JPH0348158A - ヒト・トロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫学的測定方法、そのための測定試薬およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、ヒト検体中におけるヒト・ｌ−口〉・ビン・
アンチトロンビン■複合体の免疫学的測定方法、そのた
めの測定試薬およびキ・ソト、抗ヒト・トロンビンボリ
クＤ−・針ル抗体およびその製造方法、精製されたヒト
・）０ンビン・アンチトロンビン■複合体およびその分
離方法に関する。さらに詳しく説明すると本発明は、ヒ
ト検体（殊に血漿または血清〉中におけるヒト・トロン
ビン・アンチトロンビンＩＩｒ複合体を、血清干渉を受
けずに、またヒト検体中に含まれるプロトロンビンおよ
び遊離のアンチトロンビンＩＩＩの影響を受けずに、高
感度で免疫学的に測定する方法、そのための測定試薬、
キットおよびそれらに関係する一連の技術に関する。

［従来技術］ ヒト・アンチトロンビン■（以下、これを“′ＡＴ　Ｉ
ＩＩ　”と称する場合がある）は、血液凝固系のセリン
プロテアーゼの重要なインヒビターであり、トロンビン
を始めとして活性化されたＸｌｌ、　ＸＩ、　Ｘ。

ＩＸ因子やカリクレイン、プラスミン等の活性を阻害す
る。ＡＴＩ［Ｉとセリンプロテアーゼとの反応は、１：
１のモル比で進行し、ＡＴＩＩ［のアルギニン残基がセ
リンプロテアーゼの活性中心であるセリン残基とエステ
ル結合して複合体を形成することによってセリンプロテ
アーゼの活性を抑制する。このような複合体の１つとし
てヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体く以下
、これを”　Ｔ　ＡＴ”と称する場合がある）が挙げら
れる。ヒトの血液中におけるＴＡＴの存在、増加は血液
Ｆｉ固機序の始動、活性化によってトロンビンが生成さ
れたことを示すものであると考えられている。　したが
って、血液中のＴＡＴの量を測定することにより、血液
凝固系の動態の一端を知り得るものと推察され、それに
よって血液凝固面から患者の病態を解明すること、例え
ば血栓形成あるいは汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）
への病態の進展を早期に予知し、適切な治療をすること
が可能になると期待される。

従来、ヒト検体中のＴＡＴを免疫学的に測定する試みと
して、１つは抗ＴＡＴｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ抗体を用い
た測定方法が検討されている。すなわち、Ｈｅｒｂｅｒ
ｔ、　Ｌ、　Ｌａｕが抗７’Ａ　Ｔｎｅｏａｎｔｉｇｅ
ｎ抗体を、１２５エラベルのＴＡＴを用いた１ｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙによりＴＡＴの測定を試みてい
る［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ　２５５．５８８５．
Ｉｓｓ＋＋ｅｏｆ　Ｊｕｎｅ　２５　（１９８０）　］
。

また、Ｐｅ１ｚｅｒらは、抗トロンビン抗体を固相抗体
に用い、抗ＡＴＩ［［抗体を酵素標識抗体に用いたサン
ドイッチ系によるヒト検体中のＴＡＴの測定系を提案し
ている（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　＆　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ。

ＪｕＩｙ　１４　（１９８５））。

しかしながら、これら従来の方法は、現在の医療ニーズ
に必ずしも合致する方法ではなかっな。

例えば詳述のＬａｕらの方法は抗ＴＡ　Ｔｎｅｏａｎｔ
ｉｇｅｎの選択性が問題であり、それにもし少量でもフ
リーのトロンビン、ＡＴＩＩＩまたはプロトロンビンに
交叉反応性があれば、その測定値は大幅に変化してしま
う危険性があった。なぜなら、ＴＡＴの濃度はフリーの
ＡＴｌｌ［やプロトロンビンの濃度に比べ健常人では約
１／１０’の極めて少量にすぎないからである。またＰ
ｅ１ｚｅｒらの方法は感度的に十分でなく、そのため大
量の血漿検体を用いるので、いわゆる血漿系による測定
系では強い血清干渉を受けるという欠点を有している。

