CN114720684A - 一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用。本发明中根据目前对与各种感染性疾病、肿瘤、细胞免疫治疗的科学研究与临川诊断的需求，研发一种多指标联合分析试剂盒，利用微球编码技术、磁珠标记技术、抗体标记技术、流式分析技术建立开发试剂盒，实现同时在一个液相体系中对各种感染性疾病、肿瘤、细胞免疫治疗、药物开发过程中细胞因子水平变化的监测。相对于传统的ELISA、化学发光等单指标检测系统，本产品大大提升了检测的效率，节约检测的时间，并与传统的ELISA技术相比具有较高的检测相关性，且能大大节约样本的需求量。

Description

一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及 应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
白细胞介素，简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。白细胞介素最初仅指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。IL-2是T细胞生长因子，能使T细胞在试管内长期存活，刺激T细胞进入细胞分裂周期。IL-2能增强T细胞的杀伤活性，在体外它与IL-4、IL-5和IL-6一起共同诱导细胞毒性T细胞(Tc)的产生，并使其活性大大增强，延长其生长期；在体内IL-2也能增强抗原诱导的TC活性，甚至可以辅助抗原和半抗原直接在祼鼠体内诱导产生TC。
细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭的重要原因。免疫细胞通过细胞因子彼此沟通，细胞因子是细胞释放到血液中的小分子，可以令免疫细胞冲到感染部位、吞噬遭到损伤的细胞，甚至穿透血管壁。细胞因子还可以引发炎症，令被破坏的机体肿胀、发热以及疼痛。
作为一种全身性炎症反应，细胞因子风暴表现为大量促炎症的细胞因子水平急剧升高。越来越多的临床证据显示细胞因子风暴造成的多器官衰竭是导致新型冠状肺炎重症病人死亡的重要因素。其实对于肿瘤科医生来说，细胞因子风暴并不陌生，某些单克隆抗体药物以及CAR-T细胞疗法等都会引发细胞因子风暴。
传统的ELISA、化学发光等单指标检测系统，检测效率低，检测时间长，且检测相关性也不够高。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒，包括：IL-2、6、8、10兔单抗抗体，磁性微球，MES缓冲液，EDC，Sulfo-NHS，含Tween 20的磷酸盐缓冲液，含BSA的磷酸盐缓冲液，稀释液，封闭试剂，链霉亲和素藻红蛋白；
其中，IL-2、6、8、10兔单抗抗体使用重组IL-2、6、8、10蛋白制备获得，所述重组IL-2、6、8、10蛋白ABclonal货号分别为IL-2：CatalogNo:RP01039、IL-6：CatalogNo:RP00201、IL-8：CatalogNo:RP00052、IL-10：CatalogNo:RP00093；
所述稀释液包括0.01M pbs，0.01％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4；
所述封闭试剂包括0.01M pbs，0.05％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
本发明还提供了一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，包括以下步骤：
步骤1：将IL-2、6、8、10兔单抗抗体与磁性微球偶联；其中，IL-2、6、8、10兔单抗抗体使用重组IL-2、6、8、10蛋白制备获得，所述重组IL-2、6、8、10蛋白ABclonal货号分别为IL-2：CatalogNo:RP01039、IL-6：CatalogNo:RP00201、IL-8：CatalogNo:RP00052、IL-10：CatalogNo:RP00093；
步骤2：使用稀释液稀释步骤1中得到的4种偶联抗体、蛋白样品及生物素化抗体；
步骤3：将蛋白样品与4种偶联抗体混合，避光反应；
步骤4：反应后进行洗涤；
步骤5：向反应后的体系中加入4种生物素化抗体，继续避光反应；
步骤6：反应后进行洗涤；
步骤7：向反应后的体系中加入链霉亲和素藻红蛋白，避光反应；洗涤后进行流式检测。
进一步地，步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体量为5-20ug。
进一步地，步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体量优选为10ug。
进一步地，步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体，使用的EDC用量为10ul-20ul50mg/ml。
进一步地，步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体，使用的EDC用量优选为10ul50mg/ml。
