JP6282478B2 - 蛋白質吸着抑制剤及び蛋白質吸着抑制方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的特異反応を利用した測定法等に用いる蛋白質吸着抑制剤及び蛋白質吸着抑制方法に関し、更に詳細には、臨床検査の分野で広く用いられる免疫学的測定法等において、例えば、抗体結合固相、抗原結合固相および固相自体への蛋白質等の成分の吸着を防ぐ蛋白質吸着抑制剤及び蛋白質吸着抑制方法に関する。
臨床診断薬等の分野で広く使用されている免疫学的測定法は、一般にはｔｗｏ−ｓｉｔｅ法（サンドイッチ測定法）による固相法が使われている。この測定方法は、測定すべき物質（被検物質，Ａｇ）のエピトープを異にする２種類の抗体（Ａｂ1，Ａｂ2）を用いる。まず、合成高分子などからなる固相（ＳＰ）の表面にＡｂ1を固定し、これにＡｇを加えて結合させる。次いで、標識した抗体（Ａｂ2＊）を反応させた後、洗浄して遊離Ａｂ2＊を除去し、固相に結合したＡｂ2＊（結合型，Ｂ）の標準活性を測定する。この場合Ａｇ量に応じてＢが増加し、両者間に標準曲線が得られる。この標準曲線より検体中の抗原量を測定する。また、抗原と抗体とを逆にして、即ち標識抗原を用いて、検体中の抗体量を測定する方法も用いられている（Ａｇ1，Ａｇ2＊およびＡｂを用いて測定）。これらの標識には、通常酵素、蛍光物質あるいは発光物質等が用いられている。
これらサンドイッチ測定法の感度を左右する主な要因の１つは標識抗体の抗体結合固相への吸着あるいは標識抗原の抗原結合固相への吸着である。これらの吸着は、標識に用いた酵素、蛍光物質あるいは発光物質等の性質に一部依存することは十分予測しうる。酵素標識抗体の吸着は、アルカリフォスファターゼ標識抗体、グルコースオキシダーゼ標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体のいずれの抗体も加えた量の３万分の１あるいはそれ以下であり、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗体の非特異的吸着は２０００分の１である（非特許文献１）。これらの吸着はサンドイッチ法における感度の低下および再現性の欠如の原因となっている。
これらサンドイッチ測定法の感度を左右する主な要因の１つは標識抗体の抗体結合固相への吸着あるいは標識抗原の抗原結合固相への吸着である。これらの吸着は、標識に用いた酵素、蛍光物質あるいは発光物質等の性質に一部依存することは十分予測しうる。酵素標識抗体の吸着は、アルカリフォスファターゼ標識抗体、グルコースオキシダーゼ標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体のいずれの抗体も加えた量の３万分の１あるいはそれ以下であり、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗体の非特異的吸着は２０００分の１である（非特許文献１）。これらの吸着はサンドイッチ法における感度の低下および再現性の欠如の原因となっている。
従来、これらの吸着を防止するために、免疫学的測定法をｐＨ５〜６の弱酸性緩衝液で行なう方法や、Ａｂ1を吸着させた後で、固相の余分な蛋白質結合部位を卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清、正常血清等の蛋白質成分を用いて蛋白質吸着を抑制する方法が知られている。しかしながら、弱酸性での操作や各種蛋白質で蛋白質吸着を抑制する場合、その蛋白質吸着防止能は十分ではなく、また、市販の卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清等には、しばしば免疫グロブリン、酵素あるいはホルモン等の混入があり、反応に影響をあたえ、分析値に誤差を生じさせるなどの問題も発生していた。
そのような背景から、我々は、生体成分を含まない合成高分子系の蛋白質吸着抑制剤を検討し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する重合体が比較的良好な蛋白質吸着抑制効果を示すことを見出している（特許文献１）。しかしながら、臨床診断等の分野では更に優れた蛋白質吸着抑制剤の開発が望まれている。
そのような背景から、我々は、生体成分を含まない合成高分子系の蛋白質吸着抑制剤を検討し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する重合体が比較的良好な蛋白質吸着抑制効果を示すことを見出している（特許文献１）。しかしながら、臨床診断等の分野では更に優れた蛋白質吸着抑制剤の開発が望まれている。
酵素免疫測定法 医学書院 １９８７年５月１日 石川栄治著
本発明の課題は、生物学的特異反応を利用した測定系に影響を与えず、即ち、酵素、蛍光物質あるいは化学醗酵物質等の標識物質および測定対象物質に限定されることなく、蛋白質の抗体結合固相への吸着、抗原結合固相への吸着あるいは固相への吸着等の蛋白質吸着を抑制し、高い精度で目的物質を免疫学的に分析することを可能にする蛋白質吸着抑制剤及びそれを用いた蛋白質吸着抑制方法を提供することにある。
本発明によれば、生物学的特異反応を利用した測定法に用いる蛋白質吸着抑制剤であって、式(a)及び式(b)で表される構成単位を有し、かつ式中a及びbは(b／(a＋b))×100＝30〜70の関係を示すポリマー(A)と、式(c)及び式(d)で表される構成単位を有し、かつ式中c及びdは(d／(c+d))×100＝30〜70の関係を示すポリマー(B)との混合物を含み、該ポリマー(A)と該ポリマー(B)の混合割合が、質量比で３：７〜７：３であることを特徴とする蛋白質吸着抑制剤（以下、本発明の抑制剤と略すことがある）が提供される。
また本発明によれば、生物学的特異反応を利用した測定法において、親水性ポリスチレン基材の固相への蛋白質の吸着を抑制するために、本発明の抑制剤を該生物学的特異反応系内に存在させることを特徴とする蛋白質吸着抑制方法が提供される。
本発明の抑制剤は、上記特定割合の特定のポリマー(A)及び特定のポリマー(B)からなる混合物を含むので、生物学的特異反応を利用した種々の免疫学的測定系等において影響を与えず、高い精度で蛋白質吸着を抑制し、再現性良く、高い精度で目的物質を分析することを可能にできる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抑制剤は、例えば、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、脂質、ホルモン、更に具体的には各種抗原、抗体、レセプター、酵素等の一般に酵素反応あるいは免疫グロブリンの抗原抗体反応を利用して測定する免疫学的測定法等の生物学的特異反応を利用した測定法において使用可能な試薬である。具体的には例えば、公知の放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比濁法等、特に好ましくは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比濁法等に適用することができる。これらの公知の免疫学的測定法において、固相表面に抗体あるいは抗原を結合させた後、固相の余分な蛋白質結合部位を、本発明の抑制剤の有効成分である後述するポリマー(A)及びポリマー(B)からなる混合物により、蛋白質の吸着を抑制することができる。
