JPH02503751A - 狂犬病ウイルス細胞を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体、それを産生する細胞、それを含有する処方物及びそれら全ての製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 狂犬病ウィルス細胞を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体、それを産生す る細胞、それを含有する処方物及びそれら全ての製造方法本発明はヒトモノクロ ーナル抗体、該抗体を産生するハイブリッド細胞系及びモノクローナル抗体の使 用に関する。

経組織に感染するウィルスからなる。通常は感染した動物に咬まれることにより 狂犬病にかかるが、感染した唾液で汚染された物による掻き傷や擦傷により発症 することもあり、まれには粘膜の浸透、ウィルスエアゾル剤を受けて又は感染し た組織の移植によって起ることもある。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐ ｌｅｓ　ｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　　第１０版、　　Ｐｅｔ ｅｒＳｄＯｒｆら編。

罹患する割合は約１５％であるが唾液中のウィルスの量と傷の場所や深さによっ て異なる。通常３０〜７０日間の潜伏期の後、狂犬病は人では必ず死に致る病気 を生じさせる。この疾患の第一相即ち興奮相は発熱、激しい震え、痙ｆ性の全身 性の筋収縮及び、大声、明るい光若しくは接触によりしばしば突然発症する反弓 緊張を伴う間代性又は強直性痙翠によって特徴付けられる。この疾患の最も典型 的な特徴は、液体を飲み込もうとして最初に突然に起こる咽頭筋肉の全身性の激 しい、痛みを伴う痙寧であり、このために恐水病（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉａ）　 　（恐水）になる。飲み込むことを避けるために、患者は口からよだれを垂らす 。通常長時間の無呼吸を伴う全身性！！撃の後に死亡する。

この疾患の興奮段階を生き延びた患者は憂うつ、無感心、反射性の低下及び昏睡 を特徴とする全身性の弛緩性麻痺へと進行する。麻痺性の狂犬病を発症してから 通常は２〜３日後に死亡するが、数週間後に死亡することもある。

人の狂犬病感染の診断テストには時間がかかり、しかも確実ではない。従って、 多くの患者は狂犬病陽性の診断なしに抗狂犬病血清を投与されている。

この疾患の初期には、ヘモグロビン値及び慣例的な内液化学検査値は正常である が、視床下部機能障害、消化管出血のような異常が起こり、続いて他の合併症が 発症する。末梢白血球数は通常やや増加する（１２，０００〜１７．０００／　 ｃｊ”）が、正常なこともあれば又は３０．　Ｇｏｏ／　ｃＪまで上昇すること もある。

全てのウィルス感染と同様に、狂犬病の特異的な診断は、（１）感染した分泌物 ［唾液、まれには脳を髄液（Ｃ８Ｆ）又は組織〈脳）］からのウィルスの単離、 ■急性感染の血清学的な証明、又は■感染した組織、例えば角膜の圧入塗抹、皮 膚生検又は脳中でのウィルス抗原の証明に依存している。

（ＦＡ）染色並びに、■ネグリ小体の組Ｉｌ学的及び／又は電子顕微鏡検査に掛 ける。ウィルスを単離するためのマウスへの接線− 看による研究及びウィルス抗原の直接ＦＡ染色はかなり信頼性があり、感度も高 いが、患者が長く生存を続け、血清及びＣ８Ｆ中に高いレベルの中和抗体が存在 すると「自己滅菌」が起こり、これらのテストは陰性になることがある。狂犬病 抗原を証明するための皮膚生検、角膜圧入塗抹及び唾液のＦＡ染色の使用は生存 中に狂犬病を診断する際の助けとなっている。

血清学的に、又は脳中のウィルスの証明によってこれらの所見の確認を試みるべ きである。上記のＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ狂犬病感 染のもう１つの決定法は、狂犬病ウィルスの潜伏が疑われる動物を補えて、殺し 、その脳をＦＡ法で調べることである。しかし、咬む疑いのある動物を見つけ又 は捕えることはいつも可能であるとは限らない。

従って、迅速で正確であり、しかも組織生検を必要としない狂犬病感染のための 検査が必要とされている。

狂犬病は人では必ず致死の疾患なので狂犬病の予防は非常に重要である。ワクチ ンによる暴露前（ｐｒｅ−ｅＸｐＯ３ｕｒｅ）免疫又は暴露後（ｐｏｓｔｅｘｐ ｏｓｕｒｅ）の治療により狂犬病を制＠することができすること；■抗狂犬病血 清を偽の周囲に滴下又は染込ませること：及び■抗狂犬病血清の非経口投与を含 めたワクチンの投与異種血清を投与された人では１５〜４５％）、抗ヒスタミン 剤の投与が必要となる。ヒト起源の抗狂犬病血清では、有害な副作用の発生率が 低いため、その使用が増加しつつある。しかし、ヒトの志願者から抗血清を集め ているためにその供給には限度がある。従って、再現性のある特異性と親和性を 有したヒト抗狂犬病抗体をｉｎ　Ｖｉｔ「Ｏで大量生産できればかなりの前進と なろう。

この目標を達成するための良い方法は体細胞のハイブリッド形成である。従って 、１つの態様では、本発明はこのようなヒト抗狂犬病抗体の製造を目的とする。

にｏｈｌｅｒ、Ｇ、及びＨｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　２５６　：　 ４９６（１９７５）が初め彼らの研究ではマウス起源の形質細胞腫及びリンパ球 を使用した。この方法で製造したマウスの抗体は研究及び診断の目的使用されて いる。しかし、にｏｈｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎの泌駆的研究以来、同様な特異 性と再環性を有するヒト抗体はヒト免疫グロブリかになった。　１９８０年には 、２つのグループの研究者が別々に、にｏｈｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎの手法の ヒト細胞への応用を報告した。

［Ｃｒ０Ｃｅ、Ｃ，Ｈ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２８８：　　４８８〜４８９（１ ９８０）　：　０１ｓｓｏｎ、ｌ−。

−ナル抗体の報告数よりはるかに少ないが、゛それ以来、数種の抗原に対するヒ トモノクローナル抗体の製造が文献に報告されている。

ヒトモノクローナル抗体製造の問題に対するアプローチのいくつかが開発されて きており、次のものを含んでいる：（Ｉ＞　　エプスタインバーウィルス（ＥＢ Ｖ）による正常ヒトリンパ球の形質転換。

（ＩＩ）　　とトリンパ球とマウスミニローマ細カサ融合。

（ＩＩＩ）　　ヒトリンパ球とマウス／ヒトへテロミエローマ細胞との融合。

（ＩＶ）ヒトリンパ球とヒトミエローマ又はリンパ芽球ＩＩ！胞との融合。

（Ｖ）　　　（Ｉ）（７）方法と、（Ｉ［）、（Ｉ［［）又ｃ；！　ｃｒｖ＞ノ ＆Ｎすれか１つの方法との組合わせ。

方ｖｉ（Ｉ）については、ＥＢＶ−形質転換した細胞系は抗体産生において非常 に不安定であり、クローン化することがとても難しいという欠点がある。

方法（ｎ）は、マウス／ヒトハイブリドーマはヒトの染色体を優先的に分離する 傾向にあり、そのため、持続的なヒト抗体産生において非常に不安定であるとい う欠点を有している。しかし、著者のなかには、サブクローニングを繰り返すこ とによって、安定なヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス−ヒトハイブリド ーマを単離することが可能であると主張している人もいる（例えば、Ｃｏｔｅ、 　Ｒ，Ｌ、ら、　Ｐｒ０Ｃ，８８口、　ＡＣａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ堕： 　２０２６〜２０３０（１９８３））。従って、方法（ＩＩＩ）、（ｍＶ）（Ｖ ）が多分今使用できる最良のものであろう。

