JPS62138187A - 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 - Google Patents
抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法Info
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- JPS62138187A JPS62138187A JP60279129A JP27912985A JPS62138187A JP S62138187 A JPS62138187 A JP S62138187A JP 60279129 A JP60279129 A JP 60279129A JP 27912985 A JP27912985 A JP 27912985A JP S62138187 A JPS62138187 A JP S62138187A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
この発明は、新規なモノクローナル抗体に関するもので
ある。さらに詳細には、抗アンチトロンビン■−トロン
ビン複合体・モノクローナル抗体に関するものであり、
それらのモノクローナル抗体は血漿中あるいは血清中ア
ンチトロンビン■・トロンビン複合体の免疫定量法のた
めの試薬およびアンチトロンビン■・トロンビン複合体
のアフィニティー・カラムクロマトグラフィーのだめの
免疫吸着剤として有用でおる。
ある。さらに詳細には、抗アンチトロンビン■−トロン
ビン複合体・モノクローナル抗体に関するものであり、
それらのモノクローナル抗体は血漿中あるいは血清中ア
ンチトロンビン■・トロンビン複合体の免疫定量法のた
めの試薬およびアンチトロンビン■・トロンビン複合体
のアフィニティー・カラムクロマトグラフィーのだめの
免疫吸着剤として有用でおる。
[従来の技術]
遊離アンチトロンビン■(以下ATIIIと称す)ある
いは遊離トロンビンとは反応せず、ATI・トロンビン
複合体に特異的に反応する抗ATII[・トロンビン・
モノクローナルを分泌する/・イフIJ トーマは従来
存在せず、本発明において初めて得られたものである。
いは遊離トロンビンとは反応せず、ATI・トロンビン
複合体に特異的に反応する抗ATII[・トロンビン・
モノクローナルを分泌する/・イフIJ トーマは従来
存在せず、本発明において初めて得られたものである。
「発明が解決しようとする問題点」
本発明者等は、血漿あるいは血清中に存在するATII
I・トロンビン複合体の同定定量に用いられていた従来
の免疫電気泳動法における測定に長時間を要し、検出感
度が低いという欠点を解消すべく種々研究を行ない、A
TIIIとトロンビンが複合体を形成することによって
生ずる新しい抗原決定基を認識するモノクローナル抗体
を産生、分泌するハイブリドーマを得、本発明を完成さ
せるに至った。
I・トロンビン複合体の同定定量に用いられていた従来
の免疫電気泳動法における測定に長時間を要し、検出感
度が低いという欠点を解消すべく種々研究を行ない、A
TIIIとトロンビンが複合体を形成することによって
生ずる新しい抗原決定基を認識するモノクローナル抗体
を産生、分泌するハイブリドーマを得、本発明を完成さ
せるに至った。
「問題点を解決するだめの手段」
すなわち、本発明はアンチトロンビン■・トロンビン複
合体で免疫した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアン
チトロンビ/■・トロンビン複合体モノクローナル抗体
産生性のハイブリドーマクローンである。
合体で免疫した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアン
チトロンビ/■・トロンビン複合体モノクローナル抗体
産生性のハイブリドーマクローンである。
更Vc本%明Fiアンチトロンビン■・トロンビン複合
体と反応し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロン
ビンIIIとは反応しない抗原抗体反応特異性を有する
アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体である。
体と反応し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロン
ビンIIIとは反応しない抗原抗体反応特異性を有する
アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体である。
更ニ本発明ハアンチトロンビン■・トロンビン複合体モ
ノクローナル抗体の1種または2種以上を使用すること
を特徴とするアンチトロンビン■・トロンビン複合体の
免疫定量法である。
ノクローナル抗体の1種または2種以上を使用すること
を特徴とするアンチトロンビン■・トロンビン複合体の
免疫定量法である。
また、本発明はアンチトロンビン■・トロンビン複合体
モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィ
ーの免疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチト
ロンビン■・トロンビン複合体の精製法である。
モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィ
ーの免疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチト
ロンビン■・トロンビン複合体の精製法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
抗ATIII −)ロンビン複合体モノクローナル抗体
は新規なマウス・ノ・イブリドーマをそれぞれ培地また
はマウスの腹腔内で培養することによって製造できる。
は新規なマウス・ノ・イブリドーマをそれぞれ培地また
はマウスの腹腔内で培養することによって製造できる。
ここで用いるマウス・ハイブリドーマは一般的ICハA
TIII・トロンビン複合体で免疫したマウスの膵臓細
胞とマウス骨髄肺細胞とを、K6hler およびM
ilstein の細胞融合の基本方法(natur
e第256巻495頁(1975年)参照〕により細胞
融合して製造することが可能である。詳細には、下記実
施例に述べる如くである。
TIII・トロンビン複合体で免疫したマウスの膵臓細
胞とマウス骨髄肺細胞とを、K6hler およびM
ilstein の細胞融合の基本方法(natur
e第256巻495頁(1975年)参照〕により細胞
融合して製造することが可能である。詳細には、下記実
施例に述べる如くである。
まだ、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適(−た培地であればよく、好
