CN115772220A - 针对人白介素-1β的兔单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供针对人白介素‑1β的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供针对人白介素‑1β的高亲和力兔单克隆抗体对，开发出针对人白介素‑1β蛋白的双抗夹心法酶联免疫检测方法。其中，捕获抗体为兔单克隆抗体10A10，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体1F3，检测灵敏度高。同时，该方法经验证与人白介素‑1β相似的其他人白介素系列蛋白及大鼠和兔来源的白介素‑1β蛋白没有交叉反应。

Description

针对人白介素-1β的兔单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种针对人白介素-1β的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

人白介素-1β(IL-1β，以下简称“IL-1β”)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。IL-1β分泌主要来源是巨噬细胞和几乎所有的有核细胞，如B细胞、NK细胞、体外培养的T细胞、角质细胞、树突状细胞、星形细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞。

IL-1β在急慢性炎症和自身免疫性疾病中发挥关键作用。IL-1β的过度产生会引发发热、贫血和急性期蛋白水平升高为特征的的全身性炎性疾病。IL-1β是炎症和宿主对感染反应最重要的介质之一。在病毒、细菌、真菌和寄生虫感染的患者中发现IL-1β产生增加。IL-1β水平升高也与动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病和各种自身免疫性疾病有关，如类风湿性关节炎、多发性硬化症和克罗恩病。在伴有炎症过程的神经退行性疾病中也发现了IL-1β产生增加的特征，如阿尔茨海默病或帕金森氏病。IL-1β还参与肿瘤的发生发展，IL-1β的过度表达可能导致肿瘤的发生，促进肿瘤的侵袭。已有研究证实了骨髓来源的IL-1β通过诱导乳腺癌细胞中细胞内NFkB和CREB信号转导刺激乳腺癌细胞在骨骼中的定植，这些发现可实现通过靶向抑制IL-1β介导的NFKB/CREB-Wnt信号通路作为预防乳腺癌骨转移的辅助治疗方案。

IL-1β在健康个体中不存在，即使在严重的全身炎症性疾病中，循环水平也无法检测到。但是，阻断IL-1β活性后，疾病反应表现会显著降低。这种可观察到的治疗反应是由于IL-1β的高特异性比活性，在人类中，这种反应水平在皮摩尔范围内。

目前，大部分市售IL-1βELISA检测试剂盒存在检测灵敏度不够的问题。因此，开发一种高灵敏度的IL-1β蛋白检测方法学具有非常重要的意义。

发明内容

基于此，有必要提供针对人白介素-1β的兔单克隆抗体及其制备和应用，该兔单克隆抗体与人白介素-1β的亲和力高，建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度高，特异性强。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种针对人白介素-1β的兔单克隆抗体对。其中：

兔单克隆抗体10A10的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5以及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；兔单克隆抗体10A10的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。兔单克隆抗体10A10的轻链的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.6所示。

兔单克隆抗体1F3的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15以及SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。兔单克隆抗体1F3的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。兔单克隆抗体1F3的轻链的序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供针对人白介素-1β兔单克隆抗体在制备检测人白介素-1β的试剂或者试剂盒中的应用。在其中一些实施例，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人白介素-1β，兔单克隆抗体10A10作为捕获抗体，兔单克隆抗体1F3用作标记抗体。人白介素-1β选自重组人白介素-1β、细胞分泌的人白介素-1β、人血清中人白介素-1β中的至少一种。

本发明还可以提供抗体偶联物，采用上述人白介素-1β兔单克隆抗体与偶联组分反应制备而成。

本发明还可以提供针对人白介素-1β兔单克隆抗体的基因或者包含该基因的表达载体，便于通过基因工程实现抗体的表达和纯化。

本发明还可以提供针对人白介素-1β兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：获取包含针对人白介素-1β兔单克隆抗体的基因的表达载体；转染宿主；培养，纯化获得兔单克隆抗体为兔单克隆抗体10A10或兔单克隆抗体1F3。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明实质提供了高亲和力的人白介素-1β兔单克隆抗体对：兔单克隆抗体10A10和1F3，并证明了这两个抗体可以识别人白介素-1β蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒。本发明利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。