狂犬病ウィルスに対するいくつかのマウスモノクローナル抗体が報告されテイル （例えば、Ｗｉｋｔｏｒ、Ｔ、Ｊ、及びにｏｐｒｏｗｓｋｉ。

Ｈ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：　３９３Ｂ　〜３ ９４２（１９７８））　、　１　ツ（１）例では、ＥＢＶで形質転換した細胞系 が分泌するヒト抗体が記載されている。しかし、今までの所、狂犬病ウィルスに 対するヒトモノクローナル抗体を産生ずる安定なハイブリドーマは報告きれてい ない。

本発明は、 （ａ）　Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウィルスと特異 的に結合し、 （ｂ）前記ウィルスを中和する ヒトモノクローナル抗体を提供する。

本発明はまた、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞 系及びその子孫細陸（ＰｒｏｆＪｅｎｙ）も提供する。

このようなハイブリドーマ細胞系は、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病合す ることからなる方法で作製される。

本発明は更に、本発明のヒトモノクローナル抗体の製法も提供し、この方法は本 発明のハイブリドーマ細胞系胞系又はその子孫細胞を培養し、こうして産生され たモノクローナル抗体を回収することからなる。

Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウィルスを含有している かどうかを検出する方法にも係る。この検出方法は、検体を本発明モノクローナ ル抗体と接触させて抗体−抗原複合体が形成されているかどうかを検出すること からなる。

本発明のモノクローナル抗体を使用することによって、適当な暴露後プロトコー ルの一部として、このウィルスにさらされたイ固体内で狂犬病が臨床的に発従す るのを防ぐことができる。

クラみ この抗体はどの４４の免疫グロブリンであってもよいがＩｑＧ又はＩＱＭが好ま しい。狂犬病ウィルスの少なくとも３つの実験室株すなワチＰｉｔｍａｎ−Ｈｏ ｏｒｅ、　ＣＶ　Ｓ及びＥＲＡに共通なエピトープを認識し、且つウィルスが既 に細胞表面に結合している状態で少なくとも部分的にｌＢ飽を感染から保護しう るモノクローナル抗体が得られる。

添付した図面中、 第１図はハイブリドーマ上清中の中和抗狂犬病ウィルス抗体の検出を示している 。Ａ、８．０及びＤは陰性対照を示し、すなわち、Ａは新鮮な完全ＲＰＭＩ培地 であり：ＢはＦＤ５１］胞胞系からの廃培地であり：Ｄはヒトモノクローナル抗 破傷風毒素ＩＱＭ抗体を産生ずるハイブリドーマからの上清である。また、Ｅ及 びＦは陽性対照を示し、すなわちＥは（１：１０最ＩＩ希釈でテストした）ＰＢ Ｌ供与者の血清であり；Ｆは（１：１００＠終希釈でテストした）市販の抗狂犬 病抗血清である。ハイブリドーマ上清は１：１０の最終希釈でテストした。

第２図はハイブリドーマ２０８由来のクローンの上清中での中和抗狂犬病ウィル ス抗体の検出を示している。Ａ−Ｆは上記のような対照を表わす。このクローン の上清は１：１０最終希釈でテストした。３つのパネルをテストした。すなわち 、ａ：１０５個の感染性狂犬病ウィルス粒子と一緒に上清をインキュベートして 中和を評価した。ｂ　：　１０”個の感染性狂犬病ウィルス粒子と一緒に。及び Ｃ：１０２個の感染性狂犬病ウィルス粒子と一緒に。

第３図は、正常細胞（３，４）又は狂犬病ウィルスに感染した細胞（１，２）で のクローン２０８／　９７が産生じた抗体（１，３１又はポリクローナル抗ヌク レオカプシド抗血清（２，４）による免疫螢光研究を示している。免疫螢光テス トは新鮮なｌ　ｌ１ｌ−（Ａ　）又は固定した細胞（Ｂ）で実施した。

第４図は、クローン２０８／　９７が産生じたモノクローナル抗狂犬病抗体及び 参６７抗狂犬病血清の中和能を示している。Δ：クローン２０８／　９７が産生 した抗体（最終側１０埒／ｄ）：■：１：　対ｕｌ！＋７）抗血１０．００５１ ．Ｌｌ、／Ｍ１゜第５図は、標的細胞に吸看させた狂犬病ウィルス粒子に対する クローン２０８／　９７が産生したモノクローナル抗体及び対照抗血清の抗ウィ ルス活性を示している。

■：クローン２０８／　９７が産生したモノクローナル抗体：ロ：対照のウマ抗 狂犬病血清。

本明細書中で使用しているように、「狂犬病ウィルス」という用語はＷＨＯＴｅ ｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎａ７０９（７９８４）で定義 されているようなＲｈａＭｏｖｉｒｉｄａｅの血清型１狂犬病群のウィルスを意 味するものであって、自然に発生する疾患の作用因子を表わすのに使用ぎれる［ 桁上（ｓｔｒｅｅｔ）狂犬病ウィルス」と、実験至で培養した後に唾液腺組織に 対する感染力が消失した、ワクチン製造に使用する急速に増殖する株を表わすの に用いられる［固定（ｆｌｘｅｄ）狂犬病ウィルス」の両者からなる。

請求するハイブリッド細胞系の特性化に関して、「永久」及び「安定」という用 語は、典型的には少なくとも約６ケ月の長期間に亘り生存可能なことを意味する 。本発明により、少なくとも２５回の培養を通して特異的なモノクローナル抗体 を産生ずる能力を保持している安定で永久的なハイブリドーマ細胞系胞系が得ら れるようになる。

「モノクローナル抗体」という用語は、その集団が実質的に均質である抗体、す なわち抗体集団の個々が自然に発生する突然変異以外には同一である抗体から選 択された抗体を称する。

「抗体」という用語も又、無傷の分子及びその断片、例えば抗体に結合しうるＦ ａｂ及びＦ（ａｂ’）２を包含することも意味している。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’ ）２　Ｗ！Ｔ片は抗体のＦｃ断片を欠いており、楯ｌ１（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ ｎ）からより迅速に除去され、また無傷の抗体と比べ非特異的な組織結合能がよ り低いことがある。本発明モノクローナル抗体のＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ’＞２及 び他の断片は、無傷の抗体と同様に、本発明方法による狂犬病ウィルス感染の検 出及び治療に使用しうろことが理解されよう。

「中和する」という用語は、抗体含有上清が標的細胞への感染性狂犬病ウィルス の感染能を阻止する能力を表わすのに使用する。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、 （ａ）　Ｒｈａｂｃｌｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウィルスに特 異的に結合し、 （ｂ）このウィルスを中和する。