进一步地，SA-PE体系包括0.01M pbs，1-5％BSA，0.02％Tween-20，0.05％proclin300，pH＝8.5。
如上述的白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒在非诊断目的的白介素细胞因子检测中的应用。
本发明的技术原理：多指标联合分析检测在流式荧光平台的应用：基于液相芯片技术原理，通过编码微球捕获待测分子，并通过点阵仪的两束激光分别识别微球编码和被标记物报告分子的荧光强度，从而实现同时对多个检测指标的高通量联合检测。在细胞因子风暴监测、细胞表面标志物研究、外泌体药物开发以及临床项目联检都有广泛的应用。主要技术过程包括磁珠偶联、抗原抗体反应孵育和流式检测。
本发明根据目前对于各种感染性疾病、肿瘤、细胞免疫治疗的科学研究与临川诊断的需求，研发一种多指标联合分析试剂盒，利用微球编码技术、磁珠标记技术、抗体标记技术、流式分析技术建立开发试剂盒，实现同时在一个液相体系中对各种感染性疾病、肿瘤、细胞免疫治疗、药物开发过程中细胞因子水平变化的监测。相对于传统的ELISA、化学发光等单指标检测系统，本产品大大提升了检测的效率，节约检测的时间，并与传统的ELISA技术相比具有较高的检测相关性，且能大大节约样本的需求量。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本申请中涉及对细胞因子白介素2、6、8、10抗体的筛选、对抗体的偶联优化、对反应体系的优化。相对于传统的ELISA等单指标检测系统，需要4.5小时检测时间，本产品缩短了检测的时间，只需要1.5小时可完成检测，提升了效率。且通过优化抗体的选择、磁珠的偶联、反应体系的优化提升了检测的灵敏度。与ELISA检测需要100ul/样相比，本检测只需25-50ul/样本即可实现多指标的联合分析，并与传统的ELISA技术相比具有较高的检测相关性。
附图说明
图1是实施例1中的中位荧光强度检测结果；
图2是多重流式与ELISA进行对标定量的相关性分析结果；
图3是实施例2中对IL-2的灵敏度实验相关结果；
图4是实施例2中对IL-6的灵敏度实验相关结果；
图5是实施例2中对IL-8的灵敏度实验相关结果；
图6是实施例2中对IL-10的灵敏度实验相关结果；
图7是蛋白偶联量优化实验结果；
图8是EDC用量优化实验结果；
图9是NHS用量优化实验结果；
图10是反应体系优化实验结果；
图11是SA-PE用量优化实验结果；
图12是实施例4中进行单重多重的相关性分析的实验结果，分别是单重IL-2、6、8、10与多重IL-2、6、8、10的对比；CK是4种靶标；
图13是实施例4中对特异性进行分析的实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用。
本发明中主要通过多指标流式技术开发检测细胞因子白介素2、6、8、10的试剂盒产品，实现同时在一个液相体系中对各种感染性疾病、肿瘤、细胞免疫治疗、药物开发过程中细胞因子水平变化的监测。本发明中涉及对细胞因子白介素2、6、8、10抗体的筛选、对抗体的偶联优化、对反应体系的优化而获得。相对于传统的ELISA等单指标检测系统，需要4.5小时检测时间，本产品缩短了检测的时间，只需要1.5小时可完成检测，提升了效率。且通过优化抗体的选择、磁珠的偶联、反应体系的优化提升了检测的灵敏度。与ELISA检测需要100ul/样相比，本检测只需25-50ul/样本即可实现多指标的联合分析，并与传统的ELISA技术相比具有较高的检测相关性。
本发明中涉及的试剂主要包括：磁性荧光微球：107个/mL,1mL/支。活化缓冲液：MES缓冲液,pH 6.0,需0.22μm过滤。偶联缓冲液:MES缓冲液,pH 6.0,需0.22μm过滤；封闭液:含BSA的磷酸盐缓冲液，pH 8.0,需0.22μm过滤；保存液:含BSA的磷酸盐缓冲液,pH 7.4,需0.22μm过滤。洗液：含Tween 20的磷酸盐缓冲液，pH 7.4,需0.22μm过滤。EDC:需低温保存(低于-18℃)，注意防潮。Sulfo-NHS:需低温保存(低于-18℃)，注意防潮。2.0mL磁力架(建议使用Nova系列磁力架)。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一、实验材料：
ABclonal开发的重组IL-2、6、8、10蛋白：将IL-2、6、8、10蛋白基因克隆至大肠杆菌表达系统，获得重组大肠杆菌；对所述重组大肠杆菌进行培养，对培养液进行分离和纯化，获得重组IL-2、6、8、10蛋白。蛋白货号(ABclonal)如下：IL-2：CatalogNo:RP01039、IL-6：CatalogNo:RP00201、IL-8：CatalogNo:RP00052、IL-10：CatalogNo:RP00093。IL-2、6、8、10兔单抗抗体对：使用重组IL-2、6、8、10蛋白制备获得兔单抗。
二、多重流式荧光实验方法
1、白介素2、6、8、10抗体偶联磁珠
1)将磁性微球用旋涡混匀仪混匀15s，超声20s/次，超声3次，取100μL转移至1.5mlEP管中。
2)将EP管放在磁力架上磁吸2min使磁性微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