本発明の抑制剤は、例えば、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、脂質、ホルモン、更に具体的には各種抗原、抗体、レセプター、酵素等の一般に酵素反応あるいは免疫グロブリンの抗原抗体反応を利用して測定する免疫学的測定法等の生物学的特異反応を利用した測定法において使用可能な試薬である。具体的には例えば、公知の放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比濁法等、特に好ましくは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比濁法等に適用することができる。これらの公知の免疫学的測定法において、固相表面に抗体あるいは抗原を結合させた後、固相の余分な蛋白質結合部位を、本発明の抑制剤の有効成分である後述するポリマー(A)及びポリマー(B)からなる混合物により、蛋白質の吸着を抑制することができる。
本発明の抑制剤は、上記式(a)及び上記式(b)で表される構成単位を有し、かつ式中a及びbは(b／(a＋b))×100＝30〜70の関係を示す、アニオン系のポリマー(A)と、上記式(c)及び上記式(d)で表される構成単位を有し、かつ式中c及びdは(d／(c+d))×100＝30〜70の関係を示す、カチオン系のポリマー(B)との混合物を含む。
ポリマー(A)の上記構成単位a及びbの関係が上記範囲外である場合、もしくはポリマー(B)の上記構成単位c及びdの関係が上記範囲外である場合は、本発明における優れた蛋白質吸着抑制作用が著しく低下するおそれがある。
ポリマー(A)の上記構成単位a及びbの関係が上記範囲外である場合、もしくはポリマー(B)の上記構成単位c及びdの関係が上記範囲外である場合は、本発明における優れた蛋白質吸着抑制作用が著しく低下するおそれがある。
ポリマー(A)及びポリマー(B)それぞれは、上記必須の構成単位の他に、非イオン性であり、かつ本発明の蛋白質吸着抑制効果に影響を及ぼさない程度であれば、重合可能な他のビニルモノマー成分を重合させた他の構成単位を有していても良い。
ポリマー(A)において、上記式(a)及び上記式(b)で表される構成単位の合計割合は80〜100mol％が好ましい。また、ポリマー(B)において、上記式(c)及び上記式(d)で表される構成単位の合計割合は80〜100mol％が好ましい。
従って、ポリマー(A)及び／又はポリマー(B)が上記他の構成単位を有する場合には、その割合は、各々20mol％以内であることが好ましい。
ポリマー(A)において、上記式(a)及び上記式(b)で表される構成単位の合計割合は80〜100mol％が好ましい。また、ポリマー(B)において、上記式(c)及び上記式(d)で表される構成単位の合計割合は80〜100mol％が好ましい。
従って、ポリマー(A)及び／又はポリマー(B)が上記他の構成単位を有する場合には、その割合は、各々20mol％以内であることが好ましい。
ポリマー(A)及びポリマー(B)それぞれの数平均分子量は、蛋白質吸着抑制剤としてのハンドリング性の点から、好ましくは１０００〜１０００００００、特に好ましくは２０００〜２００００００の範囲である。
ポリマー(A)は、例えば、特定の重合開始剤の存在下、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、MPCと略す）とメタクリル酸（以下、MAcと略す）とを重合させる方法、もしくは必要に応じて共重合可能な他のビニルモノマーとを重合させる方法により調製することができる。
ポリマー(B)は、例えば、特定の重合開始剤の存在下、MPCとＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル)アンモニウムクロライド（以下、QAと略す）とを重合させる方法、もしくは必要に応じて共重合可能な他のビニルモノマーとを重合させる方法により調製することができる。
ポリマー(B)は、例えば、特定の重合開始剤の存在下、MPCとＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル)アンモニウムクロライド（以下、QAと略す）とを重合させる方法、もしくは必要に応じて共重合可能な他のビニルモノマーとを重合させる方法により調製することができる。
上記ポリマー(A)又はポリマー(B)の調製において必要に応じて用いることができる共重合可能な他のビニルモノマーとしては、例えば（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、ジエチルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネートを挙げることができ、特にメタクリル酸エステル類を好ましく挙げることができる。
上記ポリマー(A)又はポリマー(B)の調製において用いる重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではなく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過硫酸塩又は過硫酸−亜硫酸水素塩が挙げられる。
重合開始剤の使用量は、全原料モノマー１００質量部に対して０．０１〜１０質量部が好ましく、特に０．１〜５質量部が望ましい。
重合開始剤の使用量は、全原料モノマー１００質量部に対して０．０１〜１０質量部が好ましく、特に０．１〜５質量部が望ましい。
上記ポリマー(A)又はポリマー(B)を調製する際の重合条件は、好ましくは３０〜８０℃、特に好ましくは４０〜７０℃において２〜７２時間である。この際、重合反応をより円滑に行なうために溶媒を用いてもよく、該溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム又はこれらの混合物を挙げることができる。
また、得られる各ポリマーの精製は公知の方法により行うことができる。
また、得られる各ポリマーの精製は公知の方法により行うことができる。
本発明の抑制剤は、上記ポリマー(A)及びポリマー(B)を特定割合で混合した混合物を有効成分とする。ポリマー(A)とポリマー(B)の混合割合は、質量比で３：７〜７：３である。混合割合がこの範囲外であると、本発明における優れた蛋白質吸着抑制作用が著しく低下するおそれがある。