使用して製造したハイブリドーマ細胞系から分泌される。静養であり且つ永続的 であって、これらの特性を示ざない１ＢＩｌａと融哺乳類起源の形質細胞腫（骨 髄ｍ＞又はリンパ芽球腫１［１胞系、例えばヒト起源のリンパ芽球腫細胞系を使 用しうる。好ましい令 タイプの細胞系はヒトヒポキサンチン−ホスフォリボシル−トランスフェラーゼ （ＨＰＰＴ）欠損及びウアバイン耐性のリンパ芽球腫細胞系である。このような 細胞系の１つが特に好ましい。このものは受託番号８７０６１７０１で、１９８ ８年２月１９日にＦｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）、ＰＯｒｔＯｎｏｏｗｎ、英国に寄 託された細胞計ＦＤ５である。

このＨＰＲＴ欠損及びウアバイン耐性の突然変異１ｇ！！系は、（Ｈｕｍａｎ　 Ｃｅ１ｌ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、カムチン。ニューシャーシー、米国から入手 した）ヒトＢ−リンパ芽球腫細胞系ＧＨ１５００八由来のものであった。ＨＰＲ Ｔ欠損突然変異株は、エチルメタンスルホネートで突然変異誘発した細胞集団を ２０ｔｔｓ　／　ｄの８−７ザグアニンの存在下で選択して得た。このようにし て得た突然変異株をウアバイン耐性とするために、ウアバイン濃度を（ｉｏ’Ｍ まで）高めた培地内でＨＰＲＴ欠損系を培養した。ＦＤ５細胞はそれ自身少Ｉｔ 　１〜７Ｍ１Ｂ／１υ−ＩＩＩｌ記／ロノ’／ｊ　Ｉ　Ｗ　％２　ＶＬ　Ｖｐ　 Ｃｃｃ　山−だ。これらの細胞は懸濁液中で典型的なリンパ芽球層系として増殖 し、大きな細胞の塊を形成する。増殖培地は２０％の熱不活性化牛脂児血清を補 ったＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０　（Ｎｏｗ社）からなる。倍イルスに特異的に結 合する抗体を産生するヒト由来の細胞と融合させる。これらの抗体産生ｌ胞はウ ィルスで形質転換されていても又はされていなくてもよいリンパ球である。エプ スタインバーウィルス（ＥＢＶ）を形質転換に使用するのが好ましい。

Ａく人 分離し、ｆｉ増殖細胞と融合させるのは典型的に８−リンパ球だヒト志願者から 入手する。この目的に、市販の狂犬病ワクチンを使用することも可能である。末 梢向りンバ球（ＰＢＬ）を志願者から入手する。Ｂ−リンパ球又は少なくともＢ −細胞の多いＰＢＬ画分を一般的に得、所望に応じてライスルで形質転換する。

ハイブリッド形成前又は好適であれば形質転換前に、有糸分裂物質の存在下又は 非存在下で、活性又は不活性（ワクチン）狂犬病ウィルスのような血清型１群の 狂犬病ウィルスによりｉｎ　ＶｉｔｒＯでリンパ球を再刺激することもできる。

Ｉ＼イブリッド形成後に、所望のモノクローナル抗体を分泌するものについて融 合産物をスクリーニングする。

どんな意味でも本発明を限定する意図はないが、本発明の抗体を産生ずるハイブ リッドを調製し、同定する好ましい戦略は下記の通りである。予め狂犬病ウィル スに対して免疫したヒト志願者に、不活性化し凍結乾燥した狂犬病ウィルス（Ｐ ｉｔｓａｎ−Ｈｏｏｒｅ／Ｗｉｓｔａｒ　ＰＨ／Ｗ　３８１５０３−３　Ｍ株） の懸濁液からなる市販の狂犬病ウィルスワクチン製剤（Ｒａｓｉｌｖａｘ（商標 ）　、５ｃｌａｖｏ、イタリア）で追加免疫した。４日後に、この供与者から得 たＰＢＬ看性のＢ−細胞の多い画分の細胞をＥＢＶで形質転換し、供給細胞とし て放射線照射した（３０００Ｒａｄ　）マウスの腹膜細胞を使用してマイクロタ イターウェル当たり細Ｗｊ１１０００個の割合で培養する。

約１５日後に、得られたリンパ芽球ｍ胞細胞系からの上清を免疫グロブリンの産 生についてＥＬＩＳＡで選別し、次にワクチンによって規定された抗原決定基に 結合して０る抗体の検出についてＲａ５ｉｌｖａｘに対するＥＬＩＳＡで選別す る。両アッセイで陽性であり、後者のアッセイで最も高い活性を示す上清を集め 、増ヤし、そして最後にＨＲＰＴ欠損及びウアバイン耐性ＦＤ５細胞と融合させ る。アミノプテリン及びウアバインを含有する組織培養培地中でハイブリッドを 選択する。

下記実施例中で記載するように、上清をＲａＳｉ　１ｖａｘ−ＥＬＩＳＡで選別 する。このアッセイで最も高い活性を示すものをその感染性狂犬病ウィルス中和 能について処理する。供給細胞として照射マウスｍ＊ｉｔ＋胞を含むウェル内で の限界希釈によって、所望の抗体を産生ずるウェルからの細胞をクローン化する 。所望の抗体を産生するクローンの子孫を、組織培養フラスコ中又は中空繊維組 織培養装置（例えば、ＡＣＬＩＳｙＳｔ−Ｊｒ、　、　ＥｎｄＯｔｒＯｎｉＣ８ ，ＣｏｏｎＲａｐｉｄＳ、ミネソタ）内の好適な培地中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで増 殖させるか又は免疫不全の実験動物内でｉｎ　ＶｉｔｒＯで増殖させる。

所望であれば、場合によっては硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフ ィニティークロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィーの如き手法又は 当業者に公知の他の手法により、培地又は体液から抗体を分離してもよい。従っ て、好ましい戦術によって、次の特徴を有するヒトモノクローナル抗体を製造す ることができる： ａ）その集団が実質的に均質である： ハイブリッドである細胞により産生される：Ｃ）狂犬病ウィルスワクチンによっ て規定される抗原決定基に結合する： ｄ）感染性の狂犬病ウィルスを中和し、ウィルスが標的細胞にもはや感染できな いようにさせる。

本発明のモノクローナル抗体は、狂犬病を発症する危険性のある固体において、 好適な暴露後プロトコールの一部として治療上の用途を見出している。これを傷 の周囲に滴下したり染込ませることもできるし、又はワクチンと共に非経口投与 することもできる。

本発明のモノクローナル抗体は、適当な量のモノクローナル抗体を医薬上許容し うる担体又は希釈剤と一緒に含有させることにより医薬組成物に処方することが できる。一般的に言うと、これらの担体及び希釈剤には食塩水及び緩衝媒質を含 有するアルコール性／水溶液、乳化液又は懸濁液を包含する。非経口用ベヒクル には塩化ナトリウム溶液、リンゲルテキストロース。

デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発油を包含する。静 脈内投与用ベヒクルには液体及び栄養補充物。

電解質補充物１例えばリンゲルデキストロースをベースとするものなどを包含す る。保存料及び他の添加剤１例えば抗菌剤。

酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなども含んでよい。−Ｈａｃｋｌｉ、１ ９８０年ヲｌｉ照セヨ。

