JPH01500564A - ヒトリンホサイトＩｇＥレセプターに対するモノクロナール抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドリンホサイトＩｇＥレセプターに対するモノクロナール抗体、該抗体を産生 するハイブリドーマ及び該抗体を用いるキット１、発明の背景 本発明は新規ヒトリンホサイトＩｇＥレセプターに対するモノクロナール抗体に 関する、即ち、リンパ球細胞（ＦｃεＲＩＩ）に存在するヒ）ＩｇＥのＦｃフラ グメントのレセプターに対するモノクロナール抗体、そのような抗体を産生する ハイプリドーマ細胞、そのような抗体を用いるためのキット、例えば、細胞上の これらのレセプター乞検出するための検定における。及びＩｇＥ結合因子（＝Ｉ ｇＥ　ＢＦ）　型の一連力可溶性分子自体である。

均一な、即ちモノクロナールな、抗体を産生できるある種の株化細胞乞えること が可能なことはこの技術分野にお（・てよく知らｎている。その基礎的技術は（ コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスｌイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、　Ｎａｔ ｕｒｅ　２５６．１９７５）”イブリドーマ細胞？形成する１こめにマウスミエ ローマと膵臓の細胞を融合すること及びそれらの融合細胞から所望の抗体Ｙｉ生 できるものの分離よりなっている。この一般的手法は米国特許第４３６４９３２ 号、第４３６４９３４号、第４３６４９３５号、第４３６４９３７号及び第４３ ６１５５０号に述べられて−・る。

一般的方法は数年前より知られて℃・るが、各々の適したハイブリドーマの調製 及び分離はそれぞれ特異的な困難性？もっている。実際に、適したハイブリドー マが見付けられる確実性は全く無くそして、同様にそのハイブリドーマが所望の 性質χ有する抗体を産生するという確実性は無い。

モノクロナール抗体は、特にモノクロナール抗体が特異性乞表丁タンパクの分離 及び精製又はそれらの検定において、例えば診断用キットにおいて種々の用途馨 持っている；例え＋ｕｃ’ｒ出願公開ＷＯ３１１０２８９９及びＷＯ８２１０１ ７７３馨参照。

イムノグロブリンＥ（ＦｃｆｆＲ１１）のＦｃフラグメントに対するレセプター はある種のヒト細胞の表面に発現する糖タンパク質である。それはＩｇＥとの結 合能カビ持ちそしてそれゆえＩｇＥ結合因子と考えられる。ＩｇＥ抑制ＢＦはア レルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び喘息のようなＩｇＥ濃度の上昇に関連す る病気の治療において非常に興味深（・ものである。一方ＩｇＥ賦活因子はＩｇ Ｅ濃度の増加が要求されるような状態の治療において用途ヲ行っている（例えば 、寄生虫の除去）。そのような因子の検定法が存在しているが、しかし、モノク ロナール抗体（Ｍａｂｓ）の利用は高（・感度及び特異的な免疫化学的検定の設 計にお（・て非常に役立つ。

それゆえ以下のもの乞提供することが不発明の目的である；可溶性ＩｇＥとヒト リンホサイトの結合乞阻止するモノクロナール抗体； ヒトリンホサイトＩｇＥレセプターに対するモノクロナール抗体； モノクロナール抗体の調製方法； モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ；モノクロナール抗体乞使用する 検定；（ヒトｍ胞上のそれらを検出する）： 可溶性物の検出にモノクロナール抗体音用℃・るキット（例えば培養上澄液中の 体液）。

それゆえ本発明はヒトリンホサイトと可溶性ＩｇＥの結合？阻止するモノクロナ ール抗体を提供する。更に、本発明はヒトリンホサイ）ＩｇＥレセプターに対す るモノクロナール抗体も提供する。これらのモノクロナール抗体は好ましくはイ ムノグロブリンサブクラスＩｇＧ、である。更に１本発明はこれらのモノクロナ ール抗体乞産生できるモノクロナールハイブリドーマを提供する。

可溶性ＩｇＥ　ＢＦの検定は競合検定又は二抗体サンドイッチ検定（それには適 切な抗体の異なった抗原決定基に結合する２つのＭａｂが必要である）の２種類 がある。

競合検定において、酵素（例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダ ーゼ）又はラジオアイソトープで標識すれたヒトＩｇＥ結合因子（ＩｇＥ　ＢＦ ）　は固体支持体に結合したＭ　ａ　ｂに結合するために非標識のものと競合す る。不発明は単に１つのＭａｂのみを要求する。

ヒトＩｇＥ結合因子に特異的Ｍａｂを生産するために、マウス乞そのような分子 音高濃度で発現している細胞免疫し１こ。別法として、マウスは可溶性ＩｇＥ結 合因子で免疫することもできる。

ヒト株化細胞ＲＰＭＩ　８８６６　はＦｃεＲＩＩ’（＜比較的高濃度で発現す ることが知られている。ＦｃεＲＩＩの検出を可能廻する検定が確立されている 。簡単に言えば、検定される細胞は連続的にＩｇＥ、抗ＩｇＥモノクロナール（ 若しくはポリクロナール）抗体及び抗マウス（若しくは抗家兎）イムノグロブリ ン抗体と結合した螢光ミクロスフェアとインキュベートされる。螢光ミクロスフ ェアと結合した細胞の割合（ＦｃｔＲＩＩＹ発現する細胞の割合と一致する）は 流動細胞計測法により測定される。

