer uma das sequências de HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1 neste documento). A composição terapêutica pode compreender qualquer um dos anticorpos anti-CD63, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou ADCs divulgados neste documento, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00225] Os anticorpos, seu fragmento de ligação ao antígeno (incluindo uma molécula de ligação multiespecífica ou proteína terapêutica de múltiplos domínios compreendendo a mesma) ou um conjugado anticorpo-droga compreendendo um anticorpo anti-CD63 da invenção podem ser úteis, inter alia, para o tratamento, prevenção e/ou melhora de qualquer doença ou distúrbio associado ou mediado por CD63. Por exemplo, os anticorpos e
109 / 144 ADCs da presente invenção são úteis para o tratamento de tumores que expressam CD63 e, em algumas modalidades, um TAA que pode ser direcionado por um anticorpo biespecífico da invenção. Os anticorpos, seu fragmento de ligação ao antígeno (incluindo uma molécula de ligação multiespecífica ou proteína terapêutica de múltiplos domínios compreendendo a mesma) ou um conjugado anticorpo-droga compreendendo um anticorpo anti-CD63 da invenção também podem ser úteis no tratamento de doenças dependentes de mastócitos (MC-), artrite reumatoide, reações alérgicas dependentes de IgE e reação alérgica mediada por Fc-ER1, asma, câncer e/ou metástases, etc. Ver, por exemplo, Kraft et al. (2005) JEM 201: 385; Valadi (2007) Nat. Cell Biol. 9: 654
[00226] Os anticorpos anti-CD63 da invenção têm várias utilidades. Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD63 são úteis para a purificação por afinidade de exossomos, por exemplo, em que os anticorpos anti-CD63 divulgados neste documento podem ser imobilizados em um suporte adequado, como uma resina Sephadex ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica, e depois em contato com uma amostra contendo os exossomos desejados contendo CD63 a ser purificado e, posteriormente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto os exossomos que estão ligados ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte pode ser lavado com outro solvente adequado que irá liberar os exossomos do anticorpo. Em outra modalidade, os anticorpos anti-CD63 podem ser usados em ensaios de diagnóstico para CD63, por exemplo, detectando sua expressão em células, tecidos ou soro específicos, por exemplo, como um reagente para identificar/marcar exossomos. Ver, por exemplo, Valadi et al. (2007) Nature Cell. Biol: 9(6):654-9. Várias técnicas de ensaio de diagnóstico e prognóstico conhecidas na técnica podem ser utilizadas, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos ou indiretos e ensaios de
110 / 144 imunoprecipitação conduzidos em fases heterogêneas ou homogêneas (Zola (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. pp. 147-1581). Os anticorpos usados nos ensaios podem ser marcados com uma fração detectável. A fração detectável deve ser capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Qualquer método conhecido na técnica para conjugar o anticorpo à fração detectável pode ser empregado.
[00227] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de uma doença, como o câncer. O método da invenção inclui preferencialmente a etapa de fornecer um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno CD63 do mesmo, como descrito acima, a um sujeito que requer o referido tratamento.
[00228] Os métodos de imunodirecionamento de células cancerosas usando anticorpos ou fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Patente US No. 6.306.393, por exemplo, descreve o uso de anticorpos anti-CD22 na imunoterapia de malignidades de células B, e a Patente US No.
6.329.503 descreve a segmentação imunológica de células que expressam antígenos transmembrana serpentina. Os anticorpos descritos neste documento (incluindo anticorpos monoclonais humanizados ou humanos ou fragmentos ou outras modificações dos mesmos, opcionalmente conjugados com agentes citotóxicos ou outros) podem ser introduzidos em um paciente de modo que o anticorpo se ligue a células cancerosas e medeie a destruição das células e do tumor e/ou inibe o crescimento das células ou do tumor.
[00229] Sem a intenção de limitar a divulgação, os mecanismos pelos quais tais anticorpos podem exercer um efeito terapêutico podem incluir, por exemplo, citólise mediada por complemento, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) 1 modulando a função fisiológica do antígeno tumoral, inibindo a ligação ou sinal vias de transdução, modulando a diferenciação de células tumorais, alterando perfis de fatores de angiogênese tumoral, modulando a secreção de citocinas e fatores de crescimento
111 / 144 imunoestimulantes ou supressores de tumor, modulando a adesão celular e/ou induzindo apoptose. Exemplo 1: Anticorpos CD63 exemplares Geração de anticorpos anti-CD63 humano
[00230] Anticorpos anti-CD63 humano foram obtidos por imunização de um camundongo (por exemplo, um camundongo projetado compreendendo DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e leve kappa humana), com CD63 humano.
[00231] Após a imunização, os esplenócitos foram coletados de cada camundongo e (1) fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar células de hibridoma e triados quanto à especificidade de CD63 humano, ou (2) células B classificadas (conforme descrito em US 2007/0280945A1) usando um fragmento de CD63 humano como o reagente de classificação que se liga e identifica anticorpos reativos (células B antígeno-positivas).
[00232] Anticorpos quiméricos para CD63 humano foram inicialmente isolados possuindo uma região variável humana e uma região constante de camundongo usando, por exemplo, a tecnologia VELOCIMMUNE como descrito na Patente US No. 7.105.348; Patente US No. 8.642.835; e US
9.622.459, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência.
[00233] Em alguns anticorpos, para fins de teste, as regiões constantes de camundongo foram substituídas por uma região constante humana desejada, por exemplo, CH humano de tipo selvagem ou CH humano modificado (por exemplo, isotipos IgG1, IgG2 ou IgG4) e região constante de cadeia leve (CL), para gerar um anti-hCD63 totalmente humano, incluindo um anticorpo biespecífico totalmente humano compreendendo um anticorpo anti-hCD63 ou porção de ligação ao antígeno respectivo. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com a utilização específica, a ligação ao antígeno de alta afinidade e características de especificidade alvo
112 / 144 residem na região variável.
[00234] Certas propriedades biológicas dos anticorpos biespecíficos exemplares compreendendo um grupo de ligação anti-CD63 humano gerado de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos apresentados abaixo. Sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de região variável de cadeia pesada e leve de anticorpos anti-CD63
[00235] A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de uma codificação de sequência de ácido nucleico (NA) e, entre parênteses, uma sequência de aminoácidos (AA) de uma região variável de cadeia pesada ou leve (HCVR ou LCVR, respectivamente), ou um CDR de cadeia pesada ou leve (HCDR e LCDR, respectivamente) de anticorpos anti-CD63 selecionados usados para gerar as proteínas terapêuticas anti-CD63 de múltiplos domínios divulgadas neste documento. Tabela 1: Identificadores de sequência anti-CD63 SEQ ID NOs: HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Designação do
NA NA NA NA NA NA NA NA Anticorpo (AA) (AA) (AA) (AA) (AA) (AA) (AA) (AA) 1 3 5 7 9 11 13 15 H1M12451N (2) (4) (6) (8) (10) (12) (14) (16) 17 19 21 23 25 27 29 31 H2M12395N (18) (20) (22) (24) (26) (28) (30) (32) 33 35 37 39 41 43 45 47 H4H12450N (34) (36) (38) (40) (42) (44) (46) (48) 49 51 53 55 57 59 61 63 H2M12450N (50) (52) (54) (56) (58) (60) (62) (64) 65 67 69 71 73 75 77 79 H1M12362N (66) (68) (70) (72) (74) (76) (78) (80) 81 83 85 87 89 91 93 95 H1M12366N (82) (84) (86) (88) (90) (92) (94) (96) 97 99 101 103 105 107 109 111 H1M12386N (98) (100) (102). (104) (106) (108). (110) (112) 113 115 117 119 121 123 125 127 H1M12388N (114) (116) (118) (120) (122) (124). (126) (128) 129 131 133 135 137 139 141 143 H1M12390N (130) (132) (134) (136) (138) (140) (142) (144) 145 147 149 151 153 155 157 159 H2M12385N (146) (148) (150) (152) (154) (156) (158) (160) 161 163 165 167 169 171 173 175 H2M12387N (162). (164) (166) (168) (170) (172) (174) (176) 177 179 181 183 185 187 189 191 H2M12392N (178) (180) (182) (184) (186) (188) (190). (192) 193 195 197 199 201 203 205 207 H2M12394N (194) (196) (198) (200) (202) (204) (206) (208)
113 / 144 209 211 213 215 217 219 221 223 H2M12452N (210) (212) (214) (216) (218) (220) (222) (224) 225 227 229 231 233 235 237 239 H2M12454N (226). (228) (230) (232) (234) (236) (238) (240) 241 243 245 247 249 251 253 255 H2M13022N (242) (244) (246) (248) (250) (252) (254) (256) 257 259 261 263 265 267 269 271 H3M12361N (258) (260) (262) (264) (266) (268) (270) (272) 273 275 277 279 281 283 285 287 H4H11990P2 (274) (276) (278) (280) (282) (284) (286) (288) 289 291 293 295 281 283 285 287 H4H11992P2 (290) (292) (294) (296) (282) (284) (286) (288) 297 299 301 303 281 283 285 287 H4H11993P2 (298) (300) (302) (304) (282) (284) (286) (288) 305 307 309 311 281 283 285 287 H4H11995P2 (306) (308) (310) (312) (282) (284) (286) (288) 313 315 317 319 281 283 285 287 H4H11996P2 (314) (316) (318) (320) (282) (284) (286) (288) 321 323 325 327 281 283 285 287 H4H11997P2 (322). (324) (326) (328) (282) (284) (286) (288) 329 331 333 335 281 283 285 287 H4H11998P2 (330) (332) (334) (336) (282) (284) (286) (288) Ligação por anticorpos parental anti-CD63 humano
[00236] A ligação à superfície celular relativa dos anticorpos anti- CD63 a células humanas que expressam CD63 foi acessada por meio de citometria de fluxo usando células HEK293 positivas para CD63 (ATCC, Cat. # CRL-1573), que expressam endogenamente CD63 humano e células HEK293/CD63 negativas para CD63. Para o ensaio, as células foram semeadas em PBS sem cálcio e magnésio (VWR, Cat # 45000-446), contendo 2% de FBS (Saradigm Cat # 1500-500) (Tampão de Coloração) em placas de 96 poços de fundo em V (Axygen Scientific, Cat # P-96-450-VCS). As células foram então incubadas com anticorpos anti-CD63 ou anticorpos de controle de isotipo em concentrações que variam de 100 nM a 1,7 pM por 30 minutos em gelo. Poços sem anticorpos foram usados como controles. As células HEK293/CD63KO foram coradas apenas com a concentração mais elevada (100 nM) dos anticorpos. As células foram então lavadas uma vez com tampão de coloração e foram incubadas com um anticorpo secundário Fc anticamundongo conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch, Cat # 115- 115-164) a 100 nM por 30 minutos a 4 °C. As células foram então lavadas e fixadas usando uma solução de Cytofix a 50% (BD Biosciences, Cat # 554655) diluída em PBS. As amostras foram executadas no citômetro de
114 / 144 fluxo Intellicyte Hypercyt e os resultados foram analisados no software ForeCyt (Intellicyte) para calcular a intensidade fluorescente média (MFI). Os valores medidos foram analisados usando uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de12 pontos usando GraphPad Prism e os valores de EC50 resultantes são relatados (Tabela 12). A razão sinal-ruído (S/N) foi determinada calculando a razão dos anticorpos anti-CD63 ou dos anticorpos de controle MFI para os poços que não contêm anticorpos (Tabela 12).