本発明の抑制剤は、有効成分である前記混合物を含むものであれば特に限定されないが、通常、該混合物を溶媒に溶解させて使用される。該溶媒としては、例えば、免疫学的測定方法に使用することができる緩衝液であれば全て用いることができる。具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、各種生理食塩水等を好ましく挙げることができる。
本発明の抑制剤は、事前にポリマー(A)を含む溶媒と、ポリマー(B)を含む溶媒とを混合してイオンコンプレックスを形成させて用いるのが好ましい。
本発明の抑制剤を溶媒に溶解させて使用する場合の、有効成分である上記混合物の濃度は、０．０００１〜５質量％であることが好ましい。
本発明の抑制剤は、事前にポリマー(A)を含む溶媒と、ポリマー(B)を含む溶媒とを混合してイオンコンプレックスを形成させて用いるのが好ましい。
本発明の抑制剤を溶媒に溶解させて使用する場合の、有効成分である上記混合物の濃度は、０．０００１〜５質量％であることが好ましい。
本発明の抑制剤を用いて、生物学的特異反応を利用した測定法における、蛋白質の吸着を抑制する固相の材質は特に限定されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル、ポリメチルメタクリレート、ガラス、金属、セラミック、シリコンラバー等を挙げることができ、特に、ポリスチレンが好ましく、更には、コロナ放電、電子線等で表面が親水化処理されたポリスチレンが好ましい。また、これら材質の形状は特に限定されるものではなく、例えば、試験管、タイタープレート、ラテックス、磁性微粒子を挙げることができる。
本発明の蛋白質吸着抑制方法は、生物学的特異反応を利用した測定法において、親水性ポリスチレン基材の固相への蛋白質の吸着を抑制するために、本発明の抑制剤を該生物学的特異反応系内に存在させることを特徴とする。例えば、各種免疫学的測定法で使用する親水性ポリスチレン基材の固相表面に、抗体あるいは抗原を結合させる前に、本発明の抑制剤を該系内に存在させれば良い。
具体的には、目的物質の含まれる血清、あるいは標識抗体または標識抗原を、添加する以前であればどの時点で存在させても良い。また、血清中の分析目的物質の固相への吸着が問題とならない場合においても、標識抗体または標識抗原を添加する以前に本発明の抑制剤をその系内に存在させることができる。更に分析を実施する際の全ての溶液に本発明の抑制剤を添加して使用することもできる。
この際、本発明の抑制剤の使用量は、有効成分である上記混合物換算で、０．０００１〜５重量％であるのが好ましい。
具体的には、目的物質の含まれる血清、あるいは標識抗体または標識抗原を、添加する以前であればどの時点で存在させても良い。また、血清中の分析目的物質の固相への吸着が問題とならない場合においても、標識抗体または標識抗原を添加する以前に本発明の抑制剤をその系内に存在させることができる。更に分析を実施する際の全ての溶液に本発明の抑制剤を添加して使用することもできる。
この際、本発明の抑制剤の使用量は、有効成分である上記混合物換算で、０．０００１〜５重量％であるのが好ましい。
以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、例中のポリマーは表１に示されるポリマーを合成例に従って合成し使用した。また、各種測定は以下に示すとおり行った。
合成例１：ポリマー(A)に相当するポリマー(A1)の合成
MPC 30.96 g(0.105mol)、及びMAc 9.04ｇ(0.105mol)を純水160ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた500mLの4つ口フラスコに入れて30分間窒素を吹き込んだ。その後、70℃でスクシニックパーオキサイド種1.56ｇ加えて７時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のポリマー(A1)水溶液を得た。ポリマー(A1)を構成する構成単位組成のモル比を表１に示す。
合成例１：ポリマー(A)に相当するポリマー(A1)の合成
MPC 30.96 g(0.105mol)、及びMAc 9.04ｇ(0.105mol)を純水160ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた500mLの4つ口フラスコに入れて30分間窒素を吹き込んだ。その後、70℃でスクシニックパーオキサイド種1.56ｇ加えて７時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のポリマー(A1)水溶液を得た。ポリマー(A1)を構成する構成単位組成のモル比を表１に示す。
合成例２：ポリマー(A)に相当するポリマー(A2)及び(A3)の合成
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例１と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(A2)及び(A3)を調製した。
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例１と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(A2)及び(A3)を調製した。
合成例３：ポリマー(B)に相当するポリマー(B1)の合成
MPC 22.15g(0.075mol)、及びQA 17.85g(0.075mol)を純水210ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた500mLの4つ口フラスコに入れて30分間窒素を吹き込んだ。その後、70℃で2，2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)ジヒドロクロライド0.373ｇ加えて2時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のポリマー(B1)水溶液を得た。ポリマー(B1)を構成する構成単位組成のモル比を表１に示す。
MPC 22.15g(0.075mol)、及びQA 17.85g(0.075mol)を純水210ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた500mLの4つ口フラスコに入れて30分間窒素を吹き込んだ。その後、70℃で2，2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)ジヒドロクロライド0.373ｇ加えて2時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のポリマー(B1)水溶液を得た。ポリマー(B1)を構成する構成単位組成のモル比を表１に示す。
合成例４：ポリマー(B)に相当するポリマー(B2)及び(B3)の合成