適にはダルベツコ氏変法イーグル氏最小必須培地(Du
lbeccoQ m0dified Eeagle%m
tnimum es+sent1ml medium以
下DMEと記す。)にウシ胎児血清、L−グルタミン、
L−ピルビン酸および抗生物質(ペニシリンGとストレ
プトマイシン)を含む培地が用いられる。
ハイブリドーマの培養に適(−た培地であればよく、好
適にはダルベツコ氏変法イーグル氏最小必須培地(Du
lbeccoQ m0dified Eeagle%m
tnimum es+sent1ml medium以
下DMEと記す。)にウシ胎児血清、L−グルタミン、
L−ピルビン酸および抗生物質(ペニシリンGとストレ
プトマイシン)を含む培地が用いられる。
上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合に
は51 Co2濃度、37℃で約3日間、またマウスの
腹腔内で培養する場合には約14日間で行なわれる。
は51 Co2濃度、37℃で約3日間、またマウスの
腹腔内で培養する場合には約14日間で行なわれる。
このようにして製造された培養液またはマウスの腹水か
ら5蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。
ら5蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩グルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩グルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
このようにして得られた抗ATI[I・トロンビン複合
体モノクローナル抗体は、遊離のATIIIあるいはト
ロンビン、!: id結合シナいで、 ATIII −
)ロンビン複合体とだけ結合する能力を有し、ATTI
・トロンビン複合体の免疫定量用の試薬としておよびA
TTf[・トロンビン複合体の精製に用いる免疫吸着剤
として有用である。
体モノクローナル抗体は、遊離のATIIIあるいはト
ロンビン、!: id結合シナいで、 ATIII −
)ロンビン複合体とだけ結合する能力を有し、ATTI
・トロンビン複合体の免疫定量用の試薬としておよびA
TTf[・トロンビン複合体の精製に用いる免疫吸着剤
として有用である。
この発明の抗ATII・トロンビン複合体モノクローナ
ル抗体(例えば後述の実施例で得られたAT−1、AT
−2、AT −3、AT −4およびAT−5)は酵
素免疫定量法(EIA )あるいは放射能免疫定量法(
RIA )における試薬として使用できる。酵素免疫定
量法としては、マイクロタイターあるいはグラスチック
チューブを用いるワン串ステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の
具体例は下記実施例7に示す通りであるが、一般的には
、ATm・トロンビン複合体の互いに異なった抗原決定
基を認識する2種類の抗ATI[I・トロンビン複合体
モノクローナル抗体を用いて行ない、まず、マイクロタ
イター・グレートの穴(ウェル)あるいはグラスチック
チューブを前もって1棟類の抗体(例えばAT−1)で
感作させておき、次に、この穴あるいはグラスチックチ
ューブにATIrl・トロンビン複合体を含む被検体お
よび酵素標識した別種の抗体(例えば、AT −2)の
溶液を入れ、約30分間静置後洗浄し、酵素基質溶液を
加えて30分間程度酵素反応を行なう。
ル抗体(例えば後述の実施例で得られたAT−1、AT
−2、AT −3、AT −4およびAT−5)は酵
素免疫定量法(EIA )あるいは放射能免疫定量法(
RIA )における試薬として使用できる。酵素免疫定
量法としては、マイクロタイターあるいはグラスチック
チューブを用いるワン串ステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の
具体例は下記実施例7に示す通りであるが、一般的には
、ATm・トロンビン複合体の互いに異なった抗原決定
基を認識する2種類の抗ATI[I・トロンビン複合体
モノクローナル抗体を用いて行ない、まず、マイクロタ
イター・グレートの穴(ウェル)あるいはグラスチック
チューブを前もって1棟類の抗体(例えばAT−1)で
感作させておき、次に、この穴あるいはグラスチックチ
ューブにATIrl・トロンビン複合体を含む被検体お
よび酵素標識した別種の抗体(例えば、AT −2)の
溶液を入れ、約30分間静置後洗浄し、酵素基質溶液を
加えて30分間程度酵素反応を行なう。
反応終了後、比色法等により、被検体中のATIIII
・トロンビン複合体の量を定量することにより行なうこ
とが可能である。
・トロンビン複合体の量を定量することにより行なうこ
とが可能である。
また、この発明の抗ATI・トロンビンモノクローナル
抗体をATIrl・トロンビン複合体の精製に使用でき
る。まず、抗ATITI*トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体(AT−1、AT −2、AT −3、AT
−4またHAT−5)をシアン化臭素・活性化セファロ
ース4Bと常法により反応させ、該AT−1,AT−2
゜AT −3、AT −4またはAT −5結合セファ
ロース4Bを調製し、これを用いて、カラム法兼たけパ
ッチ法でATI[l・トロンビン複合体を常法によって
精製すればよい。
抗体をATIrl・トロンビン複合体の精製に使用でき
る。まず、抗ATITI*トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体(AT−1、AT −2、AT −3、AT
−4またHAT−5)をシアン化臭素・活性化セファロ
ース4Bと常法により反応させ、該AT−1,AT−2
゜AT −3、AT −4またはAT −5結合セファ
ロース4Bを調製し、これを用いて、カラム法兼たけパ
ッチ法でATI[l・トロンビン複合体を常法によって
精製すればよい。
「実施例」
次にこの発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例I
ATIII・トロンビン複合体の調製:ATI[I・ト
ロンビン複合体の調製は次のような操作で行なった。精
製したトロンビン5■(0,5■/−のトロンビン溶液
、、10 m!/)と精製したATII 15■(5m
y、/rlのATIII溶液、 31R1)を混合シ(
モル比1:2)37℃で1時間反応後、1Mのジイソプ
ロピルフルオロリン酸溶液を13WLt反応液に添加す
ることによって反応を停止させる。この混合液を前もっ
て0.1 M N5CLを含む20 mM )リス塩酸
緩衝液−7,4で平衡化したヘパリン−セファロースカ
ラム(カラム容量10011)に充填する。このカラム
を上記の緩衝液約400m1で洗浄後、Q、l M N
aCtを含む20mM )リス塩酸緩衝液(p)17.