3)从磁力架上取下EP管，加入200μL活化缓冲液(缓冲液1)，涡旋混匀10s。将EP管放在磁力架上磁吸2min，使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
4)重复步骤3)一次。
5)分别用纯化水或者活化缓冲液(缓冲液1)配制50mg/mL EDC和50mg/mL Sulfo-NHS。
6)在含有微球的EP管中加入活化缓冲液100μL(缓冲液1)，10μL 50mg/mL EDC和10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，混匀后于旋转仪上室温避光孵育20min。
7)将EP管放在磁力架上磁吸2min使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
8)加入200μL偶联缓冲液(缓冲液2)，分散均匀后将EP管放在磁力架上磁吸2min使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
9)重复步骤8)一次。
10)加入500μL偶联缓冲液(缓冲液2)，混匀后取5-20ug的IL-2、6、8、10抗体和微球混匀。
11)放在旋转仪上孵育，室温避光反应2h。
12)将EP管放在磁力架上磁吸2min使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
13)加入500μL洗液，分散均匀后将EP管放在磁力架上磁吸2min使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
14)重复步骤13)一次。
15)在EP管中加入1mL封闭液，混匀后放在旋转仪上室温避光孵育2h或者4℃过夜。
16)将EP管放在磁力架上磁吸2min使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
17)在EP管中加入500μL洗液，混匀后将EP管放在磁力架上2min，使微球吸附在EP管壁上，用移液器轻轻吸去上清。
18)重复步骤17)一次。
19)在EP管中加入0.1mL的保存液，混匀后保存于2-8℃。
2、白介素2、6、8、10细胞因子多重流式荧光检测试剂盒检测方法建立
抗原抗体反应孵育
1)使用微球稀释液稀释4种偶联抗体，稀释液的成分：0.01M pbs，0.01％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
2)使用反应缓冲液按要求稀释4种蛋白。稀释倍数根据蛋白冻干品的浓度与本产品检测所需的最高浓度进行计算。反应液的成分：0.01M pbs，0.01％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
3)分别在96孔反应板上依次加入：样本50ul/孔；4种抗体偶联的微球混悬液5ul/孔(加样前需充分震荡磁珠，贴壁加入磁珠，每个样本加5ul)加盖避光，恒温振荡器上1200rpm 37℃，避光反应30min。
4)取出96孔板，置于磁力板上，磁吸3min，倾去上清。
5)加入100ul/孔洗液，置振荡孵育器上1200rpm混匀20s，取出96孔板，置于磁力板上，磁吸3min，倾去上清。
6)使用反应缓冲液按2000倍稀释4种靶标的Sulfo-NHS标记的生物素化抗体。生物素化抗体即常规方法制备所得。
7)在96孔板内，加入4种靶标生物素化抗体50ul/孔，加盖避光，恒温振荡器上1200rpm室温，避光反应30min。
8)取出96孔板，置于磁力板上，磁吸3min，倾去上清。
9)重复步骤4)-5)一次。
10)在96孔板孔内，加入链霉亲和素藻红蛋白溶液50ul/孔，加盖避光，置振荡孵育器上1200rpm混匀20s，贴上封板纸，恒温振荡器上1200rpm室温，避光反应15min。取出96孔板，置于磁力板上，磁吸2min，倾去上清。
11)重复步骤4)-5)一次。
12)将反应板从磁力架上取下，加入70ul/孔的洗涤液，充分混匀后，上机测试。
流式检测通过流式测试，获得磁珠数量、荧光值(MFI)，通过建立标准蛋白分析曲线，分析获得所需样本的检测浓度。
3、白介素2、6、8、10ELISA方法建立
1)按1-4ug/ml浓度，在微孔板包被IL-2、6、8、10抗体，4℃过夜。
2)甩掉孔内液体，使用0.5-2％BSA进行封闭，37℃，2小时。
3)甩掉孔内液体，使用0.1M PBS，0.2％Twen-20，进行洗板，每孔350ul，洗3次，每次浸泡1分钟；完成后，将酶标板真空包装并储存在4℃备用。
4)从板框上取下待用的微孔板条，将剩余的板条放回装有干燥剂的铝箔袋中，然后重新密封保存。
5)每孔加入洗涤缓冲液350μL，静置40秒后弃去液体，该步骤共洗涤3次。
6)在空白孔中添加100μL稀释液做为空白对照。
7)在其他孔中分别加入100μL不同浓度的IL-2、6、8、10标准蛋白，用封板膜封闭板孔，37℃孵育2小时。
8)提前15分钟配制生物素标记的IL-2、6、8、10抗体工作液，将抗体进行进行2000倍稀释。
9)弃去孔中液体，重复步骤3中的洗涤步骤。
10)每孔中加入生物素标记的IL-2、6、8、10抗体工作液(100μL/孔)，并盖上新的封板膜，37℃下孵育1小时。