モノクローナル抗体の投与は、ヒト又は異種起源の狂犬病免疫グロブリンを用い て現在使用されている方法で行うのが好ましい、従って、動物に咬まれたイ固体 及び狂犬病を発症する危険性のあるイ固体の傷の周囲にモノクローナル抗体を滴 下するか又は染込ませることができる。また、それを筋肉内に単回投与すること もできる。これらの処置の後にワクチンの完全コースを行うことができる（ＷＨ ＯＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ参照）。

モノクローナル抗体は典型的にはヒト起源の狂犬病免疫グロブリンについて現在 使用されている投与量（ＷＨＯＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ 参照）に相当する母を使用する。従って、本発明のモノクローナル抗体はヒト起 源の狂犬病免疫グロブリン２０〜４０国際単位（１，Ｕ、）に相当する０、４〜 １．６　ｔａ／体重ＩＫｇの投与量で投与しうる。

本発明のモノクローナル抗体はイムノアッセイに使用するのに特に適しており、 イムノアッセイでは該抗体を液相中で使用することができ、又は固相担体と結合 させることができる。更に、これらのイムノアッセイ中のモノクローナル抗体を 種々の方法で検出できるよう標識しうる。

本発明のモノクローナル抗体が結合でき、且つ狂犬病ウィルスの存在の検出に使 用しうる多くの担体がある。良く知られている担体にはガラス、ポリスチレン、 ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及 び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱を包含する。本 発明の目的のためには、担体の性質はある程度可溶性であっても不溶性であって もよい。当業者はモノクローナル抗体を結合するための他の多くの好適な担体に 気付くであろうし、慣用的実験を使用してそれを確認することもできよう。

当業者に公知の多くの異なる種属及びＩｌｉ識法がある。本発明に使用しうるタ イプの標識の具体例には、酵素、放射性同位元素、螢光化合物、化学ルミネッセ ンス化合物、バイオルミネッセンス化合物及び金属キレートを包含するがこれに 限定されるものではない。当業者はモノクローナル抗体に結合する好適な他の１ ！＃識を知っているであろうし、通常の実験を使用することによりそれを確認す ることもできよう。更に、当業者に一般的に知られているＩＩ法を使用してこれ らの標識をモノクローナル抗体に結合することができる。

本発明のモノクローナル抗体を検出可能に標識しうる方法の方法で基質と反応す るだろう。本発明のモノクローナル抗体を検出しうるように標識するために使用 しうる酵素の具体例にはリンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−■ −ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセＯリンＩＩ 脱脱水素酵素上トリオースリン酸イソメラーゼ西洋わさびペルオキシダーゼ、ア ルカリ性ホスファターゼ、アルバラキナーゼ。グルコースオキシダーゼ、β−ガ ラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−■ −リンｍ脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを包含 する。

本発明のモノクローナル抗体は放射性同位元素で標ａすることもでき、これは次 いでガンマカウンター又はシンチレーションカウンターの使用といった方法で測 定しうる。本発明の目的に特に有益な同位元素は　Ｈ，１，１，Ｐ、　　Ｓ。

伝　Ｃｒ、　　Ｃｊ！、　　Ｇｏ、　　Ｃｏ、　　Ｆｅ及び７５Ｓｅテある。

モノクローナル抗体は蛍光化合物で１ｇ識することもできる。

蛍光標識したモノクローナル抗体を適当な波長の光にさらすと、の 染伜冒光によ・てその存在が検出される。最も一般的に使用されている蛍光ｓｉ ｘ化合物にはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリ ン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌ ｄｅｈｙｄｅ）及びフルオレサミンがある。

本発明のモノクローナル抗体を、　　Ｅｕ又はランタニド系列の他の金属のよう な蛍光発光金属を使用して検出しうるように標１することもできる。これらの金 属はジエチレントリアミン五酢ＩＩ　（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢Ｉ ｆ　（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体分子に結合しうる。

本発明のモノクローナル抗体を化学ルミネッセンス化合物に結合させて検出しう るように標識することもできる。次いで、化学ルミネッセンスを付けたモノクロ ーナル抗体の存在を、化学反応の間に発止するルミネッセンスの存在を検出する ことにより測定する。特に有用な化学ルミネンセンス＊ｉ化合物の具体例は、ル ミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏ ｍａｔｉｃ　ａｃｒｉｄｉｎｉｕ＠ｅｓｔｅｒ）　、イミダゾール、アクリジニ ウム塩及びシュウ酸エステルである。

同様にバイオルミネッセンス化合物を使用して本発明のモノクローナル抗体を標 識することもできる。バイオルミネッセンスとは、触媒的な蛋白質が化学ルミネ ッセンス反応の効率を上昇させる生物学的な系で認められるタイプの化学ルミネ ッセンスである。バイオルミネッセンスモノクローナル抗体の存在はルミネッセ ンスの存在を検出することにより測定される。標識のために重要なバイオルミネ ッセンス化合物はルシフェリン。

ルシフＩラーゼ及びエクオリン（ａｅＱｕｏｒｉｎ）である。

本発明と結合させて使用すると感受性がより高くなりうるもう１つの手法は本発 明のモノクローナル抗体と低分子量ハプテンとの結合からなる。次に、ハブテン は第２反応によって特異的に検出されうる。例えば、この方法ではビオチン（ア ビジンと反応）又はジニトロフェニル、ピリドキサール及びフルオレサミン（特 異的な抗ハプテン抗体と反応）のようなハブテンを使用するのが一般的である。

本発明の目的のためには、本発明のモノクローナル抗体で検出される狂犬病ウィ ルスは午物学的体液中又は組織中に存在しうる。感染した動物又はヒトから得た もので、検出可能だが未知の量のウィルスを含有しているどんなサンプルも使用 できる。

通常サンプルは液体、例えば感染した動物の唾液、脳ＷＭ液。

血液、血清、尿など、又は固体もしくは半固体、例えば組織。

糞などである。

本発明のモノクローナル抗体はキットの製造に理想的に適している。このような キットは密封状態で受は入れるように区分されている担体手段と、１つ以上のバ イアル、チューブなどのような容器手段からなり、この容器手段の各々は使用す べきイムノアッセイの個々の要素からなっている。本発明の治療上の使用に適し た個々の要素を含む１つ以上の容器手段を有する区分きれた担体手段からなる同 様なキットを製造しうる。

キットの形態に使用又は取り入れうるイムノアッセイのタイプには多くのものが ある。本発明の抗体を使用しうるイムノアッセイのいくつかの典型的具体例は競 合アッセイ及びイムノメトリック又はサンドイッチイムノアッセイである。

［イムノメトリックアッセイ」又は［サンドイッチイムノアッセイ］という用語 は同時（ＳｉｌｌｕｌｔａｎｅＯＬＩＳ）サンドインチ、フォーワード（ｆｏｒ ｗａｒｄ）サンドイッチ及びリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）サンドイッチイムノア ッセイを包含することを意味している。これれうるイムノアッセイの弛の変法及 び形態に有用でありうることを理解するだろう。これらは本発明の範囲に含むも のとする。