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例３と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(B2)及び(B3)を合成した。
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例３と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(B2)及び(B3)を合成した。
合成例５：ポリマー(A)に相当しないポリマー(C)及び(D)の合成
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例１と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(C)及び(D)を調製した。
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例１と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(C)及び(D)を調製した。
合成例６：ポリマー(B)に相当しないポリマー(E)及び(F)の合成
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例３と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(E)及び(F)を合成した。
モノマー仕込量を変更した以外は、合成例３と同様に表１に示す構成単位組成のポリマー(E)及び(F)を合成した。
＜蛋白質吸着抑制効果の測定方法＞
後述の例で調製した蛋白質吸着抑制剤を96穴ポリスチレン製プレートに３００μL／well添加し、２５℃で３時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄後、ヒト血清１０μLと蛋白質吸着抑制剤９０μLを混合し、１００μL／wellをプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄を行ったプレートに西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ標識抗ヒトIgG抗体溶液(市販品を、２wt％BSA、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で５０００倍希釈)を１００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。次に、TMB ULTRA SENSITIVE SUBSTRATE (Moss,inc.)を１００μL／wellプレートに添加し、２５℃で１５分間インキュベートした。０．３M硫酸を１００μL／well添加し、反応を停止した。
その後、波長４５０nm（副波長６５０nm）の吸光度を測定した。吸光度により、蛋白質の基材への吸着抑制効果を評価した。吸光度が低い方が、蛋白質吸着抑制効果が高いことを示す。なお、96穴ポリスチレン製プレートは、表面親水性プレートとしてAGC社製の表面浸水化プレート(cat.3861-096)を用いた。
後述の例で調製した蛋白質吸着抑制剤を96穴ポリスチレン製プレートに３００μL／well添加し、２５℃で３時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄後、ヒト血清１０μLと蛋白質吸着抑制剤９０μLを混合し、１００μL／wellをプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄を行ったプレートに西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ標識抗ヒトIgG抗体溶液(市販品を、２wt％BSA、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で５０００倍希釈)を１００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、アスピレーターで液を除去した。その後、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。次に、TMB ULTRA SENSITIVE SUBSTRATE (Moss,inc.)を１００μL／wellプレートに添加し、２５℃で１５分間インキュベートした。０．３M硫酸を１００μL／well添加し、反応を停止した。
その後、波長４５０nm（副波長６５０nm）の吸光度を測定した。吸光度により、蛋白質の基材への吸着抑制効果を評価した。吸光度が低い方が、蛋白質吸着抑制効果が高いことを示す。なお、96穴ポリスチレン製プレートは、表面親水性プレートとしてAGC社製の表面浸水化プレート(cat.3861-096)を用いた。
実施例１−１〜１−３
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表２に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表２に示す。
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表２に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表２に示す。
比較例１−１〜１−４
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B1)の質量比を、表２に示すとおり変更した以外は、実施例１−１〜１−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表２に示す。
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B1)の質量比を、表２に示すとおり変更した以外は、実施例１−１〜１−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表２に示す。
実施例２−１〜２−３
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表３に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表３に示す。
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表３に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表３に示す。
比較例２−１〜２−４
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B2)の質量比を、表３に示すとおり変更した以外は、実施例２−１〜２−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表３に示す。