附图说明

图1为兔号为N15704和N15705四免血清ELISA检测数据。

图2为哺乳动物表达抗体轻重链载体图谱。

图3为纯化后兔单克隆抗体1F3和10A10的SDS-PAGE电泳胶图。

图4为亲和力测试实验统计图。

图5为抗体表位测定实验统计图。

图6为基于抗体10A10和1F3与建立的双抗夹心酶联免疫(ELISA)检测人白介素-1β的方法的标准曲线图。

图7为基于抗体10A10和1F3与建立的酶联免疫检测人白介素-1β的方法的交叉反应试验结果统计图。

图8为基于抗体10A10和1F3与建立的酶联免疫检测人白介素-1β的方法的热稳定性测试结果统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例提供针对人白介素-1β兔单克隆抗体，包括兔单克隆抗体10A10和兔单克隆抗体1F3。

其中，兔单克隆抗体10A10的氨基酸序列如下：

10A10-轻链全长(FL)序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSLYNNNELSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGDYSCRIADCYAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:1)。

10A10-轻链可变区(VL)序列：

AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSLYNNNELSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGDYSCRIADCYAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:2)。

10A10-轻链互补决定区(LCDR1)序列：

QSLYNNNELSW(SEQ ID NO:3)。

10A10-轻链互补决定区(LCDR2)序列：

LIYKASTLASGV(SEQ ID NO:4)。

10A10-轻链互补决定区(LCDR3)序列：

QGDYSCRIADCYAF(SEQ ID NO:5)。

10A10-重链全长(FH)序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYAMSWVRQAPGKGLEWIGIISGSGNTAYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSYEDYANIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ IDNO:6)。

10A10-重链链可变区(VH)序列：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYAMSWVRQAPGKGLEWIGIISGSGNTAYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSYEDYANIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)。

10A10-重链互补决定区(HCDR1)序列：

FSLSTYAMS(SEQ ID NO:8)。

10A10-重链互补决定区(HCDR2)序列：

WIGIISGSGNTAYASWAK(SEQ ID NO:9)。

10A10-重链互补决定区(HCDR3)序列：

YFCARSYEDYANI(SEQ ID NO:10)。

兔单克隆抗体1F3的氨基酸序列如下：

1F3-轻链全长(FL)序列：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSQSVSHNNWLAWYQQKPGQPPKLLIYDASKLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGETFCSSADCNAFGGGTELVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:11)。

1F3-轻链可变区(VL)序列：

AQVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSQSVSHNNWLAWYQQKPGQPPKLLIYDASKLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGETFCSSADCNAFGGGTELVVK(SEQ ID NO:12)。

1F3-轻链互补决定区(LCDR1)序列：

QSVSHNNWLAW(SEQ ID NO:13)。

1F3-轻链互补决定区(LCDR2)序列：

LIYDASKLASGV(SEQ ID NO:14)。

1F3-轻链互补决定区(LCDR3)序列：

QGETFCSSADCNAF(SEQ ID NO:15)。

1F3-重链全长(FH)序列：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRNAISWVRQPPGKGLEWIGFISSYDTTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKIASPTTEDTATYFCARETGADNNSNFDIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:16)。

1F3-重链链可变区(VH)序列：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRNAISWVRQPPGKGLEWIGFISSYDTTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKIASPTTEDTATYFCARETGADNNSNFDIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)。