4)と0.5M NaC1を含む20mM)IJス塩酸
緩衝液(pf(7,4)による直線濃度勾配によって溶
離する。溶出液は、5af!づつ集めた。SDSディス
ク電気泳動法によって複合体の含まれている分画を測定
したATITI・トロンビン複合体が含まれている分画
数6l−12Jを集め、50mMNa C1を含む20
mM)IJス塩酸緩衝液で透析する。
ロンビン複合体の調製は次のような操作で行なった。精
製したトロンビン5■(0,5■/−のトロンビン溶液
、、10 m!/)と精製したATII 15■(5m
y、/rlのATIII溶液、 31R1)を混合シ(
モル比1:2)37℃で1時間反応後、1Mのジイソプ
ロピルフルオロリン酸溶液を13WLt反応液に添加す
ることによって反応を停止させる。この混合液を前もっ
て0.1 M N5CLを含む20 mM )リス塩酸
緩衝液−7,4で平衡化したヘパリン−セファロースカ
ラム(カラム容量10011)に充填する。このカラム
を上記の緩衝液約400m1で洗浄後、Q、l M N
aCtを含む20mM )リス塩酸緩衝液(p)17.
4)と0.5M NaC1を含む20mM)IJス塩酸
緩衝液(pf(7,4)による直線濃度勾配によって溶
離する。溶出液は、5af!づつ集めた。SDSディス
ク電気泳動法によって複合体の含まれている分画を測定
したATITI・トロンビン複合体が含まれている分画
数6l−12Jを集め、50mMNa C1を含む20
mM)IJス塩酸緩衝液で透析する。
次にまえもって50 mM NaCtを含む20 mM
トリス塩酸緩衝液で平衡化しであるDEAE−セファ
セルカラム(カラム容−M5 (1/ 、ファルマシャ
社製、スウェーデン)に充填する。乙のカラムを上記の
緩衝液約200 mlで洗浄した後、0.05 M N
aC1を含むトリス塩酸緩衝液(pH7,4)と0.5
M NaC1を含むトリス塩酸緩衝液による直線濃度
勾配によって溶離する。溶出液は、2 wrlづつ集め
た。上記の方法で測定したATIII・トロンビン複合
体の含まれている分画を集め、限外口過法によって濃縮
し、A280nm=1.0のAT[l・トロンビン複合
体5 mlを得た。とのようにして得たATIII・ト
ロンビン複合体溶液は、免疫原として、寸た抗A、TT
II・トロンビン複合体抗体産生性ハイブリドーマを選
別するためのELISA用抗原として使用する。
トリス塩酸緩衝液で平衡化しであるDEAE−セファ
セルカラム(カラム容−M5 (1/ 、ファルマシャ
社製、スウェーデン)に充填する。乙のカラムを上記の
緩衝液約200 mlで洗浄した後、0.05 M N
aC1を含むトリス塩酸緩衝液(pH7,4)と0.5
M NaC1を含むトリス塩酸緩衝液による直線濃度
勾配によって溶離する。溶出液は、2 wrlづつ集め
た。上記の方法で測定したATIII・トロンビン複合
体の含まれている分画を集め、限外口過法によって濃縮
し、A280nm=1.0のAT[l・トロンビン複合
体5 mlを得た。とのようにして得たATIII・ト
ロンビン複合体溶液は、免疫原として、寸た抗A、TT
II・トロンビン複合体抗体産生性ハイブリドーマを選
別するためのELISA用抗原として使用する。
実施例2
(&)免疫化した肺臓細胞の調製:
上記のATIII・トロンビン複合体免疫原溶液(A2
80nm=0.1 )を等量のフロイント氏完全アジェ
パントと乳化するまで混合し、その混合液200μlを
マウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった(第
1回免疫)。30日経過後、該マウスに上記の同様の方
法でマウス腹腔内に投与した(第2同免疫)。第2回免
疫から21日経過後、ATIII・トロンビン複合体免
疫原溶液(A280nm=0.1)を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液200μlを、該マウスの静脈内
に投与した(最終免疫)。最終免疫から3日経過後、肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
80nm=0.1 )を等量のフロイント氏完全アジェ
パントと乳化するまで混合し、その混合液200μlを
マウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった(第
1回免疫)。30日経過後、該マウスに上記の同様の方
法でマウス腹腔内に投与した(第2同免疫)。第2回免
疫から21日経過後、ATIII・トロンビン複合体免
疫原溶液(A280nm=0.1)を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液200μlを、該マウスの静脈内
に投与した(最終免疫)。最終免疫から3日経過後、肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
(b) 細胞融合:
無菌的に摘出した上記の肺臓を、10〜15%ウシ胎児
血清を含むDME培地5dを入れたシャーレに入れる。
血清を含むDME培地5dを入れたシャーレに入れる。
次に、肺臓を10〜15%ウシ胎児血清を含むDMIE
培地約15i/T還流して牌細胞を流出させた後、この
牌細胞懸濁液をナイロンメツシーに通す。この牌細胞を
50IIIl遠心チ、−ブに集めて500XP、10分
間遠心する。こうして得たペレットに3〜5 mAのへ
モライジング溶液(155mMNHaC1、10mM
KHCO,、1mM Na2EDTA pH7,O)を
加え、懸濁させる。0℃で5〜10分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。10〜20mの10〜15
%ウシ胎児血清を含むDME培地を加えてから遠心分離
する。このようK L、て得た細胞ペレットをDME培
