CN112034187A - 一组预测2019冠状病毒病细胞因子和血栓风暴的标志物及应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病细胞因子释放综合征和血栓风暴的标志物及其应用、试剂盒和试剂盒的制备方法,属于生物医药技术领域。本发明所述标志物分别为VEGF‑D、TNF‑α、SCF、LIF、IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑8、IL‑10、IL‑15、IL‑17A、IL‑18、IL‑1β和IFN‑γ。利用本发明提供的VEGF‑D、TNF‑α、SCF、LIF、IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑8、IL‑10、IL‑15、IL‑17A、IL‑18、IL‑1β、IFN‑γ一组标志物或者其制备得到的试剂盒进行2019冠状病毒病(COVID‑19)细胞因子释放综合征和血栓风暴的预测,具有检测快速、准确、费用低等优点,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一组用于预测2019冠状病毒病 (COVID-19)细胞因子释放综合征和血栓风暴的标志物及其应用、试剂盒和试剂盒 的制备方法。
背景技术
2019冠状病毒病(COVID-19)患者中,约有15%的COVID-19患者发展为重症, 且5%至6%的患者发展为危重症。COVID-19危重症患者的病死率显著高于重症患 者。据报道,“细胞因子释放综合征和血栓风暴”与COVID-19患者的疾病危重症 化和致死性有关。因此,迫切需要开发能早期有效预测“细胞因子释放综合征和血 栓风暴”的标志物,来区分重症患者和危重症患者,以此来提前制定有效的治疗方 案,降低COVID-19患者的死亡率。
多种感染性疾病的重症病例均会经历“细胞因子释放综合征”,或称为“细胞 因子风暴”,例如H5N1、H7N9及H1N1等甲型病毒性流感感染疾病以及2019冠状 病毒病。“细胞因子释放综合征”参与重症病例的临床转归,它是一种过激的免疫 反应,可导致肺部炎症、水肿、呼吸功能衰竭甚至多器官系统的衰竭。重症病人的 血浆中,巨噬细胞、中性粒细胞趋化因子、促炎细胞因子和抗炎细胞因子比普通流 感病人要高。病毒侵犯人体后,体内免疫细胞迅速、大量释放细胞因子,产生“自 杀式”效应,全身的炎症反应加强,造成疾病重症化发展。同时重症病例体内病毒 特异性的T细胞过度活化后耗竭,免疫应答水平下降,从而机体的抗病毒能力降低。 既往临床研究已对多个急性病毒性呼吸道传染病重症化以及“细胞因子释放综合征” 之间的关系进行了探讨。目前比较常见的相关生物标志物包括C反应蛋白(CRP) 水平、乳酸脱氢酶(LDH)、IL-6和血管紧张素II等,它们可以预测急性病毒性呼 吸道传染病的严重程度。然而,目前的各种生物标志物都有其局限性,并不能完全 准确地预测患者的“细胞因子释放综合征”的发生情况。
有报道称,除“细胞因子释放综合征”之外,“血栓风暴”与COVID-19患者 的疾病危重症化和致死性也密切相关。然而,目前关于“血栓风暴”预测标志物的 报道较少,研究结论也尚不明确。因此,探索和开发预测COVID-19“细胞因子释放 综合征和血栓风暴”的生物标志物,建立相应的检测体系和应用方法,具有重要的 临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子 释放综合征和血栓风暴的标志物及其应用、试剂盒和试剂盒的制备方法。
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综合 征和血栓风暴的标志物,所述标志物包括VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上。
根据本发明所述的生物标志物,其中作为优选地,所述2019冠状病毒病 (COVID-19)的细胞因子释放综合征和血栓风暴。
本发明还提供了上述技术方案所述的标志物在制备用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综合征和血栓风暴的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综 合征和血栓风暴的试剂盒,所述试剂盒中包括:分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、 LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ 中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球,生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体,链霉亲和素标记的藻红蛋白。
本申请对试剂盒中各组分含量不做特别限定,本领域技术人员可以根据检测的实际情况进行组分含量的配比调整。进一步,优选地,本申请试剂盒的各组分相同 体系下的用量关系如下:
羧基微球:0.4×106~1.6×106个;
捕获抗体:VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体各30~70μg;
检测抗体:VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体各0.6~1.4mg;
生物素:0.6~1.4mg;
链霉亲和素标记的藻红蛋白:本申请不作特别限定,本领域常规市售产品或采 用本领域常规方法制备得到均可,用量可以参照市售产品说明书或本领域常规方式 添加,本申请在此不做特别限定。
优选的,所述VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的克隆号分别为106、28401、5E9、 1F10、SP176、8D4-8、3G9、6E7-C11-C9、JES3-9D7、3D4、4H1524.1、EPR19954-188、 3E1和XMG1.2。
