WO2017073795A1 - トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 - Google Patents

トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 Download PDF

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吉田　竜也
宇航 楊
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Definitions

  • the present invention relates to a reagent and method for measuring thrombin (T) / antithrombin (AT) complex (TAT) in a sample.
  • Thrombin / antithrombin complex is a protein complex produced in blood when blood coagulation progresses. TAT in blood is quantified by diagnosing thrombosis such as disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC). Useful for. However, since the amount of TAT is about 100,000 times less than the amount of free antithrombin, measurement is not easy.
  • the mainstream TAT quantification methods are reagent kits using enzyme immunoassay (ELISA) such as Enzygnost (registered trademark) TAT micro of Siemens, and chemiluminescent enzyme immunity such as Stacia (registered trademark) CLEIA TAT of LSI stipulatece.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • CLEIA chemiluminescent enzyme immunity
  • There is a method using a reagent kit that uses a measurement method (CLEIA) both of which require solid-phase / liquid-phase separation (B / F separation), require complicated washing operations, and require manual or dedicated equipment. is necessary.
  • Patent Documents 1 to 4 report a reagent system using a latex agglutination method that does not require B / F separation, but all of them are measurements of samples prepared by diluting TAT synthesized outside the body with a buffer, There is no report of a reagent that can accurately measure the concentration of TAT in human specimens using the latex agglutination method.
  • a TAT measurement reagent is constructed depending on the specificity of the antibody, or the influence of the cross-reactivity is avoided by an additive.
  • Patent Document 5 discloses TAT measurement by a sandwich measurement method using an antibody having no cross-reactivity, but is not sensitive enough for clinical use. Accordingly, there has been a demand for a reagent and method for measuring TAT in a biological sample with high sensitivity and high accuracy in a latex agglutination method that is easy to measure.
  • Patent Documents 6 and 7 The present inventors have reported a reagent that can accurately measure the concentration of TAT in a human sample using a latex agglutination method that does not require B / F separation. There was room for further improvement.
  • two types of antibodies are used in TAT measurement by latex agglutination: an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT, and an antibody that binds to the thrombin side and recognizes TAT. Is done. In principle, both antibodies bind and latex aggregation occurs only when TAT is present, and TAT can be quantified.
  • Such a heparin-antithrombin complex is considered to be closer to the structure of antithrombin when TAT is formed as compared to normal antithrombin, and more likely to form multimers. Therefore, when measuring a specimen of a heparin-administered patient, even if latex particles bound with a monoclonal antibody whose reaction to TAT is 100 times or more of the reaction to antithrombin, it recognizes the heparin-antithrombin complex alone. In this case, aggregation occurs and this is added to the present reaction as a non-specific reaction.
  • Such a non-specific reaction due to the heparin-antithrombin complex is a problem that does not occur in a measurement method capable of separating B / F, and is unique to the TAT measurement reagent using the latex agglutination method that was first discovered by the present inventor. It is a problem.
  • methods for avoiding the influence of antithrombin in a TAT measurement reagent by latex agglutination method methods such as Patent Documents 1 and 2 are known.
  • heparin produces an antithrombin multimer, and heparin multimerizes antithrombin. There is no suggestion of how to avoid the effects of thrombin.
  • the present invention accurately measures TAT while avoiding the influence of heparin and the like in a TAT measurement reagent and measurement method in a biological sample using a latex agglutination method that does not require B / F separation or washing. It is providing the reagent and method which can perform.
  • the present inventor avoided non-specific aggregation due to the heparin-antithrombin complex by adding a polycation such as hexadimethrin bromide into the TAT measurement reagent, and the biological sample It was found that TAT in the medium could be accurately measured, and the present invention was completed.
  • TAT thrombin / antithrombin complex
  • the polycation is hexadimethrine bromide, chitosans, modified dextran, aminodextran, hydroxymethylcellulose trimethylamine, lysozyme, spermine, spermidine, polylysine, polyarginine, polyornithine, protamine sulfate, hydroxyethylcellulose trimethylamine, heparin binding protein, Polyallylamine, polyallylamine hydrochloride, poly (diallyldialkylamine), polyamidoamine, polyamine, polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride, polydiallyldimethylammonium chloride, polyethyleneimine, polypropyleneimine, polypropylethyleneimine, polyimidazoline, polyvinylamine, polyvinylpyridine Poly (acrylamide / methacryloxy bromide bromide) Rutrimethylammonium), poly (diaryldimethylammonium chloride / N-isopropylacrylamide), poly (
  • the polycation is selected from the group consisting of polyalkyleneamines such as hexadimethrine bromide, polyethyleneimine, polypropylethyleneimine, protamine sulfate, polylysine, polyornithine, and aminodextran, [1] or [2]
  • a first anti-TAT antibody that recognizes TAT by binding to the antithrombin side bound to latex and a second anti-TAT antibody that recognizes TAT by binding to the thrombin side bound to latex The reagent according to any one of [1] to [4].
  • TAT measurement by latex agglutination method can be accurately performed even in heparin-administered patient plasma (or plasma collected by a heparin blood collection tube), and TAT in a patient sample to which heparin used for DIC treatment has been administered
  • the ability to measure accurately is useful for diagnosis.
  • the schematic diagram of the TAT measuring method by latex aggregation method The schematic diagram of the reaction system by indirect inhibition ELISA method.
  • the TAT measurement reagent of the present invention comprises: A reagent for measuring thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample derived from a subject by latex agglutination, which contains a polycation.
  • TAT thrombin-antithrombin complex
  • the TAT measurement reagent of the present invention is preferably an immunoassay reagent by a latex agglutination method in a sandwich system using latex particles to which two kinds of anti-TAT antibodies are bound, respectively, for measuring TAT in a biological sample. It is.
  • the antibody that can be used in the present invention is, for example, a combination of an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT (first antibody) and an antibody that binds to the thrombin side and recognizes TAT (second antibody).
  • the first antibody may be any antibody that can bind to the antithrombin side and recognize TAT.
  • An antibody having a difference of at least 100 times between reactivity to TAT and reactivity to free antithrombin is preferably used.
  • the reactivity of the first antibody to TAT should be 100 times or more than the reactivity to free antithrombin, more preferably 200 times or more, still more preferably 1,000 times or more, and 10,000 times or more. It is particularly preferred.
  • non-human animals may be immunized with free antithrombin or immunized with TAT, and bind to the antithrombin side to recognize TAT. Any antibody that can be used can be used in the present invention.
  • binding to the antithrombin side means that the antithrombin in the free state, which is present most in the sample, binds to free thrombin to form a complex (TAT).
  • TAT free thrombin
  • binding to the antithrombin side means binding to the complex type antithrombin.
  • Free structure antithrombin has a structure different from complex structure antithrombin. This is because free structure antithrombin exists in a state in which its structure is changed by binding to free thrombin to form a complex.
  • the proportion of free antithrombin that does not form TAT and TAT in the living body is considered to be between 1: 60,000 to 1: 110,000 with reference to the measured value range of a healthy person. : It is thought that it exists at 100,000. In addition, it is known that the presence ratio changes in patients with sepsis or liver disease, but even when the amount of free antithrombin decreases, it is said to be about 1: 50,000. Therefore, if the first antibody is also reactive with free antithrombin, it becomes difficult to quantify TAT. Therefore, in order to quantify TAT, it is necessary to use an antibody having a low reactivity to free antithrombin. For this reason, an antibody having a reactivity to TAT of 100 times or more of the reactivity to free antithrombin is used.
  • the reactivity to TAT is 100 times or more of the reactivity to free antithrombin
  • the affinity ratio to each antigen is 100 times or more, or when evaluated by an indirect inhibition ELISA described later.
  • the ratio of the amount of antigen necessary to exhibit a certain percentage of inhibition is 100 times or more.
  • an antibody having a reactivity to TAT that is 100 times or more of the reactivity to free antithrombin can be obtained by the method described in the examples below.
  • the antibody is evaluated or screened by indirect inhibition ELISA. Will be described.
  • an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT (first antibody candidate antibody) is prepared.
  • an antibody that recognizes TAT and whose binding site is on the antithrombin side may be selected after obtaining the antibody by a monoclonal antibody production method using a hybridoma described later.
  • it may be used in the following evaluation system.
  • a candidate antibody and a solution containing an antigen that can inhibit the TAT reaction in a certain amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ⁇ g / mL) or a sufficient amount of time (for example, , 12 hours).
  • a reaction solution is reacted with a substrate on which TAT is immobilized for a predetermined time.
  • the amount of antibody bound to TAT on the substrate is measured using a labeled secondary antibody.
  • a certain amount of TAT is solid-phased on a substrate such as a plate under the condition that there is no antigen that inhibits the antibody reaction.
