CN111004324A - 一种钙卫蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钙卫蛋白单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1‑3和轻链可变区的VLCDR1‑3序列及其制备方法和在炎症性肠病免疫检测中的应用，当cutoff值设150μg/g时，用于诊断炎症性肠病的灵敏度72％，阴性预测值90％以上。本发明成功获得鼠单克隆杂交瘤细胞株的基础上，测序并获得有效的抗体，应用该重组抗体制备定性或定量检测试剂盒具有性能稳定，定量准确等优点，能够实现对样本中钙卫蛋白高灵敏度、高特异性快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种钙卫蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
粪钙卫蛋白(faecal calprotectin，FC)是一种分子量为36kDa的钙和锌的结合蛋白，是S100A8/A9结合蛋白基因的表达。其成分在中性粒细胞的细胞质所含比例最高，占30％～40％，是急性炎性细胞活化的标志物。其中粪便钙卫蛋白定量检测成为炎症性肠病、肠癌等肠道器质性疾病的重要标志物。
钙卫蛋白是由两条分子量14kD的重链(MRP14)和一条分子量为8kD的轻链(MRP8)以共价键连接而成的异三聚体蛋白，每条链可以结合两个钙离子，在钙离子存在的情况下具有抗蛋白酶的活性，并因具有螯合锌离子的能力而具有抗热性，这些特性使得钙卫蛋白在肠腔和外界环境中可以长期保持稳定而不被各种酶和细菌破坏。
目前虽然钙卫蛋白在人类生物体中多处被发现，包括：血清、唾液、脑脊液和尿液。但在粪便中容易测得，且其成分稳定，室温下可在大便中稳定存在7d左右，且不易被细菌和各种酶类破坏，不受饮食的影响。粪便钙卫蛋白(Faecal Calprotein，FC)测定具有无创伤性、操作简便、痛苦小、价格便宜等优点，临床实用性较强。
但是免疫学定量检测时需要检测到三聚体，如果用一对分别识别轻链和重链的单抗检测，可能导致检测结果不准确。
因此，亟待产生一种特异性结合能力强、识别准确度高的钙卫蛋白聚合体的单克隆抗体。
同时研究发现，在炎症性肠病(IBD)患者的粪便中的钙卫蛋白水平明显高于结肠癌患者及肠易激综合征(IBS)患者，并且与患者病变程度呈正相关。检测粪便中的钙卫蛋白可以作为区分炎症性肠病、结肠癌、肠易激综合征，并用来监测炎症性肠病的活动性，对疾病的复发、治疗效果具有重要指导意义。目前用于检测钙卫蛋白的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，ELISA法虽然灵敏度较高，但是操作比较繁琐，检测耗时比较长，并且检测设备较大不便于移动，因此需要一个操作简便、检测快速的方法来检测钙卫蛋白的含量。
发明内容
为了解决现有技术的问题，一方面，本发明提供了一种识别多聚体钙卫蛋白不识别单体蛋白的单克隆抗体，所述钙卫蛋白单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；
VHCDR1：GGATTCACTAGTAGCTATGCC
VHCDR2：ATTAGTAGTTATGGTAGCACC
VHCDR3：GCAACCTACAGGTACGAAGGGTTTGCTTAC
VLCDR1：ACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTAT
VLCDR2：GGTACCAAC
VLCDR3：GCTCTATGGTACAGCAACCTTTGGGTG。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1-3所示：
SEQ ID NO：1Gly-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Ala
SEQ ID NO：2Ile-Ser-Ser-Tyr-Gly-Ser-Thr
SEQ ID NO：3Ala-Thr-Tyr-Arg-Tyr-Glu-Gly-Phe-Ala-Tyr。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4-6所示：
SEQ ID NO：4Thr-Gly-Ala-Val-Thr-Thr-Ser-Asn-Tyr
SEQ ID NO：5Gly-Thr-Asn
SEQ ID NO：6Ala-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Trp-Val。
另一方面，本发明公开了上述钙卫蛋白单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
所述钙卫蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株制备方法包含以下步骤：
1)用天然钙卫蛋白聚合体蛋白作为免疫抗原；
2)用1)制备的天然蛋白免疫小鼠；
3)骨髓瘤细胞悬液和免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞进行细胞融合；