[00237] Como mostrado na Tabela 2, três dos anticorpos anti-CD63 da invenção demonstraram ligação a células HEK293 com valores S/N variando de 21,0 a 31,6 e valores de EC50 variando de 0,5 nM a 1,9 nM. Os controles sem ligação não demonstraram ligação a células HEK293 (S/N ≤ 1,5). Ambos os anticorpos anti-CD63 e os anticorpos de controle de isotipo demonstraram ligação fraca a pouca às células HEK293/CD63KO (S/N ≤ 4,4). Tabela 2: Ligação de anticorpos anti-CD63 a células HEK293 e HEK293/CD63 KO conforme medido por citometria de fluxo EC50 de HEK293 HEK293 Anticorpo HEK293/CD63 KO (S/N) (nM) s. n. H2M12450N 0,5 26,7 2,9 H1M12451N 1,8 31,6 4,1 H2M12395N 1,9 21,0 2,9 Controle de Isotipo 1 ND 1,4 4,4 Controle de Isotipo 2 ND 1,5 1,6 ND = Não Determinado
[00238] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-CD63 da invenção de se ligarem a células humanas que expressam CD63 também foi determinada usando um ensaio de detecção baseado em eletroquimioluminescência (ECL).
[00239] Para gerar células de superexpressão, células de fibroblasto embrionário de camundongo NIH3T3 (ATCC, Cat # CRL-1658) foram transfectadas para formar uma linhagem celular "NIH3T3/hCD63" que expressa de forma estável CD63 humano (hCD63; aminoácidos M1-M238 do número de acesso NP_001771; SEQ ID NO: 337). Os níveis de expressão de
115 / 144 CD63 humano em células que expressam endogenamente, uma linhagem de células de adenocarcinoma de próstata sensível a andrógeno humano, LNCAP (ATCC, Cat # CRL-1740) e linhagem de células de glioblastoma primário humano, U87MG (ATCC, Cat # HTB-14) foram analisados com um Quantum™ Alexa Fluor® 647 MESF (Bangs Laboratories, Cat # 647B) e um IgG Simply Cellular® anticamundongo (Bangs Laboratories Inc, Cat # 815) seguindo as instruções do fabricante. Determinou-se que as células LNCAP tinham um número de cópias CD63 humano inferior do que as células U87MG. As células NIH3T3 não transfectadas, que não têm expressão detectável de CD63 humano por separação de células ativadas por fluorescência (FACS), foram incluídas como um controle negativo.
[00240] Resumidamente, as linhagens celulares foram enxaguadas uma vez em tampão PBS sem Ca2+/Mg2+ e incubadas durante 10 minutos a 37 °C com solução de dissociação celular sem enzima (Millipore, Cat # S- 004-C) para separar as células. As células foram então lavadas uma vez com PBS com Ca2+/Mg2+ e contadas com um contador de células T4 CellometerTM Auto (Nexcelom Bioscience, LLC). Aproximadamente 2,0x104 células NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG ou NIH3T3 foram semeadas separadamente em placas de eletrodo de carbono de 96 poços (Meso Scale Discovery, Cat # L15XB-6) e foram então incubadas por uma hora a 37oC. Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados com BSA a 2% (p/v) em PBS com Ca2+/Mg2+ durante uma hora à temperatura ambiente (TA). Soluções contendo anticorpos anti-CD63 ou anticorpos de controle de isotipo em uma faixa de concentrações (1,7 pM a 100 nM) em 0,5% de BSA (p/v) em PBS com Ca2+/Mg2+, bem como tampão de controle sozinho, foram então adicionadas em duplicata a as células NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG ou NIH3T3 ligadas à placa e incubadas por uma hora à temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas para remover os anticorpos não ligados usando um lavador de placas AquaMax2000 com uma cabeça de
116 / 144 lavagem de células (MDS Analytical Technologies). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com 1µg/mL de anticorpo lgG anti-humano policlonal de cabra conjugado com SULFO-TAGTM específico para fragmento γFc (Jackson Immunoresearch, Cat # 109-005-098) ou um anticorpo lgG anticamundongo policlonal de cabra conjugado com SULFO-TAGTM específico paraγ fragmento Fc (Jackson Immunoresearch, Cat # 115-005-164) por uma hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e então incubadas com Read Buffer (MSD, Cat # R92TD-2) de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais luminescentes foram medidos usando um SECTOR Imager (MSD). A intensidade da luminescência, medida em unidades de luz relativa (RLU), foi registrada para indicar a intensidade de ligação de cada anticorpo na faixa de concentrações testadas. A proporção de sinal detectado com ligação de anticorpo 3,7 nM a células que expressam CD63 humano em comparação com a mesma concentração de ligação de anticorpo a células negativas foi relatada como uma indicação de especificidade de ligação de CD63. Os anticorpos com a razão de ligação superior a 3 foram classificados como ligantes específicos e os anticorpos com a razão de ligação menor ou igual a 3 foram classificados como não ligantes e marcados como NB na Tabela 13. Além disso, os sinais de ligação direta (em RLU) foram analisados em função da concentração do anticorpo e os dados foram ajustados a um modelo de dose-resposta sigmoidal (logística de quatro parâmetros) usando o software GraphPad Prism™. O valor de EC50 para ligação a células que expressam CD63 humano, definido como a concentração de anticorpo em que 50% do sinal de ligação máximo é detectado, foi determinado para indicar a potência de cada anticorpo e relatado na Tabela 3 apenas para ligantes específicos. Os dados para duas experiências separadas testando anticorpos diferentes são relatados nas Tabelas 3A e 3B.