11)使用前15分钟配制好链霉亲和素-HRP的工作液。
12)弃去孔中液体，重复步骤3中的洗涤步骤。
13)每孔中加入链霉亲和素-HRP工作液(100μL/孔)，并盖上新的封板膜，37℃孵育30分钟。
14)预热酶标仪。
15)弃去孔中液体，重复步骤3中的洗涤步骤。
16)向孔中加入TMB底物(100μL/孔)。在37℃下避光孵育15-20分钟。
17)加入终止液(50μL/孔)，并立即放入酶标仪，在5min内测定每个孔450nm的OD值。如果可以选择校正波长，则设置为570nm或630nm。并从450nm的读数中减去570nm或630nm的读数，这种方式可以校正并去除非显色物质的OD值，从而获得更准确的检测结果。如果无法选择校正波长，则获得的读数将偏高，导致读数的准确度下降。
4、实验结果
白介素2、6、8、10细胞因子多重流式荧光检测标准蛋白数据如下表所示。
Figure BDA0003578188940000081
中位荧光强度如图1。
白介素2、6、8、10细胞因子ELISA检测标准品数据如下表。
Figure BDA0003578188940000082
使用白介素2、6、8、10细胞因子标准质控品分别在多重流式与ELISA进行对标定量的相关性分析如下表及图2。
Figure BDA0003578188940000091
根据数据与分析，可得出结论如下：
1、多重流式与ELISA检测相同的质控品获得的检测数据，相关性CV均小于10％，测试相关性高度相关。
传统的ELISA等单指标检测系统，需要4.5小时检测时间，多重流式产品缩短了检测的时间，只需要1.5小时可完成检测，提升了效率。且可以使用更少的样本量获得更多的检测数据，且有较好的检测相关性。
实施例2
本实施例中的实验材料、方法等同实施例1。本实施例中通过多对抗体对的灵敏度、线性测试，选取灵敏度最好的成为产品所需，提供最优的灵敏度产品。灵敏度测试分别为：IL-2：1.52pg/mL；IL-8：2.33pg/mL；IL-6：1.04pg/mL；IL-10：1.16pg/mL。相关实验数据如图3-图6所示。
本实施例中通过优化抗体选择，选择高灵敏度、线性好的克隆抗体对，提升了检测的灵敏度。
实施例3
本实施例中的实验材料、方法等同实施例1。本实施例中通过优化抗体磁珠偶联，主要是优化蛋白偶联量、EDC使用量、封闭试剂提升了检测的灵敏度。
方案1:蛋白偶联量：5ug、EDC使用量：10ul 50mg/ml、封闭试剂:0.01M pbs，0.05％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
方案2:蛋白偶联量：10ug、EDC使用量：20ul 50mg/ml、封闭试剂：0.01M pbs，0.05％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
本实施例中通过提高偶联抗体量，检测标准蛋白的的信号值MFI提升了约11％，提高了检测灵敏度。实验数据如下表及图7所示。
检测标准品浓度(pg/ml) 检测标准品浓度(pg/ml) 方案1：MFI值 方案2：MFI值
0 0 2972 3273
1.4 1.4 3229 3337
4.1 4.1 3429 3549
12.3 12.3 3613 4000
37 37 4695 5756
111.1 111.1 10606 13051
333.3 333.3 31975 42616
1000 1000 85530 115175
方案1 方案2 方案1：MFI值 方案2：MFI值
液相、优化蛋白偶联试剂EDC测试结果如下表及图8所示。
检测标准品浓度(pg/ml) 检测标准品浓度(pg/ml) 方案1：MFI值 方案2：MFI值
0 0 3729 3359
1.4 1.4 5832 3912
4.1 4.1 9538 4451
12.3 12.3 18062 5611
37 37 48647 9537
111.1 111.1 113056 26056
333.3 333.3 193206 76091
1000 1000 396578 140086
方案1 方案2 方案1 方案2
本实施例中通过优化EDC量，检测标准蛋白的的信号值MFI提升了74％，提高了检测灵敏度。
本实施例中通过优化NHS量从25mg/ml到75mg/ml，检测标准蛋白的信号值MFI提升了13.8％，提高了检测灵敏度。实验数据如下表及图9所示。
Figure BDA0003578188940000101
Figure BDA0003578188940000111
实施例4
本实施例中通过对抗体反应体系优化，提升了检测的灵敏度。本实施例中提供的反应体系方案及MFI值如下表。
Figure BDA0003578188940000112
质控品测试结果如图10所示，两种方案MFI值的均值及方差如下表。
Buffer 1MFI Buffer 2MFI 均值 方差 CV(％)
2950449 1807661 2379055 808073.1443 33.96613968
2915031 1821469 2368250 773265.1058 32.65132929
2794722 1807390 2301056 698149.1525 30.34038079