  • a person skilled in the art can appropriately set the amount of the antigen (TAT) to be immobilized on the substrate in consideration of the relationship between the dispensed amount of the antigen to be used and the kind of the antibody to be evaluated.
  • TAT antigen
  • the candidate antibody of the first antibody at each concentration (for example, 0.04 to 1 ⁇ g / mL) is reacted with the substrate on which the TAT is immobilized for a certain period of time.
  • the amount of antibody bound to TAT on the substrate is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP).
  • the antibody concentration at which the absorbance is around 1.0 1000 in the method described in Table 1.
  • This antibody concentration can be used as the antibody concentration at the time of inhibition by the antigen (Table 3; concentration at the time of reaction ( ⁇ g / mL)).
  • the candidate antibody at the concentration determined by the above method and a solution containing a certain amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ⁇ g / mL) of TAT or free antithrombin for a sufficient time For example, 12 hours).
  • the reaction solution is reacted with a substrate on which TAT is immobilized for a predetermined time. Thereafter, after washing, the amount of antibody bound to TAT on the substrate (antibody residual ratio) is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP).
  • antibody residual ratio can be calculated with the detection value obtained when absorption by the antigen is not performed as 100%.
  • the amount of TAT necessary to show the same residual antibody ratio was inhibited by the above TAT. Calculate from the time results.
  • the amount of TAT-inhibiting antigen required to achieve 50% of the remaining antibody rate when TAT is inhibited is less than 0.50 ⁇ g / mL
  • the reactivity to TAT is 100 times or more the reactivity to free antithrombin. It can be.
  • the antibody selected in this way can be selected as the first antibody.
  • the first antibody preferably has an affinity (Kd) for TAT of 10 ⁇ 8 or less.
  • Kd affinity
  • those skilled in the art are suitable for latex reagents with reference to the affinity value for TAT. It is possible to select the antibody appropriately.
  • the second antibody may be any antibody that can bind to the thrombin side and recognize TAT.
  • Antibodies that react specifically with thrombin can be used. Since there is almost no free thrombin in the sample, even an antibody having cross-reactivity with free thrombin can often be used. A person skilled in the art can select and use as appropriate.
  • a non-human animal may be immunized with free thrombin or TAT, and may bind to the thrombin side and recognize TAT. Any antibody that can be used can be used in the present invention.
  • binding to the thrombin side means binding of thrombin in a released state existing in a sample to thrombin in a state of binding to antithrombin to form a complex (TAT).
  • TAT complex
  • thrombin having the structure when the complex is formed is referred to as complex structure thrombin
  • free structure thrombin binding to the thrombin side means that complex It means to bind to the body structure thrombin.
  • the free structure thrombin may have a structure different from the complex structure thrombin. This is because free structure thrombin exists in a state in which its structure is changed by binding to antithrombin to form a complex.
  • the second antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to the thrombin side and recognizes TAT.
  • the affinity (Kd) for TAT is preferably 10 ⁇ 8 or less.
  • those skilled in the art should appropriately select an antibody suitable for a latex reagent with reference to the affinity value for TAT. Is possible.
  • an antibody used in the present invention for example, an antibody that specifically binds to TAT, that is, an antibody that does not react with thrombin or antithrombin but specifically reacts only with TAT and has different epitopes. These antibodies can also be used in combination.
  • first antibody and the second antibody either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used.
  • Those skilled in the art can obtain these antibodies according to known methods. Sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats, etc. can be used as animals to immunize the immunogen for antibody production, and rabbits, goats, etc. are particularly preferred for polyclonal antibody production.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained by a known method for producing hybridoma cells. In this case, mouse, rat, rabbit or the like is preferable.
  • the hybridoma and the monoclonal antibody can be prepared according to a conventional method, for example, a method described in a follow-up biochemistry experiment course (edited by the Japanese Biochemical Society) or an immunobiochemical research method (edited by the Japanese Biochemical Society).
  • TAT may be used as the immunogen, and an antibody prepared using VTAT bound with vitronectin as an immunogen can also be used in the present invention.
  • antithrombin may be used
  • thrombin may be used in the case of the second antibody.
  • TAT purified using a sample collected from a living body as a raw material may be used, or TAT synthesized in vitro by mixing free thrombin and free antithrombin may be used.
  • Synthetic TAT may be TAT obtained by incubating thrombin and antithrombin, which are available as biologics, in a test tube, known translations such as E.
  • coli coli, mammalian cells, and insect cells infected with baculovirus. What collected and refine
  • purified what was expressed using the expression system may be used as an immunogen.
  • antithrombin in the case of the first antibody, In the case of two antibodies, it can also be prepared using a partial peptide of thrombin.
  • known methods can be used for selection of peptide sequences as antigens, peptide fragment synthesis methods, and immunization methods.
  • Antibodies used in the present invention include antibody fragments.
  • the antibody fragment is a fragment of a desired antibody and has the same reactivity as the original antibody.
  • Antibody fragments that can be used in the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , or Fv. These fragments can be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme by a conventional method, and subsequently following a conventional method for protein separation and purification. These can be used as they are solid-phased on latex particles, but those prepared as Fab ′ fragments or F (ab ′) 2 fragments can be solid-phased on latex particles. Fab ′ and F (ab ′) 2 are more preferable from the viewpoint of avoiding a non-specific reaction of the antibody against the Fc fragment.
  • the antibody used in the present invention is obtained by first obtaining a TAT antibody (candidate antibody) by, for example, a monoclonal antibody production method using a hybridoma, and then, from the TAT antibody (candidate antibody), the method and criteria described above are used. It can be obtained by selecting one antibody and a second antibody.
  • the combination of the first antibody and the second antibody is not particularly limited as long as TAT can be measured in the latex agglutination method, but an antibody combination having the least influence of the matrix (background) contained in a biological sample such as plasma is selected. It is preferable to do. Since the sensitivity required for the TAT measurement reagent needs to be able to measure a reference value that can clearly distinguish a healthy person from a patient, or a concentration that is twice that of the reference value, the reagent of the present invention is 10 to 15 ng / in a biological sample.
  • the reagent is preferably a reagent capable of quantifying mL TAT, more preferably a reagent capable of quantifying 3-4 ng / mL TAT, and even more preferably a reagent capable of quantifying even at a concentration of about 1 ng / mL.
  • the latex particles to which the first antibody and the second antibody are bound are not particularly limited as long as they can be used in the latex agglutination reaction, but the average particle diameter is preferably 0.05 ⁇ m to 0.5 ⁇ m. More preferably, it is 2 to 0.4 ⁇ m.
  • the kind of latex particles to be used only one kind of latex particles may be used, or plural kinds of latex particles may be used.
  • latex particles having different particle diameters can be used in combination. Since latex particles are substantially difficult to produce with a single particle size, they are defined as the average particle size of the entire particle.
  • the average particle diameter is 0.05 ⁇ m to 0.5 ⁇ m, even if it contains latex particles not included in the range, it may fall under the present invention.
  • latex particles having different particle sizes are included, and those skilled in the art can use latex solutions containing particles having a large and non-biased particle size distribution. It is possible to build.
  • the average particle diameter can be measured by a known method, and is calculated by, for example, image analysis using a transmission electron microscope apparatus.
  • the latex particles according to the present invention are not particularly limited as long as they are usually used in this field.
  • vinyl particles such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid ester, and methacrylic acid ester are used.
  • Particles made of a single polymer obtained by polymerizing monomers for example, polystyrene, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, etc.
  • monomers for example, polystyrene, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, etc.
  • butadiene-based copolymers for example, styrene-butadiene copolymer, methyl methacrylate-butadiene copolymer
  • Particles made of polymer, acrylonitrile-butadiene copolymer, etc., and other copolymers for example, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylate ester copolymer, acrylate ester copolymer, vinyl chloride
  • Acrylic ester copolymer etc. That.
  • Examples thereof include particles having a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group (—CONH 2 ), a hydroxyl group, an aldehyde group, etc. as a functional group, and a substrate composed of the organic fine particles.
  • the antibody may be solid-phased on the latex particles in accordance with a known method.
  • the antibody and latex particles are suspended in a buffer, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then centrifuged. It can be obtained by a process usually performed in this field, such as a blocking process.
  • a method in which the antibody and latex particles are solid-phased by chemical bonding or a method in which the antibody is solid-phased by biotin-avidin reaction can be selected.
  • the antibody is bound to the latex particles, the antibody is subjected to the conditions that can maintain the reactivity and specificity for the TAT.
  • a solid phase latex solution is prepared for each type of antibody as a first latex particle having a first antibody as a solid phase and a second latex particle having a second antibody as a solid phase.
  • the reagent can be prepared by immobilizing the first antibody and the second antibody on one type of latex particle.
