JPS62138187A - 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 - Google Patents
抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法Info
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- JPS62138187A JPS62138187A JP60279129A JP27912985A JPS62138187A JP S62138187 A JPS62138187 A JP S62138187A JP 60279129 A JP60279129 A JP 60279129A JP 27912985 A JP27912985 A JP 27912985A JP S62138187 A JPS62138187 A JP S62138187A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
この発明は、新規なモノクローナル抗体に関するもので
ある。さらに詳細には、抗アンチトロンビン■−トロン
ビン複合体・モノクローナル抗体に関するものであり、
それらのモノクローナル抗体は血漿中あるいは血清中ア
ンチトロンビン■・トロンビン複合体の免疫定量法のた
めの試薬およびアンチトロンビン■・トロンビン複合体
のアフィニティー・カラムクロマトグラフィーのだめの
免疫吸着剤として有用でおる。
ある。さらに詳細には、抗アンチトロンビン■−トロン
ビン複合体・モノクローナル抗体に関するものであり、
それらのモノクローナル抗体は血漿中あるいは血清中ア
ンチトロンビン■・トロンビン複合体の免疫定量法のた
めの試薬およびアンチトロンビン■・トロンビン複合体
のアフィニティー・カラムクロマトグラフィーのだめの
免疫吸着剤として有用でおる。
［従来の技術］
遊離アンチトロンビン■（以下ＡＴＩＩＩと称す）ある
いは遊離トロンビンとは反応せず、ＡＴＩ・トロンビン
複合体に特異的に反応する抗ＡＴＩＩ［・トロンビン・
モノクローナルを分泌する／・イフＩＪ トーマは従来
存在せず、本発明において初めて得られたものである。
いは遊離トロンビンとは反応せず、ＡＴＩ・トロンビン
複合体に特異的に反応する抗ＡＴＩＩ［・トロンビン・
モノクローナルを分泌する／・イフＩＪ トーマは従来
存在せず、本発明において初めて得られたものである。
「発明が解決しようとする問題点」
本発明者等は、血漿あるいは血清中に存在するＡＴＩＩ
Ｉ・トロンビン複合体の同定定量に用いられていた従来
の免疫電気泳動法における測定に長時間を要し、検出感
度が低いという欠点を解消すべく種々研究を行ない、Ａ
ＴＩＩＩとトロンビンが複合体を形成することによって
生ずる新しい抗原決定基を認識するモノクローナル抗体
を産生、分泌するハイブリドーマを得、本発明を完成さ
せるに至った。
Ｉ・トロンビン複合体の同定定量に用いられていた従来
の免疫電気泳動法における測定に長時間を要し、検出感
度が低いという欠点を解消すべく種々研究を行ない、Ａ
ＴＩＩＩとトロンビンが複合体を形成することによって
生ずる新しい抗原決定基を認識するモノクローナル抗体
を産生、分泌するハイブリドーマを得、本発明を完成さ
せるに至った。
「問題点を解決するだめの手段」
すなわち、本発明はアンチトロンビン■・トロンビン複
合体で免疫した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアン
チトロンビ／■・トロンビン複合体モノクローナル抗体
産生性のハイブリドーマクローンである。
合体で免疫した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアン
チトロンビ／■・トロンビン複合体モノクローナル抗体
産生性のハイブリドーマクローンである。
更Ｖｃ本％明Ｆｉアンチトロンビン■・トロンビン複合
体と反応し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロン
ビンＩＩＩとは反応しない抗原抗体反応特異性を有する
アンチトロンビンＩＩＩ・トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体である。
体と反応し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロン
ビンＩＩＩとは反応しない抗原抗体反応特異性を有する
アンチトロンビンＩＩＩ・トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体である。
更ニ本発明ハアンチトロンビン■・トロンビン複合体モ
ノクローナル抗体の１種または２種以上を使用すること
を特徴とするアンチトロンビン■・トロンビン複合体の
免疫定量法である。
ノクローナル抗体の１種または２種以上を使用すること
を特徴とするアンチトロンビン■・トロンビン複合体の
免疫定量法である。
また、本発明はアンチトロンビン■・トロンビン複合体
モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィ
ーの免疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチト
ロンビン■・トロンビン複合体の精製法である。
モノクローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィ
ーの免疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチト
ロンビン■・トロンビン複合体の精製法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
抗ＡＴＩＩＩ −）ロンビン複合体モノクローナル抗体
は新規なマウス・ノ・イブリドーマをそれぞれ培地また
はマウスの腹腔内で培養することによって製造できる。
は新規なマウス・ノ・イブリドーマをそれぞれ培地また
はマウスの腹腔内で培養することによって製造できる。
ここで用いるマウス・ハイブリドーマは一般的ＩＣハＡ
ＴＩＩＩ・トロンビン複合体で免疫したマウスの膵臓細
胞とマウス骨髄肺細胞とを、Ｋ６ｈｌｅｒ およびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ の細胞融合の基本方法（ｎａｔｕｒ
ｅ第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照〕により細胞
融合して製造することが可能である。詳細には、下記実
施例に述べる如くである。
ＴＩＩＩ・トロンビン複合体で免疫したマウスの膵臓細
胞とマウス骨髄肺細胞とを、Ｋ６ｈｌｅｒ およびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ の細胞融合の基本方法（ｎａｔｕｒ
ｅ第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照〕により細胞
融合して製造することが可能である。詳細には、下記実
施例に述べる如くである。