[00241] Como mostrado na Tabela 3A, os quatro anticorpos anti-CD63
117 / 144 gerados conforme descrito neste exemplo e um Comparador Ab (Comparador 1) se ligaram especificamente a CD63 humano expresso em células NIH3T3/hCD63 manipuladas, bem como aquele expresso endogenamente em linhagens celulares LNCAP e U87MG. Os quatro anticorpos anti-CD63 descritos neste Exemplo ligaram-se a células NIH3T3/hCD63 com valores de EC50 variando de 280pM a 970pM e razões de ligação ao longo da linhagem celular negativa variando de 91 a 281 vezes. Os quatro anticorpos anti-CD63 da invenção ligaram-se a células U87MG com valores de EC50 variando de 500pM a 1,4nM e razões de ligação ao longo da linhagem celular negativa variando de52 a 272 vezes. Os quatro anticorpos anti-CD63 gerados conforme descrito neste Exemplo ligaram-se a células LNCAP com valores de EC50 variando de 210pM a 1,7nM e razões de ligação ao longo da linhagem celular negativa variando de 7 a 20 vezes. As razões de ligação mais baixas nas células LNCAP estão de acordo com o menor número de cópias de CD63 nessas células em comparação com as células U87MG. Os anticorpos de controle de isotipo eram não ligantes, como esperado, com razões de ligação celular menores ou iguais a 3. Tabela 3A. Anticorpos anti-CD63 que se ligam a células humanas que expressam CD63, conforme medido por detecção baseada em eletroquimioluminescência Razão na concentração de Ab 3,7 nM de sinal de ligação celular (RLU) para Potência de ligação celular, EC50 (M) Anticorpo células CD63 humanas em relação a NIH3T3 negativo NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP H1M12451N 2.9E-10 7.9E-10 3.5E-10 256 171 18 H2M12395N 5.7E-10 9.5E-10 1.7E-09 91 52 7 H4H12450N 2.8E-10 5.0E-10 2.1E-10 230 175 20 H2M12450N 9.7E-10 1.4E-09 1.4E-09 281 272 20
CONTROLES Comparador Ab 1 5.7E-10 6.7E-10 2.0E-09 253 271 16 Controle de isotipo de IgG4 NB NB NB 1 1 1 humano Controle de isotipo de IgG2 de NB NB NB 3 2 2 camundongo NB - não aglutinante; os anticorpos com uma razão de ligação inferior ou igual a 3 foram classificados como não ligantes.
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[00242] Como mostrado na Tabela 3B, dezenove dos vinte anticorpos anti-CD63 testados, bem como um Comparador Ab (Comparador 1), ligaram- se especificamente a CD63 humano expresso em células NIH3T3/hCD63 projetadas e em linhagens de células U87MG e LNCAP que expressam endogenamente. Um anticorpo anti-CD63, H4H11998P2, ligou-se especificamente a NIH3T3/hCD63 e U87MG, mas não se ligou a LNCAP. Os vinte anticorpos anti-CD63 testados se ligaram a células NIH3T3/hCD63 com valores de EC50 variando de 0,320nM a 7,4nM com razões de ligação ao longo da linhagem celular negativa variando de 14 a 608 vezes e ligados a células U87MG com valores de EC50 variando de 0,29nM a 17 nM com razões de ligação variando de 5 a 405 vezes. Dezenove anticorpos anti-CD63 ligaram-se às células LNCAP com valores de EC50 variando de 0,15pM a 55nM com razões de ligação sobre a linhagem celular negativa variando de 4 a 51 vezes. O único anticorpo anti-CD63, H4H11998P2, era não ligante às células LNCAP com uma razão de ligação celular de 1. As razões de ligação mais baixas nas células LNCAP estão de acordo com o número de cópias CD63 mais baixo nessas células em comparação com as células U87MG. Os anticorpos de controle de isotipo eram não ligantes, como esperado, com razões de ligação celular menores ou iguais a 3 ou sinal de ligação menor que 100 RLU nas linhagens de células CD63 humanas testadas. Tabela 3B. Anticorpos anti-CD63 que se ligam a células humanas que expressam CD63, conforme medido por detecção baseada em eletroquimioluminescência Razão na concentração de Ab 3,7 nM de sinal de ligação celular (RLU) para Potência de ligação celular, EC50 (M) Anticorpo células CD63 humanas em relação a NIH3T3 negativo NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP H2bM12454N 3.2E-10 4.7E-10 1.8E-10 175 132 14 H2aM12394N 3.8E-10 1.4E-09 7.5E-10 61 50 4 H2aM12387N 3.9E-10 2.9E-10 1.5E-10 228 172 18 H2aM12392N 4.0E-10 5.3E-10 2.3E-10 608 405 51 H2bM12385N 4.5E-10 6.4E-10 2.9E-10 71 47 5 H2bM13022N 4.5E-10 8.5E-10 3.2E-10 95 71 8 H1M12390N 4.8E-10 3.6E-10 3.0E-10 559 339 31 H1M12388N 5.2E-10 3.0E-10 2.5E-10 434 284 31
119 / 144 Razão na concentração de Ab 3,7 nM de sinal de ligação celular (RLU) para Potência de ligação celular, EC50 (M) Anticorpo células CD63 humanas em relação a NIH3T3 negativo NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP NIH3T3/hCD63 U87MG LNCaP H1M12386N 5.2E-10 3.1E-10 2.9E-10 220 129 16 H2aM12452N 6.1E-10 2.0E-09 7.4E-10 593 260 37 H1M12362N 6.3E-10 5.6E-10 5.7E-10 283 174 16 H3M12361N 8.1E-10 1.3E+09 1.1E+09 243 111 19 H3M12366N 8.3E-10 2.0E-09 1.8E-09 310 107 7 H4H11990P2 9.3E-10 4.8E-09 5.1E-09 168 66 6 H4H11997P2 9.4E-10 1.7E-09 1.9E-09 266 99 11 H4H11996P2 9.8E-10 8.1E-09 4.4E-09 188 57 7 H4H11992P2 1.5E-09 5.5E-09 3.6E-09 87 33 4 H4H11993P2 2.5E-09 1.7E-08 6.7E-09 227 62 8 H4H11995P2 5.0E-09 1.3E-08 5.5E+08 212 61 5 H4H11998P2 7.4E-09 IC NB 14 5 1
CONTROLES Comparador Ab 1 9.6E-10 1.1E+09 5.3E-10 589 243 25 Controle de isotipo de IgG4 NB NB NB 1 4(*) 1 humano Controle de isotipo de IgG2 NB NB NB 3 2 2 de camundongo NB - não aglutinante; anticorpos com uma razão de ligação menor ou igual a 3 ou sinal de ligação menor que 100 RLU. (*) - o sinal de ligação no U87MG era inferior a 100 RLU e o controle de isotipo foi classificado como não ligante. IC - inconclusivo; nenhum ajuste sigmoidal observado para calcular o valor de EC50.
Internalização/citotoxicidade mediada por anticorpos anti-CD63 humanos parentais
[00243] A capacidade dos anticorpos anti-CD63 divulgados neste documento para se ligar e internalizar em células que expressam CD63 foi avaliada. Para o ensaio, células T47D (ATCC, Cat # HTB-133) foram semeadas em placas revestidas com colágeno de 96 poços (Greiner, Cat # 655956) em RPMI (Irvine Scientific, Cat # 9160) contendo 10% de FBS (ATCC, Cat # 30 -2020), penicilina/estreptomicina/L-glutamina (Gibco, Cat # 10378-016),µpiruvato de sódio 100M (Millipore, Cat # TM5-005-C), 1mM de HEPES (ThermoFisher, Cat # 15630080), 10 µg/mL de Insulina bovina (Gemini BioProducts, Cat # 700-912P) (meio de crescimento) e deixada incubando durante a noite a 37 °C em 5% CO2. Para corar, placas quadruplicadas de células foram incubadas com 10 µg/mL de anticorpos anti- CD63 que foram diluídos em 2% de FBS em PBS, sem cálcio e magnésio
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(Irving, Cat # 9240) (tampão de coloração) por 30 minutos a 4 °C.
As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração, depois incubadas com um Ab secundário conjugado com Alexa-Flour 488 (Jackson Immunoresearch, Cat # 115-547-003 ou Jackson Immunoresearch, Cat # 109- 547-003) aµ10ug/mL por 30 minutos a 4 °C e, subsequentemente, lavadas mais duas vezes com tampão de coloração.
Duas placas foram imediatamente fixadas e coradas com paraformaldeído a 4% (PFA; ThermoFisher, Cat # 28908) + 5 uM DRAQ5 (ThermoFisher, Cat # 62251) em PBS por 20 minutos (placas de não internalização). As duas placas restantes foram incubadas com meio de crescimento a 37 °C por 2 horas seguido de fixação e coloração por 20 minutos usando uma solução de 4% PFA + 5µM DRAQ5 diluídos em PBS (placas de internalização). Após a fixação, todas as placas foram lavadas uma vez com PBS.
Uma placa de não internalização e uma placa de internalização foram incubadas com um anticorpo anti-Alexa Fluor 488 (Regeneron) a 50gµ/mL em PBS durante a noite a 4 °C para extinguir a superfície de fluorescência Alexa Fluor 488. As placas restantes foram incubadas apenas com PBS.
Imagens confocais foram adquiridas no Opera Phenix (Perkin Elmer) com ampliação de 40X.
O software de análise Harmony (Perkin Elmer) foi utilizado para identificar células marcadas com DRAQ5 e o total de 488 unidades fluorescentes relativas (RFU) Alexa-Fluor por célula foi determinado.