  • a person skilled in the art can appropriately design how the antibody and latex particles are solid-phased to prepare the reagent.
  • the test sample that can be applied to the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a test sample that may contain TAT, but is preferably a biological sample, and is derived from a mammal. More preferably, it is a human-derived sample.
  • a sample derived from a living body serum and plasma can be particularly preferably used.
  • it is a blood sample derived from a human administered with heparin (for example, a final concentration of 1 to 2 U / mL), and more preferably used for measurement of plasma derived from a human administered with heparin.
  • a sample derived from a mammal is preferable, and a sample derived from a human is more preferable.
  • the reagent of the present invention may be a one-reagent system or a two-reagent system.
  • a reaction solution containing a latex particle suspension in which the first and second antibodies are solid-phased and a polycation such as hexadimethrin bromide is added to a biological sample, By generating an antigen-antibody reaction, TAT in a biological sample can be measured.
  • the reagent of the present invention is a two-reagent system, after adding a first reagent mainly composed of a buffer component and containing a polycation such as hexadimethrin bromide to a biological sample, the first antibody and the second antibody are further added.
  • an antigen-antibody reaction can be caused and TAT in a biological sample can be measured.
  • a polycation may be contained in the second reagent together with the antibody-bound latex particles.
  • a two-reagent system is preferred for more accurate measurement.
  • Any polycation may be used as long as it binds to heparin in the sample and inhibits the binding between heparin and antithrombin.
  • Naturally occurring polycations include chitosans such as methyl glycol chitosan, modified dextrans such as diethylaminoethyl modified dextran, aminodextran, hydroxymethylcellulose trimethylamine, lysozyme, spermine, spermidine, polylysine, polyarginine, polyornithine, protamine sulfate, hydroxy Examples include ethyl cellulose trimethylamine and proteins.
  • the protein only needs to have the property of binding to heparin, and BXXB, BBXB, BBXXB, BXXBBXB (where B is a basic amino acid and X is any amino acid) known as heparin binding motif / peptide
  • BXXB, BBXB, BBXXB, BXXBBXB (where B is a basic amino acid and X is any amino acid) known as heparin binding motif / peptide
  • a protein / peptide having the sequence of Specific examples include activated factor X, heparin-binding growth factor, lactoferrin, transferrin, vitronectin, endonuclease, lipase, steroid receptor, histone and other DNA-binding proteins, PF4, and the like.
  • Examples of synthetic polycations are polyallylamine, polyallylamine hydrochloride, poly (diallyldialkylamine), polyamidoamine, polyamine, polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride, hexadimethrin bromide, polydiallyldimethylammonium chloride, polyethyleneimine, polypropyleneimine, polypropyl Ethyleneimine, polyimidazoline, polyvinylamine, polyvinylpyridine, poly (acrylamide / methacryloxypropyltrimethylammonium bromide), poly (diaryldimethylammonium chloride / N-isopropylacrylamide), poly (dimethylaminoethyl acrylate / acrylamide), polydimethyl Aminoethyl methacrylate, polydimethylamino epichlorohydrin, polyethyleneimino Picrylhydrin, polymethacryloxyethyltrimethylammonium bromide, hydroxypropy
  • polyalkyleneamines such as hexadimethrine bromide, polyethyleneimine, polypropylethyleneimine, protamine sulfate, polylysine, polyornithine, aminodextran, etc.
  • hexadimethrine bromide or protamine sulfate is used. It is preferable to do.
  • the molecular weight of the polycation is known to be several hundred to several million in terms of mass average molecular weight, but those that can be preferably used in the present invention have a molecular weight of 1,000 to 100,000, more preferably 1 From 1,000 to 10,000 polycations can be used.
  • the polycation is preferably present in the reaction system at a final concentration of 0.0002 to 1 w / v%, more preferably 0.0005 to 0.1 w / v%, and 0.001 to 0.05 w / v. More preferably, it is present at v%.
  • the degree of aggregation of latex particles can be quantified by measuring the concentration of latex particles using, for example, absorbance and determining the concentration from a standard calibration curve determined in advance.
  • the absorbance measurement wavelength is usually 340 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm.
  • the time during which the latex agglutination reaction is measured can be measured by the rate of change per hour or the amount of change over a certain period of time. For example, when measuring the absorbance, it can be measured by the absorbance change rate per hour from 30 seconds to 5 minutes after the start of the latex agglutination reaction, or the absorbance change amount for a certain time.
  • the reaction temperature is preferably 10 to 50 ° C., more preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction time can be determined as appropriate. For example, in a general-purpose automatic analyzer, the reaction time can be measured with a reaction time of 10 to 15 minutes.
  • a person skilled in the art can analyze the reaction temperature, reaction time, measurement wavelength, measurement time, reagent composition, latex concentration, antibody concentration to be immobilized on latex using an optical instrument or a general-purpose automatic analyzer according to known methods. Various additive concentrations can be appropriately determined.
  • the concentration of latex particles used in the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration applicable to an immunoassay reagent by latex agglutination method, but the latex particles at the time of reaction necessary for measuring TAT are not limited.
  • the concentration is preferably 0.005 w / v% to 0.2 w / v%, and more preferably 0.01 w / v% to 0.1 w / v%.
  • the reagent of the present invention can be used in addition to latex particles to which an antibody is immobilized, as well as additives that can be added to immunoassay reagents by latex agglutination, such as buffers, aggregation promoters, nonspecific reaction inhibitors, sensitization. An agent or the like can be further contained.
  • the sensitizer that can be added to the reagent of the present invention include sodium alginate and propylene glycol alginate.
  • the aggregation promoter that can be added to the reagent of the present invention water-soluble polymers and proteins are preferably used.
  • Examples include water-soluble polymers such as dextran, dextran sulfate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone, albumins such as bovine serum albumin, and globulins such as ⁇ -globulin.
  • water-soluble polymers such as dextran, dextran sulfate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone
  • albumins such as bovine serum albumin
  • globulins such as ⁇ -globulin.
  • a buffer solution having a buffer capacity at pH 5.8 to 6.6 can be used. It is more preferably 6.0 to 6.4, still more preferably 6.1 to 6.3, and particularly preferably 6.15 to 6.25.
  • the pH of the reagent may be adjusted to the above range, and in the case of a two-reagent system, the pH may be configured to be in the above range when mixed.
  • the pH of the first reagent is adjusted to the above range, A mode in which the pH of the mixed solution falls within the above range when mixed is exemplified.
  • the pH may be adjusted with a pH adjusting agent, but is preferably adjusted with a buffer.
  • Tris buffer, bis-Tris buffer, phosphate buffer, Good's buffer, or the like is preferably used, and the buffer concentration during the reaction is preferably 10 to 500 mmol / L, preferably 20 to 200 mmol / L. More preferably.
  • Nonspecific reaction inhibitors that can be added to the reagent of the present invention include antibodies and receptors for substances causing nonspecific reactions, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, borate buffer, citrate buffer, Buffers such as acetate buffer or Good buffer, chelating agents such as EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium carbonate, etc.
  • Tris buffer Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, borate buffer, citrate buffer, Buffers such as acetate buffer or Good buffer
  • chelating agents such as EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium carbonate, etc.
  • Nonionic surfactants such as alkyl glycosides and the like.
  • the reagent of the present invention may contain TAT that can be used as a standard substance.
  • TAT may be TAT purified from a living body, or TAT synthesized by gene recombination. Synthetic TAT can be obtained, for example, by incubating thrombin and antithrombin available as biologics in a test tube.
  • TAT can be synthesized by mixing and purifying what was expressed using a known translational expression system in E. coli, mammalian cells, insect cells infected with baculovirus, and the like. .
  • Example 1 Preparation of Synthetic TAT
  • Commercially available human thrombin preparation manufactured by Japan Blood Products Organization
  • antithrombin preparation manufactured by Japan Blood Products Organization
  • PBS Denbecco PBS (-) powder "Nissui (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)" , Dissolved at 9.6 g / L), mixed at a molar ratio of 1: 3, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • DFP diisopropyl fluorophosphate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Example 2 Preparation of Anti-TAT Antibody The cell fusion method was performed according to Tamie Ando and Ikuzaki Ikuzaki / Author “Monoclonal Antibody / Hybridoma and ELISA” (Kodansha). 50 ⁇ g of the synthetic TAT prepared in Example 1 was mixed with Freund's complete adjuvant (manufactured by DIFCO) to obtain an administration antigen. BALB / c mice (female, 4 weeks old) were administered 3 times at 2-week intervals, and the fourth dose was intravenously injected with a half amount of 25 ⁇ g. One week later, lymphocytes were isolated from the spleen and myeloma cells P3x63-Ag. After mixing with No.