4)培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，筛选对天然钙卫蛋白聚合体反应，但对单体蛋白不反应的阳性克隆，获得所述杂交瘤细胞株；
5)对4)杂交瘤可变区基因测序，获得VHCDR1-3和VLCDR1-3。
又一方面，本发明公开了一种上述钙卫蛋白单克隆抗体在炎症性肠病免疫检测工具中的应用；
所述免疫检测工具包括炎症性肠病检测试剂盒。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述炎症性肠病检测试剂盒包括：
免疫比浊法试剂的组成：试剂R1为样本稀释液及缓冲液；试剂R2为包被有钙卫蛋白抗体的乳胶微球溶液；定标品A-H或含有定标信息的定标芯片卡。
免疫层析试剂的组成：PVC胶板，设置于PVC胶板上表面的硝酸纤维素膜、吸水垫、有色微粒/荧光微粒结合物垫、样本垫，以及设置于硝酸纤维素膜上表面的检测线和质控线；
所述有色微粒/荧光微粒结合物垫喷涂有色微粒或荧光微粒与鼠抗人钙卫蛋白单克隆抗体结合物；
所述检测线为包被有固相化的鼠抗人钙卫蛋白单抗的检测线。
本发明具有如下有益效果：
本发明克服了现有技术中由于抗原是异源多聚体，有效抗体筛选难度大等问题，用多抗包被磁性微球，在高值样本中用亲和纯化方法获得天然钙卫蛋白，用双重筛选法获得能跟多聚体钙卫蛋白结合，但不跟单体蛋白结合的克隆株。多聚体特异的单抗在制备粪便钙卫蛋白免疫比浊法检测试剂时具有交联效果好，检测灵敏度高等优势。
此外，为了克服杂交瘤细胞长期的细胞增殖和蛋白表达可导致抗体基因发生突变以致表达的抗体失效，本发明应用杂交瘤细胞测序技术对单抗基因的可变区进行测序，获得重链VHCDR1-3和轻链VLCDR1-3序列。根据这些序列，现有技术能重组鼠源、人源及其他种类的单抗，顺转或稳转哺乳动物细胞，大批量长期稳定表达单抗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种钙卫蛋白体外诊断试剂盒的校准曲线；
图2是本发明实施例提供的一种钙卫蛋白荧光免疫层析试剂盒的校准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供了一种钙卫蛋白单克隆抗体，所述钙卫蛋白单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；
VHCDR1：GGATTCACTAGTAGCTATGCC
VHCDR2：ATTAGTAGTTATGGTAGCACC
VHCDR3：GCAACCTACAGGTACGAAGGGTTTGCTTAC
VLCDR1：ACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTAT
VLCDR2：GGTACCAAC
VLCDR3：GCTCTATGGTACAGCAACCTTTGGGTG。
其中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1-3所示：
SEQ ID NO：1Gly-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Ala
SEQ ID NO：2Ile-Ser-Ser-Tyr-Gly-Ser-Thr
SEQ ID NO：3Ala-Thr-Tyr-Arg-Tyr-Glu-Gly-Phe-Ala-Tyr。
其中，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4-6所示：
SEQ ID NO：4Thr-Gly-Ala-Val-Thr-Thr-Ser-Asn-Tyr
SEQ ID NO：5Gly-Thr-Asn
SEQ ID NO：6Ala-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Trp-Val。
实施例2
本发明进一步公开了上述鼠抗人钙卫蛋白单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
所述钙卫蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株制备方法包含以下步骤：
1)用提取自中性粒细胞的天然钙卫蛋白作为免疫抗原；
2)用1)制备的天然钙卫蛋白免疫小鼠；
3)骨髓瘤细胞悬液和免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞进行细胞融合；
4)培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，用天然钙卫蛋白聚合体进行筛选，剔除与蛋白单体反应的克隆，获得所述杂交瘤细胞株；
为使克服杂交瘤细胞株不稳定，易退化等问题，所述杂交瘤细胞株，提取mRNA，对抗体的重链和轻链可变区进行基因序列，获得CDR1-3序列。
在本发明实施例中，上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建如实施例1所述的重链可变区VHCDR1-3的gamma链和alpha链；
S2、构建如实施例1所述的轻链可变区VLCDR1-3的鼠源kappa链；
S3、将gamma链质粒和kappa链质粒共转染细胞，表达纯化获得重组单克隆抗体IgG1；
S4、转染后的细胞进行长期驯化获得稳定表达抗体的细胞株。
具体地，钙卫蛋白杂交瘤的制备
1.天然钙卫蛋白抗原提取纯化