A ligação total em 4 °C (valores de RFU de 4 °C poços não extintos), ligação total em 37 °C (valores de RFU de poços não extintos de 37 °C), a RFU total internalizada e a % de internalização foram determinados para cada anticorpo como mostrado na Tabela 1. Para todos os cálculos, a fluorescência de fundo de poços de controle de 2o Ab apenas foi subtraída de todos os poços.
A RFU total internalizada foi calculada como segue: RFU total de amostras não temperadas a 37 °C - RFU de superfície a 37 °C.
RFU de superfície é definida como RFU não extinta a 37 °C - RFU extinta a 37 °C)/QE.
QE (eficiência de extinção) é definida como: 1- (RFU
121 / 144 total de amostra a 4 °C extinta/RFU total de amostra a 4 °C não extinta). A % de internalização foi determinada a partir da seguinte fórmula: (RFU total internalizado a 37 °C/RFU total a 37 °C)*100.
[00244] Como mostrado na Tabela 4, todos os 4 anticorpos anti-CD63 da invenção demonstraram internalização em células T47D variando de 60,9% a 73,7% de internalização. Os controles isotípicos não demonstraram nenhuma internalização mensurável. Tabela 4: Internalização e ligação de superfície de anticorpos anti-CD63 em células T47D RFU total a 37°°C RFU totalmente Anticorpo RFU total a 4°°C Internalização % (2h) internalizada H4H12450N 2098644 2083920 1419840 68,1 Controle de isotipo 137648 -80525 -75133 ND* hIgG4 H2aM12450N 2359553 2938050 1790248 60,9 H1M12451N 1902759 2321763 1710839 73,7 H2M12395N 1499634 1693000 1238752 73,2 Controle de isotipo -93885 57417 66563 ND* mIgG1 Controle de isotipo -73427 65365 73850 ND* mIgG2a ND*: % de internalização não pôde ser determinada devido à ligação fraca e/ou incapacidade de determinar a eficiência de extinção
[00245] A fim de avaliar a capacidade de um anticorpo anti-CD63 descrito neste documento para internalizar em células que expressam CD63, um ensaio de citotoxicidade indireta in vitro foi feito. Células T47D positivas para CD63 humanas (ATCC, Cat # HTB-133) e células NIH3T3 negativas para CD63 humanas (ATCC, Cat # CRL-1658) foram respectivamente semeadas em placas de 96 poços revestidas com PDL (BD Biocoat, Cat # 356461) em qualquer 6.000 células por poço em RPMI (Irvine Scientific, Cat # 9160) contendo 10% de FBS (ATCC, Cat # 30-2020), penicilina/estreptomicina/L-glutamina (Gibco, Cat # 10378-016), Beta- Mercaptoetanol 50 uM (Sigma, Cat # M7522) (meio de crescimento), Piruvato de Sódio 100 mM (Millipore, Cat # TMS-005-C), HEPES 1M (Irvine Scientific, Cat # 9319) e Insulina bovina 10 ug/mL (Gemini BioProducts, Cat # 700-912P) ou 2.000 células por poço em DME com alto
122 / 144 teor de glicose (Irvine Scientific, Cat # 9033), 10% de soro bovino (Hyclone, Cat # SH30072.03), mais penicilina/estreptomicina/L-glutamina (Gibco, Cat # 10378-016) e cultivado durante a noite a 37 ° C em 5% de CO2. Para as curvas de viabilidade celular, as células foram incubadas por 5 minutos a 37 °C com um anticorpo anti-CD63 diluído em série (H2M12450N) ou um anticorpo de controle de isotipo sem ligação em concentrações que variam de 3,0 pM a 2,2 nM. Um anticorpo secundário Fab anti-mFc conjugado com a carga citotóxica MMAF (Moradec, Cat # AM-201AF-50) foi então adicionado a 20 nM a cada poço. O meio sozinho serviu como um controle negativo, e 33 µM de digitonina (Promega, Cat # G9441) foi usado para determinar a citotoxicidade máxima. Após uma incubação de 72 horas, a viabilidade celular foi medida usando Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Cat # CK04) de acordo com os protocolos do fabricante com um intervalo de tempo de incubação de 1-3 horas. A absorbância a 450nm (OD450) foi medida em um leitor de placas Envision (PerkinElmer). Os níveis de fundo de OD450 das células tratadas com digitonina foram subtraídos de todos os poços e a viabilidade foi expressa como uma porcentagem dos controles não tratados (% viabilidade). Os valores de IC50 foram determinados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de 8 pontos (GraphPad Prism). Todos os valores de IC50 são expressos em concentração de nM e a % mínima de células viáveis remanescentes após o tratamento é relatada.
[00246] Conforme resumido na Tabela 5, o anticorpo anti-CD63, H2M12450N, reduziu a viabilidade de T47D para 21% com um valor de IC50 de 0,24 nM, enquanto o controle de isotipo reduziu a viabilidade para apenas 64%. Os anticorpos tiveram pouco ou nenhum impacto na viabilidade da linhagem celular NIH3T3. Tabela 5. Internalização do anticorpo anti-CD63 medida por um ensaio de citotoxicidade indireta em células T47D e NIH3T3
123 / 144 T47D NIH3T3 Viabilidade % de Viabilidade % de Anticorpo (nM) (nM) T47D NIH3T3 IC50 IC50 H2M12450N 0,24 21 ND 83 Controle de Isotipo ND 64 ND 91 ND = Não Determinado Cinética de ligação Biacore de anticorpos monoclonais anti-CD63 que se ligam a reagentes de loop CD63 (EC2) medidos a 25ºC e 37ºC
[00247] Constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para diferentes reagentes de loop CD63 (EC2) que se ligam a anticorpos monoclonais anti- CD63 purificados foram determinadas usando um biossensor Biacore T200 ou biossensor Biacore 2000 baseado em ressonância de plasmon de superfície em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em tampão HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e surfactante Tween-20 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET) a 25 °C e 37 °C. A superfície do chip sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com um anticorpo policlonal específico Fc anticamundongo de coelho (GE Healthcare, Cat # BR100838) ou um kit Fab anti-humano (GE Healthcare, Cat # 28958325) para capturar anticorpos monoclonais CD63. Os estudos de ligação foram realizados em loop extracelular 2 de CD63 humano recombinante expresso com um C-terminal Myc-Myc-hexahistidina (hCD63 EC alça 2-MMH; SEQ ID NO: 338) ou loop extracelular 2 de CD63 humano recombinante expresso com um tag Fc humana de C-terminal (hCD63 EC loop 2-hFc; SEQ ID NO: 339). Diferentes concentrações de loop 2-MMH hCD63 EC ou loop 2-hFc hCD63 EC (testado a 50 nM - 12,5 nM em uma diluição de 4 vezes ou a 90 nM-0,37 nM em diluições em série de 3 vezes) foram primeiro preparadas em tampão de corrida HBS-ET e foram injetados sobre a superfície do anticorpo monoclonal anti-CD63 capturado por 4 minutos a uma taxa de fluxo de 35 µL/minuto ou 50 µL/minuto, enquanto a dissociação do reagente CD63 ligado ao anticorpo monoclonal foi monitorada por 8 ou 10 minutos em tampão de corrida HBS -ET. A taxa de associação (ka) e a taxa de dissociação (kd) foram determinadas ajustando os sensorgramas de ligação em tempo real a um
124 / 144 modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e a meia-vida dissociativa (t½) foram calculadas a partir das taxas cinéticas como: KD (M) = , e t½ (min) =
[00248] Parâmetros de cinética de ligação para a ligação da proteína loop 2 CD63 EC humana a diferentes anticorpos monoclonais anti-CD63 da invenção a 25 °C e 37 °C são mostrados nas Tabelas 6 a 9.