地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細胞数を測定
する。
培地約15i/T還流して牌細胞を流出させた後、この
牌細胞懸濁液をナイロンメツシーに通す。この牌細胞を
50IIIl遠心チ、−ブに集めて500XP、10分
間遠心する。こうして得たペレットに3〜5 mAのへ
モライジング溶液(155mMNHaC1、10mM
KHCO,、1mM Na2EDTA pH7,O)を
加え、懸濁させる。0℃で5〜10分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。10〜20mの10〜15
%ウシ胎児血清を含むDME培地を加えてから遠心分離
する。このようK L、て得た細胞ペレットをDME培
地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細胞数を測定
する。
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞(ミニo−
−r細胞)SP210−Ag 14約2 X 107個
に1X10個の上記牌細胞を加え、DME培地中でよく
混合し、遠心分離を行なった( 500X島10 M4
)。
−r細胞)SP210−Ag 14約2 X 107個
に1X10個の上記牌細胞を加え、DME培地中でよく
混合し、遠心分離を行なった( 500X島10 M4
)。
その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし。
38℃に保温しておいた40チポリエチレングリコール
4000溶液0.5献を滴下し、遠心チー−ブを手で、
1分間穏やかに回転することによってポリエチレングリ
コール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、38℃
に保温しておいたDME培地を、30秒毎に1−加えて
チューブを穏やかに回転させる。この操作を10回繰り
返した後、20〜30dの10〜15%ウシ胎児血清を
含むDME培地を加えて、遠心分離(500Xp、10
分間)を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを
10〜15%ウシ胎児血清を含むHAT培地(DME培
地にアミノブチ’) 74X10 ’M 、 チミジン
1.6 X 10 ”’M。
4000溶液0.5献を滴下し、遠心チー−ブを手で、
1分間穏やかに回転することによってポリエチレングリ
コール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、38℃
に保温しておいたDME培地を、30秒毎に1−加えて
チューブを穏やかに回転させる。この操作を10回繰り
返した後、20〜30dの10〜15%ウシ胎児血清を
含むDME培地を加えて、遠心分離(500Xp、10
分間)を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを
10〜15%ウシ胎児血清を含むHAT培地(DME培
地にアミノブチ’) 74X10 ’M 、 チミジン
1.6 X 10 ”’M。
ヒポキサンチンlXl0 Mになるように添加したも
の)で、遠心法によって2回洗浄後、40dの上記HA
T培地に懸濁する。この細胞懸濁液を96ウエル細胞培
養グレートの各ウェルに200μlずつ分注し、37℃
、5%炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した
。培養中、2〜3日間隔で各ウェルの培地を約100μ
l除き、新たに上記のHAT培地を100μl加えるこ
とによりHAT培地中で増殖するハイブリドーマを選択
した。8日目頃から10〜15%ウシ胎児血清を含むH
T 培地(DME培地にチミジン1.6X10−5M、
ヒポキサンチンlXl0 ’Mになるように添加したも
の)に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約10回目に、下達のELISA法により、抗AT
TII )ロンビン複合体抗体産生ハイブリドーマをス
クリー・ニングした。
の)で、遠心法によって2回洗浄後、40dの上記HA
T培地に懸濁する。この細胞懸濁液を96ウエル細胞培
養グレートの各ウェルに200μlずつ分注し、37℃
、5%炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した
。培養中、2〜3日間隔で各ウェルの培地を約100μ
l除き、新たに上記のHAT培地を100μl加えるこ
とによりHAT培地中で増殖するハイブリドーマを選択
した。8日目頃から10〜15%ウシ胎児血清を含むH
T 培地(DME培地にチミジン1.6X10−5M、
ヒポキサンチンlXl0 ’Mになるように添加したも
の)に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約10回目に、下達のELISA法により、抗AT
TII )ロンビン複合体抗体産生ハイブリドーマをス
クリー・ニングした。
(c) ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養土清栄の産生抗体の有無はELIS
A法により測定した。96ウエルELISA用グレー)
(Immulon H,日本グイナテック株式会社)
の各ウェルに、前述の精製AT■・l・ロンビン複合体
溶液(A 280 nm =0.05 p生理食塩水で
希釈した。)を50μlずつ分注し、25℃で2時間放
置した。
A法により測定した。96ウエルELISA用グレー)
(Immulon H,日本グイナテック株式会社)
の各ウェルに、前述の精製AT■・l・ロンビン複合体
溶液(A 280 nm =0.05 p生理食塩水で
希釈した。)を50μlずつ分注し、25℃で2時間放