优选的,所述VEGF-D、TNF-α、SCF、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-18、 IL-1β和IFN-γ检测抗体的克隆号分别为OTI1C7、52B83、SC61-06、25D2、5IL6、 3IL8-H10、4K5F6、EPR19954、ILB1-H67和NIB42,所述LIF、IL-2、IL-10和IL-15 的检测抗体分别为多克隆抗体。所述多克隆抗体可以根据本领域常规制备方法制备 而成。
优选的,所述编码微球包括羧基微球。
优选的,所述生物素包括N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。
本发明还提供上述任一所述试剂盒的制备方法,优选的,所述制备包括以下步骤:
制备包被捕获抗体的编码微球:将所述VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两 种以上的捕获抗体分别与对应的编码微球偶联,分别得到包被有VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球;
制备生物素标记的检测抗体:分别在VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上 的检测抗体上连接生物素,得到分别被生物素标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一 种或两种以上的检测抗体。
有益效果:
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综合 征和血栓风暴的血清学生物标志物,所述生物标志物为VEGF-D、TNF-α、SCF、 LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ 中的一种或两种以上。实验表明,对“细胞因子释放综合征和血栓风暴”发生风险 高的COVID-19危重症患者,其血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度均显著高 于“细胞因子释放综合征和血栓风暴”发生风险低的COVID-19重症患者。
利用本发明提供的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的生物标志物 或者其制备得到的试剂盒进行2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综合征 和血栓风暴的预测,具有检测快速、准确、费用低等优点,应用前景广阔。
附图说明
图1-14依次为检测血清中生物标志物VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的标准曲线示意图;
图15分别为液相芯片试剂盒检测到COVID-19重症和危重症两组患者入院时血 清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、 IL-18、IL-1β和IFN-γ的浓度的差异图(危重症组各细胞因子的浓度均显著高于重 症组);
图16分别为VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ对应COVID-19患者细胞因子释放综合征 和血栓风暴的有效性预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线),每个细胞因子对应 的曲线下面积(AUC)和95%置信区间(95%CI)见图示。
具体实施方式
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)细胞因子释放综合 征和血栓风暴的血清学生物标志物,所述血清学生物标志物包括VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ中的一种或两种以上。本发明经实验发现,患者血清中VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ的基线浓度与细胞因子释放综合征和血栓风暴发生有关,单独使用患者血清中 VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、 IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度(阈值分别为:40.128pg/mL,70.328pg/mL,18.607 pg/mL,29.911pg/mL,44.274pg/mL,10.430pg/mL,105.314pg/mL,6.040pg/mL,1.511pg/mL,23.757pg/mL,38.492pg/mL,105.535pg/mL,6.038pg/mL,10.648 pg/mL),能预测细胞因子释放综合征和血栓风暴的风险程度。因此,基于以VEGF-D、 TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β 和IFN-γ为血清学生物标志物预测COVID-19细胞因子释放综合征和血栓风暴的效 果具有准确率高、实施较为方便、成本较低的优点,具有广阔的应用前景。
本发明还提供了上述技术方案所述的血清学生物标志物在制备用于预测 COVID-19细胞因子释放综合征和血栓风暴的试剂盒中的应用。在本发明中,所述应 用包括以上述生物标志物为基础制备得到的任意具有特异性检测上述生物标志物功 能的试剂盒。