[00249] A 25 °C, 20 de 23 dos anticorpos monoclonais anti-CD63 da invenção ligaram-se a loop 2-MMH CD63 EC humano com valores KD variando de 676pM a 11,7uM, como mostrado na Tabela 6. A 37 °C, 21 de 23 dos anticorpos monoclonais anti-CD63 da invenção ligados ao loop 2-MMH CD63 EC humano com valores KD variando de 1,15 nM a 12,3 µM, como mostrado na Tabela 7. A 25 °C, 22 de 23 do anti-CD63 anticorpos monoclonais da invenção ligados a loop 2-Fc CD63 EC humano com valores KD variando de 129pM a 10,1 nM, como mostrado na Tabela 8. A 37 °C, 22 de 23 dos anticorpos monoclonais anti-CD63 da invenção ligaram-se a loop 2-Fc CD63 EC humano com valores KD variando de 45,0pM a 14,5nM, como mostrado na Tabela 9. Tabela 6: Parâmetros de cinética de ligação da ligação de loop 2-MMH CD63 EC humano a anticorpos monoclonais anti-CD63 a 25 ºC Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) Ag (RU) H2aM12450N 592 65 2.27E + 05 2.79E-04 1.23E-09 41 H2aM12395N 472 42 1.66E+05 1.82E-03 1.10E-08 6 H1M12451N 525 52 8.59E + 04 4.30E-04 5.00E-09 27 H1M12386N 405 65 5.40E + 05 3.65E-04 6.76E-10 32 H1M12388N 408 59 8.15E+05 5.87E-04 7.20E-10 20 H2aM12387N 532 74 5.43E + 05 5.40E-04 9.94E-10 21 H3M12361N 367 43 2.58E + 05 8.05E-04 3.12E-09 14 H2aM12452N 348 35 8.13E + 04 5.96E-04 7.33E-09 19 H2aM12392N 595 79 2.98E + 05 9.22E-04 3.10E-09 13 H2bM12454N 485 61 3.84E + 05 1.88E-03 4.89E-09 6 H1M12362N 308 51 1.13E + 05 1.44E -03 1.27E-08 8 H2bM13022N 350 48 1.02E-05 1.32E-03 1.30E-08 9 H1M12390N 418 54 3.23E + 05 3.36E-03 1.04E-08 3 H2bM12385 536 48 3.22E + 05 3.31E-03 1.03E-08 3
125 / 144 Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) Ag (RU) H2aM12394N 670 27 5.91E + 04 5.53E-04 9.36E-09 21 H3M12366N 239 21 IC IC IC IC H4H11990P2 707 94 1.93E + 05 5.91E-03 3.06E-08 2 H4H11997P2 819 106 1.86E + 05 3.71E-03 1.99E-08 3,1 H4H11998P2 633 11 2.64E + 03 3.09E-02 1.17E+05 0,4 H4H11996P2 628 61 1.65E + 05 1.40E-02 8.49E-08 0,8 H4H11995P2 643 8 IC IC IC IC H4H11992P2 743 53 1.25E + 05 2.67E-02 2.13E-07 0,4 H4H11993P2 601 10 IC IC IC IC IC = ligação inconclusiva
Tabela 7: Parâmetros de cinética de ligação da ligação de loop 2-MMH CD63 EC humano a anticorpos monoclonais anti-CD63 a 37 ºC Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a Ag (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) H2aM12450N 617 58 1.75E + 05 2.01E-04 1.15E-09 57 H2aM12395N 535 31 1.65E + 05 9.32E-03 5.64E-08 1 H1M12451N 597 44 8.89E + 04 1.90E-03 2.14E-08 6 H1M12386N 455 65 6.50E+05 2.35E-03 3.61E-09 5 H1M12388N 462 60 6.51E + 05 3.27E-03 5.02E-09 4 H2aM12387N 590 77 6.79E + 05 3.54E-03 5.21E-09 3 H3M12361N 425 39 4.95E + 05 2.89E-03 5.85E-09 4 H2aM12452N 421 34 3.85E + 05 2.69E-03 6.98E-09 4 H2aM12392N 626 68 4.47E + 05 3.24E-03 7.25E-09 4 H2bM12454N 586 56 5.59E + 05 5.91E-03 1.06E-08 2 H1M12362N 369 32 3.69E + 05 7.20E-03 1.95E-08 2 H2bM13022N 395 31 3.11E + 05 6.71E-03 2.15E-08 2 H1M12390N 440 38 4.19E+05 1.49E-02 3.56E-08 1 H2bM12385 642 44 2.71E + 05 1.09E-02 4.00E+08 1 H2aM12394N 753 19 3.62E + 04 2.77E-03 7.67E-08 4 H3M12366N 292 0 NB NB NB NB H4H11990P2 840 81 1.60E+05 1.98E-02 1.24E-07 0,6 H4H11997P2 899 74 1.32E + 05 1.92E-02 1.45E-07 0,6 H4H11998P2 639 3 5.28E + 05 9.17E-02 1.74E-07 0,1 H4H11996P2 704 46 1.08E + 05 3.89E-02 3.61E-07 0,3 H4H11995P2 674 3 7.94E + 04 1.28E-01 1.62E-06 0,1 H4H11992P2 889 30 6.60E + 03 8.14E-02 1.23E-05 0,1 H4H11993P2 723 3 IC IC IC IC IC = ligação inconclusiva NB = sem ligação
Tabela 8: Parâmetros de cinética de ligação da ligação de loop 2-hFC CD63 EC humano a anticorpos monoclonais anti-CD63 a 25 ºC Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a Ag (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) H2aM12450N 592 134 3.20E + 05 4.66E-05 1.50E-10 248 H2aM12395N 472 117 6.77E + 05 5.10E-04 7.53E-10 23 H1M12451N 525 107 1.19E + 05 8.40E-05 7.04E-10 138 H1M12386N 405 160 6.54E + 05 1.13E-04 1.73E-10 102 H1M12388N 408 131 7.28E + 05 1.73E-04 2.38E-10 67 H2aM12387N 532 164 8.54E + 05 1.10E-04 1.29E-10 105 H3M12361N 367 83 4.41E + 05 1.32E-04 2.99E-10 87
126 / 144 Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a Ag (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) H2aM12452N 348 91 1.22E + 05 2.28E-04 1.87E-09 51 H2aM12392N 595 169 5.10E + 05 1.99E-04 3.91E-10 58 H2bM12454N 485 142 6.88E + 05 3.60E-04 5.23E-10 32 H1M12362N 308 125 4.77E + 05 3.99E-04 8.40E-10 29 H2bM13022N 350 117 4.60E + 05 2.80E-04 6.10E-10 41 H1M12390N 418 150 5.23E + 05 9.91E-04 1.89E-09 12 H2bM12385 536 121 5.92E + 05 9.84E-04 1.66E-09 12 H2aM12394N 670 59 8.18E + 04 1.44E-04 1.76E-09 80 H3M12366N 239 51 IC IC IC IC H4H11990P2 707 275 4.30E + 05 8.99E-05 2.09E-10 128 H4H11997P2 819 291 4.17E + 05 6.20E-05 1.49E-10 186 H4H11998P2 633 136 1.75E + 05 4.53E-04 2.58E-09 26 H4H11996P2 628 257 4.61E + 05 1.35E-04 2.92E-10 86 H4H11995P2 643 198 5.52E + 05 5.55E-03 1.01E-08 2 H4H11992P2 743 304 6.41E + 05 2.57E-04 4.01E-10 45 H4H11993P2 601 194 3.64E + 05 7.28E-04 2.00E-09 16 IC = ligação inconclusiva Tabela 9: Parâmetros de cinética de ligação da ligação de loop 2-hFC CD63 EC humano a anticorpos monoclonais anti-CD63 a 37 ºC Nível de 100nM ka kd KD t½ Anticorpo captura de Ligados a Ag (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) H2aM12450N 617 138 4.11E + 05 4.89E-05 1.19E-10 236 H2aM12395N 535 123 5.29E + 05 1.79E-03 3.38E-09 6 H1M12451N 597 118 6.51E + 05 3.31E-04 5.09E-10 35 H1M12386N 455 170 9.21E + 05 6.31E-04 6.85E-10 18 H1M12388N 462 158 1.03E+06 8.87E-04 8.63E-10 13 H2aM12387N 590 196 1.10E + 06 6.57E-04 5.96E-10 18 H3M12361N 425 97 6.51E + 05 3.70E-04 5.68E-10 31 H2aM12452N 421 104 7.79E + 05 8.57E-04 1.10E-09 13 H2aM12392N 626 177 7.65E + 05 4.45E-04 5.82E-10 26 H2bM12454N 586 160 8.68E + 05 7.77E-04 8.95E-10 15 H1M12362N 369 118 6.85E + 05 6.69E-04 9.77E-10 17 H2bM13022N 395 107 5.57E + 05 5.62E-04 1.01E-09 21 H1M12390N 440 134 9.07E + 05 4.95E-04 5.46E-10 23 H2bM12385 642 133 8.27E + 05 1.70E-03 2.05E-09 7 H2aM12394N 753 67 3.27E + 05 5.04E-04 1.54E-09 23 H3M12366N 292 0 NB NB NB NB H4H11990P2 840 338 4.82E + 05 4.96E-05 1.04E-10 233 H4H11997P2 899 342 4.25E + 05 1.91E-05 4.50E-11 603 H4H11998P2 639 111 3.18E + 05 2.07E-03 6.50E-09 6 H4H11996P2 704 294 5.38E + 05 1.42E-04 2.64E-10 81 H4H11995P2 674 116 1.29E + 06 1.88E-02 1.45E-08 1 H4H11992P2 889 358 6.47E + 05 6.82E-04 1.05E-09 17 H4H11993P2 723 156 5.77E + 05 4.57E+03 7.92E-09 3 IC = ligação inconclusiva
[00250] Concorrência cruzada em Octet entre diferentes anticorpos monoclonais anti-CD63
[00251] A competição de ligação entre um painel de anticorpos
127 / 144 monoclonais anti-CD63 foi determinada usando um ensaio de interferometria de biocamada livre de marcadores em tempo real na plataforma de biossensor Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo o experimento foi realizado a 25 °C em 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA e 0,05% v/v Surfactante Tween-20, 1mg/mL BSA, pH 7,4 (HBS-EBT) tampão com a placa agitando no velocidade de 1000 rpm.