置した。
次に、0.05% Tween 20−生理食塩水で3
回洗浄した後、各ウェルに培養上清を50μl加え、2
5℃で1時間反応させた。
回洗浄した後、各ウェルに培養上清を50μl加え、2
5℃で1時間反応させた。
次にTween 20−生理食塩水で200倍希釈した
にルオキシターゼ結合抗マウス抗体(ダコ社、デンマー
ク)50μlを各ウェルに加えた。反応終了後、0.0
5%Tvreen20−生理食塩水で各ウェルを3回洗
浄し、0.5mMアミノアンチピリン、10mMフエ5
ノールおよび0.005%過酸化水素水を含む溶液25
0μlを各ウェルに加え、25℃で30分間反応させ各
ウェルの4.90 nmにおける吸光度を測定した。
にルオキシターゼ結合抗マウス抗体(ダコ社、デンマー
ク)50μlを各ウェルに加えた。反応終了後、0.0
5%Tvreen20−生理食塩水で各ウェルを3回洗
浄し、0.5mMアミノアンチピリン、10mMフエ5
ノールおよび0.005%過酸化水素水を含む溶液25
0μlを各ウェルに加え、25℃で30分間反応させ各
ウェルの4.90 nmにおける吸光度を測定した。
その結果、192ウエル中23ウエルに抗体産生が認め
られた。
られた。
上記のELISA法によって認められた培養上清中の抗
ATII・トロンビン複合体抗体が、ATIIIおよび
トロンビンと反応するか否かを、ATII[あるいはト
ロンビンを感作した96ウエルELISA 用fレート
を用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、AT
I[I・トロンビン複合体と反応した23ウエルの培養
上清中、18ウエルの培養上清がATIrlとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ATII・トロンビン複合体抗体が、ATIIIおよび
トロンビンと反応するか否かを、ATII[あるいはト
ロンビンを感作した96ウエルELISA 用fレート
を用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、AT
I[I・トロンビン複合体と反応した23ウエルの培養
上清中、18ウエルの培養上清がATIrlとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
AT■およびトロンビンとは反応しないで、AT■・ト
ロンビン複合体のみに特異的に反応する5ウエル中のハ
イブリドーマは24ウエルプレートに移し、10〜15
%ウシ胎児血清を含むHT 培養で4〜5日間培養した
。その後、再度ELISA法によって“抗AT■・トロ
ンビン複合体特異的抗体“の産生の有無を確認してから
限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、I
(T 培地でハイプリドーマが5個/献となるように希
釈し死細胞浮遊液を、予め正常BALB/C系マウスの
腹腔細胞がウェルあたり2×10 個分注しである96
ウエルプレートの各ウェルに100μtずつ分注した。
ロンビン複合体のみに特異的に反応する5ウエル中のハ
イブリドーマは24ウエルプレートに移し、10〜15
%ウシ胎児血清を含むHT 培養で4〜5日間培養した
。その後、再度ELISA法によって“抗AT■・トロ
ンビン複合体特異的抗体“の産生の有無を確認してから
限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、I
(T 培地でハイプリドーマが5個/献となるように希
釈し死細胞浮遊液を、予め正常BALB/C系マウスの
腹腔細胞がウェルあたり2×10 個分注しである96
ウエルプレートの各ウェルに100μtずつ分注した。
約10日後、 ELISA法によって抗A、Tll・ト
ロンビン複合体特異的抗体を産生するハイシリドーマの
クローンをスクリーニングした。その結果、各ハイプリ
ドーマにつき、20−40個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分
泌能の高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様
の方法で再クローン化を行い。
ロンビン複合体特異的抗体を産生するハイシリドーマの
クローンをスクリーニングした。その結果、各ハイプリ
ドーマにつき、20−40個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分
泌能の高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様
の方法で再クローン化を行い。
゛抗ATI・トロンビン複合体特異的抗体産生〕・イブ
リドーマAT−1、AT−2、AT−3、AT−4およ
びAT−5を樹立した。
リドーマAT−1、AT−2、AT−3、AT−4およ
びAT−5を樹立した。
実験例3(モノクローナル抗体の製造)(イン・ビトロ
法) マウスハイブリドーマAT−1、AT−2、AT−3゜
AT−4およびAT−5をそれぞれ15%ウシ胎児崩清
を含むDME培地中で37℃%5%二酸化炭素雰囲気中
72〜96時間培養した。培養物を遠心分離後(100
OOXP、 10分)後、上清に固形の硫酸アンモニウ
ムを50%最終濃度となるように徐々に加えた。混合物
を水冷下30分間攪拌した後60分間放置し、遠心分離
(1ooooxy、io分)後、得られた沈渣を少量の
107リン酸緩衝液(F’(8,0)に溶解し、100
0倍量の1. Q mM +)ン酸緩衝液に対して透析
した。これを、10 mM IJン酸緩衝液ですでに平
衡化したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液(P)
(8,0)と0.2 M NaClを含む10mMリン