1F3-重链互补决定区(HCDR1)序列：

FSLSRNAIS(SEQ ID NO:18)。

1F3-重链互补决定区(HCDR2)序列：

WIGFISSYDTTYYATWAK(SEQ ID NO:19)。

1F3-重链互补决定区(HCDR3)序列：

YFCARETGADNNSNFDI(SEQ ID NO:20)。

本发明还提供针对人IL-1β的兔单克隆抗体10A10或兔单克隆抗体1F3的制备方法，包括如下步骤：采用特定的重组人IL-1β作为免疫原，免疫兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取抗体对应的重链可变区、轻链可变区的基因扩增产物，进一步构建到表达载体上，转染细胞等宿主，获得含有兔单克隆抗体10A10和1F3的上清，纯化，即得。

下面针对上述兔单克隆抗体10A10或兔单克隆抗体1F3的制备及应用进行举例说明。

试验例1

以南京艾璞生物科技有限公司生产的重组人IL-1β蛋白为(货号：艾璞:HF-1001)免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200μg，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫，四次免疫后用ELISA方法测定血清效价，如图1所示，兔号N15705四免血清滴度较高，故选取血清效价高的兔号进行筛选，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

进行B淋巴细胞分选，方法参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，获得B细胞。

编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后根据ZYMO公司Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒(货号：R1051)说明书提取RNA并反转录成cDNA，采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体的轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。

其中，10A10单克隆抗体的基因序列如下：

>10A10-轻链FL基因序列：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGCTTGCTCCTCCTCTGGTTGCCCGGAGCTACATTTGCTCAGGTCCTCACGCAGACCCCTAGCAGTGTTTCCGCAGCCGTCGGAGGGACCGTGACAATAAACTGTCAAGCCTCTCAATCACTGTATAACAATAATGAGCTGAGCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGCCCCCTAAACTGCTCATCTATAAGGCCTCAACTCTGGCAAGTGGGGTGTCAAGCAGATTTAAGGGTTCCGGGTCAGGTACTCAATTTACGTTGACTATCAGCGGTGTCCAATGCGATGACGCGGCGACGTACTATTGTCAAGGGGACTACAGCTGCCGGATCGCGGACTGCTACGCTTTCGGGGGTGGAACCGAGGTTGTGGTGAAAGGAGATCCAGTTGCGCCGACTGTTCTGATATTTCCCCCTGCAGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO:21)。

>10A10-轻链可变区VL基因序列：

GGCTTGCTCCTCCTCTGGTTGCCCGGAGCTACATTTGCTCAGGTCCTCACGCAGACCCCTAGCAGTGTTTCCGCAGCCGTCGGAGGGACCGTGACAATAAACTGTCAAGCCTCTCAATCACTGTATAACAATAATGAGCTGAGCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGCCCCCTAAACTGCTCATCTATAAGGCCTCAACTCTGGCAAGTGGGGTGTCAAGCAGATTTAAGGGTTCCGGGTCAGGTACTCAATTTACGTTGACTATCAGCGGTGTCCAATGCGATGACGCGGCGACGTACTATTGTCAAGGGGACTACAGCTGCCGGATCGCGGACTGCTACGCTTTCGGGGGTGGAACCGAGGTTGTGGTGAAAGGAGATCCAGTTGCGCCGACTGTTCTGATATTTCCCCCTGCA(SEQ ID NO:22)。

>10A10-重链FH基因序列：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTTGCGGTTCTCAAGGGGGTTCAGTGTCAGAGTGTTGAGGAGAGTGGAGGACGCCTCGTTACGCCCGGAACTCCTCTGACTCTCACCTGTACGGTTAGCGGCTTCAGTCTCTCCACATACGCAATGAGCTGGGTGCGGCAGGCACCGGGAAAAGGTCTGGAATGGATAGGCATCATATCCGGAAGCGGCAATACAGCGTATGCTAGTTGGGCGAAGGGTCGGTTCACTATAAGTAAGACCAGTACCACTGTCGATTTGAAAATGACCAGTCCAACAACCGAGGACACAGCCACTTACTTCTGTGCGAGATCATATGAGGACTATGCAAACATATGGGGTCCAGGGACTCTCGTTACGGTCAGCTCAGGGCAGCCTAAGGCTCCTTCAGTCTTTCCTCTGGCCCCTTGTTGCGGTGATACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO:23)。