Para avaliar se 2 anticorpos são capazes de competir entre si pela ligação aos seus respectivos epítopos no loop 2 CD63 EC humano recombinante expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina de C-terminal (Loop 2-MMH hCD63 EC; SEQ ID: xx), cerca de ~0,61 nm de Loop 2-MMH hCD63 EC foi primeiro capturado nas pontas do biossensor Octet revestidas com anticorpo anti-Penta-His (Fortebio Inc, # 18-5122) submergindo as pontas do biossensor por 3 minutos em poços contendo 20 µg/mL de solução de Loop 2-MMH hCD63 EC.
As pontas do biossensor capturado com antígeno foram então saturadas com o primeiro anticorpo monoclonal anti-CD63 (subsequentemente referido como mAb-1) por imersão em poços contendo solução de 50 µg/mL de mAb-1 por 210 segundos.
As pontas do biossensor foram subsequentemente mergulhadas em poços contendo solução de 50 µg/mL de um segundo anticorpo monoclonal anti-CD63 (subsequentemente referido como mAb-2) durante 120 segundos.
As pontas do biossensor foram lavadas em tampão HBS-EBT entre cada etapa do experimento.
A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante todo o curso do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa foi registrada.
A resposta da ligação de mAb-2 a Loop 2-MMH hCD63 EC pré- complexado com mAb-1 foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais anti-CD63 foi determinado como mostrado na Tabela 10.
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Tabela 10. Concorrência cruzada entre diferentes anticorpos monoclonais anti-CD63 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H1M12451N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H2aM12394N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12394N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2aM12395N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2
129 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H2aM12450N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H2aM12452N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2
130 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H3M12361N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H2bM12454N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H4H11992P2 H4H11993P2 H2bM13022N H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H4H11992P2 H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2
131 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11995P2 H4H11993P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H4H11996P2 H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11997P2
132 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11997P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11998P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H4H11990P2 H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2
133 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11998P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H1M12386N H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12390N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H1M12390N H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H2aM12387N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2aM12387N H2bM13022N H4H11992P2 H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2
134 / 144 mAb-2 competindo com mAb-1 mAb-1 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12392N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N H2bM12454N H2bM13022N H4H11992P2 H2aM12392N H4H11993P2 H4H11995P2 H4H11996P2 H4H11997P2 H4H11998P2 H4H11990P2 H1M12386N H1M12390N H2aM12387N H1M12451N H2aM12394N H2aM12395N H3M12361N H2aM12450N H2aM12452N H3M12366N Geração de anticorpos biespecíficos para determinar a internalização do complexo biespecífico com um grupo de ligação anti-CD63
[00252] Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-CD63 gerados conforme descrito neste exemplo para internalizar como parte de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico, os anticorpos foram reconstruídos em formatos biespecíficos onde um grupo de ligação era o par VH/VL do anticorpo anti-CD63 (ver Tabela 1 anticorpos parentais) e o outro era um grupo de ligação irrelevante. Métodos padrão de produção de anticorpos biespecíficos foram usados, e métodos exemplares são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido US Nº 2010/0331527 e na Patente US Nº US5731168, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência. Os anticorpos biespecíficos foram testados quanto à sua capacidade de internalizar usando células humanas que expressam CD63. Para o ensaio, as células HEK293, que expressam endogenamente CD63
135 / 144 humano, foram plaqueadas a uma densidade de 10.000 células/poço em DMEM contendo 10% de FBS e penicilina-estreptomicina/L-glutamina (Gibco, Cat # 10378016) em preto de fundo transparente Placas Poly de 96 poços revestidas com D-Lisina (Greiner, Cat # 655946). Dois dias depois, o meio foi substituído por meio fresco contendo anticorpos biespecíficos anti- CD63 e um anticorpo de controle negativo em uma série de diluição de 2 vezes começando com 10 µg/mL a 0,157 µg/mL, juntamente com um controle apenas de meio. As células foram então incubadas a 37 °C durante 3 horas para permitir a internalização do anticorpo. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS, fixadas em paraformaldeído a 4% (Thermo Scientific, Cat # 28908) por 20 minutos em temperatura ambiente, e subsequentemente permeablizadas com 0,2% de Triton X-100 (Spectrum Chemical, Cat # TR135) em 5 % de soro de cabra normal (NGS) (Gibco, Cat # PCN5000) por 20 minutos em temperatura ambiente. As células foram então incubadas com 2 µg/mL de Fab IgG Alexa Fluor-647 anticamundongo de burro (Fabricação, Cat # 115-606-006) ou 2 µg/mL de Fab Alexa Fluor- 647 de lgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, Cat # 115-606- 006) em 5% NGS durante 1 hora à temperatura ambiente. A solução de anticorpo secundário foi removida, então as células foram lavadas com PBS e, subsequentemente, PBS fresco contendo 2 gotas/mL de NucBlue (Invitrogen, CAT # R37605) foi adicionado para corar núcleos de células vivas. A internalização e os núcleos do anticorpo foram capturados em 40x no ImageXpress High-Content Imaging System (Molecular Devices) e a internalização do anticorpo foi quantificada usando o MetaXpress Software Transfluor Application Module (Molecular Devices). A internalização do anticorpo é relatada como intensidade integrada do poço por ± desvio padrão da célula (DP).
[00253] Como mostrado na Tabela 11, todos os anticorpos biespecíficos que incorporam uma ligação de grupo único a CD63 humano
136 / 144 (derivado de H1M12451, H2M12450, ou H2M12395) e um grupo de não ligação irrelevante demonstraram internalização eficiente em células HEK293. O anticorpo biespecífico incorporando um grupo de ligação de mAb12450 demonstrou uma maior quantidade de internalização do que os outros anticorpos biespecíficos testados. Tabela 11: Internalização de anticorpos biespecíficos anti-CD63 por células HEK293 Internalização do anticorpo (intensidade integrada do poço) ± SD Concentração de H2M12395N H2M12450N H1M12451N Ab de controle anticorpo (µg/mL) biespecífico biespecífico biespecífico negativo 10 1.05E+06 ± 4.34E+06 ± 8.26E+05 ± 4.58E+03 ±
4.56E+05 8.77E+05 2.67E+05 6.50E+03 5 1.07E+06 ± 4.31E+06 ± 5.45E+05 ± 1.23E+03 ±
4.06E+05 5.48E+05 5.20E+04 8.85E+02 2,5 2.73E+05 ± 3.92E+06 ± 3.27E+05 ± 7.70E+02 ±
6.01E+04 5.80E+05 1.06E+05 6.09E+02 1,25 1.89E+05 ± 2.72E+06 ± 1.20E+05 ± 1.43E+03 ±
6.61E+04 2.63E+05 3.91E+04 1.19E+03 0,625 2.03E+05 ± 1.75E+06 ± 7.87E+04 ± 3.37E+03 ±
9.37E+04 1.39E+05 1.07E+04 5.22E+03 0,3125 3.95E+04 ± 8.57E+05 ± 3.77E+04 ± 1.99E+03 ±
8.23E+03 1.60E+05 1.22E+04 2.19E+03 0,15625 2.81E+04 ± 2.42E+05 ± 7.23E+03 ± 1.87E+03 ±
1.30E+04 2.54E+04 6.09E+03 1.16E+03 0 3.72E+03 ± 8.21E+03 ± 1.66E+04 ± 1.10E+03 ±
1.66E+03 3.47E+03 1.80E+04 1.56E+03 Exemplo 2: Construção de polinucleotídeo anti-hCD63 ScFv::GAA e vetor de terapia gênica
[00254] Vírus AAV2/8 que codificam para a expressão de GAA humano (hGAA; SEQ ID NO: 369) ou um fragmento variável de cadeia única de CD63 anti-humano (ScFv) fundido em seu terminal C com GAA humano (anti-hCD63 ScFv-hGAA) são gerados usando um protocolo de transfecção tripla padrão (Gray et al. 2011; ver também "Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in vitro and in vivo administration", Current Protocols in Neuroscience, John Wiley & Sons, New York (1999), pp. 4.17.1-4.17.25, Vol 1). Para a produção, 1×107 células HEK293 são semeadas em placas de 15 cm. No dia seguinte, as células são transfectadas com (A) 8 μg de um vetor pAAV de controle compreendendo um potencializador de serpina 1 específico do fígado (SEQ ID NO: 367) e o
137 / 144 promotor TTR codificador (SEQ ID NO: 368) conduzido por GAA humano ou pAAV de teste compreendendo um potencializador de serpina 1 específico do fígado (SEQ ID NO: 367) e que codifica um promotor TTR (SEQ ID NO: 368) dirigido por hCD63 ScFv-hGAA (ver, por exemplo, Figura 2) e (B) vetor derivado de pAAV RC2/8 (Gao, 2002) e 16 μg de pHelper (Agilent, Cat # 240074) usando PEIpro (Polyplus transfection, New York, NY catalog # 115-100) transfecção mediada na proporção de 1:1 (1ul PEIpro: 1μg DNA). Setenta e duas horas após a transfecção, as células são coletadas e lisadas num tampão constituído por Tris-HCl 20 mM, MgCl2 1 mM, KCl 2,5 mM, NaCl 100 mM usando um método padrão de congelamento-descongelamento. Em seguida, a benzonase (Sigma, Cat # E1014-25KU) é adicionada às amostras em uma concentração final de 0,5 U/μL e, em seguida, incubada a 37 °C por 60 minutos. Os vírus são purificados usando ultracentrifugação de gradiente de iodixanol, conforme descrito em (Zolotukhin et al., 1999, Gene Ther 1999; 6: 973–985) e posteriormente titulados por qPCR.