酸緩衝液(pi−18,0)の間で濃度勾配法により行
なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で
濃縮し、0.1 M IJン酸緩衝液(pi(8,0)
に対して透析した。ウシ血清1pG を除くために、透
析物をやぎ抗ウシ血清17G−セファロース4Bのカラ
ムに通した。次に通過液をO,]、 M IJン酸緩衝
液(pH8,0)で平衡化したプロティンA−セファロ
ース4Bのカラムに充填した。カラムを−43,5の緩
衝液で溶出して、精製した抗ATIII・トロンビン複
合体特異抗体AT −1(同様にしてAT−2、AT−
3、AT−4 、 AT −5)の溶液を得た。
法) マウスハイブリドーマAT−1、AT−2、AT−3゜
AT−4およびAT−5をそれぞれ15%ウシ胎児崩清
を含むDME培地中で37℃%5%二酸化炭素雰囲気中
72〜96時間培養した。培養物を遠心分離後(100
OOXP、 10分)後、上清に固形の硫酸アンモニウ
ムを50%最終濃度となるように徐々に加えた。混合物
を水冷下30分間攪拌した後60分間放置し、遠心分離
(1ooooxy、io分)後、得られた沈渣を少量の
107リン酸緩衝液(F’(8,0)に溶解し、100
0倍量の1. Q mM +)ン酸緩衝液に対して透析
した。これを、10 mM IJン酸緩衝液ですでに平
衡化したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液(P)
(8,0)と0.2 M NaClを含む10mMリン
酸緩衝液(pi−18,0)の間で濃度勾配法により行
なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で
濃縮し、0.1 M IJン酸緩衝液(pi(8,0)
に対して透析した。ウシ血清1pG を除くために、透
析物をやぎ抗ウシ血清17G−セファロース4Bのカラ
ムに通した。次に通過液をO,]、 M IJン酸緩衝
液(pH8,0)で平衡化したプロティンA−セファロ
ース4Bのカラムに充填した。カラムを−43,5の緩
衝液で溶出して、精製した抗ATIII・トロンビン複
合体特異抗体AT −1(同様にしてAT−2、AT−
3、AT−4 、 AT −5)の溶液を得た。
(インービが法)
グリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン)0.5肩lを10〜12週齢のBALB /
C系マウスの腹腔内に投与後14−20目目のマウス腹
腔内にインビトロで増殖させたハイプリドーマAT−1
、AT−2,AT−3,AT−4,せプζはAT−5を
マウス−匹あたり2X106細胞となるように接種した
。
デカン)0.5肩lを10〜12週齢のBALB /
C系マウスの腹腔内に投与後14−20目目のマウス腹
腔内にインビトロで増殖させたハイプリドーマAT−1
、AT−2,AT−3,AT−4,せプζはAT−5を
マウス−匹あたり2X106細胞となるように接種した
。
各ハイプリドーマにつき一匹のマウスから約10〜15
=の腹水が得られた。その抗体濃度は、2〜10m9
/HAであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、(但し、ヤギ抗ウシ血清17G−セファロース4Bの
カラムを通す操作を除く。)上記のインビトロ稍製法と
同様の方法で行なった。
=の腹水が得られた。その抗体濃度は、2〜10m9
/HAであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、(但し、ヤギ抗ウシ血清17G−セファロース4Bの
カラムを通す操作を除く。)上記のインビトロ稍製法と
同様の方法で行なった。
実験例4(モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定) 抗ATII・トロンビン複合体特異モノクローナル抗体
AT −1、AT −2、AT −3、AT −4およ
びAT −5の免疫グロブリン・クラスおよび特異性の
同定はそれぞれオフテロニー免疫拡散法およびエンザイ
ムと18) イムノアッセイ法により行った。結果は表1及び第1〜
5図にしめす通りである。
および特異性の同定) 抗ATII・トロンビン複合体特異モノクローナル抗体
AT −1、AT −2、AT −3、AT −4およ
びAT −5の免疫グロブリン・クラスおよび特異性の
同定はそれぞれオフテロニー免疫拡散法およびエンザイ
ムと18) イムノアッセイ法により行った。結果は表1及び第1〜
5図にしめす通りである。
表 1
実施例5(アフニテイクロマトグラフイー)精製された
抗ATIII・トロンビン複合体特異モノクローナル抗
体AT−1(またはAT −2、AT −3。
抗ATIII・トロンビン複合体特異モノクローナル抗
体AT−1(またはAT −2、AT −3。
AT −4、AT −5) 4 WをCNBr活性化セ
ファ o−ス4B11R1に結合させたものを免疫吸着
剤として使用した。「実施例1」の方法で精製したAT
III 、 )ロンビンあるいはATIII・トロンビ
ン複合体混合溶液をAT−1(あるいはAT = 2
、 AT −3、AT −4、AT −5)結合セファ
ロース4B(1,01))カラムに充填し、次に、0.
15M NaC1を含む0.1.Mリン酸緩衝液(pH
8,0)で洗浄する。ATIIIとトロンビンは、この
洗浄液中に100%回収された。一方、カラムに吸着さ
れたATIII・トロンビン複合体を次の溶出溶媒で溶
出を試みた。
ファ o−ス4B11R1に結合させたものを免疫吸着
剤として使用した。「実施例1」の方法で精製したAT
III 、 )ロンビンあるいはATIII・トロンビ
ン複合体混合溶液をAT−1(あるいはAT = 2
、 AT −3、AT −4、AT −5)結合セファ
ロース4B(1,01))カラムに充填し、次に、0.