まだ、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適（−た培地であればよく、好
適にはダルベツコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏＱ ｍ０ｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ％ｍ
ｔｎｉｍｕｍ ｅｓ＋ｓｅｎｔ１ｍｌ ｍｅｄｉｕｍ以
下ＤＭＥと記す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレ
プトマイシン）を含む培地が用いられる。
ハイブリドーマの培養に適（−た培地であればよく、好
適にはダルベツコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏＱ ｍ０ｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ％ｍ
ｔｎｉｍｕｍ ｅｓ＋ｓｅｎｔ１ｍｌ ｍｅｄｉｕｍ以
下ＤＭＥと記す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレ
プトマイシン）を含む培地が用いられる。
上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合に
は５１ Ｃｏ２濃度、３７℃で約３日間、またマウスの
腹腔内で培養する場合には約１４日間で行なわれる。
は５１ Ｃｏ２濃度、３７℃で約３日間、またマウスの
腹腔内で培養する場合には約１４日間で行なわれる。
このようにして製造された培養液またはマウスの腹水か
ら５蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。
ら５蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩グルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩グルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
このようにして得られた抗ＡＴＩ［Ｉ・トロンビン複合
体モノクローナル抗体は、遊離のＡＴＩＩＩあるいはト
ロンビン、！： ｉｄ結合シナいで、 ＡＴＩＩＩ −
）ロンビン複合体とだけ結合する能力を有し、ＡＴＴＩ
・トロンビン複合体の免疫定量用の試薬としておよびＡ
ＴＴｆ［・トロンビン複合体の精製に用いる免疫吸着剤
として有用である。
体モノクローナル抗体は、遊離のＡＴＩＩＩあるいはト
ロンビン、！： ｉｄ結合シナいで、 ＡＴＩＩＩ −
）ロンビン複合体とだけ結合する能力を有し、ＡＴＴＩ
・トロンビン複合体の免疫定量用の試薬としておよびＡ
ＴＴｆ［・トロンビン複合体の精製に用いる免疫吸着剤
として有用である。
この発明の抗ＡＴＩＩ・トロンビン複合体モノクローナ
ル抗体（例えば後述の実施例で得られたＡＴ−１、ＡＴ
−２、ＡＴ −３、ＡＴ −４およびＡＴ−５）は酵
素免疫定量法（ＥＩＡ ）あるいは放射能免疫定量法（
ＲＩＡ ）における試薬として使用できる。酵素免疫定
量法としては、マイクロタイターあるいはグラスチック
チューブを用いるワン串ステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の
具体例は下記実施例７に示す通りであるが、一般的には
、ＡＴｍ・トロンビン複合体の互いに異なった抗原決定
基を認識する２種類の抗ＡＴＩ［Ｉ・トロンビン複合体
モノクローナル抗体を用いて行ない、まず、マイクロタ
イター・グレートの穴（ウェル）あるいはグラスチック
チューブを前もって１棟類の抗体（例えばＡＴ−１）で
感作させておき、次に、この穴あるいはグラスチックチ
ューブにＡＴＩｒｌ・トロンビン複合体を含む被検体お
よび酵素標識した別種の抗体（例えば、ＡＴ −２）の
溶液を入れ、約３０分間静置後洗浄し、酵素基質溶液を
加えて３０分間程度酵素反応を行なう。
ル抗体（例えば後述の実施例で得られたＡＴ−１、ＡＴ
−２、ＡＴ −３、ＡＴ −４およびＡＴ−５）は酵
素免疫定量法（ＥＩＡ ）あるいは放射能免疫定量法（
ＲＩＡ ）における試薬として使用できる。酵素免疫定
量法としては、マイクロタイターあるいはグラスチック
チューブを用いるワン串ステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が例として挙げられる。この酵素免疫定量法の
具体例は下記実施例７に示す通りであるが、一般的には
、ＡＴｍ・トロンビン複合体の互いに異なった抗原決定
基を認識する２種類の抗ＡＴＩ［Ｉ・トロンビン複合体
モノクローナル抗体を用いて行ない、まず、マイクロタ
イター・グレートの穴（ウェル）あるいはグラスチック
チューブを前もって１棟類の抗体（例えばＡＴ−１）で
感作させておき、次に、この穴あるいはグラスチックチ
ューブにＡＴＩｒｌ・トロンビン複合体を含む被検体お
よび酵素標識した別種の抗体（例えば、ＡＴ −２）の
溶液を入れ、約３０分間静置後洗浄し、酵素基質溶液を
加えて３０分間程度酵素反応を行なう。
反応終了後、比色法等により、被検体中のＡＴＩＩＩＩ
・トロンビン複合体の量を定量することにより行なうこ
とが可能である。
・トロンビン複合体の量を定量することにより行なうこ
とが可能である。
また、この発明の抗ＡＴＩ・トロンビンモノクローナル
抗体をＡＴＩｒｌ・トロンビン複合体の精製に使用でき
る。まず、抗ＡＴＩＴＩ＊トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体（ＡＴ−１、ＡＴ −２、ＡＴ −３、ＡＴ
−４またＨＡＴ−５）をシアン化臭素・活性化セファロ
ース４Ｂと常法により反応させ、該ＡＴ−１，ＡＴ−２
゜ＡＴ −３、ＡＴ −４またはＡＴ −５結合セファ
ロース４Ｂを調製し、これを用いて、カラム法兼たけパ
ッチ法でＡＴＩ［ｌ・トロンビン複合体を常法によって
精製すればよい。
抗体をＡＴＩｒｌ・トロンビン複合体の精製に使用でき
る。まず、抗ＡＴＩＴＩ＊トロンビン複合体モノクロー
ナル抗体（ＡＴ−１、ＡＴ −２、ＡＴ −３、ＡＴ
−４またＨＡＴ−５）をシアン化臭素・活性化セファロ
ース４Ｂと常法により反応させ、該ＡＴ−１，ＡＴ−２
゜ＡＴ −３、ＡＴ −４またはＡＴ −５結合セファ
ロース４Ｂを調製し、これを用いて、カラム法兼たけパ
ッチ法でＡＴＩ［ｌ・トロンビン複合体を常法によって
精製すればよい。
「実施例」
次にこの発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例Ｉ
ＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体の調製：ＡＴＩ［Ｉ・ト
ロンビン複合体の調製は次のような操作で行なった。精
製したトロンビン５■（０，５■／−のトロンビン溶液
、、１０ ｍ！／）と精製したＡＴＩＩ １５■（５ｍ
ｙ、／ｒｌのＡＴＩＩＩ溶液、 ３１Ｒ１）を混合シ（
モル比１：２）３７℃で１時間反応後、１Ｍのジイソプ
ロピルフルオロリン酸溶液を１３ＷＬｔ反応液に添加す
ることによって反応を停止させる。この混合液を前もっ
て０．１ Ｍ Ｎ５ＣＬを含む２０ ｍＭ ）リス塩酸
緩衝液−７，４で平衡化したヘパリン−セファロースカ