>10A10-重链可变区VH基因序列：

GTTGCGGTTCTCAAGGGGGTTCAGTGTCAGAGTGTTGAGGAGAGTGGAGGACGCCTCGTTACGCCCGGAACTCCTCTGACTCTCACCTGTACGGTTAGCGGCTTCAGTCTCTCCACATACGCAATGAGCTGGGTGCGGCAGGCACCGGGAAAAGGTCTGGAATGGATAGGCATCATATCCGGAAGCGGCAATACAGCGTATGCTAGTTGGGCGAAGGGTCGGTTCACTATAAGTAAGACCAGTACCACTGTCGATTTGAAAATGACCAGTCCAACAACCGAGGACACAGCCACTTACTTCTGTGCGAGATCATATGAGGACTATGCAAACATATGGGGTCCAGGGACTCTCGTTACGGTCAGCTCAGGGCAGCCTAAGGCTCCTTCAGTCTTTCCTCTGGCCCCTTGTTGCGGTGATACA(SEQ ID NO:24)。

1F3单克隆抗体的基因序列如下：

>1F3-轻链FL基因序列：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTGCTCCTCTTGTGGCTGCCAGGAGCGACATTCGCTCAAGTCCTCACCCAAACTCCTAGCCCCGTGTCTGCGGCGGTTGGAGGGACTGTTACCATTAATTGTCAGTCAAGCCAGAGCGTTTCTCATAATAATTGGCTCGCGTGGTATCAACAGAAGCCGGGACAGCCCCCGAAACTGCTGATTTACGACGCGAGCAAATTGGCCTCTGGAGTTAGCAGCCGGTTTCGGGGAAGTGGTAGCGGCACGCAATTTACTCTGACAATATCTGGCGTTCAATGCGACGACGCTGCAACTTACTACTGTCAAGGGGAGACTTTTTGTTCTAGTGCGGACTGCAATGCGTTTGGAGGAGGCACAGAGCTGGTTGTCAAGGGAGACCCTGTGGCCCCAACTGTGCTCATATTCCCTCCTGCAGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO:25)。

>1F3-轻链可变区VL基因序列：

GGGCTGCTCCTCTTGTGGCTGCCAGGAGCGACATTCGCTCAAGTCCTCACCCAAACTCCTAGCCCCGTGTCTGCGGCGGTTGGAGGGACTGTTACCATTAATTGTCAGTCAAGCCAGAGCGTTTCTCATAATAATTGGCTCGCGTGGTATCAACAGAAGCCGGGACAGCCCCCGAAACTGCTGATTTACGACGCGAGCAAATTGGCCTCTGGAGTTAGCAGCCGGTTTCGGGGAAGTGGTAGCGGCACGCAATTTACTCTGACAATATCTGGCGTTCAATGCGACGACGCTGCAACTTACTACTGTCAAGGGGAGACTTTTTGTTCTAGTGCGGACTGCAATGCGTTTGGAGGAGGCACAGAGCTGGTTGTCAAGGGAGACCCTGTGGCCCCAACTGTGCTCATATTCCCTCCTGCA(SEQ ID NO:26)。

>1F3-重链FH基因序列：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCAGTCCTGAAGGGCGTGCAGTGTCAATCTGTTGAGGAGTCCGGGGGCCGCTTGGTTACCCCAGGCACTCCTCTGACGCTGACCTGCACCGTGAGCGGTTTCTCTCTCTCCAGAAATGCAATATCCTGGGTTCGGCAACCTCCGGGTAAAGGGCTCGAATGGATTGGGTTTATAAGTTCCTATGACACGACTTACTACGCAACGTGGGCAAAAGGGAGATTCACAATTTCCAAAACCAGCACTACTGTCGACTTGAAAATTGCCTCACCCACGACAGAGGATACTGCAACCTACTTCTGTGCTAGGGAGACCGGTGCGGATAATAATTCCAACTTTGATATTTGGGGGCCGGGGACGTTGGTGACTGTTTCTTCAGGGCAGCCCAAGGCACCTAGTGTCTTCCCCTTGGCTCCCTGTTGTGGTGATACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO:27)。