この方法の詳細は別の章で述べられている。

この検定はヒトＩｇＥＢＦの検出に適していることが分かつｒｓｏＩｇＥ　ＢＦ とＩｇＥの前インキュベーションは螢光ミクロスフェアに結合する細胞の割合？ 減少させるようなＩｇＥとそのレセプターの結合の減少を招く。本研究はＲＰＭ Ｉ８８６６は多（のＦｃｔＲ１１ビ持っているのでマウスを免疫するのに最も良 い株化細胞であることを示した。

ＦｃｇＲｌｌに対するＭａｂはＲＰＭＩ　８８６６細胞とＩｇＥの結合を阻止す る能力により選択することができる。最初に細胞が検定されるＮ１ａｂと、イン キュベートしそして矢にＩｇＥＹ添加する。そのほかの段階は前記の方法により 行われる。

ヒトミエローマのＩｇＥはＮａ　ＣＩ勾配法Ｃ０，０１Ｍ−０，３Ｍ　。

ｐＨ７，２）Ｌ用℃・たイオン交換クロマトクラフィ＝（ＤＥＡＥ５２）により 精製された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　及び銀染色によれば、そのＩｇＥは純粋であり 他のタンパクにより汚染していなかった。

ＩｇＥ乞検比検出１こめに抗ＩｇＥモノクロナール抗体（）・イブリテ、り（Ｈ ｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）及び抗ＩｇＥポリ クロナール抗体を使用し１こ。そのポリクロナール抗血清は精製され１こＩｇＥ 　ＰＳにより免疫され１こ家兎により調製されそして抗血清はＩｇＧ、ＩｇＡ及 びＩｇＭ免疫吸着カラム（バイオラド社製、アフィゲル−１０（Ａｆｆｉｇｅｌ −１０Ｂｉｏｒａｄ。

Ｒｉｃｈｉｍｏｎｄ、　ＣＡ）に何丁ことにより丁ｇＥにの入荷異的にし飢 家兎の抗マウスＩｇ抗血清及びヤギの抗家兎Ｉｇ抗血清は我々の実験室で調製さ れた。それらのＩｇＥ分画はトリサクリルＧＦ　０５（Ｔｒｙｓａｃｒｙｌ）及 びＤＥＡＥトリサクリル（インダストリーバイオロギフランセ（Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｇｕｅＦｒａｎｃａｉｓｅ、　Ｇｅｎｅｖｉ目１ｅｒｓ、 Ｆｒａｎｃｅ））　”ｉ用いｚカラムクロマトグラフィーにまり単離しｆこ。ヒ トＩｇＧ、ＬｇＡ　及びＩｇＭは標準的手法に従ったイオン９ｆ、換りロマトグ ラフィー乞用いてミエローマ又はワンデンストローム血清から精製した。

細　胞　： ＷＩ　Ｌ２ＷＴ（ＥＢＶ（−エプスタイン−バールウィルス）リンホブラストイ ド株化細胞）　、　Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ＠）。

Ｍｏ１ｔ　４　（Ｔ型白血病）、ＨＬ６０（プロミエロモノサイト（ｐｒｏｍｙ ｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）白血病）及び０９３７（株化前単球細胞）はＡＴＣ Ｃ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）より入手し１こ。ＲＰＭＩ８８６６ （ＥＢＶリンホブラストイド紀胞株）はイシザカ博士より提供され１こ。ＵＤ３ ８は正常な抹消血液Ｂ細胞’ｋＥＢＶに感染させた後Ｆ、クロウット（Ｆ、　Ｒ ｏｕｓｓｅｔ）博士により我々の実験室で確立すれ１コＥ　Ｂ　Ｖリンホブラス ト細胞株である。総ての細胞は１０％熱不活化牛脂児血清、２ｍＭグルタミン（ フロラ）　、　１　ｏｏｕ、冷ｚペニシリン及び１００μ９／１ストレプトマイ シン（フロラ）を補われｒｓ　ＲＰＭＩ　１６４０（フロラ（Ｆｌｏｗ）、　Ｉ ｒｖｉｎｅ、　５ｃｏｔｌａｎｄ）中で培養された。

タンパクとミクロスフェアの結合 ＥＤＡＣ（Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ′−エチル−カルボジイ ミドハイドロクロライド）（蒸留水ｉ　ｒｕｔ当たり０．１ｍ１）浴液１ｒｎｌ に結合させろタンパク０．１　ｍｇ’ｌ溶かす。

超音波懸濁（ブランソニ、り３２１（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ　３２１）中で１分間 ）されたミクロスフェア（フルオレスプライトカルボキシレート（Ｆｌｕｏｒｅ ｓｂｒｉｔｅ　ｃａｂｏｘｙｌａｔｅ）　ｉ径０．５７μｍ、ポリサイｚンス（ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）、　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　ＰＡ、ｒｅｆ１５７０ ０）Ｍ液１００μｌ’ｌ加える。懸濁液は振とうする合力上に４℃チー晩インキ ュベートする。このインキュバーショ／の後。

ミクロスフェアは遠心分離（１００００Ｇ　、　５分間）　Ｌ　ＰＢＳ−ＢＳＡ （１％牛血清アルブミン乞含む食塩リン酸緩衝液）で３回洗浄する。最終的にミ クロスフェアは１５ｍＭ　ナトリウムアザイド乞加え１こＰＢＳ−ＢＳＡ中に４ ℃で保管する。該溶液は各実験前に１分間超音波懸濁？行う。