收集粪便钙卫蛋白含量大于1800ug/g的样本，用钙卫蛋白萃取液萃取，离心取上清；羊抗人钙卫蛋白多抗包被磁性微球，0.5％BSA封闭未结合微球表面；把微球与样本萃取液混合，搅拌，4度过夜。用磁性分离器依附磁性微球，PBS洗5遍，用pH为3.5的PBS重悬磁微球，使抗原抗体解离，收集液加入含钙离子的PBS溶液(pH值8-9)中，调溶液pH值至中性；过分子筛或超滤管，去除单体蛋白。所得蛋白即为多聚体钙卫蛋白。非变性PAGE胶电泳推测蛋白纯度大于90％。钙卫蛋白抗原作为免疫原，同时用于单克隆细胞的筛选。
2.动物免疫
纯化的钙卫蛋白抗原与完全弗氏佐剂等体积混和，用双注射器互推法乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg抗原，3天后进行细胞融合。
3.细胞融合
融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个SP2/0骨髓瘤细胞悬液和5×107个来源于SPF级Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶5)至一个50ml离心管中，补加30mlIMDM不完全培养基，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基IMDM8ml终止融合，2min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入10ml HAT(SIGMA)培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
4.筛选和克隆
融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μl，第10天可用间接ELISA法测杂交瘤效价，第14天换HT(SIGMA)培养基(含饲养细胞和1％HT液体)的96孔板中。放入5％CO2细胞培养箱。
一筛：挑克隆后3天左右，观察细胞量大约占底面积2/3时，取100μL上清ELISA(用天然提取钙卫蛋白及重组)筛选。阳性克隆进行换液，添加200μL完全培养基(含1％HT液体)；
二筛：2天后重复步上述步骤进行二次筛选。阳性株转入预先准备好培养基(含饲养细胞和1％HT液体)的24孔板；
三筛：5天后，再次筛选，符合要求的克隆转入细胞培养瓶扩大培养。
由上述杂交瘤细胞制备抗钙卫蛋白单克隆抗体
1.腹水制备
10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×106/只。待小鼠腹水积聚后收集腹水。
2.单克隆抗体纯化
将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用用0.45μm膜过滤。protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。
3.ELISA法鉴定单克隆抗体亚类
具体的实验操作过程：
用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(中杉金桥)稀释至0.5μg/mL，每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBST)洗3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗3次。每孔加入0.1mL杂交瘤上清，37℃孵育1小时。倾空液体用PBST清洗3次。用封闭液1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1∶2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体0.1mL每孔，分别加入适当的孔中，37℃用孵育1小时。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL底物溶液，10-20分钟内测450nm波长下的OD值。
实验结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。
实施例3
本发明实施例公开了一种上述钙卫蛋白单克隆抗体在炎症性肠病免疫检测工具中的应用；
免疫检测工具包括炎症性肠病检测试剂盒。
(一)钙卫蛋白免疫比浊法定量检测试剂盒
在本实施例中，将实施例1中得到的钙卫蛋白单克隆抗体标记乳胶微球，粒径200-300nm，用3-吗啉丙磺酸缓冲液配制微球浓度0.2-1.5％，缓冲剂含抗体稳定剂、防腐剂等组分。
钙卫蛋白体外诊断试剂盒的制备和操作如下：
1.R1试剂的配制：
3-吗啉丙磺酸缓冲盐溶液：0.2-1.0M、pH7.0-7.5的3-吗啉丙磺酸缓冲液
2.R2试剂的配制：用R1配制乳胶微球浓度为0.5％，加防腐剂proclin 300浓度0.01-0.03％。
3.试剂盒的组成：
4.检测步骤
取样本或校准品及R1混匀，37℃孵育5min；加入R2混匀，37℃孵育1min后，读取各管吸光度值A1，反应4-5分钟后，读取各管吸光度值A2。反应吸光度ΔA的计算：ΔA＝A2-A1
5.结果判定：