［発明の目的］ そこで本発明の第１の目的は、ヒト検体中のＴＡＴを特
異的且つ高感度で測定するため免疫学的測定方法、測定
試薬およびキットを提供することにある。

本発明の第２の目的は、ヒト検体中に含まれる遊離のＡ
ＴＩＩＩやプロトロンビンの影響が極めて少なく、また
血清干渉を殆んど受けないＴＡＴの免疫学的測定方法、
測定試薬およびキットを提供することにある。

本発明の他の目的は、ヒトの血液凝固系の動態の指標を
知るのに役立ち且つ実用的な、ヒト検体中のＴＡＴの免
疫学的測定方法、測定試薬およびキットを提供すること
にある。

本発明のさらに他の目的は、前記したヒト検体中のＴＡ
Ｔの免疫学的測定系に使用しうる抗ヒト・トロンビンポ
リクローナル抗体およびその製造方法を提供することに
ある。

本発明のさらに他の目的は、ヒト検体中のＴＡＴの免疫
学的測定系において、標準物質として使用可能な極めて
高純度のＴＡＴおよびそれを得るためのプロセスを提供
することにある。

本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一層明らか
となるであろう。

［発明の構成］ 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的および利
点は、不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
抗体を固定化した第１抗体および抗ヒト・アンチトロン
ビン■抗体に標識物質を結合した第２抗体とを用いるヒ
ト検体中のヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合
体の免疫学的測定方法において、 （ｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、（
ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５Ｘ　１
０−７Ｍ〜３．５　×１０−７Ｍの範囲であり、（ｂ）
ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５Ｘ１０
−７Ｍ〜５．５　×１０−７Ｍの範囲であり、（ｃｌヒ
ト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に対する解
離定数が０．５　×１０−９Ｍ〜１．５Ｘ　１０−７Ｍ
の範囲であって、且つ （ｄ）ヒト・プロトロンビンに対する交差反応性が０．
０５％以下であり、 （ｉｉ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合
で結合している、 ことを特徴とする免疫学的測定方法を用いることによっ
て達成されることがわかった。

さらに本発明によれば、下記（Ａ）免疫学的測定試薬お
よび（Ｂ）免疫学的測定キットが提供される。

（Ａ）免疫学的測定試薬； 不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体を
固定化した第１抗体および抗ヒト・アンチトロンビン■
抗体に標識物質を結合した第２抗体からなるヒト検体中
のヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体を測定
するための免疫学的測定試薬であって、 （１）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５　×
１０−９Ｍ〜３．５　×１０−９Ｍの範囲であり、（ｂ
）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５　×
１０−７Ｍ〜５，５　×１０−７Ｍの範囲であり、 （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に
対する解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５　×１
０−７Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロトロン
ビンに対する交差反応性が０．０５％以下であり、 （ｉｉ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合
で結合している、ことを特徴とする免疫学的測定試薬。

（Ｂ）免疫学的測定キット； （１）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
抗体を固定化した第１抗体、 （２）抗ヒト・アンチトロンビン■抗体に標識物質を結
合した第２抗体、 （３）溶解剤 （４）洗浄剤 （５）標準物質及び （６）標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定
するための基質及び反応停止剤 を組合せてなるヒト検体中のヒト・トロンビン・アンチ
トロンビン■複合体を測定するためのキットであって、 （ｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、（
ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５Ｘ　１
０−７Ｍ〜３．５　×１０−７Ｍの範囲であり、（ｂ）
ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５Ｘ１０
−７Ｍ〜５．５　×１０−’ＩＶＩの範囲であり、（ｃ
）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に対す
る解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５Ｘ　１０−
７Ｍの範囲であって、且つ （ｄ）ヒト・プロトロンビンに対する交差反応性が０．
０５％以下°であり、。

（ｉｉ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２−・２５％の範囲の割
合で結合している、 ことを特徴とする免疫学的測定キット。

前記り、た本発明のヒト検体中のＴＡＴの免疫学的測定
方法、そのための試薬およびキットにおいては、前記（
ａ）〜（ｄ）に特定１．な抗ヒト・トロンビンポリクロ
−ナル抗体を用い月、つその抗体を固体組木上に前記し
、た比較的低い密度で結合させるのであり、そうするこ
とＧごよって、ヒト検体中のＴ　Ａ　Ｔを高感度で測定
することが可能となる。