>1F3-重链可变区VH基因序列：

GTGGCAGTCCTGAAGGGCGTGCAGTGTCAATCTGTTGAGGAGTCCGGGGGCCGCTTGGTTACCCCAGGCACTCCTCTGACGCTGACCTGCACCGTGAGCGGTTTCTCTCTCTCCAGAAATGCAATATCCTGGGTTCGGCAACCTCCGGGTAAAGGGCTCGAATGGATTGGGTTTATAAGTTCCTATGACACGACTTACTACGCAACGTGGGCAAAAGGGAGATTCACAATTTCCAAAACCAGCACTACTGTCGACTTGAAAATTGCCTCACCCACGACAGAGGATACTGCAACCTACTTCTGTGCTAGGGAGACCGGTGCGGATAATAATTCCAACTTTGATATTTGGGGGCCGGGGACGTTGGTGACTGTTTCTTCAGGGCAGCCCAAGGCACCTAGTGTCTTCCCCTTGGCTCCCTGTTGTGGTGATACA(SEQ ID NO:28)。

试验例2

本试验例提供兔单克隆抗体的生产和纯化方法，包括如下步骤：

构建表达载体：

所使用的哺乳动物表达载体见图2，其中，pBR322Ori和f1Ori是在E.Coli中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promotor为在真核生物中的启动子，SV40_PA_terminator是加尾信号，Heavy chain constant(图2a)和Light chain constant(图2b)分别为兔重链不变区序列和轻链不变区序列。

将含兔单克隆抗体重链不变区(图2a)和轻链不变区(图2b)哺乳动物细胞表达母本质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。

利用尾部带有和载体一致同源序列的PCR引物，对所获得的兔单克隆抗体轻重链可变区(VH和VL)基因进行扩增；PCR反应体系为：95℃3min,然后按下列条件进行25个循环反应，95℃1min，56℃1min，68℃0.5min；最后95℃10min。

其中，重链基因的扩增引物序列为：

5’-tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG-3’(SEQ ID NO:29)；

5’-gtagcctttgaccaggcagcCGCCTGAGTTCCACGACACC-3’(SEQ ID NO:30)。

轻链基因的扩增引物为：

5’-tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC-3’(SEQ ID NO:31)；

5‘-acacacacgatggtgactgGTTTCTCGTAGTCTGCTTTGC-3’(SEQ ID NO:32)。

对扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中去。

经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因、重链基因的表达质粒一起转染到293细胞中去。转染72-96小时后，离心除去细胞，获得的培养上清。

使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人白介素-1β的兔单克隆抗体。亲和层析实验步骤为：将培养上清转移至无菌50ml离心管中，1000g离心，4℃(或常温)离心10分钟，收集上清液。将预处理后的Protein A Agarose(品牌：天地人和；货号：SA023100)悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育室温3～4小时或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，用掌上离心机常温离心1分钟，使固液分离，收集流穿液。加入十倍Protein A Agarose体积的洗涤缓冲液(磷酸缓冲液pH为7.0)并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入洗脱缓冲液(柠檬酸盐缓冲液pH为3.0)，离心机离心，获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋(索莱宝；YA1070)中，透析过夜，收取抗体。

SDS-PAGE跑胶检测纯化的兔单克隆抗体1F3和10A10，结果见图3：抗体纯度均大于90％，将检测合格抗体分装，于-20℃低温保存备用。

试验例3

对试验例2所获得的兔单克隆抗体进行抗体亲和力的初步鉴定，使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体的亲和力进行初步测定，本次实验通过Gator Prime设备进行，使用探针为Anti-His Probe，方法步骤为：