フォーワードサンドイッチイムノアッセイでは、先ず、サンプルを、狂犬病抗原 に対するモノクローナル抗体を含有する固相免疫吸着剤と共にインキュベートす る。サンプル中の抗原を固相中の固定化抗体と結合させるのに十分な時間の間イ ンキュベーションを続ける。１回目のインキュベーションの後に、インキュベー ション混合物から固相免疫吸着剤を分離し、これを洗浄して過剰の抗原とサンプ ル中に存在しうる例えば非特異的な結合蛋白質のような他の妨害勧賞とを除去す る。引き続き、固定化抗体に結合した狂犬病抗原を含有する固相免疫吸着剤を、 第２回目として、可溶性の標識抗体と共にインキュベーションする。第２回目の インキュベーションの後に、もう１度洗浄して固相免疫吸着剤から未結合の標識 抗体を除去し、及び、非特異的に結合している標識抗体を除去する。次に、固相 免疫吸着剤に結合している標識抗体を検出し、検出された標識抗体の量を初めの サンプル中に存在する抗原量の直接的な測定値として使用する。また、免疫吸着 剤複合体と結合していない標識抗体も検出しうるが、この場合、測定値はサンプ ル中に存在する抗原量と反比例する。フォーワードサンドイッチアッセイは、例 えば米国特許第３，８６７．５１７号：　　４，０１２，２９４号及び４，３７ ６．１１０号明細書に記載されている。

フォーワードイムノメトリックアッセイの実施について、より詳細にはその方法 は次の通りである：（ａ）先ず、サンプルと固相に結合した抗体との混合物を形 成し、サンプル中の抗原を同相に結合している抗体に結合させるのに十分な時間 及び十分な条件下で混合物をインキュベートし： （ｂ）段ｔｌｉ　（ａ）の前記インキュベーションの後の混合物に検出しうるよ うに標識した抗体を加え、標識した抗体を固相免疫吸着剤に結合させるのに十分 な時間及び十分な条件下で新たに得られた混合物をインキュベートし；（Ｃ）段 階（ｂ）のインキュベーション後の混合物から固相免疫吸着剤を分離し：並びに （ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出するか又はそれと結合していな い抗体を検出する。

リバースサンドイッチアッセイでは、先ずサンプルを標識抗体とインキュベート し、その後、複数の固定化抗体を含有する固相免疫吸着剤をそれに加えて第２回 目のインキュベーションを実施する。第２回目のインキュベーション後に洗浄を 行うが、フォーワードサンドイッチアッセイの最初の洗浄段階は必要ではない。

リバースサンドイッチアッセイは、例えば米国特許第４、０９８．８７６号及び 第４，３７６．１１０号明細書に記載されている。

リバースイムノメトリックアッセイの実施について、より詳細にはこの方法は次 の通りである： （ａ）サンプル中の抗原を標識抗体と結合させるのに十分な時間及び十分な条件 下で、先ず、サンプルと可溶性の検出可能なａｌｌ抗体との混合物を形成し： （ｉｌ）段階（ａ）の前記インキュベーション後の混合物に固相結合抗体を加え 、標識抗体に結合した抗原を固相抗体と結合させるのに十分な時間及び十分な条 件下でインキゴベートし； （Ｃ）段階（ｂ）のインキュベルジョン後の混合物から固相免疫吸着剤を分離し ：並びに （（１）固相免疫吸着剤に結合している標識抗体を検出するが又はそれに結合し ていない標識抗体を検出する。

同時ｌサンドイッチアッセイでは、１つのインキュベーション段階で、サンプル と、複数の固定化抗体を有する免疫吸着剤と、標識した可溶性抗体とを同時にイ ンキュベーションする。

同時アッセイでは、１回のインキュベーションのみが必要であり、洗浄ステップ はない。同時アッセイの使用は非常に好ましい方法である。このタイプのアッセ イでは、操作の容易さ、均質性、再現性、アッセイの直線性及び高い精度が得ら れる。抗原を含有するサンプルと、固定化された抗体を有する固相免疫吸着剤と 、標識した可溶性抗体とを、固定化抗体及び可溶性抗体に抗原を結合させるのに 十分な時間及び十分な条件下でインキュベーションする。一般に、できる限り多 くの抗原が結合するのに十分なインキュベーション条件を使用するのが望ましい 。

何故ならば、このことにより標識抗体の固体相への結合が最大どなり、それによ り信号が増加するからである。時間及び温度の典型的な条件は４５℃で２時間又 は３７℃で１２時間である。

標識抗体は溶液中にあり、一方、固定化抗体は固相担体に結合しているために、 抗原は典型的には固定化抗体よりも標識抗体により迅速に結合する。このために 、標識抗体は固定化抗体よりも低濃度で使用でき、また、標識抗体については高 い比活性を使用することが好ましいう例えば、標識抗体は約１〜５０ｎｇ／アッ セイの濃度で使用し得、一方、固定化抗体は１０〜５００ｎｇ／アッセイ／抗体 の濃度をもち得る。放射標識した場合には、例えば、抗体は抗体１分子当たり１ 個の放射性ヨウ素又は抗体１分子当たり２個以上の放射性ヨウ素を有する比活性 を有して多価抗原を含有するサンプルについて同時イムノメトリックアッセイを 実施するときには、その方法はより詳細には次の通りである： （ａ）サンプルと固相結合抗体と可溶性標識抗体との混合物を同時に形成し： 乞 （ｂ）段階（ａ）で形成した混合物を、サンプル中の抗原７固定化抗体と標識抗 体との両者に結合させるのに十分な時間及び十分な条件下でインキュベーション し：（Ｃ）インキュベーション後のインキュベーション混合物から固相免疫吸着 剤を分離し： もちろん、サンプル中の抗原ｓ度、サンプルの性質などを含む種々の因子に応じ て、標識及び固定化抗体の特定のＩｌ！、インキュベーションの温度及び時間、 並びに他のアッセイ条件を変化させることができる。当業者は通常の実験を使用 して、各測定について有効で且つ最適なアッセイ条件を決定することができよう 。

インキュベーション後、インキュベーション混合物から固相免疫吸着剤を分離す る。例えば沈降及び遠心分離のような任意公知の分Ｉｌｌ法でこの分離を達成し うる。例えば標識が放射活性なγ線放出物質であるときにはシンチレーションカ ウンターで又は、例えばｔｇｌｌが蛍光物質であるときには蛍光光度計で検出し うる。酵素標識の場合には、その酵素の基質と使用する比色法で検出しうる。

任意特別な状況についての慣用又は必要に応じて、洗浄、攪拌、振盪、濾過など の他のステップももちろん加えることができる。

これまで使用されてきた且つ本発明に使用できる多くの固相免疫吸着剤がある。

周知の免疫吸着剤には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン 、ナイロン及び他の材料から形成したビーズ；このような材料で形成した又は被 覆したチューブなどを包含する。固定化抗体は、アミド結合若しくはエステル結 合を介した共有結合のような手法又は吸着により固相免疫ｒ！ｉ着剤に共有結合 又は物理的に結合しうる。当業者は多くの他の好適な固相免疫吸着剤及びそれへ の抗体の固定化法を知っているであろうし、単に通常の実験を使用することによ りこれを確認す委ことができるであろう。