  • cell fusion was performed using polyethylene glycol (PEG 4000, manufactured by Merck). Hybridomas were selected using a HAT selection medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody were screened using the binding activity to synthetic TAT as an indicator. Specifically, synthetic TAT was diluted to 0.2 ⁇ g / mL with 0.05 M carbonate buffer (pH 9.5), and 50 ⁇ L / well was added to an immunoplate (Maxisorp, manufactured by NUNC). After reaction at 4 ° C. and Over Night, the plate was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween-20, and 100 ⁇ L of PBS containing 1.0% BSA was added to each well for blocking.
  • PEG 4000 polyethylene glycol
  • Hybridomas were selected using a HAT selection medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody were screened using the binding activity to synthetic TAT as an indicator.
  • synthetic TAT was diluted to 0.2 ⁇ g / mL with 0.05 M carbon
  • the immunogen as thrombin In a manner similar to example 2 Example 3 antithrombin antibodies, to obtain antithrombin antibodies. An antibody that specifically reacts with thrombin was selected, and one of these clones was used as an antithrombin antibody (T-1).
  • a schematic diagram of the reaction system by the indirect inhibition ELISA is shown in FIG.
  • An antibody (anti-TAT antibody) candidate that recognizes TAT at a concentration of 0.04 to 0.4 ⁇ g / mL to be evaluated is mixed with an inhibitory antigen (prothrombin (Enzyme Research), thrombin, antithrombin, synthetic TAT). Incubated.
  • the partially inhibited antibody candidate was bound as a primary antibody to synthetic TAT immobilized on a 96-well plate.
  • a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was bound as a secondary antibody, a chromogenic substrate was added, and the absorbance was measured.
  • the residual ratio of the antibody was calculated from the color change rate.
  • TAT-5 the absorbance when each inhibitory antigen was used is shown in Table 1, and the residual ratio of the antibody calculated from the absorbance is shown in Table 2.
  • the residual rate was calculated for each antigen concentration of each antibody.
  • Pro-T represents prothrombin
  • T represents thrombin
  • AT antithrombin.
  • the TAT antigen amount which becomes the inhibition rate equivalent to the residual rate when inhibiting with antithrombin 50 microgram / mL was calculated, and the TAT reactivity difference (magnification) with respect to antithrombin was calculated
  • magnification was calculated for 27 types of antibody clones. There were 13 types of antibodies in which the difference (magnification) between the amount of added TAT and antithrombin was 100 times or more, 7 types of antibodies having 1000 times or more, and 2 types of antibodies having 10,000 times or more. Table 5 shows the five types of antibodies.
  • Example 5 Effect of hexadimethrin bromide on heparinized plasma (model sample)
  • First reagent 100 mM Bis-tris (manufactured by Dojin Chemical) pH 6.2, 700 mM NaCl (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.05% Emulgen 150 (Kao Corporation), 0.20% sodium alginate (Wako Pure Chemical Industries), 0.15% BSA (Sigma Aldrich), 0.05% Hexadimethrine bromide (Sigma Aldrich) as the first reagent Using.
  • the comparative example used what remove
  • Second reagent Adsorbed polystyrene latex particles adsorbing mouse monoclonal antibody TAT-1, which reacts with the antithrombin side of TAT whose reactivity to TAT is 100 times or more of the reactivity with antithrombin, and antithrombin mouse monoclonal antibody Polystyrene latex particles diluted and mixed with 0.05% sodium azide solution such that each antibody-sensitized particle has an absorbance at 700 nm of 1.0 (second reagent A: latex particle concentration 0.01%) Alternatively, only polystyrene latex particles adsorbed with a mouse monoclonal antibody that reacts with the antithrombin side of TAT, which has a reactivity with respect to TAT of 100 times or more with respect to antithrombin, are adjusted so that the absorbance at 700 nm is 1.0. 05% horse mackerel It was used as the second reagent of a mixture diluted with sodium solution (second reagent B), respectively.
  • Measuring instrument 7170S (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) Parameters: Sample volume 12 ⁇ L, first reagent 90 ⁇ L, second reagent 90 ⁇ L, main wavelength 570nm, subwavelength 800nm, measured by subtracting absorbance at 20th point from absorbance at 34th photometric point as ⁇ Abs did.
  • Example 6 Examination of Addition Amount of Hexadimethrin Bromide First Reagent: Same as Example 5 except that the addition amount of hexadimethrin bromide was changed between 0 and 0.05 w / v%. Second reagent: The second reagent A of Example 5 was used. Sample: normal human pool plasma with 2 U / mL of heparin sodium injection “Tanabe” or normal human pool plasma with 2 U / mL of heparin sodium injection “Tanabe” added with serum so that the TAT concentration is 50 ng / mL Parameters: Performed in the same manner as in Example 5.
  • Example 7 Effect of Protamine Sulfate First Example : Example 5 except that the addition amount of protamine sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was changed between 0 to 0.01 w / v% instead of hexadimethrin bromide. Prepared in the same manner.
  • Second reagent The second reagent A of Example 5 was used. Sample: normal human pooled plasma to which 2 U / mL of heparin sodium injection “Tanabe” was added Measuring instrument / parameter: The same as in Example 5.
  • protamine sulfate is preferably 0.001% (final concentration 0.0005%) or more, more preferably 0.01% (final concentration 0.005%) or more.
  • Example 8 Effect of Hexadimethrine Bromide on Real Specimen First Reagent: Same as Example 5.
  • Second reagent Second reagents A and B of Example 5 were used.
  • Sample Two samples of Na citrate plasma (samples 1 and 2) presumed that heparin preparation was administered because non-specific reaction was observed.
  • Measuring equipment and parameters Performed in the same manner as in Example 5.
  • the antithrombin multimer generated by binding of heparin to antithrombin in the sample is dissociated by a polycation such as hexadimethrin bromide.