染色手順 細胞ＹＰＢＳ−ＢＳＡ中で１０／ｍｊに調製した。ウェル当たりイクロタイター プレート（Ｆｌｏ〜Ｖ社、製品番号：　７６３２１０５）に添加する。

細胞７先ずモノマーＴｇＥ（５ｘ１０５　紀胞当１こり０．５な℃・し２μｇ　 ）と４５分間インキュベートする。細胞を次にＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄する。、適 当に希釈しＴこ（例えば、１／２０００）　ポリクロナール抗−ＩｇＥ抗体乞添 加する。４５分間の後、細胞ＱＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄する。抗−ウサギＩｇミク ロスフェア（１１５０希釈）を添加する。

この紀胞怒濁液乞、コニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ　Ｒｅｆ　２０９９）中の 、熱−不活化および濾過しＴこＦＣ８３ｍｒの上に重、１する。

１００×ソで１５分間遠心しまた後、上清？保々に吸引し＋　ＰＢＳ−ＢＳＡ（ １５０ａｌ／ウエル）乞細胞サンプルに添加し、これを再忠濁後にフローサイト メトリーで分析する。全ての工程は４℃螢光分析は、５Ｗのアルゴンレーザー音 信えたフローサイトメーター、ＦＡＣ３４４０（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓ ｏｎ、５ｕｎｎｙｖａｌｅ。

ＣＡ）　で４８８　ｎｍ　、　０．５Ｗ　で操作して行っに。螢光パラメーター は、前方光散乱（ＦＴ、Ｓ）および非−活性細胞から活性細胞を区別するために 用〜・た垂ｉ亘方向光散乱（ＰＬＳ）の組合せに１こいするゲート処理？シ１こ 後に、備え付けのロガリズム増＠装置で補正（−だ。

データ乞リストモードで保存し−ＰＤＰ　１１／２３で分析し１こ。

■、マウスの免疫およびＦｃｔＲＵ−特異的Ｍａｂを分泌するハイブリドーマの 生産 １、　５０Ｘ１０６のＲＰＭＩ　８８６６細抱？リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に 分散して、腹腔に３回注射することにより、マウスを免疫する。使用するマウス に特別の限定はないが、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスで良好な結果が得られる。注射の 回数および投与する細胞の量は、適当にプライミングされたスプレノサイトが有 用な腎で星生されるように選択する。適当に免疫されたマウスの血清は、ＲＰＭ Ｉ　８８６６細抱に対するＩｇＥの結合？阻止する。

２、免疫マウスを殺し、その膵臓を取り出しそして牌、′＃、細胞の懸濁液乞調 尖する。この操作は周知の技術で行う。

６、　膵臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞娶膵臓細 胞と融合させる技術は周知である。最も好ましくは、融合は、２つのタイプの細 胞の混合物乞適当な融合促進剤１例えば平均分子量が約ｉ　ｏｎｏないし４００ ０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＰＥ０１０００）とともに、加温する ことにより達成される。マウスミエローマ細胞は煙つか知られており、容易に入 手可能である。好ましくは細胞ラインとして、　ＨＧＰＲＴ−欠損（ＨＧＰＲＴ は、ヒポキサンチ／　グアノシル　ホスホリボシル　トランスフェラーゼ）のも ので、従ってＨＡ（ヒボキサンチンおよびアザセリン？含む培養培地）中で成育 出来な〜・ものを用いる。好ましくは、使用するミエローマ細胞ラインは。

それ自体はいかなる抗体も生産しないという点で非−分泌性のタイプでなければ ならない。本発明の目的に適当な一つの細胞ラインは、いわゆるＮＳ１細胞ライ ンと呼ばれるものである。

そのような細胞は、コーラ−およびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒａｎｄλｆｉｌ ｓｔｅｉｎ）　によって、Ｐ３／Ｘ６３−Ａ８ミニｒ−０−−７紀胞から誘導さ れている。

４、融合膵臓細胞ケ一べつかの別の容器（例えば２４ウエルのプレート中）で標 準的方法で培養した。ステップ３で得られた細胞培養は、融合膵臓紀胞（・・イ ブリドーマ細胞）、未融合膵臓細胞及び未融合ミエローマ細胞の混合物であった 。好ましくは、培養は未融合のミエローマ細胞株を消失させる培地、例えばＨＡ 培地中で行う。これらの非挿瘍性の未融合牌鷹細胞は通常短期間ｎ後に死減し、 一方、ＨＧＰＲＴ＋である融合細胞は、ＨＡ培地中で増殖可能である。

５、各容器中のハイブリドーマの上滑乞、抗−ＦｃεＲｒＩ抗体の存在に関して 試験した。ハイブリドーマは、ＩｇＥのＲＰλｆＩ８８６６　に対する結合を阻 止する能力に関してスクリーニングした。この試験は、前記ビーズ検定により都 合よく行うことが可能である。

６、所望の抗体？生産するハイプリドーマ乞選択し１次いで好ましくは限界希釈 法でクローン化する。

２　所望抗体は１選択されたハイブリドーマを用いて生産される。この生産は、 ハイブリドーマヲ適当な培地中でｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養し、続〜・てこの抗体乞単離することにより得られるが。

この方法では充分量の生産は出来な−・。この抗体を大量生産するには、ｉｎ　 ｖｉｖｏ法を好ましく使用する。ノ・イブリドーマをマウスに注射して戻し、こ れにより所望の抗体乞相当量で含有■、生産され１こハイブリドーマの特性二つ のハイブリドーマ、９Ｐ２５および９Ｐ１３５　ｌ６１５（これらは、夫々二つ のクローン２５および１３５　ｌ６１５　Ｙ与え１こ）を選択１〜に二何故なら 、これらはＲＰＭＩ８８６６　細胞に対するＩｇＥの結合？阻止するモノクロナ ール抗体（夫々Ｍａｂ２５およびＭａｂｌろ５と呼ぶ）を生産するがらである； 第１表参照。

Ｍａｂ２５およびＭａｂ１３５抗体にょるＩｇＥのＲＰＭＩ８８６６細、泡沫へ の結合の阻止 Ｃ−Ｃ＋　Ｍａｂ２５　Ｍａｂ１３５ ８　８２　２９（７１，６）　５５５．３（３４，７）数値はパーセントである 。括弧外の数置は陽性細胞のパーセントを示し、そして括弧内の数値は阻止パー セントを示す。

Ｃ−：　ＲＰＭＩ８８６６　細胞乞ポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（１／１０００ ）　および抗−ウサギエｇ−被覆做小粒とインキュベーションして得られた陰性 コントロールＣ±：　ＲＰＭＩ８８６６細胞乞１μｓのＩｇＥ、ポリクローナル 抗−ＩｇＥ抗体および抗−ウサギＩｇ−被覆倣小粒とインキ−ベージタンして得 られた陽性コントロール・・イブリドーマ、９Ｐ２５および９Ｐ１３５　ｌ６１ ５は、パスツール研究所（ｔｈｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ、　Ｐ ａｒｉｓ。

）’ｒａｎｃｅ）に、夫々１５６８およびｌ５４９の名称で寄託されている。

２、細胞株への結合パターン ａ）技法の説明 細胞株は、前記ＲＰＭＩ　１６４０培地に維持される。細胞株に結合するモノク ローナル抗体の細胞螢光写真分析は、ＦＡＣ３４４０を用いて、フルオレセイン −結合ヤギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｇ／Ｎ　Ｆ　ＩＴＣ）　（Ｇｒｕｂ　 Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒ　ｉｅｓ、　Ｖｉｅｎｎａ。

Ａす５ｔｒｉａ）　ｋ用−・て１間接イムノフルオレ、センスで実施シた。要約 すると、５×１０５細胞を０１５ｒｎｌ　のＭ　ａ　ｂ　（希釈または未希釈） と処理し、４°Ｃで３０分間インキュベートし、２回洗浄した。次いで細胞’Ｙ ０．１５ｍｔ’の１：４０希釈Ｇ／Ｍ　ＦＩＴＣと、４℃で３０分間反応させ、 遠心し、そして三回洗浄した。

次に細胞乞ＦＡＣ３４４０で分析し、細胞当たりの螢光の強度乞ハルスー高さ分 析器に記録し１こ。バックグラウンド染色は。

非−生産性ハイブリッドクローンで腹腔注射されたマウスの腹水１：５００の０ ．１５奴に置き換えて得られた。

ｂ）　λｆａｂ２５　（第１表） この抗体はｌＭｏ１ｔ　４細胞（Ｔ細胞白血病の細胞ライン）；Ｄａｕｄｉ（パ ーキットリンフオーマ）および種々の異なるＬＩ２−依存性ヒトＴ細胞クローン とは結合しなかった（但し、それらの成るものは弱い陽性であつ１こ）。ＥＢＶ 感染リンすブラストイドＢ細胞ラインには結合した。ミエロモノシティク細胞ラ インＵ９５７には弱く結合した。この抗体の細胞ラインへの結合は、細胞のＦｃ εＲＩＩＩ発現に非常に良好に相関（−タ。

第■表 ｌ９３７　＋　１６．４　１３，４　９５．０　１．４Ｍｏｌｔ　４　０．８　 ０．６　１．２　０．２ＤＡＵＤＩ　−２，１９６，４９９，２０，９ＲＰ二〜 ｌｌ８８６６　−ｔ−９４，１９１，８９９，８１，１Ｍ０１４　＋　９７．８ 　９８，０　９８．３　４．８８ＭＥ　＋　９７．９　８９．５　９９．５１０ ．４＊　前記ミクロスフェア（ビーズ）検定で測定ｃ）　Ｍａｂ　１３５　（第 ■表） この抗体は、　ＭｏＩｔ　４細抱には結合しないが、　Ｄａｕｄｉ　細胞並びに 試験した全てのＩＬ２　依存性Ｆ　ｃ　ｅ　ＲＩＩ−陰性Ｔ細胞クローンに結合 する。この抗体は、試験し１こ全てのＥＢＶ感染リンホブラストイド細胞ライン およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞ラインのＭＯ１４およびＢＭＥにも結合する。この抗体 は、ｌ９３７に弱く結合する。

要約すると、λｆａｂ１３５はＩｇＥがＦｃｇＲ■陽注細胞に結合すること？阻 止することができ；ざらにＦｃεＲＩＩ陰性細胞の上に存在する抗原決定基乞も 認識する。

３、　ヒト血液、扁桃腺、および膵臓細胞に対する結合パターンａ）技法の説明 血液、扁桃腺および膵臓単辰細胞は、標準的方法で単離した。

扁桃腺は、慢性扁桃腺炎の児童の扁桃腺切除により、そして膵臓は外傷患者の手 術試料から得られた。桿ｔおよび扁桃腺は、圧迫して金属メツシュ？通過させる ことにより単一細胞懸濁物（ＰＢＳ中）にした。この懸濁細胞ならびに希釈血液 （ＰＢＳ中）乞、引き続いてフィコール−・・イバ、りに重層し、遠心した〔ポ エム（Ｂｏｙｕｍ）、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、。

２１（ｓｕｐｐ、９７）ニア７．１９６８の方法？用いた〕。フィコールの境界 ｉから単核細胞を収穫して−ＰＢＳで洗浄した。

全ての細胞集団につ℃・て、モノクローナル抗体の細胞螢光写真分析？、前記の 間接免疫螢光分析で行った。どの細胞のサブ集団て、これらの）ｊａｂが結合す るかを決定するために、二重螢光分析７行っＬ０実験のプロトコールを第ｍ表に 示す。

データはに■、Ｖおよび■表に示す。

第■表 二つのモノクローナル抗体での細胞の二重染色方法１、細胞’ｔＰＢ８．１％Ｂ ＳＡ、０．０１％アジド中で、１０７／ｒＬｊ！に調製する。

２、細胞懸濁液４０μｌに、適当濃度の第一モノクローナル抗体を添加する（マ イクロタイタートレーのウェル中）。

５．４℃で１５分間インキュベートする。

４、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％アジドで２回洗浄する。

５、細胞乞、ＰＢＳ中の１／１５０希釈のＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂす。

フラグメント　ヤギ抗−マウスイムノグロブリ／（Ｇｒｕｂ。

Ｖｉｅｎｎａ、　Ａｕａｔｒｉａ）　１０（ｂｚＪ中に再懸濁する。

６．４℃で１５ないし３０分間インキュベートする。

７、ＰＢＳ−ＢＳＡ−アジドで２回洗浄する。

８、細胞を１％マウス血血清金含有るＰＢＳ−ＢＳＡＩ００μｌ中に再懸濁する 。

９．４℃で２０分間インキュベートし、２回洗浄する。

１０、紀胞乞ＰＢＳ−ＢＳＡ４０μｌに再懸濁する。

１１、ビオチンと結合した第二モノクローナル抗体を添加する。

１２．４℃で１５分間インキュベートする。

１３、ＰＢＳ−ＢＳＡ−アジドで２回洗浄する。

１４、細胞＝ｉＰＢＳ−ＢＳＡ−ブジド４０μｌに再懸濁し、フィコエリスリン （ベクトン　ディ、キンソン社）に結合したアビジンを添加する。

１５、細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ２５０μｌ　中に再琶濁させる。

１６、ＦＡＣ３で分析する。

第■ないし■茨中ニ ーは、陰性反応細胞χ示す（Ｍａｂ　結合せず）；＋は、陽性反応細胞７示す（ Ｍａｂ　結合）；Ｌｅｕ　１　は、ベクトン　ディ、キンソン社から市販されて いる。Ｔ細胞に特異的に結合するλ■ａｂである；Ｂ１は、コールタ−イムノロ ジー社から市販３ｎて−・る、Ｂ細胞に特異的に結合するＭａｂでちる；抗−Ｄ Ｒは第■表で定義されｊ：Ｍａｂである；ＬｅｕＭ３は、ベクトン　ディ、キン ソン社から市販されている。単核球に％異的に結合するＭａｂである。

第■表 Ｍａｂが結合した伴臓紀胞のパーセント全細胞　４．８　５２．２ ＋　２７．９　（１３６，４＜１ ＋５６．４　４，４　３．０　３９．５＋　５８３　５．０　１．７５Ｚ６ 十４．４　１．１　１．３５．５ ＊コントロール；非関連Ｍａ　ｂ　：　０．７第Ｖ表 扁桃腺＊　Ｍａｂ　２５　Ｍａｂ　１３５全細胞　９．４　５５．２ −　５３−４　９．４　２６．２　２７．６Ｌｅｕ　ｌ　（４０，３）　□ ＋　５７．２　＜１　４６．２　＜１ −　５０．１　４．ａ　６０．４　９．７８１　（４１，６） ＋　３９．２　６．３　３．１　２６．８−　５０．７　＜１　６２．３　＜１ 抗−ＤＲ（４５，８＞ ＋　ａｌ、８　７．５　２．５　３５．２−　９０．５　７．６　６５．１　５ ３．９Ｌｅｕ　ｈ（５（２，０） ＋　＜１　１９　＜１　１．０ ＊　コｙ）ｏ−＃：非関連Ｍａ　ｂ　：　０．９第■表 ＰＢＬ　＊　Ｍａｂ　２５　Ｍａｂ　１３５全細胞　４．０　７．３ −　２８．６　５．７　２８．１　７．３Ｌｅｕｌ（６７，５） ＋　６５．７　＜１　６４．６　＜１ −９０．３　＜１　８７．６　５．１ Ｂ１（８，１）　□□ ＋　６．６　３．１　１．６　５．７ −　７６．５　＜１　７８．５　＜１ 抗−ＤＲ（２０，１）　−□ ＋　１９．９　３，６　１３．４　８．１−８４．９　４．３　８’０．１　８ ．２Ｌｅｕλ１３（１２，０） ＋　９．７　１．１　９．５　２．２ ＊　コントロール：非関連Ｍａ　ｂ　：　０．７ｂ）　Ｍａｂ　２５ この抗体Ｇ飢約４％の血液単核細胞、４．８％牌単核細胞及び９．４％扁桃単核 細胞と結合する。それは、Ｔ細胞（Ｌｅｕｌ陽性）に結合しない。それは、Ｂ細 胞（Ｂｌ陽性）のうち総てではな℃・が、優先的にＢＥ胞に結合する。それは、 又、−べつかの非−Ｔ非−Ｂリンホサイト、い（っかのＬｅｕ　Ｍ３＋細胞（モ ノサイトに特異的）及びいくつかのＬｅｕ　Ｍ−細胞を染色する。

ｃ）　Ｍａｂ　１３５ この抗体は、約７３％血液単碩紀胞、５２．２％牌単核細胞及び３３．２％扁桃 単核細胞と結合する。それは、Ｔ細胞（Ｌｅｕ　１陽性）に結合しな〜・。そｎ は、殆んど総てのＢ細胞（Ｂｌ陽性）に結合し、そしてモノサイ）　（Ｌｅｕ　 Ｍ３陽性）の一部と結合する。それは、殆んど総てのＤＲ陽性牌及び扁桃単核細 胞と結合するが血液ＤＲ陽性細胞の一部のみにしか結合しない。

４、活性化ＰＢＬに対す列結合バ已二２ａ）技術面 次のマイトジェンの存在下に、培地（ＲＰＭＩ　１６４．０＋グルタミン２ｍ〜 １＋ペニシリンｃｉｏｏカ価／ｍｌ）＋ストレプトマイシン（Ｉ　ＣＪｒ：Ｊμ ｇ／ｍｅ）＋　１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ＣａｌｆＳｅｒｕｍ　）　） 中に、５Ｘ１０”細胞／ｒａｔ−Ｃ−，分離済末梢ｍｉ細胞乞再懸濁する： フィトヘムアグルチニン１％（ＰＨＡ）（ジプコ、グランドアイランド）；コン カナバリンＡ１０μｇ７ｙｃｃｏｎ　Ａ）（ファルマシア、ウプサラ、スウェー デン；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　株コ ーワ７工（Ｃｏｗａｎ　Ｉ）。

０．０１％（ＳＡ、Ｃ）（パンソルビン（ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）カルビオケム。

ラジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、Ｃａ、）；ホークライード（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ ）マイトジェン−１／’ｔｏｏ希釈（Ｐｔｔ”Ｎ）（ジブコ、グランド　アイラ ンド、ＮＹ）。

５日後に細胞を採取し、３回洗浄し、そして前述したようにＭａｂで染色し１こ 。データを表■に与える。

第　■　表 対照　Ｍａｂ　２５　Ｍａｂ　１３５ ＣＯＮ　Ａ　３．６％　２．５％　４２．８％ＰＨＡ　５．９％　５．９％　４ ９′５％　ＥＸＰＴ　１ｐＷＭ　ｉ、ｉ％　４．２％　２８．８％−ｘ−ｒ７ｙ ７．７％　２１．０％　２３．８％ＣＯＮ　Ａ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ ＰＨＡ　４．７％　１６．４％　５２．２％　ＥＸＰＴ　２ＰＷＭ　Ｏ，８％　 １．４％　４２．５％コーワン　４．１％　５．２％　２０．５％ｂ）　Ｍａｂ 　２５ マイトジェン活性化のもとで、その発現をほんのわずか若しくは非常にわずか増 加する。

ｃ）　Ｍａｂ　１３５ マイトジーン刺激のもとで、？Ｍａｂと反応する細胞の百分率を増加する。

５、免疫沈降分析 ａ）技術面 ａｌ）　細胞の標識 （５０〜１００）ｘ１０６の細胞を、先ずＰＢＳで二度洗浄し１次〜・で、２ｍ ｊＰＢＳ中に再懸濁する。この懸濁物に次の試薬乞添加する二Ｎａ　■（アマ− ジャム：　Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ）　？０．５〜１　ｍＣｉ　。

５　ｍｇ　／ｌｎｌのラクトバーオキシダーゼ（カルビオケム）χ１００μｌ及 びＨ，Ｏ，（水中０．０３％）を５０μ１０室温で６分間程この懸濁物乞攪拌す る。更に、ラクトパーオキシダーゼ乞１００μｌとＨ，０□’Ｙ５０μｉｔｒ加 える。再び、室温で３分間１Ｍ濁物乞攪拌する。この行程乞もう一度繰返し、最 終的に、細胞を、５館ＩＫＩＹ含むＰＢＳで洗浄する。次いで標識済細胞を、５ 刈０６Ａｌで、０．５％ノニデｙ　）　（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｉ）−４０＋　１　 ｍＭの７−＝ルメチルスルホニルフルオリド（Ｐλｌ５Ｆ）　、ｏ、０１　Ｍの ベンズアミジン塩酸塩、０．０５Ｍのアミノカプロン酸−、２０ｍＭのヨードア セタミド、１０Ｍｇ／Ｉｔのロイベフ゛チン、１μｇ／ａｔのペプスタチン及び １００μｇ／ｒｎｉの大豆トリプシンインヒビター乞含有するＰＢＳ中に再懸濁 し、セして０℃で２０分間培養をする。

細胞Ｙ３０００ｘ、９で２０分間遠心分離し、上澄を一７０℃で貯蔵する。溶解 質乞、１００．ｔ］００Ｘｇ　で３ｏ分間の遠心分離によって清澄にする。

ａ２）　メンプラン抗原の免疫沈降： 先ず、溶解質？、非−関連モツクローナル抗体乞含有する腹水（ａｓｃｉｔｅ） 　で−夜予備清澄化する。次いで、ホルマリン処理した黄色ブドウ球園株コーワ ンに力、プルされているウサギ抗−マウスイムノグロブリンビ加える。遠心分離 後、磐解質乞免疫沈降のな備暑し、非−関連Ｍａｂ’（＜分析されるべき抗体に よって置き換える以外は予備清澄行程と同様に実りする。

ｂ）　Ｍａｂ　２５： それは、固定化ＩｇＥ上のアフィニイティークロマトグラフィー乞使用するＦｃ ＥＲ■■の立証されて℃・るデータに相当する４２−４４Ｋｄ　分子乞特異的に 沈降する。

ｃ）　Ｍａｂ　１３５： それは、３種の異なった分子実体：すなわち、４４−４６Ｋｄ分子（これはＭａ ｂ２５によって沈降されるものと異なってもよ℃・）並びに約３５Ｋｄ及び約３ Ｋｄの分子さえも免疫沈降する。

６、〜１ａｂ２５の親和性（Ｋａ）の測定Ｍａｂ２５の、その特異細胞表面抗原 につ〜・ての親和性は、トルツコ及びドペトリス（Ｔｒｕｃｃｏ　ａｎｄ　ｄｅ 　Ｐｅｔｒｉｓ）法〔［イムノロジカル・メソ・ノズ（Ｔｒｒｍｕｎｏｌｏｇｉ ｃａｌλｆｅｔｈｏｄｓ）Ｖｏｌｍ、１．レフコビッッ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ） 、Ｂ　、バーニス（Ｐｅｒｎｉｓ）編、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　ｐｒｅｓｓ）社１９８１　年、第１〜２６頁〕によって芙施した。

ａ）技術的見地 １００μ６のＰＢＳ中の５０μｙｌ１７’）Ｍａｂ２５乞、　１ｍＣ１Ｎａ１２ ５Ｉ（５μｇ）及びクロラミンＴ（ＰＢＳ中０．８ｍｇ／ｍｌで５μｌ）と混合 する。緩かな振とう下に室温で１０分のインキュベーション期間後、５μｌの重 亜硫酸すｌ−’Ｊウム（ＰＢＳ中１　ｍｇ／ｒｎｉ　）及び２５０Ｉｇの卵アル ブミン（ＰＢＳ中５％）を添加して反応ヲ停止させ１こ。０．１％のツウィーン （Ｔｗｅｅｎ）　２０　（ドイツ、メルク社）及び１％の子牛血清アルブミンを 含むＰＢＳで予め平衡化３れているＰＤｌ　０カラム（スエーデン、ファーマシ ア社）に通す。この工程によって、遊離沃素を伴なわない沃素化抗体の回収が可 能である。

ａ２）　レセプターの親和性及びレセプターの数の唄［１定漸増する濃度（０， １μＳから４μＳまで）の沃素化Ｍａｂ２５を。

２％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ　１６４０培地ノ１　ｍｔ：ｔｎ最終ｇＷｉ中ノ１０６ のＲＰＭＩ　８８６６細胞に添加する。０．３　、０．５及び１μｇの抗体濃度 知ついては、非特異抗体結合を測定するために、非標識λｆａｂ２５’Ｙ５００ 倍過剰に添加した別の試験管乞臨備する。結合は４℃で６時間継続する。最後に 紀胞乞６回洗浄し、最終の細胞ペレット中の放射能乞ガンマ計数管で測定する。

最後に、データを標準スカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析７用いてプロ ＲＰＭＩ　８８６６　ＦｃｆｆＪｌ　に対するＭａｂ２５の親和性は１．２Ｘ１ ０へ１　であり、そして４３５．０００のレセプター乞同定する。

慣用ＩｇＥロゼツト検定は、アトピー症思者が彼等の血液単核細胞上のＦｃｔＲ Ｈの増加し１こ発現を示すことを示唆する。

Ｍａｂ２５はＦｃεＲＩＩ発現のはるかに正確な測定？可能となし。

従ってこのタイプの臨床検査ておいて有用である。血液単核細胞上のＦｃεＲＩ Ｉ　の発現′（！″測定ることは、アトピーに関連する多数の病状において有用 である。Ｍａｂ２５は、それ自体標識されていないが適宜に標識された第２段階 抗マウスＩｇ抗体Ｙ随伴した凍結乾燥状態あるいはＦＩＴＣま１こはビオチンで 標識された凍結乾燥状態で入手可能とし５る。標識としてのビオチン？検出する １こめに、ＦＩＴＣ−または藻紅素−標識アピジンを使用できる。