钙卫蛋白免疫比浊法定量检测试剂盒钙卫蛋白校准品浓度0μg/g、50μg/g、200μg/g、500μg/g、1000μg/g、2000μg/g，平均反应吸光度ΔA值为0.026、0.143、0.352、0.468、0.613、0.776，以校准品浓度和对应反应吸光度进行二次多项式拟合，绘制校准曲线，R2＝0.9953，见图1。
(二)粪便钙卫蛋白免疫层析定量检测试剂盒
在本实施例中，将实施例1中得到的鼠抗人钙卫蛋白单克隆抗体标记胶体金颗粒或荧光微球，粒径100-300nm，标记的胶体金颗粒或荧光微球可喷在结合垫上，或者独立包装用于跟样本反应。
粪便钙卫蛋白免疫层析定量检测试剂盒包括：
1.试剂卡
包括PVC胶板，设置于PVC胶板上表面的硝酸纤维素膜、吸水垫、有色微粒/荧光微粒结合物垫、样本垫，以及设置于硝酸纤维素膜上表面的检测线和质控线。
2.粪便钙卫蛋白萃取液
含有3.0M尿素、0.35M磷酸盐、0.12M三氨基甲烷。
3.校准曲线芯片卡
所述标准品A-F为定值分别为0μg/g、50μg/g、200μg/g、500μg/g、1000μg/g、2000μg/g，将校准品加入试剂卡加样孔，每个浓度平行测定3次。反应10min后，以免疫层析读数仪检测其反应信号强度，得到各校准品对应的T/C值，数据见表1。以校准品浓度与其对应的T/C值进行线性拟合，绘制校准曲线，R2＝0.9945，见图2，并将曲线信息烧制到芯片卡上，得到校准曲线芯片卡。
表1：校准品对应的T/C值
4.样本稀释液
含有1％BSA、0.2％吐温20的硼酸盐缓冲液
5.检测步骤
将提取后的样本稀释后加入到试剂卡加样孔中，反应10min后，以免疫层析读数仪检测其反应信号强度并根据校准曲线芯片卡直接得出标本钙卫蛋白浓度结果。
对30例IBD患者和82例健康者按上述方式进行粪便钙卫蛋白检测，患者粪便中的钙卫蛋白含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。
表2：两组样本钙卫蛋白浓度比较
在本发明实施例中，采用的测序方法为：
采集指数生长期的杂交瘤细胞用现有的常规技术杂交瘤的轻链和重链可变区基因进行检测，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的基因序列分别为SED ID：7～9，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的基因序列分别为SEQ ID：10～12。
或者，对纯化的抗体蛋白进行可变区氨基酸序列测定，具体方案是先用变性凝胶电泳，使轻链和重链分离，对轻链和重链分别进行酶解及质谱测定，根据不同氨基酸的特定质谱信息，获得轻链和重链可变区的完整序列。
本发明具有如下有益效果：
本发明克服了现有技术中由于抗原是异源多聚体，有效抗体筛选难度大等问题，用多抗包被磁性微球，在高值样本中用亲和纯化方法获得天然钙卫蛋白，用双重筛选法获得能跟多聚体钙卫蛋白结合，但不跟单体蛋白结合的克隆株。多聚体特异的单抗在制备粪便钙卫蛋白免疫比浊法检测试剂时具有交联效果好，检测灵敏度高等优势。
此外，为了克服杂交瘤细胞长期的细胞增殖和蛋白表达可导致抗体基因发生突变以致表达的抗体失效，本发明应用杂交瘤细胞测序技术对单抗基因的可变区进行测序，获得重链VHCDR1-3和轻链VLCDR1-3序列。根据这些序列，现有技术能重组鼠源、人源及其他种类的单抗，顺转或稳转哺乳动物细胞，大批量长期稳定表达单抗。
上述所有可选技术方案，可以采用任意结合形成本发明的可选实施例，在此不再一一赘述。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州和锐生物科技有限公司
<120> 一种钙卫蛋白单克隆抗体及其应用
<130> 钙卫蛋白单克隆抗体
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Mouse cytomegalovirus 1
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gcaacctaca ggtacgaagg gtttgcttac 30
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<400> 4
actggggctg ttacaactag taactat 27
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<400> 5
ggtaccaac 9
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<400> 6
gctctatggt acagcaacct ttgggtg 27
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(21)
<400> 7
Gly Leu Tyr Pro His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr
1 5 10 15
Tyr Arg Ala Leu Ala
20
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(21)
<400> 8
Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Glu Arg Thr His Arg
20