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B2)の質量比を、表３に示すとおり変更した以外は、実施例２−１〜２−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表３に示す。
実施例３−１〜３−３
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表４に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表４に示す。
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表４に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表４に示す。
比較例３−１〜３−４
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B3)の質量比を、表４に示すとおり変更した以外は、実施例３−１〜３−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表４に示す。
表１に示すポリマー(A1)とポリマー(B3)の質量比を、表４に示すとおり変更した以外は、実施例３−１〜３−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表４に示す。
実施例４−１〜４−３
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表５に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表５に示す。
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表５に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表５に示す。
比較例４−１〜４−４
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B1)の質量比を、表５に示すとおり変更した以外は、実施例４−１〜４−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表５に示す。
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B1)の質量比を、表５に示すとおり変更した以外は、実施例４−１〜４−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表５に示す。
実施例５−１〜５−３
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表６に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表６に示す。
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表６に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表６に示す。
比較例５−１〜５−４
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B2)の質量比を、表６に示すとおり変更した以外は、実施例５−１〜５−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表６に示す。
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B2)の質量比を、表６に示すとおり変更した以外は、実施例５−１〜５−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表６に示す。
実施例６−１〜６−３
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表７に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表７に示す。
表１に示すポリマー(A2)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表７に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表７に示す。
比較例６−１〜６−４
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B3)の質量比を、表７に示すとおり変更した以外は、実施例６−１〜６−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表７に示す。
表１に示すポリマー(A2)とポリマー(B3)の質量比を、表７に示すとおり変更した以外は、実施例６−１〜６−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表７に示す。
実施例７−１〜７−３
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表８に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表８に示す。
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表８に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表８に示す。
比較例７−１〜７−４
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B1)の質量比を、表８に示すとおり変更した以外は、実施例７−１〜７−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表８に示す。
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B1)の質量比を、表８に示すとおり変更した以外は、実施例７−１〜７−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表８に示す。
実施例８−１〜８−３
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表９に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表９に示す。