[00255] As amostras de AAV são tratadas com DNaseI (Thermofisher Scientific, Cat # EN0525) a 37 °C por uma hora e lisadas usando extrato de DNA de todos os reagentes (Thermofisher Scientific Cat # 4403319). Os genomas virais encapsidados são quantificados usando um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3 (Thermofisher Scientific), usando primers direcionados às ITRs de AAV2. As sequências dos primers ITRs de AAV2 são 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ (fwd ITR; SEQ ID NO:370) e 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′ (rev ITR; SEQ ID NO:371) (Aurnhammer et al., 2012), derivou a sequência de repetição interna invertida (ITR) do AAV (SEQ ID NO: 365) e a sequência de repetição interna invertida (ITR) do AAV (SEQ ID NO: 366), respectivamente. A sequência da sonda de ITRs de AAV2 é 5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3 ′ (SEQ ID NO: 372) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18-28). Após uma etapa de ativação de 95 °C por 10 min, um
138 / 144 ciclo de PCR de duas etapas é realizado a 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 30 segundos por 40 ciclos. O TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermofisher Scientific, Cat # 4304437) é usado no qPCR. O plasmídeo de DNA (Agilent, Cat # 240074) é usado como padrão para determinar os títulos absolutos.
[00256] Anticorpos anti-CD63 humano e suas fusões usam os domínios variáveis anti-CD63 apresentados na Tabela 1. As versões ScFv dos anticorpos são clonadas com domínios variáveis em ordem pesada-leve com um ligante glicina-serina no meio (5'-VH- Gly-Ser-VL-3 ').
[00257] AAV que codifica um anti-hCD63 scFv::GAA terapêutico de múltiplos domínios tendo uma sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 364 (FIG. 2) foi gerado e testado quanto à eficácia no fornecimento de tratamento de substituição de enzima Exemplo 3: Conteúdo de glicogênio no modelo Murine Pompe pós-AAV
[00258] Para determinar o efeito da fusão anti-hCD63 ScFv-GAA distribuída por AAV (SEQ ID NO: 364) versus GAA distribuída por AAV, em um modelo de armazenamento de glicogênio relevante in vivo, ambas as terapias são distribuídas a um modelo de camundongo com doença de Pompe em que os camundongos são homozigotos para a deleção do gene GAA de camundongo e são homozigotos para a expressão de CD63 humano no lugar de CD63 de camundongo com uma cepa de fundo de 75% C57BL/6; 25% 129SvJ. Estes camundongos são referidos neste documento como camundongos CD63 HumIn GAA KO ou, alternativamente, como CD63hu/hu; camundongos GAA-/-.
[00259] Para o experimento, CD63 HumIn GAA KO de 2 meses de idade foram administrados via injeção na veia da cauda com o vírus AAV2/8 contendo um genoma com o promotor específico do fígado TTR que direciona o GAA humano (AAV-hGAA; descrito no Exemplo 2) ou o promotor TTR específico do fígado que dirige o anti-CD63 ScFv humano
139 / 144 fundido no seu terminal C com GAA humano (AAV-anti-hCD63 ScFv- hGAA; descrito no Exemplo 2). Ambos os vírus AAV2/8 são entregues em uma das duas doses, 1e10 vg/camundongo ou 1e11 vg/camundongo. Como controles, camundongos CD63 HumIn GAA KO não tratados e CD63 HumIn não tratados com o gene GAA de camundongo intacto estão incluídos no ensaio. Os camundongos são alojados por 3 meses após o tratamento e sangrados incrementalmente (mensalmente) durante este período para medições de níveis séricos de GAA e anticorpos anti-GAA. Após 3 meses, todos os camundongos são sacrificados e os tecidos individuais são coletados para medições de glicogênio, coloração de PAS-H, quantificação de núcleos centrais, medição de proliferação lisossomal e medição da expressão de LC3b. A dosagem experimental e o protocolo de tratamento para grupos de camundongos são mostrados na Tabela 12. Tabela 12: Dosagem experimental e protocolo de tratamento para grupos de camundongos Número de Grupo Camundongos Tratamento Dosagem Camundongos 1 CD63 HumIn GAA KO 4 Nenhum N/A 2 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA 1e10 vg/camundongo 3 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA 1e11 vg/camundongo AAV-anti-hCD63 ScFv- 4 CD63 HumIn GAA KO 5 1e10 vg/camundongo hGAA AAV-anti-hCD63 ScFv- 5 CD63 HumIn GAA KO 4 1e11 vg/camundongo hGAA 6 CD63 HumIn GAA WT 2 Nenhum N/A Exemplo 4: Resposta imunológica a GAA
[00260] Para medir os níveis séricos de anticorpos anti-GAA humanos, o soro de todos os grupos de tratamento é separado do sangue coletado durante o sangramento terminal usando tubos separadores de soro (BD Biosciences, Cat # 365967) de acordo com as especificações do fabricante. Separadamente, placas de 96 poços de alta ligação de proteína (ThermoFisher, Cat # 15041) são revestidas com 20µg de hGAA (R&D Systems, Cat # 8329- GH-025) diluído em PBS durante a noite. As placas são lavadas com PBS + Tween a 0,05% (PBS-T) 3 vezes. As placas são bloqueadas com 0,5% BSA
140 / 144 em PBS-T, e diluições em série de soro de camundongo variando de 1:300 a 1:5.1e7 são adicionadas à placa durante a noite. IgG anticamundongo total (subclasses 1 + 2a + 2b + 3) é medido usando um anticorpo IgG de cabra anticamundongo conjugado com HRP (Jackson Immuno Research, Cat # 115- 035-164) e o kit de substrato BD Opt EIA. As reações colorimétricas são interrompidas com ácido fosfórico 1 N. A absorvância é então lida a 450 nm em um leitor de placas Spectramax i3 (Molecular Devices). As curvas de diluição são ajustadas às curvas sigmoidais e os títulos são calculados a partir das curvas.
[00261] Em experiências realizadas de forma semelhante, níveis mais elevados de GAA ou anti-hCD63scFv::GAA (SEQ ID NO: 364) após a administração de AAV foram correlacionados com títulos de anti-GAA mais baixos (dados não mostrados). O soro de camundongos GAA nulos tratados com títulos altos ou baixos de AAV-anti-hCD63scFv::GAA (SEQ ID NO: 364) ou AAV-GAA foram avaliados para anticorpos anti-GAA ao longo de três meses após a injeção. Foi observada uma correlação negativa entre o título de anticorpos e a exposição do soro ao GAA, e uma correlação inversa entre as doses do construto e o título de anticorpos anti-GAA (dados não mostrados). Exemplo 5: Soro de GAA
[00262] Para medir os níveis séricos de GAA humanos ao longo do experimento, as amostras são coletadas em pontos de tempo mensais via sangramento da cauda. O soro é separado do sangue usando tubos separadores de soro (BD Biosciences, Cat # 365967) de acordo com as especificações do fabricante. 1 µL de soro isolado é então carregado em um gel pré-moldado Novex wedgewell 4-20%, executado a 220 V por 45 minutos e transferido para membrana de nitrocelulose a 200 mA por 1 hora usando procedimentos padrão. A membrana de nitrocelulose é então sondada com um anticorpo primário anti-GAA (Abcam, # ab137068) usado em uma diluição de 1: 2000 e
141 / 144 um anticorpo anti-GAPDH (Abcam, # AB9484) usado em uma diluição de 1: 1000 em 12mL e incubado durante a noite a 4 °C. Após a incubação do anticorpo primário, a membrana é lavada três vezes com 1 x TBST por 5 minutos por lavagem. IgG anticoelho (LiCor, 926-32211) e IgG anticamundongo (LiCor, 925-68070) (LiCor, Lincoln, NE) anticorpos secundários em uma diluição de 1: 15000 em 12mL são então adicionados à membrana e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação do anticorpo secundário, a membrana é lavada duas vezes com 1 x TBST por 5 minutos por lavagem e uma vez com 1 x TBS por 5 minutos. A membrana é então fotografada e quantificada usando um instrumento LiCor Odyssey (LI- COR Biotechnology).
[00263] Em experimentos semelhantes aos descritos acima, camundongos CD63 HumIn GAA KO tratados com a dose alta (1011 vg/camundongo) de AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA (SEQ ID NO: 364) ou AAV-hGAA demonstraram níveis sustentados de GAA em o soro ao longo do experimento (dados não mostrados).