1)Pre-wet：使用前将Anti-His探针在配套buffer中震荡润湿，1000rpm，300sec；2)Baseline1：将Anti-His探针放置于缓冲液中进行起始点校准，保证探针初始于稳定状态，1000rpm，60sec；3)Loading：将目的蛋白固化在Anti-His探针上，固化浓度为5μg/mL，1000rpm，1660sec；4)Baseline2：将固化蛋白后的探针放置于缓冲液中进行震荡洗涤，1000rpm，60sec；5)Association1：固化蛋白后的探针首先放置于3μg/mL的第一抗体稀释液中，使第一抗体和目的蛋白结合至饱和，1000rpm，1980sec；6)Association2：将固化目的蛋白和第一抗体后的探针放置于第二抗体稀释液中，使第二抗体结合目的蛋白在不同于第一抗体的其他表位上，1000rpm，600sec。

其中，使用到的材料为重组人IL-1β蛋白，使用浓度为527nM；使用所获得抗体的浓度为333nM；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和力较好的抗体。

测试如图4所示：兔单克隆抗体1F3和10A10在短时间内结合抗原达到饱和状态，较长时间内无明显解离，整体亲和力较高。

试验例4

对试验例2所获得的兔单克隆抗体与人IL-1β蛋白抗原识别表位进行鉴定。使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇。本次实验通过Gator Prime设备进行，使用探针为Protein A Probe，方法步骤为：

1)Pre-wet：使用前将Pro A探针在配套buffer中震荡润湿，1000rpm，300sec；2)Baseline1：将Pro A探针放置于缓冲液中进行起始点校准，保证探针初始于稳定状态，1000rpm，60sec；3)Loading：将待测抗体A(B)固化在Pro A探针上，固化浓度为3μg/mL，1000rpm，100sec；4)Baseline2：将固化抗体后的探针放置于缓冲液中进行震荡洗涤，1000rpm，60sec；5)Association：固化抗体后的探针分别放置于75nM和150nM抗原稀释液中，测试抗体在不同的摩尔浓度条件下结合抗原的亲和力情况，1000rpm，300sec；6)Dissociation：当抗原抗体结合达到饱和状态后，将探针转至解离体系中完成解离过程，1000rpm，1080sec。

其中，使用到的材料为重组人IL-1β蛋白，使用浓度为527nM，使用所获得抗体(试验2制备的兔单克隆抗体1F3和10A10，分别记作兔抗Human IL-1β单克隆抗体A和兔抗HumanIL-1β单克隆抗体B)的浓度分别为333nM；通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗本。

测试结果如图5所示：固化IL-1β后的探针在结合兔单克隆抗体1F3后能明显结合作为第二抗体的10A10，此时shift值为0.214，综上，判断兔单克隆抗体1F3和10A10结合IL-1β表位不一致。

实施例5

针对人IL-1β蛋白的兔单克隆抗体10A10和1F3，建立双抗夹心法酶联免疫检测方法：

1)包被：将兔单克隆抗体10A10(捕获抗体，试验例2制备)用1×PBS稀释成1μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16～20h。

2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

3)封闭：将E007封闭液以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干22h，取出备用。

4)加蛋白：将标准样品(重组人白介素-1β，R&D货号：840170)用稀释液(含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)稀释，稀释浓度：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、0pg/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

6)加检测抗体：将1F3-biotin(检测抗体)稀释成0.1μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。

其中，1F3-biotin(检测抗体)的标记处理方法为：将兔单克隆抗体1F3配成1mg/mL的溶液；用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的兔单克隆抗体1F3溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50μg 500mM pH9.0的Tris溶液中止反应；最后加入大量pH7.4的1X PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