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B2)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表９に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表９に示す。
比較例８−１〜８−４
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B2)の質量比を、表９に示すとおり変更した以外は、実施例８−１〜８−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表９に示す。
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B2)の質量比を、表９に示すとおり変更した以外は、実施例８−１〜８−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表９に示す。
実施例９−１〜９−３
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表１０に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表１０に示す。
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとして用い、質量比が表１０に示す３：７から７：３になるよう混合した。ポリマー混合物の終濃度が１wt％になるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、蛋白質吸着抑制剤を調製した。得られた蛋白質吸着抑制剤を用いて、上記蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。結果を表１０に示す。
比較例９−１〜９−４
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B3)の質量比を、表１０に示すとおり変更した以外は、実施例９−１〜９−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１０に示す。
表１に示すポリマー(A3)とポリマー(B3)の質量比を、表１０に示すとおり変更した以外は、実施例９−１〜９−３と同様に蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１０に示す。
比較例１０
蛋白質吸着抑制剤として、牛血清アルブミン(BSA)を使用した以外は、実施例１−１と同様の方法にて、蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。なお、BSAの終濃度は２wt％で蛋白質吸着抑制を行った。結果を表１１に示す。
蛋白質吸着抑制剤として、牛血清アルブミン(BSA)を使用した以外は、実施例１−１と同様の方法にて、蛋白質吸着抑制効果の測定を行った。なお、BSAの終濃度は２wt％で蛋白質吸着抑制を行った。結果を表１１に示す。
比較例１１−１〜１１−５
表１に示すポリマー(C)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとし、表１２に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１２に示す。
表１に示すポリマー(C)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとし、表１２に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１２に示す。
比較例１２−１〜１２−５
表１に示すポリマー(C)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとし、表１３に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１３に示す。
表１に示すポリマー(C)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとし、表１３に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１３に示す。
比較例１３−１〜１３−５
表１に示すポリマー(D)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとし、表１４に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１４に示す。
表１に示すポリマー(D)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B1)をカチオン系ポリマーとし、表１４に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１４に示す。
比較例１４−１〜１４−５
表１に示すポリマー(D)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとし、表１５に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１５に示す。
表１に示すポリマー(D)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(B3)をカチオン系ポリマーとし、表１５に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１５に示す。
比較例１５−１〜１５−５
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(E)をカチオン系ポリマーとし、表１６に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１６に示す。
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(E)をカチオン系ポリマーとし、表１６に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１６に示す。
比較例１６−１〜１６−５
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(E)をカチオン系ポリマーとし、表１７に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１７に示す。
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(E)をカチオン系ポリマーとし、表１７に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１７に示す。