ラム（カラム容量１００１１）に充填する。このカラム
を上記の緩衝液約４００ｍ１で洗浄後、Ｑ、ｌ Ｍ Ｎ
ａＣｔを含む２０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１７．
４）と０．５Ｍ ＮａＣ１を含む２０ｍＭ）ＩＪス塩酸
緩衝液（ｐｆ（７，４）による直線濃度勾配によって溶
離する。溶出液は、５ａｆ！づつ集めた。ＳＤＳディス
ク電気泳動法によって複合体の含まれている分画を測定
したＡＴＩＴＩ・トロンビン複合体が含まれている分画
数６ｌ−１２Ｊを集め、５０ｍＭＮａ Ｃ１を含む２０
ｍＭ）ＩＪス塩酸緩衝液で透析する。
ロンビン複合体の調製は次のような操作で行なった。精
製したトロンビン５■（０，５■／−のトロンビン溶液
、、１０ ｍ！／）と精製したＡＴＩＩ １５■（５ｍ
ｙ、／ｒｌのＡＴＩＩＩ溶液、 ３１Ｒ１）を混合シ（
モル比１：２）３７℃で１時間反応後、１Ｍのジイソプ
ロピルフルオロリン酸溶液を１３ＷＬｔ反応液に添加す
ることによって反応を停止させる。この混合液を前もっ
て０．１ Ｍ Ｎ５ＣＬを含む２０ ｍＭ ）リス塩酸
緩衝液−７，４で平衡化したヘパリン−セファロースカ
ラム（カラム容量１００１１）に充填する。このカラム
を上記の緩衝液約４００ｍ１で洗浄後、Ｑ、ｌ Ｍ Ｎ
ａＣｔを含む２０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１７．
４）と０．５Ｍ ＮａＣ１を含む２０ｍＭ）ＩＪス塩酸
緩衝液（ｐｆ（７，４）による直線濃度勾配によって溶
離する。溶出液は、５ａｆ！づつ集めた。ＳＤＳディス
ク電気泳動法によって複合体の含まれている分画を測定
したＡＴＩＴＩ・トロンビン複合体が含まれている分画
数６ｌ−１２Ｊを集め、５０ｍＭＮａ Ｃ１を含む２０
ｍＭ）ＩＪス塩酸緩衝液で透析する。
次にまえもって５０ ｍＭ ＮａＣｔを含む２０ ｍＭ
トリス塩酸緩衝液で平衡化しであるＤＥＡＥ−セファ
セルカラム（カラム容−Ｍ５ （１／ 、ファルマシャ
社製、スウェーデン）に充填する。乙のカラムを上記の
緩衝液約２００ ｍｌで洗浄した後、０．０５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）と０．５
Ｍ ＮａＣ１を含むトリス塩酸緩衝液による直線濃度
勾配によって溶離する。溶出液は、２ ｗｒｌづつ集め
た。上記の方法で測定したＡＴＩＩＩ・トロンビン複合
体の含まれている分画を集め、限外口過法によって濃縮
し、Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＡＴ［ｌ・トロンビン複合
体５ ｍｌを得た。とのようにして得たＡＴＩＩＩ・ト
ロンビン複合体溶液は、免疫原として、寸た抗Ａ、ＴＴ
ＩＩ・トロンビン複合体抗体産生性ハイブリドーマを選
別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用する。
トリス塩酸緩衝液で平衡化しであるＤＥＡＥ−セファ
セルカラム（カラム容−Ｍ５ （１／ 、ファルマシャ
社製、スウェーデン）に充填する。乙のカラムを上記の
緩衝液約２００ ｍｌで洗浄した後、０．０５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）と０．５
Ｍ ＮａＣ１を含むトリス塩酸緩衝液による直線濃度
勾配によって溶離する。溶出液は、２ ｗｒｌづつ集め
た。上記の方法で測定したＡＴＩＩＩ・トロンビン複合
体の含まれている分画を集め、限外口過法によって濃縮
し、Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＡＴ［ｌ・トロンビン複合
体５ ｍｌを得た。とのようにして得たＡＴＩＩＩ・ト
ロンビン複合体溶液は、免疫原として、寸た抗Ａ、ＴＴ
ＩＩ・トロンビン複合体抗体産生性ハイブリドーマを選
別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用する。
実施例２
（＆）免疫化した肺臓細胞の調製：
上記のＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体免疫原溶液（Ａ２
８０ｎｍ＝０．１ ）を等量のフロイント氏完全アジェ
パントと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌを
マウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第
１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記の同様の方
法でマウス腹腔内に投与した（第２同免疫）。第２回免
疫から２１日経過後、ＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体免
疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内
に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
８０ｎｍ＝０．１ ）を等量のフロイント氏完全アジェ
パントと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌを
マウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第
１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記の同様の方
法でマウス腹腔内に投与した（第２同免疫）。第２回免
疫から２１日経過後、ＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体免
疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内
に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
（ｂ） 細胞融合：
無菌的に摘出した上記の肺臓を、１０〜１５％ウシ胎児
血清を含むＤＭＥ培地５ｄを入れたシャーレに入れる。
血清を含むＤＭＥ培地５ｄを入れたシャーレに入れる。
次に、肺臓を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＩＥ
培地約１５ｉ／Ｔ還流して牌細胞を流出させた後、この
牌細胞懸濁液をナイロンメツシーに通す。この牌細胞を
５０ＩＩＩｌ遠心チ、−ブに集めて５００ＸＰ、１０分
間遠心する。こうして得たペレットに３〜５ ｍＡのへ
モライジング溶液（１５５ｍＭＮＨａＣ１、１０ｍＭ
ＫＨＣＯ，、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ ｐＨ７，Ｏ）を
加え、懸濁させる。０℃で５〜１０分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍの１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離
する。このようＫ Ｌ、て得た細胞ペレットをＤＭＥ培