[00264] As quantificações de PCR em tempo real da expressão em lisados de fígado, coração e quadríceps 3 meses após a injeção foram realizadas. A expressão hepática foi detectada para todas as injeções do construto AAV, e uma comparação do nível de GAA no soro com o nível de expressão de RNA de GAA também foi feita. Os dados (não mostrados) sugeriram que o AAV que codifica a proteína de fusão apresentada como SEQ ID NO: 364 (e a expressão é conduzida por um promotor específico do fígado) atinge um perfil de secreção melhorado para GAA. Exemplo 6: Medição de tecido de glicogênio e caracterização histológica de tecido muscular
[00265] Medições de glicogênio nos tecidos: para medir o conteúdo de glicogênio em tecidos individuais, coração, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, sóleo e tecido EDL são dissecados de camundongos de todos os
142 / 144 grupos imediatamente após asfixia com CO2 e, em seguida, congelados em nitrogênio líquido e armazenados em -80 ºC. ~50 mg de cada tecido são lisados em um homogeneizador de bancada com contas de aço inoxidável em água destilada em uma razão de 1 mg a 25 µl de água para medições de glicogênio. Os lisados de análise de glicogênio são aquecidos a 105 ° durante 15 minutos e centrifugados a 21000 xg para limpar os resíduos. As medições de glicogênio são realizadas usando um kit de ensaio de glicogênio (Sigma- Aldrich, # MAK016) de acordo com as instruções do fabricante para ensaios fluorométricos. A fluorescência de cada amostra é medida a 535 nm de excitação e 587 nm de emissão em um leitor de placa de fluorescência (Molecular Devices, Spectramax i3). A quantidade calculada de glicogênio é calculada usando a seguinte fórmula fornecida pelo fabricante.
[00266] Coleta de quadríceps para histopatologia e quantificação: Amostras de tecido de quadríceps de camundongos de cada grupo além do grupo de tratamento de baixa dose (1e10 vg/camundongo) são congeladas imediatamente após a dissecção em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC para quantificação da expressão de LC3b ou são colocadas em blocos contendo meio OCT (Tissue-Tek, # 4583).
[00267] Amostras de tecidos em meio OCT são enviadas para Histoserv, Inc (Germantown, MD) para seccionamento e coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) para detectar polissacarídeos. Secções adicionais são preparadas e devolvidas para coloração de núcleos centrais e proliferação lisossomal.
[00268] Coloração PAS: as seções de coloração PAS são fotografadas usando um scanner de slides Leica com ampliação de 20x.
[00269] Quantificação dos núcleos centrais e proliferação lisossomal: Seções não coradas de Histoserv são removidas do freezer e então fixadas com paraformaldeído 4% em PBS por 15 minutos em uma câmara de coloração. As lâminas fixadas são então lavadas duas vezes durante 5 minutos
143 / 144 em PBS e subsequentemente incubadas com tampão de bloqueio (eBiosciences, 00-4953-54) durante 1 hora à temperatura ambiente. As lâminas são então coradas com um anticorpo anti-Lamp-1 de rato (Abcam, # AB25245) a uma diluição de 1:50 em tampão de bloqueio, um anticorpo anti- laminina de coelho (Sigma, # L9393) a uma diluição de 1: 1000 em tampão de bloqueio, ou tampão de bloqueio sem anticorpo adicionado, enquanto em uma câmara de coloração umidificada e, em seguida, transferidos a 4 ºC para incubação durante a noite. No dia seguinte, as lâminas são então lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS e subsequentemente coradas com anticorpo secundário superclonal de cabra anticoelho IgG (H+L) conjugado com Alexa Fluor 647 (Life Tech Thermo, # A27040) ou cabra anticamundongo IgG (H+L) com adsorção cruzada de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 555 (Life Tech Thermo, # A21434) em uma câmara de coloração e depois incubado por 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas coradas são então lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS antes de serem montadas com Fluoromount-G com DAPI (Life Tech Thermo, # 00-4959-52) e fotografadas em um instrumento Zeiss LSM710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH). O número de núcleos centralizados é quantificado usando o software Halo (Indica Labs, NM).
[00270] Quantificação da expressão de LC3b: Para a quantificação da expressão de LC3b, as amostras congeladas são descongeladas, homogeneizadas e, em seguida, lisadas em tampão RIPA em uma proporção de tecido de 1 mg para 25 µL de tampão RIPA (NaCl 150 mM, IGEPAL® CA-630 1,0%, desoxicolato de sódio 0,5%, SDS a 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0, Sigma Aldrich, R0278) por impactação de grânulo durante 45 segundos (MP Biomedical). Os lisados são eliminados do material insolúvel por centrifugação a 21.000 xg e, em seguida, 300 µg de lisado em tampão RIPA são carregados em um gel pré-moldado Novex wedgewell 4-20%, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e analisados por western
144 / 144 blot usando um protocolo semelhante ao anterior descrito para a análise dos níveis séricos de GAA, substituindo o uso de anticorpo primário que reconhece LC3b-I e LC3b-II de camundongo (Sigma, # L7543) no lugar do anticorpo primário contra GAA.
A membrana foi então fotografada e quantificada usando um instrumento LiCor Odyssey (LI-COR Biotechnology). Níveis LC3b-I e LC3b-II expressos como (média +/- desvio padrão) em unidades arbitrárias.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela ou compete pela ligação ao CD63 humano com um anticorpo de referência compreendendo um HCVR/Par de sequência de aminoácidos de LCVR conforme estabelecido na Tabela 1.
2. Anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de referência compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em estabelecido como SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs: 290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282, e SEQ ID NOs: 330/282.
3. Anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo no CD63 humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela 1.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo no
CD63 humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 2/10, SEQ ID NOs: 18/26, SEQ ID NOs: 34/42, SEQ ID NOs: 50/58, SEQ ID NOs: 66/74, SEQ ID NOs: 82/90, SEQ ID NOs: 98/106, SEQ ID NOs: 114/122, SEQ ID NOs: 130/138, SEQ ID NOs: 146/154, SEQ ID NOs: 162/170, SEQ ID NOs: 178/186, SEQ ID NOs: 194/202, SEQ ID NOs: 210/218, SEQ ID NOs: 226/234, SEQ ID NOs: 242/250, SEQ ID NOs: 258/266, SEQ ID NOs: 274/282, SEQ ID NOs: 290/282, SEQ ID NOs: 298/282, SEQ ID NOs: 306/282, SEQ ID NOs: 314/282, SEQ ID NOs: 322/282, e SEQ ID NOs: 330/282.
5. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compete pela ligação ao CD63 humano com o anticorpo anti-CD63 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga um antígeno alvo.
6. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o antígeno alvo é um antígeno associado a tumor.
7. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno não se liga às células humanas que expressam CD63, mas não ao antígeno alvo, por exemplo, se liga apenas às células humanas que expressam tanto CD63 quanto o antígeno alvo.
8. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizada pelo fato de que cada um dentre o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é totalmente humano.
9. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno se liga tanto a CD63 humano quanto a um antígeno alvo humano expresso em uma célula e induz a internalização e/ou degradação de CD63 do antígeno alvo humano em essa célula.
10. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo não é internalizado por células que expressam CD63 humano, mas não expressam o antígeno alvo humano.
11. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é totalmente humano.
12. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-11, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga a CD63 humano com uma baixa afinidade de ligação, de modo que o anticorpo não se liga às células que expressam o CD63 humano sozinho, mas se liga às células que expressam ambos CD63 humano e o antígeno alvo.
13. Proteína terapêutica de múltiplos domínios, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, e um domínio de enzima.
14. Proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o domínio da enzima compreende GAA, ou uma porção biologicamente ativa dele.
15. Proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:
364.
16. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência que codifica o anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-12, ou a proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15.
17. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos é um vetor AAV que codifica a proteína terapêutica de múltiplos domínios de qualquer uma das reivindicações 13-15.
18. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende ainda a sequência apresentada como SEQ ID NO: 365 e SEQ ID NO: 366.
19. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende ainda um potencializador específico do fígado e/ou promotor específico do fígado.
20. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o potencializador específico do fígado compreende uma sequência apresentada como SEQ ID NO: 367 e/ou o promotor específico do fígado compreende a sequência apresentada como SEQ ID NO: 368.
21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD63 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-12, a proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15, ou o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 16-20, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
22. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-CD63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-12, a proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15, ou o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 16-20 para uso em medicina.
23. Composto de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio associado a CD63.
24. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado a CD63 é selecionado do grupo que consiste em doenças dependentes de mastócitos (MC-), artrite reumatoide, reações alérgicas dependentes de IgE e reação alérgica mediada por Fc-ER1, asma, câncer e/ou metástases.
25. Composto da reivindicação 22, para utilização na identificação e/ou isolamento de exossomas.
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