比較例１７−１〜１７−５
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(F)をカチオン系ポリマーとし、表１８に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１８に示す。
表１に示すポリマー(A1)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(F)をカチオン系ポリマーとし、表１８に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１８に示す。
比較例１８−１〜１８−５
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(F)をカチオン系ポリマーとし、表１９に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１９に示す。
表１に示すポリマー(A3)をアニオン系ポリマーとし、ポリマー(F)をカチオン系ポリマーとし、表１９に示す混合比率で、実施例１−１に準じて蛋白質吸着抑制剤を調製し、測定を行った。結果を表１９に示す。
実施例１０：ELISA試験
PCT／JP２００９／０００５５５記載の方法と同様に調製した配列番号１で示されるペプチドタグを融合した抗甲状腺刺激ホルモン単鎖抗体を、１００μg／mLになるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した。得られた溶液を、表面親水化ポリスチレン製プレートであるAGC社製の表面浸水化プレート(cat. 3861-096)に１００μL／well添加し、一晩４℃でインキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで溶液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。実施例５−２で調製した蛋白質吸着抑制剤を３００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。標準品として、表２０に示す１０００ng／mLから０．０６４ng／mL濃度の甲状腺刺激ホルモンそれぞれに、１μg／mLのビオチン標識化抗甲状腺刺激ホルモン抗体を含む溶液を１００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。市販のペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で５０００倍希釈し、２００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。アスピレーターで液を除去後、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。TMB ULTRA SENSITIVE SUBSTRATE (Moss,inc.)を１００μL／well加え、２５℃で１５分インキュベートした。続いて、０．３Mの硫酸を加え反応を停止させた後、各甲状腺刺激ホルモン濃度における反応液の波長４５０nm（副波長６５０nm）における吸光度を測定した。結果を図１及び表２０に示す。
PCT／JP２００９／０００５５５記載の方法と同様に調製した配列番号１で示されるペプチドタグを融合した抗甲状腺刺激ホルモン単鎖抗体を、１００μg／mLになるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した。得られた溶液を、表面親水化ポリスチレン製プレートであるAGC社製の表面浸水化プレート(cat. 3861-096)に１００μL／well添加し、一晩４℃でインキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで溶液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。実施例５−２で調製した蛋白質吸着抑制剤を３００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。標準品として、表２０に示す１０００ng／mLから０．０６４ng／mL濃度の甲状腺刺激ホルモンそれぞれに、１μg／mLのビオチン標識化抗甲状腺刺激ホルモン抗体を含む溶液を１００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、アスピレーターで液を除去した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。市販のペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で５０００倍希釈し、２００μL／well添加し、２５℃で１時間インキュベートした。アスピレーターで液を除去後、０．０５wt％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３００μL／well加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を５回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。TMB ULTRA SENSITIVE SUBSTRATE (Moss,inc.)を１００μL／well加え、２５℃で１５分インキュベートした。続いて、０．３Mの硫酸を加え反応を停止させた後、各甲状腺刺激ホルモン濃度における反応液の波長４５０nm（副波長６５０nm）における吸光度を測定した。結果を図１及び表２０に示す。
Claims (2)
- 酵素反応あるいは抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法に用いる蛋白質吸着抑制剤であって、
式(a)及び式(b)で表される構成単位を有し、かつ式中a及びbは(b／(a＋b))×100＝30〜70の関係を示すポリマー(A)と、式(c)及び式(d)で表される構成単位を有し、かつ式中c及びdは(d／(c+d))×100＝30〜70の関係を示すポリマー(B)との混合物を含み、該ポリマー(A)と該ポリマー(B)の混合割合が、質量比で３：７〜７：３であることを特徴とする蛋白質吸着抑制剤。
- 酵素反応あるいは抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法において、親水性ポリスチレン基材の固相への蛋白質の吸着を抑制するために、請求項１記載の蛋白質吸着抑制剤を該酵素反応あるいは抗原抗体反応の系内に存在させることを特徴とする蛋白質吸着抑制方法。
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