15M NaC1を含む0.1.Mリン酸緩衝液(pH
8,0)で洗浄する。ATIIIとトロンビンは、この
洗浄液中に100%回収された。一方、カラムに吸着さ
れたATIII・トロンビン複合体を次の溶出溶媒で溶
出を試みた。
a) 4.5M Mgcz2(pH7,5)b)リ
ン酸−クエン酸、 p112.8C)グリシン/ HC
t、 pH2,5d)3Mチオシアン酸カリウム溶液 ATI・トロンビンを含有する自分を、0.15MNa
C1を含む0.1Mリン酸緩衝液(pl(8,0)に対
して透析後、各画分のATTO・トロンビン複合体の含
量を定量した。結果を第2表に示す。
ン酸−クエン酸、 p112.8C)グリシン/ HC
t、 pH2,5d)3Mチオシアン酸カリウム溶液 ATI・トロンビンを含有する自分を、0.15MNa
C1を含む0.1Mリン酸緩衝液(pl(8,0)に対
して透析後、各画分のATTO・トロンビン複合体の含
量を定量した。結果を第2表に示す。
実施例6(ラテックススライド凝集免疫定量法)抗AT
II[・トロンビン複合体特異的モノクローナル抗体に
よるラテックス(日本合成ゴム社製、0.497μrn
)の感作は次のような操作で行なった。
II[・トロンビン複合体特異的モノクローナル抗体に
よるラテックス(日本合成ゴム社製、0.497μrn
)の感作は次のような操作で行なった。
5種類のモノクローナル抗体AT −1、AT −2。
AT−3,AT−4,AT−5、各々の濃度が0.11
■/mの溶液10−に、ラテックス濃度が1%(W/v
)になるように、ラテックスを加え、25℃で1時間激
しく攪拌する。次に、牛アルブミン溶液(10■/ r
trl )をQ、 2ml添加し、25℃で30分間激
しく攪拌後、遠心分離(20,000X S’ 、 3
0分間)を行なう。
■/mの溶液10−に、ラテックス濃度が1%(W/v
)になるように、ラテックスを加え、25℃で1時間激
しく攪拌する。次に、牛アルブミン溶液(10■/ r
trl )をQ、 2ml添加し、25℃で30分間激
しく攪拌後、遠心分離(20,000X S’ 、 3
0分間)を行なう。
沈渣を50m/の水に懸濁し、抗ATIII・トロンビ
ン複合体特異的モノクローナル抗体感作ラテツクスとし
て以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
ン複合体特異的モノクローナル抗体感作ラテツクスとし
て以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
スライド凝集板の各ウェルに感作ラテツクス(0,2%
)25μlを添加し、次に、生理食塩水による2倍希釈
列の被検体25μlを加える。このスライド凝集板を1
00回転/分で1分間回転させ、各ウェルの凝集の有無
を測定する。被検体中のATI・トロンビン複合体の量
は同時に測定した、2倍希釈列の検量用複合体によるラ
テックス凝集反応の有無から求める。
)25μlを添加し、次に、生理食塩水による2倍希釈
列の被検体25μlを加える。このスライド凝集板を1
00回転/分で1分間回転させ、各ウェルの凝集の有無
を測定する。被検体中のATI・トロンビン複合体の量
は同時に測定した、2倍希釈列の検量用複合体によるラ
テックス凝集反応の有無から求める。
実施例7(ワン・ステッf−サンドイッチ酵素免疫定量
法) 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ATI・トロンビン
複合体モノクローナル抗体AT−1に結合させる方法は
ナカネおよびカワオイ(ジャナル・オプ・ヒストケミス
トリ一番アンド・サイトケミストリー第22巻第108
4〜1o91頁(1,974年))の方法に準じて行な
った。この酵素ラベル抗体を用いてATI[[・トロン
ビン複合体のワン・ステッノ・サンドイッチ酵素免疫定
量を次のようにして行なった。
法) 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ATI・トロンビン
複合体モノクローナル抗体AT−1に結合させる方法は
ナカネおよびカワオイ(ジャナル・オプ・ヒストケミス
トリ一番アンド・サイトケミストリー第22巻第108
4〜1o91頁(1,974年))の方法に準じて行な
った。この酵素ラベル抗体を用いてATI[[・トロン
ビン複合体のワン・ステッノ・サンドイッチ酵素免疫定
量を次のようにして行なった。
モノクローナル抗体AT−2を20mM炭酸緩衝液中に
10μy−/1の濃度にした溶液を96ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに100μ)
入れて25℃で30分間静置した。そのプレートを0.
05%Tween −20を含む生理食塩水で3回洗浄
した。このようにして抗体を感作したプレートのウェル
に50μlの被検体および上記で調製したベルオキシタ
ーゼ標識抗体、0.15MNactおよび2%ウシアル
ブミンを包む20mMリン酸緩衝液(声8.0)100
μlを加えた。25℃で30分間静置後、グレートを0
゜05%Tween −20を含む生理食塩水で3回洗
浄した。次いで、酵素基質液(10城フエノール、20
mM4−アミノアンチピリンおよび0.005%過酸化
水素を含む液)200μlずつをグレートのそれぞれの
ウェルに添加した。25℃で、30分間反応佼、各ウェ
ルの液の490 nmにおける吸光度をMP −590
型マイクローエンイザ・ミニリーダー(グイナテック社
製)で測定した被検体中のATI[I・トロンビン複合
体の*は同時に測定した検量用複合体の490 nmに
おける吸光度から描いた検量線から求めた。
10μy−/1の濃度にした溶液を96ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに100μ)
入れて25℃で30分間静置した。そのプレートを0.