以下の実施例により、本発明の種々の態様を説明する。この実施例はどんな意味 でも本発明を限定することを意図したものではない。

叉−厘一■ 狂犬病ウィルスに対する抗体産生反応が強いことが分かっているワクチン接種し たヒト志願者にＲａ５ｉｌｖａｘでブースター免疫ヘパリン処理した血液をＣａ ＋＋−Ｍｇ０非含有のＥａｒｌｅｓＢａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉ ｏｎ　（ＥＢＳＳ）ｒｌ：Ｉ　Ｉｐニー希釈し、次に、市販のＦｉｃｏｌ　ｌ／ 　Ｈｙｐａｑｕｅ（ｄ−１，０７７、ＬｙＩＩｌｐｈｏｐｒｅｐ、　Ｉｍｍｎｏ 、ピザ。イタリア）を使用して３００Ｘ（＋で４０分間グラジェント遠心分離し た。２０％の牛脂充血１（Ｆｌｏｗ、５６℃で３０分間熱不活性化した）　、　 １ｍＭのＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、ベイズレイ、スコツトラン ド）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、　　１００埒／ｄのペニシリン、 　　１０Ｊｅ／ｄのストレプトマイシン、　　１．５ｐ９／ｍｅのアンホテリシ ンＢ及び追加グルタミン（２ｍＭ　）を補充した完全ＲＰＭＩ培地［ＲＰＭ　Ｉ 　　１６４０（Ｆｌｏｗ、　マ’ｙリ−＞、　バージニア）］ニハフイーコート リンパ球を懸濁し、ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗血清（Ｃａｐｐｅｌ、マルバー ン、ペンシルバニア、　２０＋ｎＨリン酸バツフア中２０〜／ｄ、５ｄ／皿）で 予めコートしたプラスチックベトリ皿（１００ｍ＋プラスチック皿、　Ｆａｌｃ ｏｎ　１００５　、　Ｂｅｅｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ。

マウンテーンビュー、カリフォルニア）中、４℃で７０分間インキュベーション した（５ＪＥｉ！　／皿）。

インキュベーションの終了時に、非接着細胞を含有する上清培地を吸引し、激し くピペッティングすることにより接着ＩＩＩ胞を分離させた。Ｂ−リンパ球表面 の免疫グロブリンを検出する、と、非接着細胞ではＢ−細胞が油導しており、接 着細胞にはＢ−細胞が多いことが示された。ＥＢＶ産生マーモセットｉｔ胞系３ ９５−８の上清と共に３７℃で２時間インキュベーションすることにより、Ｂ− １８胞に冨む画分をＥＢＶで形質転換した（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｇ、ら、笠、田ユ、佳鱈、銃二　並Ｌ　肚：３８３〜３８７（１９７２））。

この処理の終了時に、細胞洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、９６ウ工ル組 １／培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ　ＮＱ３０７２）中１０３細胞／ウェルで５％ ＣＯ２下３７℃下塔７した。１５日後に、ＩＱＥＬＩＳＡ及びＲａ５ｉｌｖａｘ −Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａで培養プレートをアッセイした（下記）。この後者のアッ セイで強い陽性を示す抗体培養物をプールし、融合工程に充分な数のＩＢ胞が得 られるまで組織培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ　Ｎｃｒ３０５０．ケンブリッヂ、 マサチューセッツ）内で増殖させた。これらのアッセイの結果を第１表に示す。

Ｃ０融合のプロトコール 前述のようにして得たＥＢＶ形質転換細胞培養物のプールからの細胞とＨＰＲＴ 欠損及びウアバイン耐性のＦＤ５細胞系からの細胞とが融合パートナ−であった 。この後者の細胞系は無視しうる量のＩＱＧを分泌する。融合混合物は牛胎児血 清を含まない完全ＲＰＭＩ培地中に４０％Ｗハのポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）１５００（Ｓｅｒｖａ、ハイテルヘルク、西ドイツ）金含有した。

親１８胞を血清を含まない完全ＲＰＭＩ培地中、室温で２回洗浄し、続いて再懸 濁し、円錐形の５０ｄ遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ　Ｎｃ２０７０）中、３７℃に温め た血清を含まないＲＰＭＩ中でＥＢＶ形質転換細胞：ＦＤ５細胞を１：１の比で 合わせた。

４００ｇで１０分１１ｉ！３！心分離して、培地を捨て、２ｄのＰＥＧＩ合混合 物を１分間に亘り注意深く一滴ずつ加えた。その後、血清を含まない完全ＲＰＭ Ｉ培地で混合物をゆっくりと希釈した。

細胞密度が５Ｘ１０”ＦＤ５細胞／−となるように容器を調整した。照射された マウス腹膜細胞（５Ｘ　１０’細胞／ウエル）を予め接種した９６ウエルプレー トの各ウェルにこの懸濁液２００蔗を接種した。次に、融合産物を含有するプレ ートを５％Ｃ０２，３７℃で２４時間インキュベーションした。

次に、培地をヒポキサンチン（１０’Ｍ　）　、アミノプテリン（４Ｘ　１０’ Ｍ　）　、チミジン（１，６Ｘ　１０−５Ｍ　）及びウアバイン（１０−６Ｍ　 ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地に換えた。本明ｍｉ！中、この培地をＨＡＴ−０ 培地と呼ぶ。この培養培地中では、ＦＤ５細胞はアミノプテリンの存在により死 滅し、ＥＢＶ−形質転換細胞はウアバインの存在下で死滅するためにハイブリド ーマのみが生存しうる。

次に、５％Ｇ　Ｏ２、３７℃でプレートを更に５〜６週閤インキュベーションし た。この期間の間、３日毎に培養物に新鮮な培地を与えた。１５イでにハイブリ ッドの増殖が眼で見られた。

この期間の１０日１にウアバインを、３０日１にアミノプテリンを培地から除去 し、６週間目からは完全ＲＰＭＩ培地を使用し始めた。

上記の期間の終了時には、狂犬病ウィルスで規定される抗原決定基に結合する抗 体の産生について培養物をＲａｓ　ｉ　Ｉｖａｘ−ＥＬＩＳＡによってテストし 、最終的には迅速な蛍光焦点阻害テスト（ｒａｐｉｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ 　ｆｏｃｕｓ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　　（ＲＦ　Ｐ　Ｉ　Ｔ；ア ッセイの詳細については下記参照せよ）によりウィルス中和抗体の産生について 培養物をテストした。これらのアッセイの結果を第２表と第１図に示す。０，５ 細胞／ウエルを入れる限界希釈により、ウィルス中和抗体アッセイで最も強い阻 害が測定された上清２０８を産生するハイブリッド細胞をクローン化した。

３週Ｂ後に、増殖陽性ウェルのパーセンテージを測定した。

Ｒａ５ｉ　１ｖａｘ−ＥＬＩＳＡでの測定により、ＩＱの産生及び狂犬病ウィル スワクチンで規定された抗原決定基に結合する抗体の産生について増殖陽性ウェ ルをテストした。これらのアッセイの結果を第３表にまとめて示す。

最も強い抗原結合活性を示す上清を、ＲＦＦＴＴでの測定により感染性狂犬病ウ ィルスを中和する能力についてテストした。

結果を第２図に示す。この一連の実験では、上演（１：１０最終希釈）ｔｌｏ　 　（バネｊＬｚａ）、１０　　（ハネ／Ｌ／　ｂ　）又ハ１０２（パネルＣ）個 の感染性狂犬病ウィルス粒子と共に３７℃で″１時間インキュベーションした。