本发明还提供了一种用于预测COVID-19细胞因子释放综合征和血栓风暴的试 剂盒,所述试剂盒中包括:分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的编码微球, 生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体,链霉亲和素标记的藻红蛋白。 在本发明中,所述VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的克隆号分别优选为106、28401、 5E9、1F10、SP176、8D4-8、3G9、6E7-C11-C9、JES3-9D7、3D4、4H1524.1、EPR19954-188、3E1和XMG1.2。所述VEGF-D、TNF-α、SCF、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体的克隆号分别为OTI1C7、52B83、SC61-06、 25D2、5IL6、3IL8-H10、4K5F6、EPR19954、ILB1-H67和NIB42,所述LIF、IL-2、 IL-10和IL-15的检测抗体分别为多克隆抗体。在本发明中,所述编码微球优选为羧 基微球。在本发明中,所述生物素优选为N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。在本发明中, 所述试剂盒先利用分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的编码微球捕获待 测样品中的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ,然后利用生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ检测抗体和链霉亲和素标记的藻红蛋白对捕获得到的VEGF-D、TNF-α、SCF、 LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ 分别进行定量。在本发明中,所述编码微球是指使用不同荧光比例的微球进行数据 编码,利用荧光编码的微球共价交联特异性单克隆抗体,通过激光扫描荧光编码来 识别单个微球。
本发明基于液相芯片技术,开发出可以对血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ生物标 志物进行快速检测的试剂盒,即液相芯片试剂盒。该试剂盒具有无副作用、敏感度 高、检测快速、重复性好等优点。该液相芯片试剂盒的制备方法简单可靠、稳定性 好。
在本发明中,所述试剂盒的制备方法,优选包括如下步骤:
(1)将分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体与 编码微球偶联,得到包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体的 编码微球;
(2)在VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体上分别连接生物素, 得到生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体;
所述步骤(1)和(2)之间不存在先后顺序的关系。
本发明将VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体与编码微球偶联, 得到分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微 球。在本发明中,所述偶联的方法优选包括如下步骤:
a.取羧基微球,用漩涡振荡器振荡微球悬液15~25s,使微球混合均匀;
b.取震荡后的羧基微球0.4×106~1.6×106个,转移到离心管中,≥8000g离心1.5~3min,沉淀微球;
c.移走上清,加入dH2O 80~120μL,用漩涡振荡器振荡15~25s重悬微球,≥8000g离心1.5~3min,沉淀羧基微球;移走上清,加入80~120mmol/L,pH值6~6.5的磷酸 二氢钠盐溶液60~100μL,用漩涡振荡器振荡15~25s,重悬洗涤的羧基微球;
d.加入40~60mg/mL的N羟基硫代琥珀酰亚胺8~12μL,用漩涡振荡器轻轻地振荡;
e.加入40~60mg/ml的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺8~12μL,用漩涡振荡 器轻轻振荡;
f.室温孵育15~25min,每隔8~12min用漩涡振荡器轻振,≥8000g离心1.5~3min, 沉淀活化的羧基微球;
g.移走上清,加入40~60mmol/L,pH值4.8~5.2的2-(N-吗啡啉)乙磺酸,漩涡振荡器振荡15~25s,重悬活化的羧基微球,≥8000g离心1.5~3min,沉淀洗涤后的羧基 微球;重复该步骤2~3次,用40~60mmol/L,pH值4.8~5.2的MES洗涤2~3次,加 入40~60mmol/L,pH值4.8~5.2的MES,用漩涡振荡器振荡15~25s,在混匀的微球 中分别加入30~70μg的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体,用40~60mmol/L,pH 值4.8~5.2的MES定容至400~600μL,用漩涡振荡器混匀;于室温置于摇床上孵育 1.5~3h,≥8000g离心1.5~3min,沉淀偶联好的微球;
h.移走上清,加入PBS-TBN 200~400μL,漩涡振荡器振荡25~35s;于室温置于 摇床上孵育25~35min,≥8000g离心1.5~3min,沉淀偶联好的微球;
i.移走上清,加入PBS-TBN 0.8~1.2mL,漩涡振荡器振荡25~35s,≥8000g离心1.5~3min,沉淀偶联好的微球;重复该步骤l~2次,用PBS-TBN洗涤2~3次;
j.加入PBS-TBN 0.8~1.2mL,重悬偶联好且经过洗涤的微球,即得VEGF-D、 TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β 和IFN-γ捕获抗体与微球的偶联体;
k.用细胞计数器计数微球的数量,浓度为2~3×105个/mL;将偶联好的微球置于2~6℃避光保存。
本发明在VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体上连接生物素,得 到生物素分别标记VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体。在本发 明中,所述连接的方法优选包括如下步骤:
①.分别将0.6~1.4mg的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体用0.08~0.12mol/L,pH值 7.8~8.2的碳酸氢钠缓冲液稀释到0.6~1.4mg/mL,终体积为0.8~1.2mL;
②交互用0.08~0.12mol/L,pH值7.8~8.2的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析;
③用0.8~1.2mL二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素0.6~1.4mg;
④分别向0.8~1.2mL的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体溶液中加入0.8~1.2g/L的 NHSB溶液100~150μL;在室温下持续搅拌,保温2~4h;
⑤加入0.8~1.2mol/L的NH4Cl溶液9~10μL,在室温下搅拌8~12min,在2~6℃下对PBS充分透析,以除去游离的生物素;将样品上0.8~1.2mL的分子筛柱,以PBS 缓慢洗脱,收集0.8~1.2mL/管,蛋白质在1~3mL之间洗脱;样品加入终浓度为 0.4~0.6g/L的叠氮钠及0.8~1.2g/L的BSA;将结合产物置于2~6℃避光保存。
本发明对所述链霉亲和素标记的藻红蛋白的来源不作特别限定,本领域常规市售产品或采用本领域常规方法制备得到均可。
在本发明中,用于COVID-19细胞因子释放综合征和血栓风暴判断的方法,优 选包括以下步骤:
(1)测量受试者的血清样品中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ标志物的含量;
(2)利用步骤(1)中的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的测量值,对COVID-19细 胞因子释放综合征和血栓风暴的发生风险进行判断;
在本发明中,所述2019冠状病毒病(COVID-19),包括2019新型冠状病毒肺 炎以及2019新型冠状病毒导致的其他脏器损伤型疾病;细胞因子释放综合征和血栓 风暴是2019冠状病毒病(COVID-19)危重症化的标志,本发明提供的方法能应用 于2019冠状病毒病(COVID-19)患者。在COVID-19患者中,细胞因子释放综合 征和血栓风暴风险高的患者,血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度显著高于 风险低的患者;单独使用患者血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度(阈值分 别为:40.128pg/mL,70.328pg/mL,18.607pg/mL,29.911pg/mL,44.274pg/mL,10.430pg/mL,105.314pg/mL,6.040pg/mL,1.511pg/mL,23.757pg/mL,38.492 pg/mL,105.535pg/mL,6.038pg/mL,10.648pg/mL),能预测细胞因子释放综合征 和血栓风暴的风险程度。在本发明中,所述基线浓度指用药前采集患者的血浆中的 生物标志物的浓度。
下面结合实施例对本发明提供的一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19) 细胞因子释放综合征和血栓风暴的血清学生物标志物及其应用和试剂盒进行详细的 说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用于VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ生物标志物检测的液相芯片试剂盒的制备。
1,试剂盒组成
(1)14-plex包被微球:含有分别包被了VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的编码微球;
(2)14-plex生物素标记检测抗体:用生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、 LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ 检测抗体;
(3)链亲和素藻红蛋白。
其中,捕获抗体VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的克隆号分别为106、28401、5E9、1F10、 SP176、8D4-8、3G9、6E7-C11-C9、JES3-9D7、3D4、4H1524.1、EPR19954-188、 3E1和XMG1.2;VEGF-D、TNF-α、SCF、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-18、 IL-1β和IFN-γ检测抗体的克隆号分别为OTI1C7、52B83、SC61-06、25D2、5IL6、 3IL8-H10、4K5F6、EPR19954、ILB1-H67和NIB42,而LIF、IL-2、IL-10和IL-15的检测抗体选用了多克隆抗体,多克隆抗体根据本领域常规制备方法制备而成。
2,试剂盒的制备方法
包括以下步骤:
(1)相应捕获抗体包被相应微球
a.取羧基微球用漩涡振荡器振荡微球悬液20s,使微球混合均匀;
b.取羧基微球1.1×106个,转移到离心管中,≥8000g离心2min,沉淀微球;
c.移走上清,加入dH2O 100μL,用漩涡振荡器振荡20s重悬微球,≥8000g离心2min,沉淀羧基微球;移走上清,加入100mmol/L,pH值6.2的磷酸二氢钠盐溶液 80μL,用漩涡振荡器振荡20s,重悬洗涤的羧基微球;
d.加入50mg/mL的N羟基硫代琥珀酰亚胺10μL,用漩涡振荡器轻轻地振荡;