8)加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

10)加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

11)孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

统计结果绘制的线性曲线见图6。

进一步进行灵敏度测试，方法步骤同上，区别在于：双抗夹心法酶联免疫检测方法中重组人IL-1β蛋白的稀释浓度分别为：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、0pg/mL，加样量为100ul/孔。兔单克隆抗体10A10和1F3协同应用的检测方案的检测灵敏度可以达5.0979pg/mL。

同时，对比Abcam(货号：ab46052)灵敏度6.5pg/mL，兔单克隆抗体10A10和1F3协同应用的检测方案具有更高灵敏度。

实施例6

本实施例参照实施例5的方法步骤进行双抗夹心法酶联免疫检测方法的交叉反应(特异性)测试，部分步骤的区别在于：2)洗板步骤加样体积为350μL；4)加蛋白步骤中过程为：将人白介素-1β蛋白用稀释液稀释成100pg/mL，其它蛋白H IL-1A(ABclonal自产货号：RM00485)、H IL-1RA(ABclonal自产)、H IL-18(R&D货号：844543)、H IL-33(ABclonal自货号：RM00753)、M IL-1β(R&D货号：840136)、M IL-33(ABclonal自货号：RM00485)、R IL-1A(ABclonal自货号:RM00417)、R IL-1β(R&D货号：840416)稀释成2ng/ml，然后以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

测试统计结果见图7，可以看出：兔单克隆抗体10A10和1F3对于人白介素-1β蛋白具有高度的特异性，与其它蛋白无交叉反应。

实施例7

本实施例参照实施例5的方法步骤探究兔单克隆抗体10A10和1F3的测试稳定性，区别在于在加蛋白步骤之前还包括热破坏的步骤：将包被好的酶标板、重组人白介素-1β冻干蛋白、100X浓缩的检测抗体(兔单克隆抗体10A10和1F3)分成三份，分别置于-20℃、4℃、37℃密封保存，7天后取出测试。

测试统计结果见图8，可以看出：以-20℃保存七天后进行检测的结果为基准，与-4℃保存七天后进行检测的差异为10.95％，与37℃破坏七天后进行检测的差异为9.24％，得出兔单克隆抗体10A10和1F3具有较强温度稳定性。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.针对人白介素-1β的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体10A10或兔单克隆抗体1F3；

所述兔单克隆抗体10A10的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5以及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；

所述兔单克隆抗体1F3的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15以及SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的针对人白介素-1β的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体10A10的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，和/或所述兔单克隆抗体10A10的重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；或者

所述兔单克隆抗体1F3的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或所述兔单克隆抗体1F3的重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求2所述的针对人白介素-1β的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体10A10的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，和/或所述兔单克隆抗体10A10的重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示；或者

所述兔单克隆抗体1F3的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或所述兔单克隆抗体1F3的重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。

4.如权利要求1至3任一项所述的针对人白介素-1β的兔单克隆抗体在制备检测人白介素-1β的试剂或者试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人白介素-1β，其中所述兔单克隆抗体10A10作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体1F3用作标记抗体。

6.一种检测人白介素-1β的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的针对人白介素-1β的兔单克隆抗体10A10和/或兔单克隆抗体1F3。

7.根据权利要求6所述的检测人白介素-1β的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述人白介素-1β选自重组人白介素-1β、细胞分泌的人白介素-1β、人血清中人白介素-1β中的至少一种。

8.一种抗体偶联物，其特征在于，采用权利要求1至3任一项所述的人白介素-1β兔单克隆抗体与偶联组分反应制备而成。

9.一种权利要求1至3任一项所述的针对人白介素-1β兔单克隆抗体的基因或者包含该基因的表达载体。

10.如权利要求1至3任一项所述的针对人白介素-1β兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取包含针对人白介素-1β兔单克隆抗体的基因的表达载体；

转染宿主；

培养，纯化获得兔单克隆抗体为兔单克隆抗体10A10或兔单克隆抗体1F3。

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