2949540 1944454 2446997 710703.1263 29.04389038
本实施例中通过优化反应体系，提高了检测灵敏度，可提高29％-33％。最优反应体系配对方案为：蛋白(Buffer 1)、检抗(Buffer 1)、藻红蛋白(Buffer 2)。反应体系主要含有1-2％BSA，0.01mPBS等成分。
检测标准品的两种方案MFI值的均值及方差如下表。
Figure BDA0003578188940000113
Figure BDA0003578188940000121
本实施例中通过优化SA-PE浓度，提高了检测灵敏度，可平均提高13.7％。实验数据如图11所示。优化前：0.01M pbs，0.05％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。优化后：0.01M pbs，1-5％BSA，0.02％Tween-20，0.05％proclin300，pH＝8.5。
本实施例中还进行了其他相关验证：单重多重的相关性分析，多重分析由于体系中同时分析定量多个靶标，对各种检测抗体试剂之间相互干扰的要求也非常高，所以进行了单重多重的对比测试，如图12-图13所示，单多重的差异均小于15％。其中，H.IL-10的CV(％)为4.4；H.IL-8的CV(％)为6.7；H.IL-2的CV(％)为10.5；H.IL-6的CV(％)为12.8。
实验结果显示，特异性分析时，同时加入高浓度的靶标蛋白，检测均不受影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：IL-2、6、8、10兔单抗抗体，磁性微球，MES缓冲液，EDC，Sulfo-NHS，含Tween 20的磷酸盐缓冲液，含BSA的磷酸盐缓冲液，稀释液，封闭试剂，链霉亲和素藻红蛋白；
其中，IL-2、6、8、10兔单抗抗体使用重组IL-2、6、8、10蛋白制备获得，所述重组IL-2、6、8、10蛋白ABclonal货号分别为IL-2：CatalogNo:RP01039、IL-6：CatalogNo:RP00201、IL-8：CatalogNo:RP00052、IL-10：CatalogNo:RP00093；
所述稀释液包括0.01M pbs，0.01％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4；
所述封闭试剂包括0.01M pbs，0.05％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Azide，pH＝7.4。
2.一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将IL-2、6、8、10兔单抗抗体与磁性微球偶联；其中，IL-2、6、8、10兔单抗抗体使用重组IL-2、6、8、10蛋白制备获得，所述重组IL-2、6、8、10蛋白ABclonal货号分别为IL-2：CatalogNo:RP01039、IL-6：CatalogNo:RP00201、IL-8：CatalogNo:RP00052、IL-10：CatalogNo:RP00093；
步骤2：使用稀释液稀释步骤1中得到的4种偶联抗体、蛋白样品及生物素化抗体；
步骤3：将蛋白样品与4种偶联抗体混合，避光反应；
步骤4：反应后进行洗涤；
步骤5：向反应后的体系中加入4种生物素化抗体，继续避光反应；
步骤6：反应后进行洗涤；
步骤7：向反应后的体系中加入链霉亲和素藻红蛋白，避光反应；洗涤后进行流式检测。
3.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于：步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体量为5-20ug。
4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于：步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体量为10ug。
5.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于：步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体，使用的EDC用量为10ul-20ul 50mg/ml。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于：步骤1中，每100μL磁性微球偶联抗体，使用的EDC用量为10ul 50mg/ml。
7.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的白介素细胞因子多重流式荧光检测方法，其特征在于：SA-PE体系包括0.01M pbs，1-5％BSA，0.02％Tween-20，0.05％proclin300，pH＝8.5。
8.如权利要求1所述的白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒在非诊断目的的白介素细胞因子检测中的应用。
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