e.加入50mg/mL的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺10μL,用漩涡振荡器轻轻振荡;
f.室温孵育20min,每隔10min用漩涡振荡器轻振,≥8000g离心2min,沉淀活 化的羧基微球;
g.移走上清,加入50mmol/L,pH值5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸,漩涡振荡器振 荡20s,重悬活化的羧基微球,≥8000g离心2min,沉淀洗涤后的羧基微球;重复该 步骤2次,用50mmol/L,pH值5.0的MES洗涤2次,加入50mmol/L,pH值5.0 的MES,用漩涡振荡器振荡20s,在混匀的微球中分别加入55μg VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和 IFN-γ捕获抗体,用50mmol/L,pH值5.0的MES定容至500μL,用漩涡振荡器混 匀;于室温置于摇床上孵育2h,≥8000g离心2min,沉淀偶联好的微球;
h.移走上清,加入PBS-TBN 300μL,漩涡振荡器振荡30s;于室温置于摇床上孵 育30min,≥8000g离心2min,沉淀偶联好的微球;
i.移走上清,加入PBS-TBN 1mL,漩涡振荡器振荡30s,≥8000g离心2min,沉 淀偶联好的微球;重复该步骤l次,用PBS-TBN洗涤2次;
j.加入PBS-TBN 1mL,重悬偶联好且经过洗涤的微球,即得VEGF-D、TNF-α、 SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体与微球的偶联体;
k.用细胞计数器计数微球的数量,浓度为2.5×105个/mL;将偶联好的微球置于 4℃避光保存;
(2)相应检测抗体的生物素化
l.分别将1mg的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体用0.1mol/L,pH值8.0的碳酸氢 钠缓冲液稀释到1mg/mL,终体积为1mL;
m.交互用0.1mol/L,pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析;
n.用1mL二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素1mg;
o.分别向1mL的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体溶液中加入1g/L的NHSB溶液 120μL;在室温下持续搅拌,保温2-4h;
p.加入1mol/L NH4Cl溶液9.6μL,在室温下搅拌10min,在4℃下对PBS充分透 析,以除去游离的生物素;将样品上1mL的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1mL/ 管,蛋白质在1~3mL之间洗脱;样品加入终浓度为0.5g/L的叠氮钠及1.0g/L BSA; 将结合产物置于4℃避光保存。
实施例2
VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、 IL-18、IL-1β和IFN-γ液相芯片试剂盒在预测COVID-19细胞因子释放综合征和血 栓风暴中的应用。
1,实验目的
证明VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、 IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的入院时基线浓度在发生细胞因子释放综合征和血 栓风暴的COVID-19患者中高。
2,实验对象
1)在知情同意及满足纳入条件的前提下,选择入组病例,记录个人基本信息。COVID-19患者队列来自于首都医科大学附属北京地坛医院24例COVID患者,包 括14例重症患者和10例危重症患者。。
2)抽取患者入院时未治疗前血浆,标本至于-80℃冰箱中保存。
3,试剂准备
采用实施例1中制备的试剂盒。
(1)Beads:将所需Beads(微球)超声30秒,涡旋1min,然后各取出60μL 加入MixingBottle,剩余体积用Bead Diluent补足3mL,充分混匀,2~8℃贮存一个 月。
(2)Quality Control:用250μL蒸馏水分别溶解对照1和2,颠倒多次使其充分 混匀,静止5-10min,然后分别移入两个试管中,-20℃贮存一个月。
(3)Standard:用250μL蒸馏水溶解Standard,颠倒多次使其充分混匀,静止 5~10min,然后移入试管中,标记为Antigen standard vial。然后另取7个试管,分别 标记为S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7。在S2,S3,S4,S5,S6,S7中分别加入150μL Assay缓冲液。将Antigenstandard vial管中液体转移200μL至S1中。将S1中液体 取出50μL转移至S2中,轻柔吹打混合10次。将S2中液体取出50μL转移至S3中, 轻柔吹打混合10次。将S3中液体取出50μL转移至S4中,轻柔吹打混合10次。将 S4中液体取出50μL转移至S5中,轻柔吹打混合10次。将S5中液体取出50μL转 移至S6中,轻柔吹打混合10次。将S6中液体取出50μL转移至S7中,轻柔吹打混 合10次,-20℃贮存一个月。
(4)Wash Buffer:将10×WB放置室温,使其中盐分充分溶解,30mL WB+270mL 蒸馏水将其配成1×(1倍),4℃保存一个月。
(5)Serum Matrix:向SM中加入1ml蒸馏水使其充分溶解,静止10min,然 后移入试管里,-20℃贮存一个月。
4,实验流程:
①向96孔板中每孔加入200μL Wash Buffer,室温摇十分钟润洗,然后直接倒掉,充分擦干。
②分别加入25μL;
@Serum Matrix到Background、Standard和Control;
@Assay Buffer到样品孔;
@Assay Buffer到Background;