05%Tween −20を含む生理食塩水で3回洗浄
した。このようにして抗体を感作したプレートのウェル
に50μlの被検体および上記で調製したベルオキシタ
ーゼ標識抗体、0.15MNactおよび2%ウシアル
ブミンを包む20mMリン酸緩衝液(声8.0)100
μlを加えた。25℃で30分間静置後、グレートを0
゜05%Tween −20を含む生理食塩水で3回洗
浄した。次いで、酵素基質液(10城フエノール、20
mM4−アミノアンチピリンおよび0.005%過酸化
水素を含む液)200μlずつをグレートのそれぞれの
ウェルに添加した。25℃で、30分間反応佼、各ウェ
ルの液の490 nmにおける吸光度をMP −590
型マイクローエンイザ・ミニリーダー(グイナテック社
製)で測定した被検体中のATI[I・トロンビン複合
体の*は同時に測定した検量用複合体の490 nmに
おける吸光度から描いた検量線から求めた。
「発明の効果」
この発明のATII・トロンビン複合体特異的モノクロ
ーナル抗体は、上述のごとく、複合体免疫吸着剤および
免疫定量法として有用である。
ーナル抗体は、上述のごとく、複合体免疫吸着剤および
免疫定量法として有用である。
第1〜5図は各々モノクローナル抗体AT−1゜AT−
2、AT−3、AT−4およびAT −5のトロンビン
、ATI[IおよびATII[・トロンビン複合体との
結合力を96ウエルマイクロタイター・グレートを用い
てエンザイムイムノ・アッセイ法で測定した結果を表す
グラフ図である。 T・・・トロンビン、A・・・アンチトロンビンII[
、B・・・アンチトロンビンI[[−)ロンビン複合体
。 山u o6t’ y 7. ”’ga 田u06t7111 第3図 第4図 1簀、7JEト 軟イ廿ず( 第5図
2、AT−3、AT−4およびAT −5のトロンビン
、ATI[IおよびATII[・トロンビン複合体との
結合力を96ウエルマイクロタイター・グレートを用い
てエンザイムイムノ・アッセイ法で測定した結果を表す
グラフ図である。 T・・・トロンビン、A・・・アンチトロンビンII[
、B・・・アンチトロンビンI[[−)ロンビン複合体
。 山u o6t’ y 7. ”’ga 田u06t7111 第3図 第4図 1簀、7JEト 軟イ廿ず( 第5図
Claims (9)
- (1)アンチトロンビンIII・トロンビン複合体で免疫
した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアンチトロンビ
ンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体産生性の
ハイブリドーマクローン。 - (2)免疫化した細胞がマウス脾臓であり、他の細胞が
マウス骨髄である特許請求の範囲第1項記載のハイブリ
ドーマクローン。 - (3)アンチトロンビンIII・トロンビン複合体と反応
し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロンビンIII
とは反応しない抗原抗体反応特異性を有するアンチトロ
ンビンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体。 - (4)アンチトロンビンIII・トロンビン複合体で免疫
した細胞を他の細胞と細胞融合して得たハイブリドーマ
クローンに由来する特許請求の範囲第3項記載のアンチ
トロンビンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体
。 - (5)免疫した細胞がマウス脾臓であり、他の細胞がマ
ウス骨髄である特許請求の範囲第4項記載のアンチトロ
ンビンIII・トロンビン複合体モノクロナール抗体。 - (6)アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノク
ロナール抗体の1種または2種以上を使用することを特
徴とするアンチトロンビンIII・トロンビン複合体の免
疫定量法。 - (7)免疫定量法が酵素免疫定量法である特許請求の範
囲第6項記載の免疫定量法。 - (8)免疫定量法がマイクロタイター・プレートあるい
はプラスチックチューブを使用する酵素免疫定量法であ
る特許請求の範囲第6項記載の免疫定量法。 - (9)アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノク
ローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィーの免
疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチトロンビ
ンIII・トロンビン複合体の精製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62138187A true JPS62138187A (ja) | 1987-06-20 |
JPH0644876B2 JPH0644876B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17606834
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60279129A Expired - Lifetime JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0644876B2 (ja) |
Cited By (8)
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---|---|---|---|---|
WO1990008320A1 (fr) * | 1989-01-19 | 1990-07-26 | Teijin Limited | Procede, reactifs et kits d'analyse immunologique |
EP0640621A2 (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-01 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Anti-thrombin monoclonal antibody |
EP0669344A3 (en) * | 1994-02-25 | 1996-12-18 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Monoclonal antibody and its use in an immunoassay. |
JP2002316999A (ja) * | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
JP2016194444A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-17 | 株式会社Lsiメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
WO2017073795A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 株式会社Lsiメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
CN116162165A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-05-26 | 杭州博茵生物技术有限公司 | 抗人凝血酶-抗凝血酶复合物抗体、制备方法、检测试剂及应用 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1985
- 1985-12-13 JP JP60279129A patent/JPH0644876B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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JPS52108018A (en) * | 1976-03-08 | 1977-09-10 | Leuven Res & Dev Vzw | Measuring method of heparin in plasma |
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EP0640621A2 (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-01 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Anti-thrombin monoclonal antibody |
EP0640621A3 (en) * | 1993-08-24 | 1996-03-06 | Oriental Yeast Co Ltd | Monoclonal anti-thrombin antibody. |
EP0669344A3 (en) * | 1994-02-25 | 1996-12-18 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Monoclonal antibody and its use in an immunoassay. |
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