示されたように、抗原ｆ＊＊重量低い条件では完全又はほぼ完全な中和が観察で きた。

この特性をより詳しく特徴付けるためにクローン２０Ｂ／　９７を更に増殖させ た。得られたデータのいくつかを第４表にまとめて示す。このクローンが産生す るモノクローナル抗体は狂犬病ウィルスの２つの異なる株（ＣＶＳ及びＥＲＡ） を中和し、従って共通のエピトープを認識することが示されたことは特筆すべき ことである。

免疫蛍光研究（第３図）は、クローン２０８／　９７が産生するモノクローナル 抗体が感染細胞のみを染色することを示した。

それらは新鮮な（膜の蛍光）細胞と固定したＩＲ胞の両者に結合した。このこと は、中和抗体が狂犬病ウィルスのＧ蛋白質を認識することが予期されていたよう に（ＣＯＸ、　Ｊ、ｔＬら、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｔｍ１ｕｎ　、１６：　７４３（ １９７７））、モノクローナル抗体が膜上に現われるウィルス抗原決定基を認識 することを示している。一方、感染細胞の細胞質中にのみ現われる抗原であるウ ィルスのヌクレオ力ブシＩドに対するポリクローナル抗血清は感染した固定細胞 （細胞質の蛍光）にのみ結合した。

クローン２０８／　９７が産生した抗体の中和能を対照のウマ抗狂犬病血清のも のと比較した。結果を第４図に示す。示されているように、１０Ｒ／ｉｄのモノ クローナル抗体は０．５１．ｔｌ、のポリクローナル抗体製剤で得られたものと 同等の阻害を示す。

もう１つの実験では、ウィルスのインターナリゼーションを妨げる条件下（４℃ ）で標的のニワトリ胚に関連した（ＣＥＲ）ＩＩ飽飽上１０３個の感染性ウィル ス粒子を１１ｉｌｉＪ吸看させた。インキュベーション時間の終了時に、細胞を 洗って未吸着のウィルスを除き、モノクローナル抗体２０８／　９７又はポリク ローナル抗血清を含む又は含まない新鮮な培地を細胞に加えた。

次に、ｉｌｍを３７℃で１時間インキュベーションした。この時点で、抗体を含 有する培地を新鮮な培養培地に換え、標準条件下で１１１１１を更に培養した。

結果を第５図に示す。示されているように、これらの条件下では抗血清は保護的 ではなかった。しかし、モノクローナル抗体は保護作用を示したままだった。こ れらの結果は、本発明のモノクローナル抗体は吸着したウィルスを介しての感染 から標的ｍ胞を部分的に保護する力を有しているが、ポリクロ−チルな抗血清は そうｊることができないために、本発朗のモノクローナル抗体の方が抗血清より 更に効果的であることを示唆している。

ハイブリドーマ２０８／　９７は１９８８年２月１９日に受託番号第８８０２１ ９０１号としてＥＣＡＣＣに寄託しである。

Ｄ、方　法 Ｏプリン（１ｇ）抗体（２０埒／ウエル、　Ｃａｐｐｅｌ）　　１００埒／ウエ ルで平底のマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ　ｋ３９ｔ２）をコートし た。４℃で一晩インキユベーションしたｔｌｋ　、Ｔｗｅｅｎ−２００，０５％ 及び１０＋＋＋ＨＴｒｉｓ（ヒドロキシメチルアミノメタン）（Ｎ　Ｅ　Ｎ　。

ボストン、マサチューセッツ）を含有するｐＨ８の洗浄用バッファ（ＷＢ）でプ レートを２回洗浄した。

次に、各ウェルに、１％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌＣＯｏ、カナキー、イリノイ）を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ） を加え、未占有のプラスチック部分を飽和した。次に、プレートを空温で更に３ ０分間インキュベーションした。その後、上記のようにプレートを洗浄した。テ スト用の上１ｉ（１００成）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間イン キュベー０．０５％（ＮＥＮ）含有、ｐＨ７，４］で適当に希釈した、ｌルオキ シダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＴｏ（ｌａＡ＋ＩａＧ＋　Ｉ　Ｑ　 Ｍ　：　Ｃａｔ）ｐｅｌ）又Ｌｔウサキ抗ヒトＩ　ＱＭ　（μ１ｌｌＷ異性：Ｄ ａｋＯｐａｔｔＳ、コペンハーゲン、デンマーク）　　１００ＪＩｊを各ウェル に加え、プレートを３７℃で６０分間上記のように更にインキュベーションした 。

次に２００成のペルオキシダーゼ基質（ＮＥＮ）を各ウェルに加えた。この基質 は０．２％の０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び０．０１５％のＨ２Ｏ２を 含有する蒸留水からなる。５〜１５分間反応させ、その後に４ＭＨＳＯ２を加え て発色を停止させま た。ウール内の発色の程度をプレートＥＬＩＳＡリーダー上、４９２ｎｉで読み 取った。１ｇ量を定量するために、ヒト１ｇ標準（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ、ネーパービル、イリノイ）を加えてこの系を検量した。

２、　Ｒａ５ｉｌＶａＸ−ＥＬＩＳ＾ ５０ｍＭ重炭酸バッファ　（ｐＨ９，６）で希釈した５０Ｊ４／　ａｆｆのＲａ ５ｉｌｖａｘ１００ＪＪ／ウエルで平底マイクロタイタープレートをコートした 。

４℃で一晩インキユベートした後、プレートをＷ巳で２回洗浄した。次に１％の ＢＳＡを有するＰＢＳを各ウェルに加えて非占有プラスチック部分を飽和し、こ のプレートを空温で更に３０分間インキュベーションした。その後、上記のよう にプレートを洗った。テスト用の上清（１００ｇｆｆ　）を各ウェルに加え、プ レートを３７℃で６０分間インキュベーションした後、上記のように洗４を各ウ ェルに加え、プレートを上記のように３７℃で６０分間更にインキュベーション した。