地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細胞数を測定
する。
培地約１５ｉ／Ｔ還流して牌細胞を流出させた後、この
牌細胞懸濁液をナイロンメツシーに通す。この牌細胞を
５０ＩＩＩｌ遠心チ、−ブに集めて５００ＸＰ、１０分
間遠心する。こうして得たペレットに３〜５ ｍＡのへ
モライジング溶液（１５５ｍＭＮＨａＣ１、１０ｍＭ
ＫＨＣＯ，、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ ｐＨ７，Ｏ）を
加え、懸濁させる。０℃で５〜１０分間放置すると懸濁
液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍの１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離
する。このようＫ Ｌ、て得た細胞ペレットをＤＭＥ培
地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細胞数を測定
する。
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミニｏ−
−ｒ細胞）ＳＰ２１０−Ａｇ １４約２ Ｘ １０７個
に１Ｘ１０個の上記牌細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく
混合し、遠心分離を行なった（ ５００Ｘ島１０ Ｍ４
）。
−ｒ細胞）ＳＰ２１０−Ａｇ １４約２ Ｘ １０７個
に１Ｘ１０個の上記牌細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく
混合し、遠心分離を行なった（ ５００Ｘ島１０ Ｍ４
）。
その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし。
３８℃に保温しておいた４０チポリエチレングリコール
４０００溶液０．５献を滴下し、遠心チー−ブを手で、
１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリ
コール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃
に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１−加えて
チューブを穏やかに回転させる。この操作を１０回繰り
返した後、２０〜３０ｄの１０〜１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００Ｘｐ、１０
分間）を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを
１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培
地にアミノブチ’） ７４Ｘ１０ ’Ｍ 、 チミジン
１．６ Ｘ １０ ”’Ｍ。
４０００溶液０．５献を滴下し、遠心チー−ブを手で、
１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリ
コール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃
に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１−加えて
チューブを穏やかに回転させる。この操作を１０回繰り
返した後、２０〜３０ｄの１０〜１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００Ｘｐ、１０
分間）を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを
１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培
地にアミノブチ’） ７４Ｘ１０ ’Ｍ 、 チミジン
１．６ Ｘ １０ ”’Ｍ。
ヒポキサンチンｌＸｌ０ Ｍになるように添加したも
の）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｄの上記ＨＡ
Ｔ培地に懸濁する。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培
養グレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、３７℃
、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した
。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地を約１００μ
ｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えるこ
とによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択
した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨ
Ｔ 培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６Ｘ１０−５Ｍ、
ヒポキサンチンｌＸｌ０ ’Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０回目に、下達のＥＬＩＳＡ法により、抗ＡＴ
ＴＩＩ ）ロンビン複合体抗体産生ハイブリドーマをス
クリー・ニングした。
の）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｄの上記ＨＡ
Ｔ培地に懸濁する。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培
養グレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、３７℃
、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した
。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地を約１００μ
ｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えるこ
とによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択
した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨ
Ｔ 培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６Ｘ１０−５Ｍ、
ヒポキサンチンｌＸｌ０ ’Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０回目に、下達のＥＬＩＳＡ法により、抗ＡＴ
ＴＩＩ ）ロンビン複合体抗体産生ハイブリドーマをス
クリー・ニングした。
（ｃ） ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養土清栄の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用グレー）
（Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｈ，日本グイナテック株式会社）
の各ウェルに、前述の精製ＡＴ■・ｌ・ロンビン複合体
溶液（Ａ ２８０ ｎｍ ＝０．０５ ｐ生理食塩水で
希釈した。）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放
置した。
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用グレー）
（Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｈ，日本グイナテック株式会社）
の各ウェルに、前述の精製ＡＴ■・ｌ・ロンビン複合体
溶液（Ａ ２８０ ｎｍ ＝０．０５ ｐ生理食塩水で
希釈した。）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放
置した。
次に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０−生理食塩水で３
回洗浄した後、各ウェルに培養上清を５０μｌ加え、２
５℃で１時間反応させた。
回洗浄した後、各ウェルに培養上清を５０μｌ加え、２
５℃で１時間反応させた。
次にＴｗｅｅｎ ２０−生理食塩水で２００倍希釈した
にルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマー
ク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、０．０
５％Ｔｖｒｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗
浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフエ５
ノールおよび０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５
０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ各
ウェルの４．９０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
にルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマー
ク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、０．０
５％Ｔｖｒｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗
浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフエ５
ノールおよび０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５
０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ各
ウェルの４．９０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、１９２ウエル中２３ウエルに抗体産生が認め
られた。
られた。
上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗
ＡＴＩＩ・トロンビン複合体抗体が、ＡＴＩＩＩおよび
トロンビンと反応するか否かを、ＡＴＩＩ［あるいはト
ロンビンを感作した９６ウエルＥＬＩＳＡ 用ｆレート
を用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、ＡＴ
Ｉ［Ｉ・トロンビン複合体と反応した２３ウエルの培養
上清中、１８ウエルの培養上清がＡＴＩｒｌとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ＡＴＩＩ・トロンビン複合体抗体が、ＡＴＩＩＩおよび
トロンビンと反応するか否かを、ＡＴＩＩ［あるいはト
ロンビンを感作した９６ウエルＥＬＩＳＡ 用ｆレート
を用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、ＡＴ
Ｉ［Ｉ・トロンビン複合体と反応した２３ウエルの培養
上清中、１８ウエルの培養上清がＡＴＩｒｌとも反応し
た。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ＡＴ■およびトロンビンとは反応しないで、ＡＴ■・ト
ロンビン複合体のみに特異的に反応する５ウエル中のハ
イブリドーマは２４ウエルプレートに移し、１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＨＴ 培養で４〜５日間培養した
。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって“抗ＡＴ■・トロ
ンビン複合体特異的抗体“の産生の有無を確認してから
限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、Ｉ
（Ｔ 培地でハイプリドーマが５個／献となるように希
釈し死細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの
腹腔細胞がウェルあたり２×１０ 個分注しである９６
ウエルプレートの各ウェルに１００μｔずつ分注した。
ロンビン複合体のみに特異的に反応する５ウエル中のハ
イブリドーマは２４ウエルプレートに移し、１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＨＴ 培養で４〜５日間培養した
。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって“抗ＡＴ■・トロ
ンビン複合体特異的抗体“の産生の有無を確認してから
限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、Ｉ
（Ｔ 培地でハイプリドーマが５個／献となるように希
釈し死細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの
腹腔細胞がウェルあたり２×１０ 個分注しである９６
ウエルプレートの各ウェルに１００μｔずつ分注した。
約１０日後、 ＥＬＩＳＡ法によって抗Ａ、Ｔｌｌ・ト
ロンビン複合体特異的抗体を産生するハイシリドーマの
クローンをスクリーニングした。その結果、各ハイプリ
ドーマにつき、２０−４０個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分
泌能の高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様
の方法で再クローン化を行い。
ロンビン複合体特異的抗体を産生するハイシリドーマの
クローンをスクリーニングした。その結果、各ハイプリ
ドーマにつき、２０−４０個の抗体産生クローンが得ら
れた。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分
泌能の高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様
の方法で再クローン化を行い。
゛抗ＡＴＩ・トロンビン複合体特異的抗体産生〕・イブ
リドーマＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４およ
びＡＴ−５を樹立した。
リドーマＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３、ＡＴ−４およ
びＡＴ−５を樹立した。
実験例３（モノクローナル抗体の製造）（イン・ビトロ
法） マウスハイブリドーマＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３゜
ＡＴ−４およびＡＴ−５をそれぞれ１５％ウシ胎児崩清
を含むＤＭＥ培地中で３７℃％５％二酸化炭素雰囲気中
７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離後（１００
ＯＯＸＰ、 １０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウ
ムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物
を水冷下３０分間攪拌した後６０分間放置し、遠心分離
（１ｏｏｏｏｘｙ、ｉｏ分）後、得られた沈渣を少量の
１０７リン酸緩衝液（Ｆ’（８，０）に溶解し、１００
０倍量の１． Ｑ ｍＭ ＋）ン酸緩衝液に対して透析
した。これを、１０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液ですでに平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ）
（８，０）と０．２ Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）の間で濃度勾配法により行
なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で
濃縮し、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐｉ（８，０）
に対して透析した。ウシ血清１ｐＧ を除くために、透
析物をやぎ抗ウシ血清１７Ｇ−セファロース４Ｂのカラ
ムに通した。次に通過液をＯ，］、 Ｍ ＩＪン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で平衡化したプロティンＡ−セファロ
ース４Ｂのカラムに充填した。カラムを−４３，５の緩
衝液で溶出して、精製した抗ＡＴＩＩＩ・トロンビン複
合体特異抗体ＡＴ −１（同様にしてＡＴ−２、ＡＴ−
３、ＡＴ−４ 、 ＡＴ −５）の溶液を得た。
法） マウスハイブリドーマＡＴ−１、ＡＴ−２、ＡＴ−３゜
ＡＴ−４およびＡＴ−５をそれぞれ１５％ウシ胎児崩清
を含むＤＭＥ培地中で３７℃％５％二酸化炭素雰囲気中
７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離後（１００
ＯＯＸＰ、 １０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウ
ムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物
を水冷下３０分間攪拌した後６０分間放置し、遠心分離
（１ｏｏｏｏｘｙ、ｉｏ分）後、得られた沈渣を少量の
１０７リン酸緩衝液（Ｆ’（８，０）に溶解し、１００
０倍量の１． Ｑ ｍＭ ＋）ン酸緩衝液に対して透析
した。これを、１０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液ですでに平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モ
ノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ）
（８，０）と０．２ Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）の間で濃度勾配法により行
なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で
濃縮し、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐｉ（８，０）
に対して透析した。ウシ血清１ｐＧ を除くために、透
析物をやぎ抗ウシ血清１７Ｇ−セファロース４Ｂのカラ
ムに通した。次に通過液をＯ，］、 Ｍ ＩＪン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で平衡化したプロティンＡ−セファロ
ース４Ｂのカラムに充填した。カラムを−４３，５の緩
衝液で溶出して、精製した抗ＡＴＩＩＩ・トロンビン複
合体特異抗体ＡＴ −１（同様にしてＡＴ−２、ＡＴ−
３、ＡＴ−４ 、 ＡＴ −５）の溶液を得た。
（インービが法）
グリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５肩ｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ ／
Ｃ系マウスの腹腔内に投与後１４−２０目目のマウス腹
腔内にインビトロで増殖させたハイプリドーマＡＴ−１
、ＡＴ−２，ＡＴ−３，ＡＴ−４，せプζはＡＴ−５を
マウス−匹あたり２Ｘ１０６細胞となるように接種した
。
デカン）０．５肩ｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ ／
Ｃ系マウスの腹腔内に投与後１４−２０目目のマウス腹
腔内にインビトロで増殖させたハイプリドーマＡＴ−１
、ＡＴ−２，ＡＴ−３，ＡＴ−４，せプζはＡＴ−５を
マウス−匹あたり２Ｘ１０６細胞となるように接種した
。
各ハイプリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５
＝の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍ９
／ＨＡであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、（但し、ヤギ抗ウシ血清１７Ｇ−セファロース４Ｂの
カラムを通す操作を除く。）上記のインビトロ稍製法と
同様の方法で行なった。
＝の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍ９
／ＨＡであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、（但し、ヤギ抗ウシ血清１７Ｇ−セファロース４Ｂの
カラムを通す操作を除く。）上記のインビトロ稍製法と
同様の方法で行なった。
実験例４（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定） 抗ＡＴＩＩ・トロンビン複合体特異モノクローナル抗体
ＡＴ −１、ＡＴ −２、ＡＴ −３、ＡＴ −４およ
びＡＴ −５の免疫グロブリン・クラスおよび特異性の
同定はそれぞれオフテロニー免疫拡散法およびエンザイ
ムと１８） イムノアッセイ法により行った。結果は表１及び第１〜
５図にしめす通りである。
および特異性の同定） 抗ＡＴＩＩ・トロンビン複合体特異モノクローナル抗体
ＡＴ −１、ＡＴ −２、ＡＴ −３、ＡＴ −４およ
びＡＴ −５の免疫グロブリン・クラスおよび特異性の
同定はそれぞれオフテロニー免疫拡散法およびエンザイ
ムと１８） イムノアッセイ法により行った。結果は表１及び第１〜
５図にしめす通りである。
表 １
実施例５（アフニテイクロマトグラフイー）精製された
抗ＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体特異モノクローナル抗
体ＡＴ−１（またはＡＴ −２、ＡＴ −３。
抗ＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体特異モノクローナル抗
体ＡＴ−１（またはＡＴ −２、ＡＴ −３。
ＡＴ −４、ＡＴ −５） ４ ＷをＣＮＢｒ活性化セ
ファ ｏ−ス４Ｂ１１Ｒ１に結合させたものを免疫吸着
剤として使用した。「実施例１」の方法で精製したＡＴ
ＩＩＩ 、 ）ロンビンあるいはＡＴＩＩＩ・トロンビ
ン複合体混合溶液をＡＴ−１（あるいはＡＴ ＝ ２
、 ＡＴ −３、ＡＴ −４、ＡＴ −５）結合セファ
ロース４Ｂ（１，０１））カラムに充填し、次に、０．
１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．１．Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で洗浄する。ＡＴＩＩＩとトロンビンは、この
洗浄液中に１００％回収された。一方、カラムに吸着さ
れたＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体を次の溶出溶媒で溶
出を試みた。
ファ ｏ−ス４Ｂ１１Ｒ１に結合させたものを免疫吸着
剤として使用した。「実施例１」の方法で精製したＡＴ
ＩＩＩ 、 ）ロンビンあるいはＡＴＩＩＩ・トロンビ
ン複合体混合溶液をＡＴ−１（あるいはＡＴ ＝ ２
、 ＡＴ −３、ＡＴ −４、ＡＴ −５）結合セファ
ロース４Ｂ（１，０１））カラムに充填し、次に、０．
１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．１．Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で洗浄する。ＡＴＩＩＩとトロンビンは、この
洗浄液中に１００％回収された。一方、カラムに吸着さ
れたＡＴＩＩＩ・トロンビン複合体を次の溶出溶媒で溶
出を試みた。
ａ） ４．５Ｍ Ｍｇｃｚ２（ｐＨ７，５）ｂ）リ
ン酸−クエン酸、 ｐ１１２．８Ｃ）グリシン／ ＨＣ
ｔ、 ｐＨ２，５ｄ）３Ｍチオシアン酸カリウム溶液 ＡＴＩ・トロンビンを含有する自分を、０．１５ＭＮａ
Ｃ１を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（８，０）に対
して透析後、各画分のＡＴＴＯ・トロンビン複合体の含
量を定量した。結果を第２表に示す。
ン酸−クエン酸、 ｐ１１２．８Ｃ）グリシン／ ＨＣ
ｔ、 ｐＨ２，５ｄ）３Ｍチオシアン酸カリウム溶液 ＡＴＩ・トロンビンを含有する自分を、０．１５ＭＮａ
Ｃ１を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（８，０）に対
して透析後、各画分のＡＴＴＯ・トロンビン複合体の含
量を定量した。結果を第２表に示す。
実施例６（ラテックススライド凝集免疫定量法）抗ＡＴ
ＩＩ［・トロンビン複合体特異的モノクローナル抗体に
よるラテックス（日本合成ゴム社製、０．４９７μｒｎ
）の感作は次のような操作で行なった。
ＩＩ［・トロンビン複合体特異的モノクローナル抗体に
よるラテックス（日本合成ゴム社製、０．４９７μｒｎ
）の感作は次のような操作で行なった。
５種類のモノクローナル抗体ＡＴ −１、ＡＴ −２。
ＡＴ−３，ＡＴ−４，ＡＴ−５、各々の濃度が０．１１
■／ｍの溶液１０−に、ラテックス濃度が１％（Ｗ／ｖ
）になるように、ラテックスを加え、２５℃で１時間激
しく攪拌する。次に、牛アルブミン溶液（１０■／ ｒ
ｔｒｌ ）をＱ、 ２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激
しく攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｘ Ｓ’ 、 ３
０分間）を行なう。
■／ｍの溶液１０−に、ラテックス濃度が１％（Ｗ／ｖ
）になるように、ラテックスを加え、２５℃で１時間激
しく攪拌する。次に、牛アルブミン溶液（１０■／ ｒ
ｔｒｌ ）をＱ、 ２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激
しく攪拌後、遠心分離（２０，０００Ｘ Ｓ’ 、 ３
０分間）を行なう。
沈渣を５０ｍ／の水に懸濁し、抗ＡＴＩＩＩ・トロンビ
ン複合体特異的モノクローナル抗体感作ラテツクスとし
て以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
ン複合体特異的モノクローナル抗体感作ラテツクスとし
て以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
スライド凝集板の各ウェルに感作ラテツクス（０，２％
）２５μｌを添加し、次に、生理食塩水による２倍希釈
列の被検体２５μｌを加える。このスライド凝集板を１
００回転／分で１分間回転させ、各ウェルの凝集の有無
を測定する。被検体中のＡＴＩ・トロンビン複合体の量
は同時に測定した、２倍希釈列の検量用複合体によるラ
テックス凝集反応の有無から求める。
）２５μｌを添加し、次に、生理食塩水による２倍希釈
列の被検体２５μｌを加える。このスライド凝集板を１
００回転／分で１分間回転させ、各ウェルの凝集の有無
を測定する。被検体中のＡＴＩ・トロンビン複合体の量
は同時に測定した、２倍希釈列の検量用複合体によるラ
テックス凝集反応の有無から求める。
実施例７（ワン・ステッｆ−サンドイッチ酵素免疫定量
法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ＡＴＩ・トロンビン
複合体モノクローナル抗体ＡＴ−１に結合させる方法は
ナカネおよびカワオイ（ジャナル・オプ・ヒストケミス
トリ一番アンド・サイトケミストリー第２２巻第１０８
４〜１ｏ９１頁（１，９７４年））の方法に準じて行な
った。この酵素ラベル抗体を用いてＡＴＩ［［・トロン
ビン複合体のワン・ステッノ・サンドイッチ酵素免疫定
量を次のようにして行なった。
法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ＡＴＩ・トロンビン
複合体モノクローナル抗体ＡＴ−１に結合させる方法は
ナカネおよびカワオイ（ジャナル・オプ・ヒストケミス
トリ一番アンド・サイトケミストリー第２２巻第１０８
４〜１ｏ９１頁（１，９７４年））の方法に準じて行な
った。この酵素ラベル抗体を用いてＡＴＩ［［・トロン