  • a polycation such as hexadimethrin bromide.

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Abstract

被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、ポリカチオンを含むことを特徴とする、試薬。これにより、ヘパリンの影響を回避してＴＡＴを正確に測定することができる。

Description

トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法
　本発明は、試料中のトロンビン（Ｔ）・アンチトロンビン（ＡＴ）複合体(ＴＡＴ)を測定する試薬および方法に関する。
　トロンビン・アンチトロンビン複合体(ＴＡＴ)は血液凝固が進行するときに血液中に産生されるタンパク質複合体で、血液中のＴＡＴの定量は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の血栓症の診断にとって有用である。しかしながら、ＴＡＴの存在量は遊離アンチトロンビンの存在量の約１００，０００分の１であるため、測定が容易ではない。
　現在主流のＴＡＴ定量法は、シーメンス社のエンザイグノスト（登録商標）ＴＡＴ　ｍｉｃｒｏ等の酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用いる試薬キット、およびＬＳＩメディエンス社のステイシア（登録商標）　ＣＬＥＩＡ　ＴＡＴ等の化学発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ)を用いる試薬キットを用いる方法があるが、いずれも固相・液相分離(Ｂ／Ｆ分離)が必要な測定法で、煩雑な洗浄作業が要り、手作業あるいは専用機器が必要である。
　特許文献１～４には、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用いる試薬系が報告されたが、いずれも体外で合成したＴＡＴをバッファーで希釈することで作製したサンプルの測定であり、ラテックス凝集法を用いて、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬の報告は無い。また、これらの文献はいずれも、抗体の特異性に依存してＴＡＴ測定試薬の構築をしているか、添加剤によってその交差反応性による影響を回避しているものである。特許文献５は、交差反応性を有さない抗体を使用するサンドイッチ測定法によるＴＡＴ測定について開示しているが、臨床的に利用するためには十分な感度ではない。
　従って、測定が簡便なラテックス凝集法において、高感度・高精度に生体試料中のＴＡＴを測定する試薬及び方法が求められていた。
　本発明者らは、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用い、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬を報告した（特許文献６，７）が、臨床応用のためにはさらなる改善の余地があった。
特開２００１－２８９８５０号公報 特開２００１－２２１８００号公報 特開平７－２３８０９９号公報 特開２００２－３１６９９９号公報 特開平３－４８１５８号公報 特願２０１５－０７４１６８号 特願２０１５－０７４１７３号
　図１に記載されたように、ラテックス凝集法によるＴＡＴの測定では、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体、およびトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体の２種類の抗体が使用される。そして、原理的にはＴＡＴが存在するときのみに両抗体が結合してラテックス凝集が起こり、ＴＡＴの定量が可能となる。
　しかしながら、特許文献６，７で用いられているようなＴＡＴのアンチトロンビン側に結合する抗体として、ＴＡＴに対する反応がアンチトロンビンに対する反応の１００倍以上のモノクローナル抗体を用いたときでも、血栓塞栓症やＤＩＣの治療などで抗凝固薬として用いられるヘパリン（特に未分画ヘパリン）の影響で非特異的な反応が生じ、不正確な測定結果となることが本発明者らの検討で明らかとなった。これはおそらくヘパリンが血中でアンチトロンビンと複合体を形成しアンチトロンビンを多量体化することに起因すると考えられる。このようなヘパリン－アンチトロンビン複合体は通常のアンチトロンビンに比べ、よりＴＡＴを形成した際のアンチトロンビンの構造に近いと考えられ、さらに多量体を形成していると考えられる。よって、ヘパリン投与患者の検体を測定すると、ＴＡＴに対する反応がアンチトロンビンに対する反応の１００倍以上のモノクローナル抗体を結合したラテックス粒子を用いても、それがヘパリン－アンチトロンビン複合体を認識し、それ単独で凝集が生じ、これが非特異反応として本反応に上乗せされてしまう。このようなヘパリン－アンチトロンビン複合体による非特異的反応はＢ／Ｆ分離が可能な測定法では生じない問題であり、本発明者が初めて発見したラテックス凝集法を用いたＴＡＴ測定試薬に特有の問題である。
　従来ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定試薬におけるアンチトロンビンの影響回避法としては特許文献１，２のような方法が知られているが、ヘパリンによりアンチトロンビン多量体が生じること、ヘパリンにより多量体化したアンチトロンビンの影響回避策については何ら示唆されていない。
　そこで、本発明は、Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業を必須としないラテックス凝集法を用いた、生体試料中のＴＡＴの測定試薬および測定方法において、ヘパリン等の影響を回避して正確にＴＡＴの測定を行うことのできる試薬及び方法を提供することである。
　この課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者はＴＡＴ測定試薬中に臭化ヘキサジメトリンなどのポリカチオンを添加することでヘパリン－アンチトロンビン複合体による非特異的凝集を回避し、生体試料中のＴＡＴを正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、ポリカチオンを含むことを特徴とする、試薬。
[２] 前記被検者がヘパリン投与された患者である、[１]に記載の試薬。
[３] 前記ポリカチオンが、臭化ヘキサジメトリン、キトサン類、変性デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシメチルセルローストリメチルアミン、リゾチーム、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、硫酸プロタミン、ヒドロキシエチルセルローストリメチルアミン、ヘパリン結合タンパク質、ポリアリルアミン、塩酸ポリアリルアミン、ポリ（ジアリルジアルキルアミン）、ポリアミドアミン、ポリアミン、塩化ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリプロピルエチレンイミン、ポリイミダゾリン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリ（アクリルアミド／臭化メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウム）、ポリ（塩化ジアリールジメチルアンモニウム／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ジメチルアミノエチルアクリレート／アクリルアミド）、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエピクロルヒドリン、ポリエチレンイミノエピクロルヒドリン、臭化ポリメタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化ヒドロキシプロピルメタクリロイルオキシエチルジメチルアンモニウム、ポリ（メチルジエチルアミノエチルメタクリレート／アクリルアミド）、ポリ（メチル／グアニジン）、臭化ポリメチルビニルピリジニウム、ポリ（ビニルピロリドン－ジメチルアミノエチルメタクリレート）および臭化ポリビニルメチルピリジニウムからなる群より選択される、[１]又は[２]に記載の試薬。
[４]前記ポリカチオンが臭化ヘキサジメトリン、ポリエチレンイミン、ポリプロピルエチレンイミンなどのポリアルキレンアミン、硫酸プロタミン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびアミノデキストランからなる群より選択される、[１]又は[２]に記載の試薬。
[５] 前記試薬が、ラテックスに結合したアンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１抗ＴＡＴ抗体と、ラテックスに結合したトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２抗ＴＡＴ抗体とを含む、[１]乃至[４]のいずれかに記載の試薬。
[６] 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体である、[５]に記載の試薬。
[７] 被検者由来の血液試料中に存在するＴＡＴを測定する方法であって、[１]乃至[６]のいずれかに記載の試薬を用いてラテックス凝集法を行うことによりＴＡＴを測定することを特徴とする方法。
[８] 前記被検者がヘパリン投与された患者である、[７]に記載の方法。
　本発明によれば、ラテックス凝集法の試薬により、生体試料中の微量なＴＡＴをヘパリンの影響を回避しつつ、正確に測定（定量）することが可能である。これにより、ヘパリン投与患者血漿（またはヘパリン採血管により採取した血漿）でも正確にラテックス凝集法によるＴＡＴ測定が可能であり、ＤＩＣの治療にも用いられるヘパリンの投与がなされた患者検体中のＴＡＴを正確に測定できることは診断上有用である。
ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定方法の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法によるクローンＴＡＴ－５の各抗原への結合性を評価した結果を示す図。 ヘパリン添加血漿（モデル検体）における臭化ヘキサジメトリンの効果を示す図。 ヘパリン処理血液またはヘパリン非処理血液のそれぞれについて臭化ヘキサジメトリンの濃度を変化させたときの検出結果を示す図。 ヘパリン処理血液またはヘパリン非処理血液にさらにTAT濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように血清を添加し、それぞれについて臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）の濃度を変化させたときの検出結果を示す図。下は上の図を拡大したものを示す。 ヘパリン処理血液またはヘパリン非処理血液のそれぞれについて硫酸プロタミンの濃度を変化させたときの検出結果を示す図。下は上の図を拡大したものを示す。 臭化ヘキサジメトリンの有り（＋）無し（－）で、第２試薬Ａまたは第２試薬Ｂを用いて臨床検体を評価した測定結果を示す図。
　本発明のＴＡＴ測定試薬は、
　被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、ポリカチオンを含む。
　以下に、本発明のＴＡＴ測定試薬の一例を、実施の一態様として記載するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
　本発明のＴＡＴ測定試薬は、好ましくは、生体試料中のＴＡＴを測定するための、２種類の抗ＴＡＴ抗体をそれぞれ結合させたラテックス粒子を用いた、サンドイッチ系でのラテックス凝集法による免疫測定試薬である。
　本発明に使用することができる抗体は、例えば、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第１抗体）とトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第２抗体）を組み合わせて使用することができる。
　第１抗体としては、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよい。ＴＡＴに対する反応性と遊離アンチトロンビンに対する反応性に少なくとも１００倍以上の差を有する抗体が好ましく用いられる。第１抗体のＴＡＴに対する反応性は遊離アンチトロンビンに対する反応性より１００倍以上であればよく、２００倍以上がより好ましく、１，０００倍以上であることがさらに好ましく、１０，０００倍以上であることが特に好ましい。交差反応性は少ないほどよいので上限は特にないが、例えば、１００，０００倍未満、または５０，０００倍未満であってもよい。
　該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離アンチトロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
　ここで、本発明においてアンチトロンビン側に結合するとは、試料中に最も多く存在している遊離した状態のアンチトロンビンが、遊離トロンビンと結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のアンチトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するアンチトロンビンを複合体型構造アンチトロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するアンチトロンビンを遊離型構造アンチトロンビン（遊離アンチトロンビン）と称した場合、アンチトロンビン側に結合するとは、複合体型構造アンチトロンビンに結合することを意味する。