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(29)
<400> 9
Ala Leu Ala Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Gly
1 5 10 15
Leu Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Arg
20 25
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<400> 10
Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr His Arg Thr
1 5 10 15
His Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Thr Tyr Arg
20 25
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<400> 11
Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Ser Asn
1 5
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Mouse cytomegalovirus 1
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 12
Ala Leu Ala Leu Glu Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Ser
1 5 10 15
Asn Leu Glu Thr Arg Pro Val Ala Leu
20 25
Claims (6)
1.一种钙卫蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述钙卫蛋白单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；
VHCDR1：GGATTCACTAGTAGCTATGCC
VHCDR2：ATTAGTAGTTATGGTAGCACC
VHCDR3：GCAACCTACAGGTACGAAGGGTTTGCTTAC
VLCDR1：ACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTAT
VLCDR2：GGTACCAAC
VLCDR3：GCTCTATGGTACAGCAACCTTTGGGTG。
2.根据权利要求1所述的钙卫蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1-3所示：
SEQ ID NO：1Gly-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Ala
SEQ ID NO：2Ile-Ser-Ser-Tyr-Gly-Ser-Thr
SEQ ID NO：3Ala-Thr-Tyr-Arg-Tyr-Glu-Gly-Phe-Ala-Tyr。
3.根据权利要求1所述的钙卫蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4-6所示：
SEQ ID NO：4Thr-Gly-Ala-Val-Thr-Thr-Ser-Asn-Tyr
SEQ ID NO：5Gly-Thr-Asn
SEQ ID NO：6Ala-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Trp-Val。
4.一种根据权利要求1所述的钙卫蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
所述钙卫蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株制备方法包含以下步骤：
1)用天然提取的钙卫蛋白作为免疫抗原；
2)用1)制备的天然蛋白免疫小鼠；
3)骨髓瘤细胞悬液和免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞进行细胞融合；
4)培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，筛选对天然蛋白聚合体识别，不识别重组蛋白单体的阳性细胞株；
5)对单克隆的阳性杂交瘤细胞株测序获得权利要求1所述序列。
5.一种根据权利要求1所述的钙卫蛋白单克隆抗体在炎症性肠病免疫检测工具中的应用；
所述免疫检测工具包括炎症性肠病检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的钙卫蛋白单克隆抗体在炎症性肠病免疫检测工具中的应用，其特征在于，所述炎症性肠病检测试剂盒包括：
权利要求1-4所述抗体包被或标记的微球或固相膜、标准品A-H或定标芯片卡、阳性质控品和阴性质控品；所述标准品A-F为定值0μg/g、50μg/g、200μg/g、500μg/g、1000μg/g、2000μg/g。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |