JPH11504208A

JPH11504208A - レパートリークローニング法、それから得られる産物及びその産物の使用

Info

Publication number: JPH11504208A
Application number: JP8531818A
Authority: JP
Inventors: オカシンスキ，グレゴリー・エフ; フライ，デニス・ジー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1999-04-20
Also published as: EP0821738A2; WO1996033279A2; WO1996033279A3; CA2218651A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物モノクローナル抗体を産生させるためのレパートリークローニング法。これらのモノクローナル抗体を使用する方法、及びこれらのモノクローナル抗体を含有するキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】レパートリークローニング法、それから得られる産物及びその産物の使用発明の背景本発明は一般的に、モノクローナル抗体産生の新規レパートリークローニング法、より詳細には、哺乳動物でモノクローナル抗体を産生できる新規哺乳動物レパートリークローニング法、それから産生されたモノクローナル抗体、及びそれらのモノクローナル抗体の使用に関する。最近、免疫グロブリン遺伝子レパートリーライブラリーをクローニングし、特異的抗原に対する抗体をコードするクローンを単離する方法が開発された。総説として、Burton，Trends Biotechnol. 9:169(1991)；Winter 及び Milstein，N ature 349:293(1991)；Pluckthun，Current Opinion in Biotechnology 2:228(1 991)を参照されたい。このような技術は、哺乳動物においてモノクローナル抗体の産生の代替法を提供できよう。これらのクローニング技術は、分子クローニングのため、リンパ球のｍＲＮＡから免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅技術に基づく。問題の抗原に特異的な抗体を産生するクローンは、細菌コロニー（Dreher ら、J.Immunol.Methods 139:197(1991)、ファージプラーク（Huseら、Science 2 46:1275(1989)；Perssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2432(1991)）、又はファージ−ディスプレーライブラリー（Kang ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:436 3(1991)；Clackson ら、Nature 352:624(1991)）をスクリーニングすることによって同定、単離される。次に、クローンされた抗体配列は E.coli で発現され、抗体フラグメントを産生できる(総説としてSkerra,Current Opinion in Immunol ogy 5:256(1993))。しかし、細菌による抗体産生とアッセンブリは効率的でないので、細菌発現ライブラリーのスクリーニングは問題がありうる。過度の擬陽性を避けるように検出試薬の十分に低い非特異的結合を維持しつつ、レパートリーライブラリー細胞によって産生される少量の及び時には低アフィニティーのＦａｂフラグメントを検出するために適切な感度を与える適切な条件の同定が、とりわけ困難である。ウサギなどの哺乳動物は、研究と産業的利用の両方のために、広い範囲の抗原に対する高アフィニティー抗血清の源として長く使用されてきた。不幸にも、ウサギモノクローナル抗体を産生する細胞株を生成させる努力の成功には限界があった。例えば、Yarmushら、P roc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2988(1980)；Kuoら、Mol.Immunol．22:351(1985);並びにRaybould及びTakahashi，Science 240:1788(1988)を参照されたい。このために、ウサギポリクローナル抗血清は、ポリクローナル抗血清に関連する固有の困難性にもかかわらず、研究と産業上の適用の両方において広範囲に使用されている。ウサギは、免疫グロブリン発現に利用されるＶ_H遺伝子の数が限られているので、レパートリークローニング法に特に適した種であるように考えられる（Knig ht 及び Becker，Cell 60:963(1990)）。抗体多様性が多重Ｖ、Ｄ及びＪ領域の組合せ結合によって生じるマウス及びヒトとは対照的に、ウサギ免疫グロブリンの８０％以上は、ＶＤＪ再配置のためのＶＨ１遺伝子の使用により生じる（Knig ht 及び Becker，上記）。抗原特異性の多様性は、遺伝子変換及び体細胞突然変異によって生じる(Becker及びKnight，Cell 63:987(1990);Shortら、J.Immunol ．5:256(1991))。発現された抗体における単一のＶ_H領域の使用は、クローニング法をはなはだ単純にする。何故ならば、増幅に必要なものは、マウス又はヒトＶ_H遺伝子の増幅に必要なＰＣＲプライマーの複数ファミリーでなく、ＰＣＲプライマーの単一のセットのみでよいからである（Huseら、上記）。研究者らは最近、ウサギＶＤＪ領域のクローニングと発現の系を報告し、プロテインＣに特異的な単一ドメイン抗体を獲得した（Suter ら、Immunology Lette rs 33:53(1992)）。何人かの著者らは、Ｆｖ及びＶ_H領域の両方への同等の結合を観察したが（例えば、Wardら、Nature 341:544(1989)；Barry及びLee、Molecu lar Immunology 30:833(1993)）、他の研究者らは、Ｆｖ又はＦａｂ抗体と比較して、Ｖ_Hドメインへのアフィニティーの大きな減少を報告した（例えば、Borre baeck ら、Biotechnology 10:697(1992);Froyenら、Molecular Immunology 30:8 05(1993)）。従って、Ｉｇ結合特性（即ち、特異性、アフィニティー、親和性）の決定における軽鎖の役割は、試験される特定の抗体により大変広く依存しているように考えられる。事実、Hamars-Casterman ら、Nature 363:466(1993)は最近、抗体の多様性にもアフィニティーにも見かけの欠陥の無い、ラクダの軽鎖を欠くＩｇＧ抗体の存在を示した。無傷の哺乳動物ＩｇＧモノクローナル抗体を産生させることによる、Ｆｖ又はＦａｂフラグメントで起りうる上記困難の幾分かを避けるために哺乳動物モノクローナル抗体及び哺乳動物モノクローナル抗体産生系を提供することは利益であろう。このような系により、単一免疫化動物から繰返しサンプリングができ、従って、最少数の動物を使用しつつ、特異的抗原のための適切な培養条件の開発ができることも利点であろう。このような系は、免疫化動物の分画でのみで又は広範なブースター免疫化後のみで有効な免疫応答を生じさせる抗原のために、特に有用であろう。発明の概要本発明は、哺乳動物Ｉｇ遺伝子のレパートリークローニング及び抗原特異的哺乳動物ＩｇＧを発現する哺乳動物細胞株の単離の新規方法を提供する。問題の特異的細胞の数を増加させるステップを行う。このようなステップの好適例は、分子クローニングのためのｍＲＮＡの単離前に、リンパ球集団の中で抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させる、リンパ球のインビトロ感作（ＩＶＳ）培養方法である。本発明者らは、抗−Chlamydia trachomatis（C.trachomatis）リポ多糖（ＣｔＬＰＳ）ＩｇＧを単離するためにこれらの方法を用いた。方法は４つのステップからなる：１）問題の細胞の頻度を増加させるための富化ステップ；２）真核発現ベクターへのＩｇカッパ（κ）及びガンマ（γ）遺伝子のクローニング；３）ＩｇＧを分泌できる哺乳動物細胞へのクローン化されたＩｇカッパ及びガンマ遺伝子の導入；及び４）所望の抗原特異性を有する抗体を産生する細胞株の単離。好適富化ステップは、ＲＮＡが単離される集団中の抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させるためのリンパ球のインビトロ感作（ＩＶＳ）であった。リンパ球は、ウサギ、ヤギ、ヒト及びヒツジからなる群から選択される哺乳動物から得られる。哺乳動物細胞は、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ及びＢＨＫからなる群から選択される。Ｉｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子は、真核ウイルス発現ベクター、特に真核レトロウイルス発現ベクターにもクローン化されうる。クローン化Ｉｇカッパ及びＩｇガンマ遺伝子は、感染によって哺乳動物細胞に導入できる。本発明はまた、特異的結合ペアの一メンバーであり、特異的結合ペアの他の一メンバーと特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体はレパートリークローニング法によって産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供する。特異的結合ペアの一メンバーであり、特異的結合ペアの他の一メンバーと特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントを分泌する細胞株であって、上記モノクローナル抗体はレパートリークローニング法によって産生される細胞株を提供する。更に、問題の被検物質の免疫アッセイも提供する。ここで、モノクローナル抗体を用いて該被検物質を捕捉し、レパートリークローニング法によって産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントの既知量を加えるステップを含むことが改良である。試験サンプル中の問題の被検物質の存在を測定するキットであって、上記キットは、レパートリークローニング法によって産生される少なくとも一つのモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含有する容器を含むキットも提供する。所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するレパートリークローニング法はまた、以下のステップを含む：抗体産生細胞の割合を約１０倍以上増加させること；Ｉｇカッパ（κ）及びＩｇガンマ（γ）遺伝子を真核発現ベクター又は真核ウイルス発現ベクターにクローニングすること；クローン化されたＩｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子を含むウイルス発現ベクターを用いてトランスフェクト又は感染させることによってクローン化Ｉｇカッパ及びＩｇガンマ遺伝子を哺乳動物細胞に導入すること；及び所望の特異性を有する抗体産生細胞株を単離すること。Ｉｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子は、真核レトロウイルス発現ベクターにクローン化できる。哺乳動物動物細胞は、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ及びＢＨＫからなる群から選択する。本発明はまた、特異的結合ペアの一メンバーである被検物質ともう一方の特異的結合ペアの一メンバーを結合させ、複合体を生成させるステップ、モノクローナル抗体応答及びシグナル発生化合物を含む指示薬と上記複合体を接触させることによって上記被検物質の存在を検出するステップを含む免疫アッセイにおいて、レパートリークローニング法によって産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを使用するという改良も提供する。図面の簡単な説明図１は、インビトロ感作培養法を用いる本発明のレパートリークローニング法のフローダイアグラムを示す。図２は、Ｉｇガンマ及びＩｇカッパｍＲＮＡに関し、ＰＣＲプライマーの相対的位置を示す図である。ここで、「１」は配列番号１を示し、「２」は配列番号２を示し、「３」は配列番号３を示し、「４」は配列番号４を示す。図３Ａは、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするＨｙｇＢ遺伝子を含むレトロウイルスクローニングベクターへのＩｇカッパクローニング戦略を示す。図３Ｂは、ｐＬＣＬｎｅｏクローニングベクターへのＩｇガンマクローニング戦略を示す。図４は、C.trachomatis のガンマ遺伝子のＶ領域のヌクレオチド配列アラインメントを示す。ここで、配列番号５、６、７、８は、４つの別々のクローンを示し、配列番号９はプロトタイプ配列を示し、配列番号１５はコンセンサス配列を示す。図５は、C.trachomatis のカッパ遺伝子のＶ領域のヌクレオチド配列アラインメントを示す。ここで、配列番号１０、１１、１２、１３は、４つの別々のクローンを示し、配列番号１４はプロトタイプ配列を示し、配列番号１６はコンセンサス配列を示す。図６は、（吸光度）対（間接ＥＬＩＺＡ法によって測定したC.trachomatis リポ多糖（ＣｔＬＰＳ）及び Salmonella ＬＰＳ（ＳａｌＬＰＳ）への抗体反応性）をプロットする棒グラフである。ここで、黒色棒はＣｔＬＰＳを表し、白色棒はＳａｌＬＰＳを表す。図７は、モノクローナル抗体Ｂ２の全カッパＩｇＧのプロテインＧカラム分画のグラフを示す。ここで、吸光度₄₉₀を分画に対しプロットする。図８は、モノクローナル抗体Ａ８の全カッパＩｇＧのプロテインＡカラム分画のグラフを示す。図９は、還元及び非還元条件下での、モノクローナル抗体Ｂ２及びＡ８によって沈殿した抗原の分子量のＳＤＳ―ＰＡＧＥである。発明の詳細な説明本発明者らの発明した系は、無傷の哺乳動物ＩｇＧを産生させることにより、Ｆｖ又はＦａｂフラグメントで起りうる幾つかの困難を避ける。本発明者らが開発した方法は、富化ステップを含む。富化ステップというのは、インビトロ感作（ＩＶＳ）法を用いて、ｍＲＮＡを単離する抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させるステップである。ＩＶＳを用い、細胞融合の前に抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させてハイブリドーマ産生を容易にする(Luben及びMohler,Mol.Immunol.17:635( 1980)； Borrebaeck，Trends Biotechnol．4: 147(1986)；De Boerら、J.Immunol.Method s 113:143(1988))。脾臓リンパ球又はリンパ節リンパ球を用いる大部分のＩＶＳ法とは異なり、本発明者らの方法では、免疫化ウサギからの末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を用いた。この方法では、ただの一匹の動物からサンプリングを繰返すことができる。この方法によって、最少数の動物を用い、特異的抗原のための適切な培養条件の開発が容易になる。ただの一匹の動物から繰返しサンプリングできるということは、免疫化した動物のただの一分画においてのみ、又は広範なブースター免疫化後のみ有用な免疫応答を生じる抗原のために特に有用である。本発明者らはこの方法をウサギで行ったが、本明細書で記載するレパートリークローニング法は他の哺乳動物でも使用できる。他の哺乳動物の例には、ヤギ、ヒツジ、ヒトなどがある。本明細書で記載する方法がヒトモノクローナル抗体を作製するのに有用であるために、ヒト細胞を移植されたマウスなどの重度複合免疫欠陥（ＳＣＩＤ）−ヒト（ＨＵ）動物を用いるのが好ましく、問題の抗原でヒトを免疫化する必要なしにヒト抗体の刺激を可能とする。例えば、Duchosalら、Natu re 355:258-262(1992)を参照されたい。富化ステップはまた、行うべき必要なスクリーニング数を少なくとも１：１０，０００から１：１０００以下に減少できるという利点を提供する。本発明者らは、容易に形質転換できる哺乳動物細胞株とレトロウイルスベクターを用いて、哺乳動物動物細胞で直接抗体発現ライブラリーを構築することが可能であろうと推論し、そのことを見出した。このようなライブラリーは幾つかの望ましい性質をもつはずである。哺乳動物細胞は２価のＩｇＧを産生するであろうが、それは、細菌が産生するＦａｂフラグメントよりも高い結合アフィニティーを有することが期待される。この抗体は無傷のＦｃ領域を有し、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによる精製が可能となろう。適切な抗原特異性を有するクローンのスクリーニングは、通常のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンを同定するために用いる十分に性質の解明されたＥＬＩＳＡ法によって達成されよう。本発明者らは、適切なモノクローナル抗体を見出すのに必要なスクリーニング数が、公知の融合技術の場合の少なくとも約１：１０，０００から、本発明の方法を用いる場合の１：１０００以下に大きく減少することを発見した。本発明者らが発明した方法の詳細を本明細書に記載し図１のダイアグラムで概説する。図１について本方法は４つのステップからなる：１）問題の細胞の頻度を増加させる富化ステップ；２）真核発現ベクターへのＩｇカッパ（κ ）及びガンマ（γ）遺伝子のクローニング；３）ＩｇＧを分泌できる哺乳動物細胞へのクローン化されたＩｇカッパ及びガンマ遺伝子の導入；及び４）所望の抗原特異性を有する抗体産生細胞株の単離。好適な富化ステップはリンパ球のインビトロ感作（ＩＶＳ）であって、これによりＲＮＡを単離する集団中の抗原特異的Ｂ細胞の頻度が増加した。しかし、特異的抗体産生細胞の富化の他の方法も使用できると考えられ、それは本発明の範囲内である。これらの他の方法の例には、例えば特異的抗体産生細胞を富化するレーザー操作による、細胞選別、抗原産生細胞のアフィニティー結合、及び単一細胞操作などがあるが、それらに限定されない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びヘルペスウイルスベクター、ｐＤＥＭ、バキュロウイルス、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーターなど（これらに限定されない）の、実施例には記載しない他のウイルス発現ベクターの使用も本発明に含まれる。本明細書記載の方法での使用に適した他のベクターは当業者に公知である。レパートリークローニング法から得られた単離特異的抗体産生細胞からのＩｇカッパ及びＩｇガンマ遺伝子（ｃＤＮＡクローンとして）をサブクローニングすることによる哺乳動物モノクローナル抗体の大規模単離は、周知のタンパク質発現技術と本明細書記載の教示と合わせて使用すると、行えると考えられ、それは本発明の範囲内である。抗体産生細胞の一タイプから、例えばＳｐ２／０への抗体ｃＤＮＡの移入は当業者に周知である。例えば、D.M.Knight ら、Hum.Antib.Hybrid．3(3):129-136( 1992)を参照されたい。発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞株は当業界公知であり、American Type Culture Collectionから利用できる多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞など、並びにヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）及びＩＰＢＬ−Ｓｆ２１などの細胞株がある。更に他の適切な宿主はルーチン作業者に公知である。本発明はウサギからのモノクローナル抗体の産生方法を詳述するが、本明細書記載のレパートリークローニング法は用いる動物によらず本発明の範囲内である。即ち本明細書記載のレパートリークローニング法は他の哺乳動物で使用できる。本発明のモノクローナル抗体は種々の点で有用である。本発明のモノクローナル抗体は、問題の被検物質がもし存在すれば、その存在を検出するために、種々のインビトロ及びインビボアッセイ法で使用できる。このような使用の例は本明細書に記載してある。更に、新規レパートリークローニング法によって産生されたモノクローナル抗体は、抗原のアフィニティー精製及びキメラ抗体の生成のために使用できる。これらのモノクローナル抗体はまた、種々の治療法で治療に、並びに種々の方法で予後に使用できる。本発明は特異的結合メンバーを用いる免疫アッセイを提供する。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアの一メンバーである。即ち、２つの異なる分子の一方が化学的又は物理的手段によって特異的に第２の分子に結合するその２つの異なる分子である。そのため、その他の特異的結合ペアは、通常の免疫アッセイの抗原抗体特異的結合ペアの他に、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などを含みうる。特異的結合ペアメンバーはまた、コンジュゲート（下記）とプローブ（下記）の組合せも含みうる。更に、特異的結合ペアは、もともとの特異的結合メンバーのアナログであるメンバー、例えば被検物質アナログを含みうる。免疫反応性特異的結合メンバーは、抗原、抗原フラグメント、抗体及び抗体フラグメント（モノクローナルとポリクローナルの両方）、並びにそれらの複合体を含む。この中には組換えＤＮＡ分子によって生成されたものが含まれる。本明細書で使用する「ハプテン」は、抗体に結合できるが、担体タンパク質に結合しなければ抗体産生ができない部分的抗原又は非タンパク質性結合メンバーを指す。本明細書で使用する「被検物質」は、試験サンプル中に存在しうる、検出すべき物質である。被検物質は、ある物質に対して天然の特異的結合メンバーが存在するその物質（例えば抗体）、又はある物質に対して特異的結合メンバーが調製しうるその物質でありうる。従って、被検物質は、アッセイで１種以上の特異的結合メンバーに結合できる物質である。「被検物質」はまた、抗原物質、ハプテン、抗体、及びその組合せを含む。特異的結合ペアのメンバーとして、被検物質は、ビタミンＢ１２の測定のための特異的結合ペアの一メンバーとして固有因子タンパク質の使用、又は炭水化物の測定のための特異的結合ペアの一メンバーとしてレクチンの使用などの天然の特異的結合パートナー（ペア）の手段によって検出できる。被検物質は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的又は違法目的のために投与されるものを含む薬剤、細菌、ウイルス、及び上記物質の代謝産物又は上記物質に対する抗体を含みうる。このような抗体の調製の詳細及び特異的結合メンバーとしての使用の適切性は、当業者に周知である。本明細書で使用する「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイでのように被検物質、又は競合アッセイでのように指示薬もしくは被検物質、又は間接的アッセイでのようにそれ自体被検物質に特異的である補助的特異的結合メンバーに対して特異的な非標識結合メンバーを指す。捕捉試薬は、アッセイを行う前に、又はアッセイを行っている最中に、固相物質に直接的又は間接的に結合でき、そのために試験サンプルからの固定化複合体の分離が可能となる。本明細書記載の本発明の方法によって試験できる試験サンプルは、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿などのヒト及び動物体液、細胞培養上清などの生物的液体、固定化組織標本及び固定化細胞標本がある。本発明のモノクローナル抗体を用いて、種々の非ヒト又は非動物体液も被検物質のために分析でき、これも本発明の範囲内である。アッセイにおいて使用するとき、「固相」は必須ではなく、当業者によって選択されうる。即ち、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズもしくは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、ミクロタイターウエルの壁、ガラスチップもしくはシリコンチップ、及びタンニン酸処理ヒツジ赤血球は全て適切な例である。固相上にペプチドを固定化する適切な方法には、イオン性、疎水性又は共有結合性相互作用などが含まれる。本明細書で使用する「固相」は、不溶であるか、又は次なる反応によって不溶にされうる物質を指す。捕捉試薬を引付け、固定化する固相の固有の能力によって固相は選択されうる。あるいは、固相は、捕捉試薬を引付け、固定化する能力を有する更なるレセプターを保持できる。更なるレセプターは、捕捉試薬それ自体又は捕捉試薬に結合した電荷を有する物質に関し反対の荷電の荷電物質を含みうる。更に別の代替策として、レセプター分子は、固相に固定化し（結合した）、特異的結合反応を介し、捕捉試薬を固定化する能力を有する特異的結合メンバーでありうる。レセプター分子は、アッセイ前、又はアッセイ中に捕捉試薬の固相物質への間接的結合を可能にする。従って、固相は、試験管、マイクロタイターウエル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者公知の他の形態のプラスチック、誘導体プラスチック、磁気もしくは非磁気金属、ガラス又はシリコン表面でありうる。固相はまた、検出抗体による接近が十分に可能な多穴性及び抗原を結合する適切な表面アフィニティーを有する適切な多穴性物質も含みうると考えられ、それは本発明の範囲内である。ミクロ多穴性構造が一般的に好ましいが、水和状態でゲル構造を有する物質も使用できる。このような有用な固体支持体には、寒天、アガロース、架橋性アルギン酸、置換及び架橋性グアーゴム、セルロースエステル、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、及びセルロースエーテルなどの天然のポリマー性炭水化物及びそれらの合成修飾性、架橋性又は置換誘導体；架橋又は修飾ゼラチンを含む、タンパク質及び誘導体などの窒素含有天然ポリマー；ラテックス及びゴムなどの天然炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリビニルアセテート及びその部分的加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリエステル・ポリアミド・ポリウレタン又はポリエポキシドなどの他のポリマーなどの上記ポリ縮合物のコポリマー及びターポリマーを含む、ビニルポリマーなどの、適切な多穴性構造を有するように製造されうる合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ及とアルカリ土類金属・アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩を含む、アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩などの多穴性無機物質；粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、又はガラス（これらの物質は上記ポリマー性物質と共に充填剤として使用できる）などの酸化又は水和アルミニウム又はシリコン；及びもとから存在する天然ポリマー上に合成ポリマーの重合を開始させることによって得られるグラフトコポリマーなどの上記クラスの混合物又はコポリマーがある。これらの物質の全てが、フィルム、シート又はプレートなどの適切な形態で使用できるか、又は紙、ガラス、プラスチックフィルム又は織物などの、適切な不活性担体に被覆させるか、又は結合させるか、又は薄層としてかぶせるかしうる。ニトロセルロースの多穴性構造は、モノクローナル抗体を含む種々の試薬の良好な吸収性特性及び良好な吸着特性を有する。ナイロンも同様の性質を有し、適している。上記のそのような多穴性固相支持体は好ましくは、約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態であると考えられる。穴のサイズは広い範囲で変りえて、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミクロンである。固相の固有の荷電を変化をさせるか、又は増進させるために、荷電を有する物質を、材料又は微粒子に直接被覆することができ、次にその材料又は微粒子は固相支持体物質によって保持される。あるいは、微粒子は、カラムに保持されるか、又は可溶性試薬と試験サンプルの混合液中に懸濁されることによって、固相として用いることができ、あるいは粒子それ自体が固相支持体物質によって保持され、固定化されることができる。「保持及び固定化」によって、支持物質上又は中の粒子は、支持物質中の他の位置への実質的な動きができないことを意味する。粒子は特定の物質の適切なタイプから当業者が選択でき、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート又は同様の物質からなるものを含む。粒子のサイズは重要ではないが、粒子の平均直径は、用いる支持物質の平均穴サイズより小さいことが好ましい。従って、種々の他の固相を用いる具体例も考えられ、それらは本発明の範囲内である。例えば、同時係属中の米国特許出願第１５０，２７８号（欧州特許公開第０３２６１００号に対応）及び米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許公開第０４０６４７３号）に記載の、固定化可能反応複合体を陰性荷電ポリマーを用いて固定化するイオン捕捉方法を、本発明によって使用でき、急速溶液相免疫化学反応を起こすことができる。固定化免疫複合体は、陰性荷電ポリアニオン／免疫複合体と前もって処理した陽性荷電多穴性マトリックスの間のイオン性相互作用によって残りの反応混合液から分離され、同時係属中の米国特許出願第９２１，９７９号（欧州特許公開第０２７３１１５号に対応）に記載の化学発光シグナル測定で記載のものを含む、前に記載した種々のシグナル発生系を用いて検出する。また、本発明の方法は、固相が微粒子である自動又は半自動系を含む、微粒子技術を用いる系での使用に適合させることができる。このような系は、係属中の米国特許出願第４２５，６５１号及び米国特許第５，０８９，４２４号（それぞれ欧州特許出願公開第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に対応）及び米国特許第５，００６，３０９号に記載のものを含む。指示薬は、被検物質の特異的結合メンバーに結合した（付着した）、外部手段によって検出できる測定可能シグナルを発生できるシグナル発生化合物（標識）を含む。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアの一メンバーを意味する。即ち、２個の異なる分子のうち１個が化学的又は物理的手段を介し、第２の分子に特異的に結合するその２個の異なる分子。被検物質のための特異的結合ペアの一抗体メンバーであることに加え、指示薬はまた、ビオチン又は抗ビオチンなどのハプテン−抗ハプテン系、アビジンもしくはビオチン、炭水化物もしくはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターもしくはレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤もしくは酵素などを含む、特異的結合ペアの一メンバーでありうる。免疫反応特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおけるように問題の被検物質、競合アッセイにおけるように捕捉試薬、又は間接アッセイにおけるように補助的特異的結合メンバーに結合できる、抗体、抗原、又は抗体／抗原複合体でありうる。考えられる種々のシグナル発生化合物（標識）は、色原体、酵素などの触媒、フルオレセイン及びローダミンなどの発光化合物、ルミナール、ジオキセタン、フェナントリジニウム化合物及びアクリジニウム化合物などの化学発光化合物、放射性元素、及び直接的可視標識を含む。酵素の例には、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどがある。特定の標識の選別は重要ではないが、標識はそれ自体又は１種以上の更なる物質と結合してシグナルを発生できる。種々の他の固相を用いる他の具体例も考えられ、それは本発明の範囲内である。例えば、同時係属中の米国特許出願第１５０，２７８号（欧州特許公開第０３２６１００号に対応）及び米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許公開第０４０６４７３号）［共通の所有権を有し、引用により本明細書に含まれるものとする］に記載の、固定化可能反応複合体を陰性荷電ポリマーを用いて固定化するイオン捕捉方法を、本発明で使用でき、急速溶液相免疫化学反応を起こすことができる。固定化免疫複合体は、陰性荷電ポリアニオン／免疫複合体と前もって処理した陽性荷電多穴性マトリックスの間のイオン性相互作用によって、反応混合液の残りから分離され、同時係属中の米国特許出願第９２１，９７９号（欧州特許公開第０２７３１１５号に対応）［共通の所有権を有し、引用により本明細書に含まれるものとする］に記載の化学発光シグナル測定で記載のものを含む、前に記載した種々のシグナル発生系を用いて検出する。免疫アッセイのために走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用はまた、本発明のモノクローナル抗体が容易に適合できる技術である。走査型プローブ顕微鏡法において、特に原子間力顕微鏡法において、捕捉相、例えば本発明のモノクローナル抗体の少なくとも一つを固相に接着し、走査型プローブ顕微鏡を用い、固相表面に存在しうる抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を使用すると、多くの免疫アッセイ系で通常用いる必要のある標識の必要がなく、抗原／抗体複合体を検出できる。このような系は係属中の米国特許出願第６６２，１４７号（欧州特許出願第９２９０８１１３．１号に対応）［共通の所有権を有し、引用により本明細書に含まれるものとする］に記載されている。多数の方法で、特異的結合反応をモニターするためにＳＰＭが使用できる。一つの具体例では、特異的結合パートナーの一メンバー（本発明のモノクローナル抗体である被検物質に特異的な物質）を、走査に適した表面に結合させる。被検物質に特異的な物質の結合は、当業者に公知の方法に従うと、プラスチック又は金属表面の固相を含む試験片への吸着によるものでありうる。あるいは、誘導体化プラスチック、金属、シリコン、又はガラスの固相を含む試験片への特異的結合パートナー（被検物質に特異的な物質）の共有結合も使用できる。共有結合法は当業者に公知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に結合させる種々の手段を含む。試験片がシリコン又はガラスである場合、表面は、特異的結合パートナーを結合する前に活性化される必要がある。トリエトキシアミノプロピルシラン（Sigma Chemical CO.，St.Louis，MO から市販）、トリエトキシビニルシラン（Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI）、及び( ３−メルカプト−プロピル)−トリメトキシシラン(Sigma Chemical CO.，St.Lou is，MO)などの活性化シラン化合物を用いて、それぞれアミノ、ビニル、及びチオールなどの反応性基を導入できる。このような活性化表面を用いて結合パートナーを直接結合できるし、又は活性化表面を更に、グルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ９スクシンイミジル３− ［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４− ［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）などのリンカーと反応させて、表面から結合パートナーを離すことができる。ビニル基を酸化して共有結合の手段とすることができる。それを使用して、特異的結合パートナーのための多重結合部位を提供できるポリアクリル酸などの種々のポリマーの重合のアンカーとすることもできる。アミノ表面は種々の分子量の酸化デキストラン（当業者に公知）と反応させて、異なるサイズと収容量の親水性リンカーを提供できる。また、高分子電解質相互作用を用いて、係属中の米国特許出願第１５０，２７８号（1988年１月29日出願）及び第３７５，０２９号（1989年７月７日出願）［各々は共通の所有権を有し、引用により本明細書に含まれるものとする］に記載の技術と化学によって試験片の表面に特異的結合パートナーを固定化できる。好適な結合法は共有結合である。特異的結合メンバーの結合後、表面を更に血清、タンパク質、又は他のブロック剤などの物質で処理して非特異的結合を最小化できる。表面を製造部位又は使用点で走査して、アッセイ目的への適合性を証明することもできる。走査過程は試験片の特異的結合性質を変化させないものと考えられる。本発明のモノクローナル抗体を種々のアッセイ系で用いて、試験サンプル中の問題の抗原又は問題の抗体（存在するならば）の存在を決定できる。提供するモノクローナル抗体のフラグメントも使用できる。例えば、好適アッセイ形式において、本発明のモノクローナル抗体は、問題の被検物質に対する抗体の検出用の競合アッセイでの試薬として使用できる。例えば、前もって固相に被覆された問題の被検物質を、問題の被検物質に対する抗体を含む可能性のある試験サンプルと接触させ、本発明のモノクローナル抗体に結合させた、測定可能シグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指示薬とインキュベートする。このとき、固相への試験サンプル又は固相への指示薬の抗原／固体複合体を形成させるのに十分な時間をかけ、十分な条件にする。本発明のモノクローナル抗体の固相への結合の減少は発生シグナルの減少で示され、定量的に測定できる。陰性と確認された試験サンプルから発生するシグナルに比較してシグナルの測定可能な減少により、試験サンプル中の抗−被検物質抗体の存在が示されよう。別のアッセイ法において、問題の被検物質の検出のために、固相に被覆されたポリクローナル又はモノクローナル抗−被検物質抗体又はそのフラグメントを、問題の被検物質を含みうる試験サンプルと接触させて、混合液を形成させる。この混合液を抗原／抗体複合体を形成させるのに十分な時間と条件下インキュベートする。次に、測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物が結合した、問題の被検物質に特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はそのフラグメントを含む指示薬を、抗原／抗体複合体と接触させ、第２の混合液を形成させる。次に、この第２の混合液を、抗体／抗原／指示薬複合体を形成させるのに十分な時間と条件下でインキュベートする。試験サンプル中に存在し、固相に捕捉された問題の被検物質の存在（もし存在すれば）を、シグナル発生化合物によって発生した測定可能なシグナルを検出して測定する。試験サンプルに存在する被検物質の量は、発生したシグナルに比例する。あるいは、固相支持体に結合したポリクローナル又はモノクローナル抗−被検物質抗体又はそのフラグメント、試験サンプル、及び測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物が結合し、問題の被検物質に特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はそのフラグメントを含む指示薬を同時に接触させて、混合液を形成させる。この混合液を抗体／抗原／指示薬複合体を形成させるのに十分な時間と条件下インキュベートする。試験サンプル中に存在し、固相に捕捉された問題の被検物質の存在（もし存在すれば）を、シグナル発生化合物によって発生した測定可能なシグナルを検出して測定する。試験サンプルに存在する被検物質の量は、発生したシグナルに比例する。この、又は上記のアッセイ形式で、本発明のモノクローナル抗体は、捕捉相又は指示薬の一部として使用できる。更に別の検出法において、本発明のモノクローナル抗体は、当業者に周知の標準的方法を用い、免疫組織化学分析によって、固定組織薄片及び固定細胞中の問題の被検物質の検出で使用できる。更に、モノクローナル抗体は、ＣＮＢｒ−活性化セファロースと同様のマトリックスに結合でき、これを使用して、細胞培養液又は血液及び肝臓などの生物組織から問題の特異的被検物質をアフィニティー精製ができる。本発明のモノクローナル抗体は、治療上の使用又は他の同様の適用のためにキメラ抗体を作製するためにも使用できる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、各々の抗体が同定された抗原又は因子に対し異なる結合特異性を有するそれらの抗体のカクテルの一成分として使用できる。カクテルは、異なる細胞及び組織特異性を有するモノクローナル抗体からなるので、診断への適用及び治療、並びに細胞分化及び細胞型特異性の研究に有用である。例えば、モノクローナル抗体は、腫瘍画像のために、色素分子、蛍光性分子、又は放射活性トレーサーなどの検出可能な標識で標識できる。適切なトレーサーにはヨウ素¹³¹、インジウム¹ ¹¹ 又はテクネチウム⁹⁹がある。適切なモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のカクテルとして、又は別々に、結合形態又は非結合形態の両方で、治療上使用できる。これらのモノクローナル抗体のための適切な結合体には化学療法薬、毒素又は放射性同位元素がある。ヨウ素¹³¹などのある放射性同位元素は直接結合でき、インジウム¹¹¹又はテクネチウム⁹⁹などの他の放射性同位元素は、当業者公知のキレーターの使用又は他の方法によって、本発明の抗体に間接的に結合できる。結合又は非結合のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のカクテルとして、又は別々の投与形態で投与できる。ヒトへの投与量は公知の方法で決定できる。本明細書記載のモノクローナル抗体は、抗体を上記のように標識し、適切に予め決定した投与量で個人にインビボ投与するか、問題の細胞を個人から採取し、問題の被検物質のためにインビトロでアッセイするという疾患状態をステージするなどの予後適用にも有用である。モノクローナル抗体又はそのフラグメントは個々に提供でき、問題の被検物質を検出できる。本明細書で提供する本発明のモノクローナル抗体（及びそのフラグメント）の組合せは、各々が異なる結合特異性を有する抗−被検物質抗体の混合物即ちカクテル中の成分として、問題の被検物質に対し異なる特異性を有する他のモノクローナル抗体と組合せても使用できる。従って、このカクテルは、特異的被検物質又はその一部に対する本発明のモノクローナル抗体を、問題の被検物質上の他の結合部位などの被検物質の他の領域に対する別のモノクローナル抗体と一緒に含むことができる。次に、モノクローナル抗体のこのカクテルは、本明細書のアッセイ形式で記載された単一のモノクローナル抗体の代わりに使用されよう。本発明では固相の使用が好ましいということを記載したが、本発明のモノクローナル抗体を非固相アッセイ系で使用できると考えられる。これらのアッセイ系は当業者に公知であり、本発明の範囲内であると考えられる。本発明のモノクローナル抗体は、試験サンプル中の被検物質である抗体の存在を検出するように設計したアッセイで陽性対照として使用できる。試験サンプル中の被検物質である抗体の存在を検出するアッセイで、抗体の特異的結合ペアメンバーは捕捉相として使用される。これらの抗体の特異的結合ペアメンバーは、ウイルス、酵母又は細菌溶解液、抗体の特異的結合ペアメンバーゲノムの種々の免疫原的領域の合成ペプチド、及び／又は合成もしくは天然抗原又は抗原のエピトープを用いて産生された組換えタンパク質から種々の手段（天然にある微生物的であれば）で調製できよう。哺乳動物が物質に対しモノクローナル抗体を産生できるその物質は、本発明の範囲内である。抗体の特異的結合ペアメンバーのこれらのタイプは、捕捉相又は検出相として本明細書記載のものを含む種々のアッセイ形式で使用できる。本発明のモノクローナル抗体を使用すると、被検物質である抗体を検出するために提供された試薬は、当業者公知の方法に従って、アッセイの実施にあたり試験血清の代わりに使用することによって十分に働くことが可能となろう。本発明のモノクローナル抗体の更なるアッセイ法は、フローサイトメトリー法及び粒子計測法でのモノクローナル抗体の使用を含む。例えば、粒子計測において、特異的結合ペアのメンバーである被検物質は、特異的結合ペアのメンバーとして、問題の被検物質に結合できるモノクローナル抗体で被覆した微粒子と、試験サンプルのアリコートを混合することによって定量化できる。試験サンプルに被検物質が存在する場合、被検物質はモノクローナル抗体で被覆された微粒子の幾分かに結合し、凝集が起る。被検物質濃度は、非凝集粒子計測に逆比例する。例えば、Roseら編、Manual of Clinical Laboratory Immunology,３版、８章、4 3-48 頁、American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1986)を参照されたい。照射された細胞からの電気及び光シグナルを感知するフローサイトメトリーによって、細胞表面特性、容量及び細胞サイズの決定ができる。試験サンプル中に存在する被検物質に対するモノクローナル抗体は被検物質に結合し、モノクローナル抗体抗体に直接結合するか、第２の反応を介し添加される蛍光色素により検出される。異なる波長で励起されうる異なる色素は、一つ以上の被検物質が一つのサンプルから検出できるように、異なる被検物質に特異的な一つ以上のモノクローナル抗体と共に使用できる。蛍光フローサイトメトリーでは、粒子の懸濁液、典型的には血液サンプルの細胞はフローセル中を輸送される。フローセルでは、サンプル中の個々の粒子は一つ以上の、焦点を合わせた光ビームで照射される。一つ以上の検出器が、光ビームとフローセル内を流れる標識粒子との相互作用を検出する。通常、幾つかの検出器は蛍光放射を測定するように設計され、他の検出器は散乱強度又はパルス継続時間を測定する。従って、フローセルを通過する各粒子は特性スペースに位置づけられる。特性スペースの軸は放射色、光強度、又は他の性質、即ち検出器で測定される散乱である。一つの状況下では、サンプル中の異なる粒子は特性スペース内で異なり、重なり合わない領域にマップされ、特性スペースでのマッピングに基づき各粒子の分析が可能となる。フローサイトメトリー分析用試験サンプルを調製するために、操作者はサンプルチューブからある容量の血液を手によるピペットで分析チューブに移す。ある容量の所望の蛍光色素標識された本発明のモノクローナル抗体を加える。次に、サンプル／抗体混合物を、抗体／抗原結合が起りうる十分な時間と条件下インキュベートする。インキュベーション後、必要ならば、操作者はサンプル中のＲＢＣを破壊するためにある容量のＲＮＳ溶解物を加える。溶解後、サンプルを遠心分離し、洗浄し、溶解ステップからの細胞残渣を除去する。遠心分離／洗浄ステップを数回繰返してもよい。サンプルをある容量の固定液に再懸濁し、次にサンプルを蛍光フローサイトメトリー装置に通す。フロー自動分析を行う方法と装置は、共同所有の米国特許出願第０８／２８３，３７９号[引用により本明細書に含まれるものとする]に記載されている。インビトロ診断適用のために、極小球体を本明細書記載の抗体と結合させて利用し、標識付けし、利用することができるということは本発明の範囲内である。細菌、ウイルス、durocy te などを含む他の細胞又は粒子を、本発明のモノクローナル抗体で標識でき、フローサイトメトリー法で使用できることも本発明の範囲内である。インビトロアッセイで使用する試薬は、バイアル又は瓶などの一つ以上の容器を有するキットの形態で提供できる。ここで、各々の容器は、アッセイで使用するモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体のカクテルなどの別々の試薬を含む。これらのキットは、洗浄試薬、処理試薬及び指示薬などの、アッセイを行うために必要な他の試薬のバイアル又は容器も含みうる。診断使用と治療使用の両方のインビボ適用のために、同じことが実施できうる。以下の実施例で、本発明のモノクローナル抗体の開発、キャラクタリゼーション、及び臨床的有用性の方法を記載して、本発明の方法及びモノクローナル抗体の利点及び有用性を説明する。実施例実施例１．インビトロ感作 Chlamydia trachomatis（C.trachomatis）で免疫化したＮＺＷウサギを、以下のように末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の源として使用した。公知の技術に従い、 C.trachomatis の流行株に共通の抗原を用いて抗体を産生できる。このような抗原はルーチン作業者によって容易に確認され、このような抗原は、例えば、C.trachomati s LGV II型 Tang株；C.trachomatis Trachoma血清型Ａ HAR-13 株；C.trachomat is LGV II 型 434 株などを含む。単一の抗原を使用してクラミジア抗体を産生しうるが、種々の株からの抗原のプールを動物の順次免疫化で用い、クラミジア抗体を産生させうる。例えば、米国特許第4,497,899 号[共通の所有権を有し、引用により本明細書に含まれるものとする]を参照されたい。各免疫化期間で、ウサギ１羽当り総投与量は１０¹⁰精製クラミジア粒子であった。ウサギに皮下で４個所及び各肉趾に、クラミジア抗原懸濁液と等量のフロインドアジュバントを混合して、１月間隔で２回の別々の接種を行った。第２の免疫化後１週間で、ウサギにクラミジア懸濁液の静脈内注射を行った。３月後、２週間離してウサギに更に２回の静脈内注射を行った。免疫化プロトコルは、例えばL.Howard,Infecti on and Tmmunity 11(4):698-703(1975)に記載されている。ＰＢＬ単離のための採血７日前に、動物にルーチンにブースター免疫化を行った。動物の扱いの全てを、動物ケア及び取扱いに関する適用規則に従い行った。ＰＢＬを、クエン酸添加全血からLympholyte-R(カタログ番号ＣＬ５０５０,Cedarlane Laboratories，Hornby，Ontario，カナダ)中の遠心分離によって単離した。リンパ球分画中の残りの赤血球細胞を、１７ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．２／１４４ｍＭＮＨ₄Ｃｌによる溶解、次にウシ胎児血清中のリンパ球の遠心分離によって除去した。生細胞数を、トリパンブルー排除によって測定した。単離リンパ球を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）[４．５ｇ／Ｌグルコース（但し、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ非必須アミノ酸、２０ｍＭグルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０％正常ウサギ血清（ＧＩＢＣＯ）、８％ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）上清、８％Ｊｕｒｋａｔ細胞培養上清、４％ヒトＴ細胞 Polyclone（Becton Dickinson,Bedford,MA）、及び０．５μｇ／ｍＬ C.trachomatis リポ多糖（ＣｔＬＰＳ）又は抗原無しを補充）]中に３×１０⁶ 細胞／ｍＬで懸濁した。培養液を３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。３日後、培養液に８％Jurkat及び４％Polyclone上清を補充した。抗原特異的、抗体分泌細胞の頻度の測定のために、１日後細胞を回収した。実施例２．免疫金ミクロプラークアッセイ抗原特異的、抗体分泌細胞の頻度を、ミクロプラーク免疫アッセイ（Walker及びDawe，J.Immunol.Methods 104:281(1987)）を用いて評価した。９６ウエル免疫アッセイプレート（カタログ番号３５９０，Costar,Cambrid ge,MA）を、ウエル当り、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍＬＣｔＬＰＳ１００μｌを用いて４℃で一晩被覆した。プレートを、ＭＡＢ希釈剤（０．１ＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．２／０．１％Ｔｗン酸緩衝化生理食塩水，ｐＨ７．２／２５％ウシ胎児血清）を用い、３７℃で２０分間ブロックした。血清を含まないＤＭＥＭ中に懸濁した洗浄済リンパ球の２倍連続希釈液をウエルに入れ、振蕩しないＣＯ₂インキュベーターで３時間インキュベートした。プレートを１０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．２で洗浄した。コロイド性金−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Auroprobe^TMＬＭ，Amersham,Arlington Heights,IL）を加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、非結合抗体を除去し、金結合抗体の結合部位を、Intense^TM銀染色溶液（A mersham,Arlington Heights,IL）による発色で可視化した。プラークを顕微鏡で計測した。抗原特異的、抗体分泌細胞の頻度を、ウエル中に入れたリンパ球の数によって割った、ウエル当りのプレート数として計算した（“ＩＧＳＳ頻度”）。表１のデータが示すように、ＩＶＳは、ＰＢＬ集団中の抗原特異的Ｂ細胞の頻度を１０〜６００倍増加させた。次のクローニング法のために、本発明者らは、ＣｔＬＰＳＩｇＧに対する抗体を分泌する細胞の頻度で３０倍増加を示すＩＶＳ反応液から単離したｍＲＮＡを使用した。ＣｔＬＰＳ細胞に対する抗体のプレＩＶＳ頻度は０．０３６％であった。ＩＶＳ後、ＣｔＬＰＳ細胞に対する抗体の頻度は１．１％であり、Salmonella ＬＰＳ細胞（ＳａｌＬＰＳ）に対する抗体の頻度は０．４６％であった。実施例３．ＰＣＲプライマーウサギＩｇガンマ及びカッパ遺伝子に特異的なＤＮＡ増幅プライマーを、Kaba tら、５版、U.S.Department of Health and Human は、ガンマ特異的配列のためには以下のようであった：Ｍ２１２６０，Ｋ００７５２，Ｊ００６６５；カッパ特異的配列のた Res．22:3441-3444(1994)を参照されたい。５′−及び３′−ガンマ特異的プライマーは、それぞれ配列ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴ（配列番号１）及びＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＴ（配列番号２）を有した。５′−及び３′−カッパ特異的プライマーは、それぞれ配列ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡ（配列番号３）及びＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＣ（配列番号４）を有した。これらのプライマーは、ガンマ（Ｘｂａ１ −Ｓａｃ１）及びカッパ（ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１）ライブラリーのために、発現ベクターへの方向性を有するクローニングができる制限部位を含む。図２は、Ｉｇガンマ及びカッパｍＲＮＡに関するプライマー配列とそれらの位置を図式的に示す。実施例４．ウサギリンパ球からのｍＲＮＡの単離 Dynabead ｍＲＮＡ精製キット（カタログ番号６１０．０１，DYNAL，Lake Suc cess，NY）を用い、インビトロ感作リンパ球からｍＲＮＡを単離した。以下に要約する。１×１０⁶〜３×１０⁶細胞を、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で洗浄した。ペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／０．１４ＭＮる１００μＬに再懸濁し、１分間氷上に置いた。次に、核を遠心分離でペレットにし、上清を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１ＭＬｉＣｌ／２ｍＭＥＤＴＡ／１％ＳＤＳからなる１００μＬ中にオリゴ（ｄＴ）２５Dynabeads を含む新しいチューブに移した。混合液を室温で５分間インキュベートし、磁気ビーズにｍＲＮＡを結合させた。次に、ＭＰＣ−Ｅ−１磁気粒子濃縮器（ＤＹＮＡＬ）を用い、ビーズを捕捉し、上清を除去した。ＭＰＣ−Ｅ−１を用い、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／０．１５ＭＬｉＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ／０．２％ＳＤＳからなる２００μＬで３回ビーズを洗浄した。２ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５中、６５℃で２分間インキュベートして、ＲＮＡをビーズから溶出した（２０μＬ／１×１０⁶細胞）。実施例５．Ｉｇ遺伝子増幅及びクローニングｃＤＮＡを合成し、Ｉｇ遺伝子を、Perkin-Elmer-Cetus'RNA PCR キット（カタログ番号Ｎ８０８−００１７，Perkin-Elmer-Cetus，Norwalk，CT）を用い増幅させた。オリゴ（ｄＴ）₁₆ＤＮＡを、ＩｇカッパｃＤＮＡの合成のためにプライマーとして用いた。オリゴ（ｄＴ）₁₆ＤＮＡとランダムＤＮＡヘキサマーの両方を、ＩｇガンマｃＤＮＡ合成をプライミングするために用いた。４２℃で３０分間、次に９９℃で５分間の変性、４℃での反応中止で、合成を行った。４μＬＭＭｇＣｌ₂、８μＬ１０×ＰＣＲ緩衝液 II、１μＬ Perfect Match（Str atagene，La Jolla，CA）、０．５μＬ AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ、２μＬプライマー、及び６４．５μＬ滅菌蒸留水からなる容量１００μＬ（反応当り）の添加後、同一チューブでＩｇ遺伝子をＰＣＲ増幅させた。９５℃で２分間加熱して、ＤＮＡを変性させた。９４℃、１．５分間の変性及び６４℃、３分間の伸長からなる４０サイクルで増幅を行った。６４℃、１０分間の最終サイクルを行い、増幅鎖の完全合成をさせた。次に、増幅ＤＮＡを、クローニングに使用するまで４℃に保存した。カッパ特異的プライマー（配列番号３及び４）は約７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを与え、ガンマ特異的プライマー（配列番号１及び２）は約１４００ｂｐのフラグメントを与えた。増幅遺伝子産物を、標準的技術を用い真核発現ベクターにクローニングした。ＩｇカッパＤＮＡフラグメントをＳａｌ１及びＢａｍＨ１で消化し、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ）遺伝子を含むレトロウイルスベクターに連結させ、Ｉｇカッパライブラリーを構築した。連結プラスミドを用い E.coli を形質転換した。哺乳動物細胞へのトランスフェクションのために、プラスミドＤＮＡをこれらの細菌集団から調製した。図３Ａは、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするＨｙｇＢ遺伝子を含むレトロウイルスクローニングベクターへのＩｇカッパクローニング戦略を示す。図３Ｂは、ｐＬＣＬ_neoクローニングベクターへのＩｇガンマクローニング戦略を示す。ＩｇガンマフラグメントＤＮＡをＳａｃ１及びＸｂａ１で消化し、ｐＬＣＬ_neoベクターに連結させ、Ｉｇガンマライブラリーを構築した。連結させたプラスミドを用い、E.coli を形質転換させた。これらの形質転換から得られるアンピシリン耐性細菌コロニーをプールし、カッパ及びガンマ配列ライブラリーを作製した。これらのデータを表２に示す。哺乳動物細胞へのトランスフェクションのために、これらのライブラリーから、プラスミドＤＮＡを単離した。実施例６．哺乳動物細胞のトランスフェクション製造業者の推奨に基づきリポフェクチン（カタログ番号１８２９２−０３７， Gibco BRL，Gaithersburg，MD）を用い、上記クローン化ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入した。１０％ウシ胎児血清とゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と適切な選択剤を補充したＤＭＥＭで、細胞を培養した。ガンマライブラリー１０７から単離したプラスミドＤＮＡをマウスＬ細胞（American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive，Rockville,MD20852からA.T.T .C.受託番号ＣＣ１１として得られる）に導入し、ゲンタマイシン（６００μｇ／ｍＬ）（Gibco BRL,Gaithersburg,MD）耐性で細胞を選別した。約２２００個のゲンタマイシン耐性コロニーを得た。ＲＨＣ（組換え重鎖）細胞と命名したこれらのコロニーをプールし、液体窒素（ＬＮ₂）中に保存した。カッパライブラリーをＰＡ３１７レトロウイルスパッケージング細胞に導入し、ハイグロマイシンＢ（４００μｇ／ｍＬ）（Calbiochem,La Jolla，CA）耐性で細胞を選択した。選別後、約１５００個のコロニーを得た。ウイルス保存液をＲＬＣ（組換え軽鎖）細胞（ハイグロマイシン耐性）細胞から調製し、−８０℃で保存した。ハイグロマイシン耐性細胞をプールし、ＬＮ₂中に保存した。組換え抗体産生細胞株を、ＲＨＣ細胞全てを感染させるために、ＲＬＣウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）≧５でＲＨＣ細胞に感染させて作製した。ゲンタマイシン（６００μｇ／ｍＬ）とハイグロマイシンＢ（４００μｇ／ｍＬ）の両方に耐性で、感染細胞を選別した。細胞をＭＯＩ約５で感染させたので、殺菌はこの選別ステップでほとんど起らなかった。ゲンタマイシン／ハイグロマイシン耐性細胞のアリコートをＬＮ₂中に保存し、次にＣｔＬＰＳに特異的な抗体を分泌する細胞のスクリーニングを行った。実施例７．ＣｔＬＰＳクローンのための組換えライブラリーのスクリーニングＣｔＬＰＳに対する抗体を発現するクローンは、以下のように、間接的ＥＬＩＳＡを用いて、細胞集団からの培養上清をスクリーニングすることによって同定した。組換え細胞は、選択培地を含有する９６ウエルプレートに、ウエル当り１０００個の細胞を入れた。細胞が集密近傍に到達したとき、選択培地をＤＩＦＩＴＳ培地（ＤＭＥＭ：Ham's Ｆ１２，１：１，以下のものを補充，１．２ｇ／Ｌグリシン、８ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＬ／ＬＩＴＳ＋^TM（カタログ番号４０３５２，Beckton Dickinson，Bedford，MA）、１０ｍＬ／Ｌ非必須アミノ酸、及び２ｍＭＬ−グルタミン）に置換え、４日間インキュベートした。これらの細胞集団からの培養上清をＭＡＢ希釈剤（０．０％ウシ胎児血清）で１：２に希釈し、間接ＥＬＩＳＡを用い、ＣｔＬＰＳに対する抗体及びＳａｌＬＰＳに対する抗体、ＣｔＬＰＳ抗体のための共通交差反応性抗原のアッセイを行った。要約すると、ＥＬＩＳＡミクロタイタープレート(ＣＯＳＴＡＲ)を、Chlamidiazyme^TM標本希釈緩衝液(Abbott Labor atories,Abbott Park,ILから入手可能)中で１μｇ／ｍＬで懸濁したＣｔＬＰＳ又はＳａｌＬＬＳで被覆した。これらのプレート上に捕獲されたウサギＩｇは、ペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギＩｇＧ(Ｆｃ−特異的)(Jackson ImmunoResea rch,West Groves,PAから入手可能)及びＯ−フェニレンジアミン(ＯＰＤ)(Abbott Laboratories，Abbott Park,IL から入手可能)を用い検出され、４９０ｎｍでの吸光度（Ａ₄₉₀）を測定して定量化された。バックグラウンドレベル（この場合約０．０８５）の２倍以上のＡ₄₉₀値を示すサンプルを、一次スクリーニングで陽性と見なした。９６ウエルのうち１１からの上清がＣｔＬＰＳ被覆プレートに結合した。９６ウエルのうち４ウエルからの上清がＳａｌＬＰＳ被覆プレートに結合し、これらの４個の上清のうち３個がＣｔＬＰＳへの結合にも陽性であった。陽性ウエルからの細胞を、ウエル当り２０細胞の割合で再プレートし、ＣｔＬＰＳ及びＳａｌＬＰＳに対する抗体産生を見るために再アッセイした。この二次スクリーニングレベルで陽性と決定された細胞集団を単一細胞クローニングにかけた。所望の特異性を有する抗体を産生する単一細胞クローン化集団を単離し、抗体及び遺伝子配列のキャラクタリゼーションのために増殖させた。実施例８．配列解析のための抗体遺伝子の再単離ウサギガンマ及びカッパ配列を、上記のようにＰＣＲによって、６８１．１Ｂ２、６８１．１Ｂ５、７１．４Ａ８、及び７１．４Ｂ４細胞集団から単離した。ガンマ及びカッパ遺伝子のＶ領域の配列は、標準的ＤＮＡ配列決定技術を用いて決定した。ガンマ及びカッパＶ領域のアラインメントを行った配列を、それぞれ図４及び５に示す。細胞株６８１．１Ｂ２のガンマＶ領域は配列番号５としても表し、そのカッパＶ領域は配列番号１０として表す；細胞株７１．４Ｂ４のガンマＶ領域は配列番号６としても表し、そのカッパＶ領域は配列番号１１として表す；細胞株６８１．１Ｂ５のガンマＶ領域は配列番号７としても表し、そのカッパＶ領域は配列番号１２として表す；細胞株７１．４Ａ８のガンマＶ領域は配列番号８としても表し、そのカッパＶ領域は配列番号１３として表す。ガンマＶ領域のプロトタイプ配列は配列番号９として表し、ガンマＶ領域のコンセンサス配列は配列番号１５として表す。カッパＶ領域のプロトタイプ配列は配列番号１４として表し、カッパＶ領域のコンセンサス配列は配列番号１６として表す。実施例９．ＥＬＩＳＡ全Ｉｇ及びＬＰＳ産生に対する抗体をＥＬＩＳＡでアッセイした。要約する。ＥＬＩＳＡミクロタイタープレート（ＣＯＳＴＡＲ）を、抗−ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ′２特異的）（Jackson ImmunoResearch，West Groves,PAから入手可能）で被覆し全Ｉｇを測定するか、又は上記のように、ＣｔＬＰＳに対する抗体もしくはＳａｌＬＰＳに対する抗体で被覆し、ＬＰＳＩｇに対する抗体を測定する。これらのプレート上に捕捉されたウサギＩｇを、ペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Jackson ImmunoResearch，West Groves,PAから入手可能）及びＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Abbott Laboratories，Abbott Park,ILから入手可能）を用い検出し、４９０ｎｍでの吸光度（Ａ₄₉₀）を測定して定量化した。実施例１０．抗体産生及びキャラクタリゼーション当業界公知の方法に従い、クローン化細胞集団を選択培地で集密まで増殖させた。生育培地をＤＩＦＩＴＳ培地で置換え、抗体含有培養上清を産生させた。抗体含有培地をアッセイまで−２０℃で保存した。培養上清中のウサギＩｇＧ濃度は、上記のＥＬＩＳＡ法でアッセイすると、この産生期間の３日〜７日で比較的一定に保たれた。６８１．１Ｂ２（配列番号５及び１０を発現）、６８１．１Ｂ５（配列番号７及び１２を発現）、７１．４Ａ８（配列番号８及び１３を発現）、及び７１．４Ｂ４（配列番号６及び１１を発現）と命名した４種のＬ細胞株による抗体産生のキャラクタリゼーションを行った。血清を含まない培養培地への全ＩｇＧ分泌を、上記のようにＥＬＩＳＡで測定した。全ての細胞株は、４日培養上清で５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの同様のレベルのＩｇＧを産生した。これらのデータを図６にグラフで要約する。そこでは、C.trachomatis に対するポリクローナル抗体（「抗−C.trach」と命名）及び上記の方法で産生された４個のモノクローナル抗体（Ｅ１Ｃ５Ｂ２、Ｅ１Ｇ４Ｂ５、Ｇ９Ｆ１１Ａ８及びＧ９Ｆ１１Ｂ４）のＣｔＬＰＳ及びＳａｌＬＰＳへの結合をＡ₄₉₀に対しプロットする。図６に言及すると、データは、全ての抗体は、ポリクローナルウサギ抗−ＣｔＬＰＳの結合と同等にＣｔＬＰＳに結合することを示した。６８１．１モノクローナル抗体及びポリクローナル血清はまた、抗クラミジア抗血清のための共通の交差反応性抗原であるSalmonella ＬＰＳ（ＳａｌＬＰＳ）への結合を示した（図６参照）。これらの細胞株は、ブダペスト条約下、１９９５年月日にＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃに寄託した。アフィニティーリガンドであるプロテインＡ及びプロテインＧはしばしば、ＩｇＧの精製及び濃縮の両方のために便利な手段として使用される。アミコンＭＡＣプロテインＡ（カタログ番号１１０３５）又はプロテインＧ（カタログ番号１１０３９）カプセル（Amicon,Beverly,MA）を、製造業者の指示に従いこの目的のために使用した。濾過した培養上清をカプセルに負荷し、カプセルをＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧは０．１５Ｍグリシン(ｐＨ２．３)で溶出され、１ｍＬ分画を集め、分画を１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）で中和した。ウサギＩｇＧで予期されるように、プロテインＡ及びプロテインＧの両方に関し、これを用いて培養上清からＩｇＧの濃縮及び精製するのに成功した。これらのデータを表３、図７及び８に示す。図７は、モノクローナル抗体Ｂ２の全カッパＩｇＧの分画のプロテインＧカラムのグラフを示す。ここで、吸光度₄₉₀を分画に対しプロットする。図８は、モノクローナル抗体Ａ８の全カッパＩｇＧの分画のプロテインＡカラムのグラフを示す。ここで、ＩｇＧ量（ｍｇ／ｍＬ）を分画に対しプロットする。表３、図７及び８のデータが示すように、ＩｇＧはカラム通過液にも洗浄分画にも検出されず、このことは、培養上清で検出されたＩｇＧ物質は無傷のＩｇＧを表すことを示した。 Amicon YM100膜を用いる攪拌セル又はAmicon Centriprep 100濃縮器を使用する限外濾過によって、抗体を濃縮した。両方の装置で、限外濾過膜は、濃縮物質で、１００ｋｄ以上の分子量を有する分子を保持する。ＩｇＧは、無傷のＩｇＧ（分子量約１５０ｋｄ）に関し期待されるように、濃縮された物質にのみ検出された。アフィニティー精製抗体の分子量は、ウエスタンブロットでも評価した。プロテインＡ−又はプロテインＧ−精製ＩｇＧを、ラエミリ緩衝液（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在の有無のどちらか）中に懸濁し、４％−２０％ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad,Hercules,CA）で分離し、電気ブロットでニトロセルロースに移した。ブロットをＭＡＢ希釈剤でブロックした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｆａｂ′₂−特異的及びヤギ抗ウサギＩｇＧ、重鎖及び軽鎖特異的の混合物、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合，マウス抗ヤギＩｇＧ（Jackson ImmunoRese ach,West Groves,PAから入手可能）を用い、ウサギＩｇバンドを検出した。抗体結合を、４−クロロナフトールを用い可視化した。非還元条件下で電気泳動すると、ウサギＩｇＧと同時移動する単一バンドを得た。還元条件下で、カッパとガンマポリペプチド鎖に対応する２本のバンドを検出した。図９は、還元又は非還元条件下で得られたバンドを示す。ここで、レーン１はブランク、レーン２は、ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、炭酸脱水酵素、大豆トリプシンインヒビター、リゾチーム及びアプロチニンの対照ＭＷマーカー（カタログ番号７２８０７Ａ，BioRad,Hercules,CA）、レーン３はウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoReseach, West Grove,PA）（還元）、レーン４は細胞株６８１．１Ｂ２から得られたモノクローナル抗体（還元）、レーン５は細胞株７１．４Ａ８から得られたモノクローナル抗体（還元）、レーン６はブランク、レーン７は細胞株７１．４Ａ８から得られたモノクローナル抗体（非還元）、レーン８は細胞株６８１．１Ｂ２から得られたモノクローナル抗体（非還元）、レーン９はウサギＩｇＧ（Jackson Im munoReseach,West Grove,PA）（非還元）、及びレーン１０はブランクである。本明細書記載の新規レパートリークローニング法によって作製される哺乳動物モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体及びそれらの産生法に対し幾つかの利点を提供する。本明細書記載の方法によって、Ｆｖ又はＦａｂフラグメントで起りうる困難性の幾分かを、無傷の哺乳動物ＩｇＧモノクローナル抗体を産生することにより避けられる。本明細書記載の方法は、単一の免疫化動物からのサンプリングを繰返し、最小数の動物を用い特定抗原のための適切な培養条件の開発が可能となる系も提供する。免疫化動物の単一分画で、又は広範なブースター免疫化後のみ、有用な免疫応答をする抗原に対するモノクローナル抗体抗体が産生できる。更に、問題のモノクローナル抗体の同定に必要なスクリーニング数は非常に減少する。本明細書記載の方法によって産生された細胞株、並びに本明細書記載のプラスミドは、ブダペスト条約下、American Type Culture Collection, 12301 Par lawn Drive, Rockville，Maryland 20852 に現在、寄託され、寄託日から３０年間、又は寄託に対する最後の要求から５年間、又は米国特許の有効期間のいずれか長い期間維持される。本明細書記載の寄託及びその他の寄託材料は、便宜のためのみ提供され、本明細書記載の教示を考慮して本発明を実施することは必要ではない。寄託した材料の全ての配列は引用により本明細書に含まれるものとする。ｐ６８１．１Ｂ２κ及びｐ６８１．１Ｂ２γと命名した、細胞株６８１．１Ｂ２によって産生されるモノクローナル抗体関連プラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号であり、ｐ６８１．１Ｂ５κ及びｐ６８１．１Ｂ５ γと命名した、細胞株６８１．１Ｂ５によって産生されるモノクローナル抗体関連プラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号であり、ｐ７１．４Ａ８κ 及びｐ７１．４Ａ８γと命名した、細胞株７１．４Ａ８によって産生されるモノクローナル抗体関連プラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号であり、ｐ７１．４Ｂ４κ及びｐ７１．４Ｂ４γと命名した、細胞株７１．４Ｂ４によって産生されるモノクローナル抗体関連プラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号である。細胞株は以下のＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃ受託番号を与えられた：細胞株６８１．１Ｂ２（ＡＬ６８１．１Ｂ２と命名）はＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃ受託番号、細胞株６８１．１Ｂ５（ＡＬ６８１．１Ｂ５と命名）はＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃ受託番号、細胞株７１．４Ａ８（ＡＬ７１．４Ａ８と命名）はＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃ受託番号、細胞株７１．４Ｂ４（ＡＬ７１．４Ｂ４と命名）はＡ．Ｔ．Ｔ．Ｃ受託番号を与えられた。本明細書記載の本発明の特別の実施態様の他の修飾及び改変は当業者に自明である。それ故、本発明は請求の範囲によって限定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．特異的結合ペアの一メンバーに特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、上記モノクローナル抗体はレパートリークローニング法によって産生されることを特徴とする上記モノクローナル抗体又はそのフラグメント。２．特異的結合ペアの一メンバーに特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントを分泌する細胞株であって、上記モノクローナル抗体はレパートリークローニング法によって産生されることを特徴とする上記細胞株。３．問題の被検物質を含む可能性のある試験サンプルをモノクローナル抗体と接触させ、試験サンプル中の被検物質の存在を検出するステップを含む、問題の被検物質の免疫アッセイにおいて、被検物質である、レパートリークローニング法によって産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントの既知量を加えるステップを含む改良。４．少なくとも１種のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含有する容器を含む、試験サンプル中の被検物質の存在を測定するためのアッセイキットであって、上記モノクローナル抗体又はそのフラグメントはレパートリークローニング法によって産生されることを特徴とする上記アッセイキット。５．ａ．富化ステップを行うことによって、問題の細胞の頻度を増加させること；ｂ．Ｉｇカッパ（κ）及びＩｇガンマ（γ）遺伝子を真核発現ベクターにクローニングすること；ｃ．クローン化されたＩｇカッパ及びＩｇガンマ遺伝子を、ＩｇＧを分泌できる哺乳動物細胞に導入すること；及びｄ．所望の抗原特異性を有する抗体を産生する細胞株を単離すること；を含むレパートリークローニング法。６．ステップ（ａ）が、ｍＲＮＡを単離する集団中の抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させるためのリンパ球のインビトロ感作（ＩＶＳ）を更に含むことを特徴とする請求項５に記載のレパートリークローニング法。７．上記リンパ球を、ウサギ、ヤギ、及びヒツジからなる群から選択される哺乳動物から得ることを特徴とする請求項６に記載のレパートリークローニング法。８．上記リンパ球をウサギから得ることを特徴とする請求項５に記載のレパートリークローニング法。９．上記哺乳動物細胞を、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ及びＢＨＫからなる群から選択することを特徴とする請求項５に記載のレパートリークローニング法。１０．Ｉｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子を、真核ウイルス発現ベクターにクローニングすることを特徴とする請求項５に記載のレパートリークローニング法。１１．Ｉｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子を、真核レトロウイルス発現ベクターにクローニングすることを特徴とする請求項１０に記載のレパートリークローニング法。１２．クローン化Ｉｇカッパ及びＩｇガンマ遺伝子を哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項１０に記載のレパートリークローニング法。１３．クローン化Ｉｇカッパ及び／又はＩｇガンマ遺伝子を哺乳動物細胞に感染によって導入することを特徴とする請求項１２に記載のレパートリークローニング法。１４．所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生させるためのレパートリークローニング法であって、ａ．抗体産生細胞の割合を約１０倍以上増加させること；ｂ．Ｉｇカッパ（κ）及びＩｇガンマ（γ）遺伝子を、真核発現ベクター又は真核ウイルス発現ベクターにクローニングすること；ｃ．クローン化されたＩｇカッパ及びガンマ遺伝子を、Ｉｇカッパ及び／又はガンマ遺伝子を含むウイルス発現ベクターによってトランスフェクト又は感染させることにより、哺乳動物細胞に導入すること；及びｄ．所望の特異性を有する抗体を産生する細胞株を単離すること；を含むことを特徴とする上記レパートリークローニング法。１５．Ｉｇカッパ及び／又はガンマ遺伝子を、真核レトロウイルス発現ベクターにクローニングすることを特徴とする請求項１４に記載のレパートリークローニング法。１６．上記哺乳動物細胞を、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ及びＢＨＫからなる群から選択することを特徴とする請求項１４に記載のレパートリークローニング法。１７．上記免疫アッセイが、上記被検物質とその特異的結合ペアの一メンバーを結合させ複合体を形成させ、上記複合体をモノクローナル抗体及びシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させることによって上記被検物質の存在を検出することを含む免疫アッセイにおいて、レパートリークローニング法によって産生されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを使用することを含む改良。