ビン複合体のワン・ステッノ・サンドイッチ酵素免疫定
量を次のようにして行なった。
モノクローナル抗体ＡＴ−２を２０ｍＭ炭酸緩衝液中に
１０μｙ−／１の濃度にした溶液を９６ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに１００μ）
入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ −２０を含む生理食塩水で３回洗浄
した。このようにして抗体を感作したプレートのウェル
に５０μｌの被検体および上記で調製したベルオキシタ
ーゼ標識抗体、０．１５ＭＮａｃｔおよび２％ウシアル
ブミンを包む２０ｍＭリン酸緩衝液（声８．０）１００
μｌを加えた。２５℃で３０分間静置後、グレートを０
゜０５％Ｔｗｅｅｎ −２０を含む生理食塩水で３回洗
浄した。次いで、酵素基質液（１０城フエノール、２０
ｍＭ４−アミノアンチピリンおよび０．００５％過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをグレートのそれぞれの
ウェルに添加した。２５℃で、３０分間反応佼、各ウェ
ルの液の４９０ ｎｍにおける吸光度をＭＰ −５９０
型マイクローエンイザ・ミニリーダー（グイナテック社
製）で測定した被検体中のＡＴＩ［Ｉ・トロンビン複合
体の＊は同時に測定した検量用複合体の４９０ ｎｍに
おける吸光度から描いた検量線から求めた。
１０μｙ−／１の濃度にした溶液を９６ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに１００μ）
入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ −２０を含む生理食塩水で３回洗浄
した。このようにして抗体を感作したプレートのウェル
に５０μｌの被検体および上記で調製したベルオキシタ
ーゼ標識抗体、０．１５ＭＮａｃｔおよび２％ウシアル
ブミンを包む２０ｍＭリン酸緩衝液（声８．０）１００
μｌを加えた。２５℃で３０分間静置後、グレートを０
゜０５％Ｔｗｅｅｎ −２０を含む生理食塩水で３回洗
浄した。次いで、酵素基質液（１０城フエノール、２０
ｍＭ４−アミノアンチピリンおよび０．００５％過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをグレートのそれぞれの
ウェルに添加した。２５℃で、３０分間反応佼、各ウェ
ルの液の４９０ ｎｍにおける吸光度をＭＰ −５９０
型マイクローエンイザ・ミニリーダー（グイナテック社
製）で測定した被検体中のＡＴＩ［Ｉ・トロンビン複合
体の＊は同時に測定した検量用複合体の４９０ ｎｍに
おける吸光度から描いた検量線から求めた。
「発明の効果」
この発明のＡＴＩＩ・トロンビン複合体特異的モノクロ
ーナル抗体は、上述のごとく、複合体免疫吸着剤および
免疫定量法として有用である。
ーナル抗体は、上述のごとく、複合体免疫吸着剤および
免疫定量法として有用である。
第１〜５図は各々モノクローナル抗体ＡＴ−１゜ＡＴ−
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４およびＡＴ −５のトロンビン
、ＡＴＩ［ＩおよびＡＴＩＩ［・トロンビン複合体との
結合力を９６ウエルマイクロタイター・グレートを用い
てエンザイムイムノ・アッセイ法で測定した結果を表す
グラフ図である。 Ｔ・・・トロンビン、Ａ・・・アンチトロンビンＩＩ［
、Ｂ・・・アンチトロンビンＩ［［−）ロンビン複合体
。 山ｕ ｏ６ｔ’ ｙ ７． ”’ｇａ 田ｕ０６ｔ７１１１ 第３図 第４図 １簀、７ＪＥト 軟イ廿ず（ 第５図
２、ＡＴ−３、ＡＴ−４およびＡＴ −５のトロンビン
、ＡＴＩ［ＩおよびＡＴＩＩ［・トロンビン複合体との
結合力を９６ウエルマイクロタイター・グレートを用い
てエンザイムイムノ・アッセイ法で測定した結果を表す
グラフ図である。 Ｔ・・・トロンビン、Ａ・・・アンチトロンビンＩＩ［
、Ｂ・・・アンチトロンビンＩ［［−）ロンビン複合体
。 山ｕ ｏ６ｔ’ ｙ ７． ”’ｇａ 田ｕ０６ｔ７１１１ 第３図 第４図 １簀、７ＪＥト 軟イ廿ず（ 第５図
Claims (9)
- （１）アンチトロンビンIII・トロンビン複合体で免疫
した細胞を他の細胞と細胞融合して得たアンチトロンビ
ンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体産生性の
ハイブリドーマクローン。 - （２）免疫化した細胞がマウス脾臓であり、他の細胞が
マウス骨髄である特許請求の範囲第１項記載のハイブリ
ドーマクローン。 - （３）アンチトロンビンIII・トロンビン複合体と反応
し、遊離トロンビンあるいは遊離アンチトロンビンIII
とは反応しない抗原抗体反応特異性を有するアンチトロ
ンビンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体。 - （４）アンチトロンビンIII・トロンビン複合体で免疫
した細胞を他の細胞と細胞融合して得たハイブリドーマ
クローンに由来する特許請求の範囲第３項記載のアンチ
トロンビンIII・トロンビン複合体モノクローナル抗体
。 - （５）免疫した細胞がマウス脾臓であり、他の細胞がマ
ウス骨髄である特許請求の範囲第４項記載のアンチトロ
ンビンIII・トロンビン複合体モノクロナール抗体。 - （６）アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノク
ロナール抗体の１種または２種以上を使用することを特
徴とするアンチトロンビンIII・トロンビン複合体の免
疫定量法。 - （７）免疫定量法が酵素免疫定量法である特許請求の範
囲第６項記載の免疫定量法。 - （８）免疫定量法がマイクロタイター・プレートあるい
はプラスチックチューブを使用する酵素免疫定量法であ
る特許請求の範囲第６項記載の免疫定量法。 - （９）アンチトロンビンIII・トロンビン複合体モノク
ローナル抗体をアフィニティークロマトグラフィーの免
疫吸着剤として用いることを特徴とするアンチトロンビ
ンIII・トロンビン複合体の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60279129A JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62138187A true JPS62138187A (ja) | 1987-06-20 |
| JPH0644876B2 JPH0644876B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17606834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60279129A Expired - Lifetime JPH0644876B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644876B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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