１ｏ−ＥＬＩＳＡについてと同様にペルオキシダーゼの基質を加え、発色させた 。

３、　　蛍光ＩＦの研究 狂犬病ウィルスに感染した又は感染していない細胞へのモノクローナル抗体２０ ８／　９７の結合を間接免疫蛍光を用いて研究した。８至のミグ０組＄１空／ス ライド（Ｍｉ　１ｅｓ）内の、５％の生新生児血清（ＮＣ８）を補充したイーグ ル最少必須培地（ＥＭＥＭ）中で、３７℃、　５％Ｃ０２で２４時間ＣＥＲ［ｌ 胞を増殖させた。次に、血清を含まないＥＭＥＭで細胞を３回洗った後、ＥＭＥ Ｍ　１％ＮＣ３で希釈したＣＶＳ　［誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）ウィルス株］ 固定狂犬病ウィルスを用いて３７℃で１時間細胞に感染させた。次に、接種物を 取り除き、細胞を血清を含まないＥＭＥＭで洗浄し、更に　１００％の細胞を感 染させるのに十分な時間インキュベーションした。次に、細胞をＰＢＳで３回洗 い、全て固定しないか又はアセトン中−２０℃で５分間固定して使用した。直接 ＩＦ研究では、次に、ＰＢＳで１・４０に希釈したフルオロレセインイソチオシ アネート（ＦＩＴＣ）結合ウサギ抗狂犬病ウィルスヌクレオカプシドＩ　Ｌ；Ｊ 　Ｇ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒＰｒＯｄＬＩＣｔ　ｉｏｎ、パリ、 フランス）で細胞をコートし、３７℃（固定ｍ胞）又は４℃（新鮮な細胞）で４ ５分間インキュベーションした。間接ＩＦ研究では、先ず２７４Ｆ／ｍｅのモノ クローナル抗体２０８／　９７を含有するＰＢＳ　２％牛脂児血清（Ｆｅ２）と 共に細胞を３７℃（固定細胞）又は４℃（新鮮な細胞）で４５分間インキュベー ションした。次に、細胞を洗い、ＦＩＴＣ結合ウサギつヒトＩ　Ｑ　（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｏｅｒ、　ｖンハイム、ＦＲＧ）の１：１０希釈液と共に上記のように３ ７℃又は４℃で更にインキュベーションした。

最後に、細胞をＰＢＳで洗い、グリセロール中に固定し、蛍光顕微鏡下で観察し た。

４、　イルスの中和 直接免疫蛍光￥＆（ＲＦＦＩＴ）でウィルス中和抗体を測定した。指示した希釈 のハイブリドーマ又は対照の上清２００成を種々の個数の感染性狂犬病ウィルス 粒子を含有するＥＭＥＭ　１％ＦＣ８等量と共に３７℃で１時間インキュベーシ ョンすることにより、ハイブリドーマ上清の中和効果を測定した。

狂犬病ウィルスはＢＨＫ〜２１１１１中で増殖するＳＡＤウィルスのＣｖＳ又は ＥＲＡ株であった。インキュベーションの終了時に、ミラ０組織空／スライド内 で増殖したＣＥＲＩＵＭに各上清混合物を加えた。３７℃で１時間後、接種物を 取り除き、単層物をＥＭＥＭで洗浄した。更に、対照培養物（ウィルスのみ）中 の細胞を１００％感染させるのに十分な時間、３７℃。５％ＣＯ２で細胞をイン キュベーションした。次に、３０項に記載したようにＦＩＴＣ結合ウサギつ狂犬 病ウィルつヌクレオカプシドＩＯＧを使って固定細胞上での直接ＩＦで感染細胞 の割合を測定した。結果を、ウィルスのみで処理したＩｌｌに対する抗体／ウィ ルス混合物で処理した細胞培養物のパーセント蛍光阻害として表わす。

１組の実験の後に、ウィルス吸着後の中和を調べた。この場合には、４℃でｉｉ ｍインキュベーションすることによって、１０３個の感染性ＣｖＳ狂犬病ウィル ス粒子をミラ０組１１苗／スライド内で増殖させたＣＥＲ細胞に吸着させた。次 に、細胞を血清を含まないＥＭＥＭで洗い、予め温めておいたＥＭＥＭ１％ＦＣ ８のみ又は、モノクローナル抗体２０８／　９７若しくは国際的な基準の抗狂犬 病血清を含むＥＭＥＭ　１％ＦＣ５と共に３７℃で１時間インキュベーションＬ ノだ。次に、上記のように細胞を洗い、ＥＭＥＭ　５％ＮＣ３と共に３７℃で７ ２時間更にインキュベーションした。この後、前述のように感染した細胞数を測 定した。

５、染色体調製物 ｌ５ｈｉｈａｒａら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、２２：　　３７５〜３７９（ １９６２）に記載されている空気感染法を使って、２０ｇ／　９７ハイブリド一 マｍ胞の染色体調製物を作製した。

工　　１ 上　　べ ω く 、り会　テＬ　がＬ４−Ｑ＠市イｉレス　ル１−局★＝ウマ元ン工九゛杓上味鳴 　　　　（１，Ｕ、／ｍｌ　ｌ甲野ｉＩ！否報告 一、−−、−＝−−−−−Ｐ（Ｔ／Ｅ？　８９１００３６５国際調査報告 εＰ　８９００３６５ ＳＡ　　　　２７７５７

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスに特 異的に結合し、 （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体。
2. ２．前記抗体がＩｇＭ免疫グロブリンクテである請求項１に記載のヒトモノクロ ーナル抗体。
3. ３．前記抗体がＩｇＧ免疫グロブリンクテスである請求項１に記載のヒトモノク ローナル抗体。
4. ４．狂犬病ウイルス株Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅに特異的に結合し、並びに狂犬 病ウイルス株ＣＶＳ及びＥＲＡを特異的に中和する請求項１に記載のヒトモノク ローナル抗体。
5. ５．（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄｅｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスと特 異的に結合し、及び （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ細胞系及びその子孫細胞。
6. ６．ハイプリドーマ細胞系２０８／９７（ＥＣＡＣＣ受託番号第８８９０２１９ ０１号）及びその子孫細胞。
7. ７．（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスと特 異的に結合し；及び （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ細胞系の製造方法であって、 Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスに特異的に結合 する抗体を産生するヒト由来の細胞と永久増殖細胞とを融合することからなる方 法。
8. ８．永久増殖細胞が細胞系ＦＤ５（ＥＣＡＣＣ受託番号第８７０６１７０１号） の細胞である請求項７に記載の方法。
9. ９．ヒト由来の抗体産生細胞がウイルスで形質転換されたヒトリンパ球である請 求項７に記載の方法。
10. １０．ヒト由来の抗体産生細胞が形質転換していないヒトリンパ球である請求項 ７に記載の方法。
11. １１．融合する前、又はもし適切であれば形質転換する前に、Ｒｈａｂｄｏｖｉ ｒｉｄａｅの狂犬病ウイルス群の血清型１群のウイルス及び／又は有糸分裂物質 を用いてリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏで刺激激する請求項９又は１０に記載の方法 。
12. １２．（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスに 特異的に結合し；及び （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体の製造方法であって、前記抗体を分泌するハイプリドー マ細胞系又はその子孫細胞を培養し並びに、このようにして製造したモノクロー ナル抗体を回収することからなる方法。
13. １３．ハイプリドーマ細胞系が細胞系２０８／９７（ＥＣＡＣＣ受託番号第８８ ０２１９０１号）である請求項１２に記載の方法。
14. １４．（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスと 特異的に結合し；及び （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体と医薬上許容しうる担体又は希釈剤とからなる医薬組成 物。
15. １５．細胞系ＦＤ５（ＥＣＡＣＣ受託番号第８７０６１７０１号）。
16. １６．検体がＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスを 含有しているかどうかを検出する方法であって、（ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄ ａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスに特異的に結合し；及び （ｂ）前記ウイルスを中和する ヒトモノクローナル抗体を検体と接触させること並びに、抗体−抗原複合体が形 成されているかどうかを検出することからなる方法。
17. １７．狂犬病を発症する危険性の疑いのある人を治療する方法であって、 （ａ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅの狂犬病群の血清型１群のウイルスに特異的 に結合し；及び （ｂ）前記ウィルスを中和する ヒトモノクローナル抗体の有効量をその人に投与することからなる方法。