■）ヒ）Ｔ細胞クローン上のＦｃｔＲＨの検出ＦｃεＲＩＩ−陽性Ｔ細胞がＩｇ Ｅ合成の調節において主要な役割馨演じることは、げつ歯動物において示されて きている。

Ｍａｂ２５は現在ヒトＦｃεＲＩＩ−陽性ＩＬ、−依存ヒトＴ細胞クローンを定 着するのに使用される。そのようなりローンはヒトにおけろＩｇＥｉ生の調節を 説明するために非常に価１直のある手段を証拠立てよう。

競合検定による可溶性ＦｃεＲＩＩ　の検出のためのキット入１ａｂ２５’ｒピ ーズま１こはマイクロタイターのウェルヘ力、フ。

リングさせる。可溶性ＦｃｅＲ１１の存在につ℃・て検定されるべき試料、また はＦｃεＲＩＩ　の標準試料乞、まず既知量の標試可溶ＦＣεＲＩＩ　と共にイ ンキュベートする。インキュベーションの後、それらを移して、ビーズ上ま１こ はウェル中の不溶化抗体と反応させる。標識可溶性ＦｃεＲＩＩ　は、１　）　 １２５１　で沃素化された組換ＦｃεＲｕ：　ｉｉ　＞　ＦＣεＲＩＩ　と酵素 、例えばＥ、ｃｏｌ　ｉｉ−ガラクトシダーゼとの間の人工融合生成物；または １１１）ビオチニル化ＦｃεＲＩＩ　：のいずれかでありうる。１）の場合に反 応はガンマ計数により監視されよ５　；　ｉ　＞の場合に反応は酵素に％異な基 質分解の光学的測定により監視されよう（例えば反応はβ−ガラクトシダーゼに より監視されよう）　；　ｉｉｉ　）の場合にビオチン袢異性アビジンに力、ブ リングされた酵素に特異な基質分解の光学的測定である。いずれの場合にも被検 定試料中の可溶性ＦｃｇＲＨの存在は、観察される信号の低減を誘起することに なる。

手続補正書（ハ） １．事件の表示 ＰＣＴ／ＥＰ８７１００２６４ ２、発明の名称 ヒトリンホサイトＩｇＥレセプターに対するモノクロナール抗体、該抗体を産生 ずるハイブリドーマ及び該抗体を用いるキット３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ラボラドアール・ユニセ ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　昭和６３年１１月　１日　溌送日）６、補正の対象 （１）出願人の代表者名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文 （３）法人国籍証明書及び翻訳文 （４）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容 別紙の通り（尚、（４）の書面の内容には変更なし）国際調査報告 一１ｓ１＋Ｉｌｌ＊Ｍｌ＾ａａＩ−ｃａ＋□ａｌＩｓｏ、ｐ（７７Ｅ？Ｂ１１０ ０２６ｑｌｓ＋ｅ＋ｍ＋＋ｓ＊ａｌ　Ａｌ５ｌｌｅｔｌ＠。ｈａ、　：’ＣＴ（ ／三？　８７／ＣＣ！２６４頁の続き ；Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号シ　明　者　ヴアイダーナス、ヨー ン　フランス共和国エフ；間者　ペロンヌ、カトリーヌ　フランス共和国エフ５ 　明　者　オーブリーーラーシエーネイ、　フランス共和国エフジャン−ビニー ル　エ　４ ５　明　者　バンシエロー、ジャック　フランス共和国エフサンティ　２５ 特表平１−５００５６４　（９） ’−６９００８　１Ｊヨン、リュー・ジャン・ペレアル’　−６９００２リヨン 、リュー・ド・う・シャリテア　−６９６３０シャボノス、リュー・デ・フレー シフ　−６９１３０エキユリ−、アヴニュー・ポール・

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトリンホサイトヘの可溶性ＩｇＥの結合を抑制するモノクローナル抗体 。
2. （２）ヒトリンホサイトＩｇＥレセブターに対するモノクローナル抗体。
3. （３）イムノグロブリンサブクラスＩｇＧ１、特にＭａｂ２５及びＭａｂ１３５ である請求の範囲第１項または第２項記載の抗体。
4. （４）ヒトリンホサイトヘの可溶性ＩｇＥの結合を抑制するモノクローナル抗体 を産生することができるモノクローナルハイブリドーマ。
5. （５）ヒトリンホサイトＩｇＥレセブターに対するモノクローナル抗体を産生す ることができるモノクローナルハイブリドーマ。
6. （６）９ｐ２５及び９ｐ１３５Ｄ６／５として表されるモノクローナルハイブリ ドーマ。
7. （７）ヒトＦｃεＲＩＩレセブターを保持する細胞を検定するための請求の範囲 第１項〜第３項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体の使用。
8. （８）ＦｃεＲＩＩである４２−４４Ｋｄ膜分子を免疫沈降するためのＭａｂ２ ５の使用。
9. （９）４４−４６，３５及び３０Ｋｄの範囲の分子量を持つ３種類の膜分子を免 疫沈降するためのＭａｂ１３５の使用。
10. （１０）可溶性ＦｃεＲＩＩ及びＩｇＥＢＦの検出のための競合免疫検定におけ るＭａｂ２５の使用。
11. （１１）ＦｃεＲＩＩを保持するヒトＩＬ２−依存性−Ｔ細胞株を樹立するため のＭａｂ２５の使用。