@Standard和Control到各自位置;
@样品到对应样品孔;
@Beads到每个孔,4℃避光过夜振荡孵育。
③洗板机洗2遍。
④每孔加25μL检测抗体,室温避光摇1h。
⑤每孔加25μL SAPE,室温避光摇30min。
⑥洗板机洗2遍,最后每孔加150μL鞘液上机(Luminex系统)检测。
5,实验结果:
用液相芯片试剂盒来检测COVID-19重症和危重症两组患者血清中的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β 和IFN-γ的基线浓度。此14种血清生物标志物的浓度是根据机器读取的荧光值及对 应的标准曲线计算得来,14种血清生物标志物的标准曲线见图1至图14及表1。各 标准曲线中的截断值(Cut-Off)都是30%Bias(表示暂不显示)。表1中,Fit,表 示符合度,Cut-off:30%Bias代表暂时不展示;LLOQ:代表最低值;ULOQ:代表最 高值。
表1 14种血清生物标志物的标准曲线参数
实验结果表明,在COVID-19患者中,细胞因子释放综合征和血栓风暴(危重 症)风险高的患者,血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度显著高于风险低的患者, 具体结果如图15所示;利用患者血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ的基线浓度进行细胞 因子释放综合征和血栓风暴预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)见图16,曲线 下面积(AUC)和95%置信区间(95%CI)见图示。
实验结果表明,对COVID-19患者入院时血清中VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ基线浓 度的检测,可实现对患者细胞因子释放综合征和血栓风暴风险的准确预测,预测准 确率分别为83.6%、77.1%、78.6%、81.4%、79.3%、74.6%、78.6%、75.4%、75.7%、79.3%、78.2%、74.6%、77.9%、80.7%。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管 参照实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应该理解,对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换,都不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均 应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一组预测2019冠状病毒病细胞因子和血栓风暴的标志物,其特征在于,所述标志物包括VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上。
2.权利要求1所述的标志物在制备用于预测2019冠状病毒病细胞因子释放综合征和血栓风暴的试剂盒中的应用。
3.一种预测2019冠状病毒病细胞因子和血栓风暴的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括:分别包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球,生物素分别标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体,链霉亲和素标记的藻红蛋白。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ捕获抗体的克隆号分别为106、28401、5E9、1F10、SP176、8D4-8、3G9、6E7-C11-C9、JES3-9D7、3D4、4H1524.1、EPR19954-188、3E1和XMG1.2。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述VEGF-D、TNF-α、SCF、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ检测抗体的克隆号分别为OTI1C7、52B83、SC61-06、25D2、5IL6、3IL8-H10、4K5F6、EPR19954、ILB1-H67和NIB42,所述LIF、IL-2、IL-10和IL-15的检测抗体分别为多克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述编码微球包括羧基微球。
7.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素包括N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。
8.一种权利要求3-7任一所述试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
制备包被捕获抗体的编码微球:将VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体分别与对应的编码微球偶联,分别得到包被有VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球;
制备生物素标记的检测抗体:分别在VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体上连接生物素,得到分别被生物素标记的VEGF-D、TNF-α、SCF、LIF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-1β和IFN-γ中的一种或两种以上的检测抗体。
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