　遊離型構造アンチトロンビンは、複合体型構造アンチトロンビンと異なる構造を有する。それは、遊離型構造アンチトロンビンは、遊離トロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在するためである。
　生体内におけるＴＡＴとＴＡＴを形成していない遊離アンチトロンビンの存在割合は健常人の測定値幅を参考として１：６０，０００～１：１１０，０００の間と考えられるが、一般的には約１：１００，０００で存在していると考えられる。また、敗血症や肝疾患患者においてその存在割合が変化する場合が知られているが、遊離アンチトロンビン量が少なくなる場合でも１：５０，０００程度であるとされている。従って、第１抗体が遊離アンチトロンビンにも反応性を示すとＴＡＴの定量が困難になる。そこで、ＴＡＴを定量するには、遊離アンチトロンビンへの反応性が低い抗体を使用する必要があり、そのために、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上の抗体を用いる。
　本発明において、「ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上」とは、各抗原に対する親和性の比が１００倍以上である場合や、後述の、間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したときの、一定割合の阻害率を示すのに必要な抗原量の比が１００倍以上である場合などが挙げられる。
　ＴＡＴに対する反応性が、遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体は後述の実施例に記載された方法で得ることができるが、以下に当該抗体を間接阻害ＥＬＩＳＡで評価またはスクリーニングする場合について説明する。
　まず、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第１抗体の候補抗体）を用意する。このような抗体は、後述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法等により抗体を得たのち、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体を選択すればよい。もちろん、あらかじめ、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体が存在する場合はそれを以下の評価系に供すればよい。
　すなわち、候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ、又はＴＡＴの反応を阻害し得る抗原を含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
　例えば、まず、該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、一定量のＴＡＴをプレート等の基材に固相する。基材に固相する抗原（ＴＡＴ）の量は、当業者であれば、使用する抗原の分注量と評価対象の抗体の種類との関係を考慮して、適宜設定することができる。
　該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、各濃度（例えば０．０４～１μｇ／ｍＬ）の上記第１抗体の候補抗体を、上記ＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ）を用いて、基材上のＴＡＴに結合した抗体の量を測定する。吸光度が１．０付近（表１の記載方法だと１０００）となる抗体濃度を決定する。この抗体濃度を、抗原による阻害時の抗体濃度とすることができる（表３；反応時濃度（μｇ／ｍＬ））。
　次に上記方法で決定した濃度の候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴまたは遊離アンチトロンビンを含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ）を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
　なお、抗体残存率は、抗原による吸収が未実施の時に得られる検出値を１００％として算出できる。
　抗体の遊離アンチトロンビンに対する反応性が高い場合はＴＡＴに結合できる抗体の量が減るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が少なくなり（抗体残存率が低くなり）、一方、抗体が遊離アンチトロンビンに対する反応性が低い場合はＴＡＴに結合できる抗体が多く残るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が多くなる（抗体残存率が高くなる）。
　この抗体残存率を、最初にＴＡＴと抗体とを反応させた（阻害反応をＴＡＴで行った）後に、反応液を固体化ＴＡＴと反応させたときの抗体残存率と比較する。
　そして、例えば、遊離アンチトロンビンを５０μｇ／ｍＬ加えて阻害反応させたときの抗体残存率が５０％であった場合、同じ抗体残存率を示すのに必要なＴＡＴの量を上記のＴＡＴで阻害したときの結果から算出する。ＴＡＴで阻害したときに、抗体残存率５０％を達成するのに必要なＴＡＴ阻害抗原の量が０．５０μｇ／ｍＬ未満であれば、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上とすることができる。
　このようにして選択された抗体を第1抗体として選択することができる。なお、第1抗体は、モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０－８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。
　第１抗体として、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体を選択した場合、第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよく、トロンビンに対して特異的に反応する抗体を使用することができる。試料中において、遊離トロンビンはほとんど存在しないため、遊離トロンビンに対して交差反応性を有する抗体であっても利用できることが多い。当業者であれば、適宜選択して使用することができる。
　該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離トロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
　ここで、本発明においてトロンビン側に結合するとは、試料中に存在している遊離した状態のトロンビンが、アンチトロンビンに結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するトロンビンを複合体型構造トロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するトロンビンを遊離型構造トロンビンと称した場合、トロンビン側に結合するとは、複合体型構造トロンビンに結合することを意味する。
　遊離型構造トロンビンは、複合体型構造トロンビンと異なる構造を有する可能性が考えられる。それは、遊離型構造トロンビンは、アンチトロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在することによる。
　第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であれば特に制限されない。モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０－８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。
　また、本発明に使用する抗体として、例えば、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、即ちトロンビンやアンチトロンビンには反応しないが、ＴＡＴにのみ特異的に反応する抗体であって、エピトープが異なる２種類の抗体を組み合わせて使用することもできる。
　上記の第１抗体及び第２抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれも使用することができる。これらの抗体は、当業者であれば、公知の手法に従って取得することができる。
　抗体作製用に免疫原を免疫する動物としては、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が使用可能であり、特にポリクローナル抗体作製にはウサギ、ヤギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であり、この場合はマウス、ラット或いはウサギ等が好ましい。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。
　免疫原としては、上述したように、ＴＡＴを使用してもよいし、ビトロネクチンが結合したＶＴＡＴを免疫原として作製した抗体を本願発明の使用することもできる。また、第１抗体の場合はアンチトロンビンを、第２抗体の場合にはトロンビンを使用してもよい。
　これらの免疫原は、生体から採取された試料を原料として精製されたＴＡＴを使用してもよいし、遊離トロンビンと遊離アンチトロンビンを混合してｉｎｖｉｔｒｏで合成したＴＡＴを使用してもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得られるＴＡＴでもよいし、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを免疫原として使用してもよい。
　また、立体構造の違いを部分的なペプチドのみで免疫させることが可能である場合、具体的に抗体の結合部位を特定して抗体を作製したい場合には第１抗体の場合はアンチトロンビン、第２抗体の場合はトロンビンの部分ペプチドを用いて作製することもできる。その場合の抗原としてのペプチド配列の選択やペプチド断片の合成方法、免疫方法は既知の方法を使用することができる。
　本発明で使用される抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望の抗体のフラグメントであって、しかも、もとの抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）2フラグメントに調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）2がより好ましい。
　本発明で使用する抗体は、まず、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法などによりＴＡＴ抗体（候補抗体）を得て、その後、ＴＡＴ抗体（候補抗体）の中から、上記のような手法及び基準で、第１抗体および第２抗体を選択することにより得ることができる。
　第１抗体と第２抗体の組み合わせはラテックス凝集法においてＴＡＴの測定が可能であれば特に制限されないが、血漿などの生体試料中に含まれるマトリクス（バックグラウンド）の影響が最少の抗体組み合わせを選出することが好ましい。
　ＴＡＴ測定試薬に求められる感度は、健常人と患者とを明確に区別できる基準値、或いはその２倍の濃度を測定できることが必要であるため、本発明の試薬は生体試料中の１０～１５ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることが好ましく、３～４ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ程度の濃度でも定量できる試薬であることがさらに好ましい。
　上記の第１抗体および第２抗体を結合させるラテックス粒子はラテックス凝集反応に使用し得るものであれば特に制限されないが、平均粒子径が０．０５μｍ～０．５μｍであることが好ましく、０．２～０．４μｍであることがより好ましい。
　使用するラテックス粒子の種類は、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数種のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、平均粒子径０．０５μｍ～０．５μｍという場合、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。当業者にとって、粒径が異なるラテックス粒子が含まれることは常識の範囲内であり、当業者であれば、その粒径の分布に大きく偏りの無い粒子群を含む溶液を使用してラテックス試薬の構築することが可能である。
　なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析により算出される。
　本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン－ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート－ブタジエン共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（－ＣＯＮＨ2）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる粒子が挙げられる。
　ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法や、ビオチン－アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
　ラテックス粒子に抗体を結合させる際には、抗体が、上記のＴＡＴに対する反応性および特異性を維持できる条件で行う。
　好適な試薬の調製が行いやすいことから、第１抗体を固相した第１のラテックス粒子、第２抗体を固相した第２のラテックス粒子として、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製することもできるし、１種類のラテックス粒子に第１の抗体と第２の抗体を固相させて試薬の調製を行うこともできる。抗体とラテックス粒子をどのように固相させて試薬の調製を行うかは、当業者であれば適宜設計することができる。
　本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＴＡＴを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではないが、生体試料であることが好ましく、哺乳動物由来の試料であることがより好ましく、ヒト由来の試料であることが更に好ましい。生体由来の試料としては、血清、血漿が特に好適に使用できる。好ましくは、ヘパリン（例えば、終濃度１～２U/mL）が投与されたヒト由来の血液試料であり、更に好ましくは、ヘパリンが投与されたヒト由来血漿の測定に特に好適に使用できる。哺乳動物由来の試料であることが好ましく、ヒト由来の試料であることがより好ましい。
　本発明の試薬は、１試薬系であってもよいし、２試薬系であってもよい。本発明の試薬が１試薬系である場合は、生体試料に、前記第１及び第２抗体をそれぞれ固相したラテックス粒子懸濁液と臭化ヘキサジメトリンなどのポリカチオンを含む反応液を添加し、抗原抗体反応を生じさせることにより、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。本発明の試薬が２試薬系である場合には、緩衝液成分を主体とし、臭化ヘキサジメトリンなどのポリカチオンを含む第１試薬を生体試料に添加した後、更に前記第１抗体、第２抗体をそれぞれ固相したラテックス粒子を含む第２試薬を添加することで、抗原抗体反応を生じさせ、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。なお、ポリカチオンを抗体結合ラテックス粒子とともに第２試薬に含有させてもよい。より正確に測定するには２試薬系が好ましい。
　ポリカチオンとしては試料中のヘパリンと結合してヘパリンとアンチトロンビンとの結合を阻害するものであればよいが、例えば、以下のようなものが使用できる。
　天然に生じるポリカチオンとしては、メチルグリコールキトサン等のキトサン類、ジエチルアミノエチル変性デキストランなどの変性デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシメチルセルローストリメチルアミン、リゾチーム、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、硫酸プロタミン、ヒドロキシエチルセルローストリメチルアミンおよびタンパク質が挙げられる。
　タンパク質としては、ヘパリンに結合する性質を有していればよく、ヘパリン結合モチーフ・ペプチドとして既知の、ＢＸＸＢ、ＢＢＸＢ、ＢＢＢＸＸＢ、ＢＸＸＢＢＸＢ（ここでＢは塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸を意味する）の配列を有するタンパク質・ペプチドを使用することができる。具体的には、活性化第Ｘ因子、ヘパリン結合性成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、ビトロネクチン、エンドヌクレアーゼ、リパーゼ、ステロイドレセプター、ヒストン等のＤＮＡ結合タンパク質、ＰＦ４等である。
　合成ポリカチオンの例は、ポリアリルアミン、塩酸ポリアリルアミン、ポリ（ジアリルジアルキルアミン）、ポリアミドアミン、ポリアミン、塩化ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサジメトリン、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリプロピルエチレンイミン、ポリイミダゾリン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリ（アクリルアミド／臭化メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウム）、ポリ（塩化ジアリールジメチルアンモニウム／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ジメチルアミノエチルアクリレート／アクリルアミド）、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエピクロルヒドリン、ポリエチレンイミノエピクロルヒドリン、臭化ポリメタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化ヒドロキシプロピルメタクリロイルオキシエチルジメチルアンモニウム、ポリ（メチルジエチルアミノエチルメタクリレート／アクリルアミド）、ポリ（メチル／グアニジン）、臭化ポリメチルビニルピリジニウム、ポリ（ビニルピロリドン－ジメチルアミノエチルメタクリレート）および臭化ポリビニルメチルピリジニウムである。
　これらのポリカチオンの中では、臭化ヘキサジメトリン、ポリエチレンイミン、ポリプロピルエチレンイミンなどのポリアルキレンアミン、硫酸プロタミン、ポリリジン、ポリオルニチン、アミノデキストランなどが挙げられ、特に、臭化ヘキサジメトリン或いは硫酸プロタミンを使用することが好ましい。
　ポリカチオンの分子量としては、質量平均分子量で数百～数百万が知られているが、本発明において好ましく用いることができるものは、分子量１，０００～１００，０００であり、より好ましくは１，０００～１０，０００のポリカチオンを使用することができる。
　ポリカチオンは、反応系に最終濃度０．０００２～１ｗ／ｖ％で存在させることが好ましく、０．０００５～０．１ｗ／ｖ％で存在させることがより好ましく、０．００１～０．０５ｗ／ｖ％で存在させることがさらに好ましい。
　ラテックス粒子上には、通常ＳＯ3-やＳＯ4-、ＣＯＯ-といったマイナスチャージが存在するため、試薬中にポリカチオンを添加することは測定対象物非存在下でもポリカチオンのプラスチャージにより凝集が引き起こされることが容易に考えられ、測定系への影響が懸念されるため通常は使用がためらわれるものである。しかし、本発明者は検体中でヘパリンがアンチトロンビンと結合することで生じるアンチトロンビン多量体が臭化ヘキサジメトリンなどのポリカチオンにより解離することを見出した。上記ポリカチオンを使用することにより、このような副作用（凝集）を生じることなく、ヘパリンによる影響のみを回避し正確にＴＡＴを測定することができたのは意外であった。
　ラテックス粒子の凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＴＡＴ濃度を定量することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ～９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０～５０℃であることが好ましく、２０～４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０～１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化する抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜決定することができる。
　本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＴＡＴを測定するために必要な反応時のラテックス粒子の濃度は０．００５ｗ／ｖ％～０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％～０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。
　本発明の試薬は、抗体を固定化したラテックス粒子以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤、非特異反応抑制剤、増感剤などを更に含有することができる。本発明の試薬に添加可能な増感剤としては、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。また、本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ－グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。
　前記緩衝液としては、例えば、ｐＨ５．８～６．６に緩衝能を有する緩衝液を使用することができる。６．０～６．４であることがより好ましく、６．１～６．３であることがさらに好ましく、６．１５～６．２５であることが特に好ましい。１試薬系であれば、試薬のｐＨが上記範囲に調整されていればよいし、２試薬系であれば、混合したときにｐＨが上記範囲になるように構成されていればよい。例えば、緩衝液成分を主体とした第１試薬と、抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬から構成される場合に、第１試薬のｐＨが上記範囲に調整されており、両試薬を混合したときに、混合液のｐＨが上記範囲になるような態様が挙げられる。
　ｐＨはｐＨ調節剤によって調節されてもよいが、緩衝液により調整されることが好ましい。トリス緩衝液、ビス－トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用され、反応時の緩衝液濃度は１０～５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
　本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　本発明の試薬は、標準物質として使用し得るＴＡＴを含んでもよい。ＴＡＴは生体から精製されたＴＡＴでもよいし、遺伝子組み換えなどで合成されたＴＡＴでもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得ることができる。また、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等において、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを混合してＴＡＴを合成することもできる。
実施例１　合成ＴＡＴの調製
　市販のヒトトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）とアンチトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）をＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（－）粉末「ニッスイ（日水製薬株式会社製）」、を９．６ｇ／Ｌで溶解）で希釈し、１：３のモル比で混合後、３７℃で３０分間反応させた。３０分後、ＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル、和光純薬社製）を０．７５ｍＭになるように添加し反応を停止した。
　得られた反応物には未反応のトロンビン、アンチトロンビンが含まれるため、予め５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）によって精製した。
　ＴＡＴ画分はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した後、回収した。得られたＴＡＴは０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈し、ＣＬＥＩＡ試薬（ステイシア(登録商標) ＣＬＥＩＡ　ＴＡＴ、ＬＳＩメディエンス社製）を用いて値付けした。これを合成ＴＡＴとして使用した。
実施例２　抗ＴＡＴ抗体の調製
　細胞融合法は、安藤民衛・岩崎辰夫/著「単クローン抗体/ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社）に従って実施した。
　実施例１で調製した合成ＴＡＴ ５０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）と混合し、投与抗原とした。
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、４週令）に２週間間隔で３回投与し、４回目の投与は半量の２５μｇを静注した。
　１週間後、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３－Ａｇ．８と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メルク社製）を用いて細胞融合を実施した。
　ＨＡＴ選択培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマを合成ＴＡＴに対する結合活性を指標にスクリーニングした。すなわち、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合成ＴＡＴをそれぞれ０．２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製）に５０μＬ／ウェル添加した。４℃、Ｏｖｅｒ　Ｎｉｇｈｔで反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。　次に、培養上清各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。
　３７℃、１時間反応後、同様に５回洗浄しｏ－フェニレンジアミン溶液（和光純薬社製）を各ウェル５０μＬ添加した。室温で５～１０分間反応後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止した。
　プレート分光光度計（ＥＬ３１２ｅ、ＢＩＯ－ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。合成ＴＡＴとの反応が良好な抗体を産生している細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、スクリーニングを行い、合成ＴＡＴと反応する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。
実施例３　抗トロンビン抗体の調製
　実施例２と同様の方法で免疫抗原をトロンビンとして、抗トロンビン抗体を得た。トロンビンに対して特異的に反応する抗体を選択し、このうちの１クローンを抗トロンビン抗体（Ｔ－１）として使用した。
実施例４　間接阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の評価
　間接阻害ＥＬＩＳＡ法によって、各抗体の反応性の評価を行った。間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図を図２に示す。
　評価しようとする０．０４～０．４μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴを認識する抗体（抗ＴＡＴ抗体）候補を阻害抗原（プロトロンビン（エンザイムリサーチ社製）、トロンビン、アンチトロンビン、合成ＴＡＴ）と混合し、インキュベートした。一部阻害された該抗体候補を一次抗体として、９６ウェルプレートに固相化した合成ＴＡＴと結合させた。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を二次抗体として結合させ、発色基質を添加し吸光度を測定した。また、発色の変化率から、抗体の残存率を計算した。
　特定の抗体（ＴＡＴ－５）について、各阻害抗原を用いた時の吸光度を表１に、吸光度から計算された抗体の残存率を表２に示した。
　例えば、ＴＡＴの阻害抗原濃度が１０μｇ／ｍＬの時の残存率は、２８５／１０６６×１００＝２６．７（％）となる。各抗体の各抗原濃度について残存率を算出した。なお、表中において、Ｐｒｏ－Ｔはプロトロンビンを、Ｔはトロンビンを、ＡＴはアンチトロンビンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬで阻害をかけた時の残存率と同等の阻害率となるＴＡＴ抗原量を算出し比較することで、アンチトロンビンに対するＴＡＴの反応性差（倍率）を求めた。この違いが大きければ、アンチトロンビンと比較しＴＡＴに対する特異性が強いこと意味する。計算はＴＡＴの阻害曲線（阻害抗原添加濃度対数-残存率％）を描き、スプライン関数を用いておこなった。
　例えば、ＴＡＴ－５の場合、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬの残存率は、７４．０％でありその残存率と同様となるＴＡＴ抗原量は１．１４４ μｇ／ｍＬである。すなわち、反応性の差は５０／１．１４４＝４４倍となる。（図３）。
　その他、抗体クローン２７種類について上記倍率の計算を行った。添加ＴＡＴとアンチトロンビンの量の違い（倍率）が１００倍以上となる抗体は１３種類、１０００倍以上となる抗体は7種類、１００００倍以上となる抗体は２種類存在した。５種類の抗体について、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例５　ヘパリン添加血漿（モデル検体）における臭化ヘキサジメトリンの効果
　第１試薬：１００ｍＭ　Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ（同仁化学社製）　ｐＨ６．２、７００ｍＭ　ＮａＣｌ（和光純薬社製）、０．０５％　エマルゲン１５０（花王社製）、０．２０％　アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．１５％　ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）、０．０５％　臭化ヘキサジメトリン（シグマアルドリッチ社製）を第１試薬として用いた。また、比較例は上記第１試薬より臭化ヘキサジメトリンを除いたものを用いた。
　第２試薬：ＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体ＴＡＴ－１を吸着したポリスチレンラテックス粒子と、抗トロンビンマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子を、各抗体感作粒子が７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（第２試薬Ａ：ラテックス粒子濃度０．０１％）、もしくはＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子のみを７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（第２試薬Ｂ）をそれぞれ第２試薬として用いた。
　サンプル：ヘパリンナトリウム注「タナベ」（田辺三菱製薬社製）を１または２Ｕ／ｍＬになるように添加した正常ヒトプール血漿またはヘパリン未添加の正常ヒトプール血漿をそれぞれ測定した。
　測定機器：７１７０Ｓ（日立ハイテクノロジーズ社製）
　パラメータ：サンプル量１２μＬ、第１試薬９０μＬ、第２試薬９０μＬ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍに設定し、測光ポイント３４ポイント目の吸光度から２０ポイント目の吸光度を差し引きしたものをΔＡｂｓとして測定を実施した。
　結果・考察
　結果を図４に示す。比較例（臭化ヘキサジメトリンなし）の第１試薬を用いた場合、第２試薬Ａ、Ｂともにヘパリンの濃度依存的な非特異的凝集が同程度認められたのに対し、実施例（臭化ヘキサジメトリンあり）の第１試薬を用いた場合はいずれも凝集を認めなかった。このことから、ヘパリン－アンチトロンビン複合体による非特異的凝集はＴＡＴのアンチトロンビン側を認識する抗体を吸着した粒子により引き起こされ、臭化ヘキサジメトリンを添加することでヘパリン－アンチトロンビン複合体が解消されることが示唆された。
実施例６　臭化ヘキサジメトリン添加量の検討
　第１試薬：臭化ヘキサジメトリン添加量を０～０．０５ｗ／ｖ％の間で変化させたこと以外は実施例５と同様。
　第２試薬：実施例５の第２試薬Ａを用いた。
　サンプル：ヘパリンナトリウム注「タナベ」を２Ｕ／ｍＬ添加した正常ヒトプール血漿またはヘパリンナトリウム注「タナベ」を２Ｕ／ｍＬ添加し、ＴＡＴ濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように血清を添加した正常ヒトプール血漿
　測定機器・パラメータ：実施例５と同様に行った。
　結果・考察：結果を図５、図６に示す。２Ｕ／ｍＬのヘパリンに対し、０．０００５％（終濃度０．０００２％）の臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）添加で効果が認められた。また、０．０５％（終濃度％０．０２３％）添加までヘパリン無添加のベース血漿で臭化ヘキサジメトリンのプラスチャージに由来するラテックス粒子の非特異的凝集が生じないことが確認された。したがって、臭化ヘキサジメトリンは０．０００５％（終濃度０．０００２％）以上が好ましく、０．００５％（終濃度０．００２％）以上がより好ましいことが分かった。
　なお、図６（ａ）に示されるように、ポリカチオンの添加によっても、目的とするＴＡＴ検出反応に大きな影響を及ぼさないことが確認された。図６（ｂ）は、ベースライン付近を拡大した図である。
実施例７　硫酸プロタミンの効果
　第１試薬：臭化ヘキサジメトリンに代えて硫酸プロタミン（和光純薬社製）の添加量を０～０．０１ｗ／ｖ％の間で変化させたこと以外は実施例５と同様に調製した。
　第２試薬：実施例５の第２試薬Ａを用いた。
　サンプル：ヘパリンナトリウム注「タナベ」を２Ｕ／ｍＬ添加した正常ヒトプール血漿　測定機器・パラメータ：実施例５と同様に行った。
　結果・考察
　結果を図７に示す。硫酸プロタミンを添加しなかった場合に比べて、硫酸プロタミンを０．００１％（終濃度０．０００５％）以上添加した場合には、ヘパリン添加血漿の吸光度が大幅に減少し改善が見られた。更に、硫酸プロタミンを０．０１％（終濃度０．００５％）添加した場合には臭化ヘキサジメトリン添加時同様に、ヘパリン添加による非特異的凝集がほぼ抑えられることが確認された。したがって、硫酸プロタミンは０．００１％（終濃度０．０００５％）以上が好ましく、０．０１％（終濃度０．００５％）以上がより好ましいことが分かった。
実施例８　実検体における臭化ヘキサジメトリンの効果
　第１試薬：実施例５と同様。
　第２試薬：実施例５の第２試薬Ａ、Ｂを用いた。
　サンプル：非特異反応が認められたことから、ヘパリン製剤が投与されたと推定される、クエン酸Ｎａ血漿（検体１、２）２検体を用いた。
　測定機器・パラメータ：実施例５と同様に行った。
　結果・考察
　結果を図８に示す。臭化ヘキサジメトリンを添加しないときは第２試薬Ａ、第２試薬Ｂのいずれを用いた場合でも高いシグナルが検出された。一方、臭化ヘキサジメトリンの添加により非特異的凝集が解消され、第２試薬Ａ、すなわち、２種類の抗体を使用した場合にＴＡＴ特異的な検出が可能になった。以上より、実際の血漿検体でも臭化ヘキサジメトリンの効果が確認された。
　以上の通り、検体中でヘパリンがアンチトロンビンと結合することで生じるアンチトロンビン多量体が臭化ヘキサジメトリンなどのポリカチオンにより解離することは本発明者が見出した意外な効果である。ポリカチオンを使用することにより、このような副作用を生じることなく、ヘパリンによる影響のみを回避してＴＡＴを正確に測定することが可能となった。

Claims (8)

  1. 　被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、ポリカチオンを含むことを特徴とする、試薬。
  2. 　前記被検者がヘパリン投与された患者である、請求項１に記載の試薬。
  3. 　前記ポリカチオンが、臭化ヘキサジメトリン、キトサン類、変性デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシメチルセルローストリメチルアミン、リゾチーム、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、硫酸プロタミン、ヒドロキシエチルセルローストリメチルアミン、ヘパリン結合タンパク質、ポリアリルアミン、塩酸ポリアリルアミン、ポリ（ジアリルジアルキルアミン）、ポリアミドアミン、ポリアミン、塩化ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリプロピルエチレンイミン、ポリイミダゾリン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリ（アクリルアミド／臭化メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウム）、ポリ（塩化ジアリールジメチルアンモニウム／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ジメチルアミノエチルアクリレート／アクリルアミド）、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエピクロルヒドリン、ポリエチレンイミノエピクロルヒドリン、臭化ポリメタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化ヒドロキシプロピルメタクリロイルオキシエチルジメチルアンモニウム、ポリ（メチルジエチルアミノエチルメタクリレート／アクリルアミド）、ポリ（メチル／グアニジン）、臭化ポリメチルビニルピリジニウム、ポリ（ビニルピロリドン－ジメチルアミノエチルメタクリレート）および臭化ポリビニルメチルピリジニウムからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の試薬。
  4. 　前記ポリカチオンが臭化ヘキサジメトリン、ポリエチレンイミン、ポリプロピルエチレンイミンなどのポリアルキレンアミン、硫酸プロタミン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびアミノデキストランからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の試薬。
  5. 　前記試薬が、ラテックスに結合したアンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１抗ＴＡＴ抗体と、ラテックスに結合したトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２抗ＴＡＴ抗体とを含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の試薬。
  6. 　前記第１抗ＴＡＴ抗体が、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体である、請求項５に記載の試薬。
  7. 　被検者由来の血液試料中に存在するＴＡＴを測定する方法であって、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の試薬を用いてラテックス凝集法を行うことによりＴＡＴを測定することを特徴とする方法。
  8. 　前記被検者がヘパリン投与された患者である、請求項７に記載の方法。
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