以下本発明についてさらに詳しく説明する。

本発明の前記免疫学的測定系に使用される抗ヒト・トロ
ンビンポリクローナル抗体は、ヒト・トロンビンおよび
ＴＡＴに対して選択的に強い親和力を有しているが、ヒ
ト・プロトロンビンに対しては親和力が弱く且つ交差反
応性も低い。

すなわち、本発明の抗ヒト・トロンビンポリクローナル
抗体は、下記（ａ）　＝（ｄ）の親和力および交差反応
性を有している、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５Ｘ１
０〜９Ｍ〜３．５　×１０−７Ｍ、好ましくは３．０Ｘ
１０−・９Ｍ〜３．４　×１０−９Ｍの範囲であり、（
ｂｌヒト・プロトし′１ンビンに対する解離定数が４．
５　×１０−７Ｍ〜５．５　ＸＩ（１−７Ｍ、好ましく
は４．８Ｘ　１０−’〜５．２　×１０−”Ｍの範囲で
あり、（ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトＶ１ンビン■
複合体に対する解離定数が０．５　Ｘ１０−９Ｍ〜１．
５×１０−７Ｍ、好ましくは１．０　Ｘ１０−９Ｍ〜・
１．４　×１０−７Ｍの範囲であって、且つ （ｄ）ヒト・プロトロンビンに対する交差反応性が０．
０５％以下、好ましくは０，０４％以下であり、前記（
ａ）〜（ｄ）の特性を満足する抗ヒト・トロンビンポリ
クローナル抗体は、以下説明するように免疫すべき動物
、免疫量、免疫回数を厳密に規定することによっ′Ｃ初
めて収得する、：とが可能である。本発明者らは、ヒト
・トロンビンをマウスや羊に免疫操作を種々の条件で行
ったが、全く免疫ができないかあるいは目的とする抗体
は全く得られなかった。

すなわち、本発明者の研究によれば、本発明の目的を達
成するために使用し、うる抗ヒト・トロンビンポリクロ
ーナル抗体は、免疫に使用するヒト・トロンビンそれ自
体、強力な酵素（蛋白分解酵素）であり、免疫動物血中
の蛋白を分解しなり、自己消化を行なうといった極めて
不安定な物質であるため、免疫する抗原の性状、免疫す
べき動物、抗原の投与方法および投与量、免疫間隔、免
疫期間を厳密に行うことによって得られることがわかっ
た。以下本発明の前記（ａｔへ・（（１）の特性を満足
する抗ヒト・トロンビンポリクローナルの製造方法につ
いて説明する。

抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体の製造方法 （ｉ）免疫する抗原の性状 ヒト・トロンビンの活性部位がジイソプロピルフルオロ
フォスフェート等のインヒビターによってブロックされ
ていないものを用いる。すなわち、活性を有するヒト・
トロンビンを０．２〜０．５ｍｇ　／　ｍｌとなるよう
に生理食塩水に溶解し、免疫に供する。ここでヒト・ト
ロンビンはαトロンビンであることが好ましい。

（ｉｌ）　　投与方法 ウサギに免疫する。１〜３回目は全て Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎ
ｔと前記トロンビン溶液とを等量で混合し、皮下注射す
る。抗体価がある程度上がった後の免疫は、生理食塩水
に０．１〜０．２ｉｇ／ｍｌ濃度になるように、活性を
有するヒト・トロンビンを溶解し、静脈注射する。

（出）　投与量 ウサギに対して抗原刺激が充分にいくように配慮する。

しかし、前述したようにトロンビンは強力な蛋白分解酵
素であるから、投与量に関しては注意を要する。

すなわち、ウサキに対し１回当りの免疫量が０．０５〜
０．２５■／　ｋｇ体重の範囲、好ましくは０１１５〜
０２５■／　ｋｇ体重の範囲であり且つ合計の免疫量が
０．２５〜１．２５■／　ｋｇ体重の範囲、好ましくは
０．５〜１．０■、／　ｋｇ体重の範囲でヒト・トロン
ビンを免疫！９７、そのウサギから抗ヒト・トロンビン
ポリクローナル抗体を取得する。

（ｉｖ　　免疫間隔および期間 免疫期間は約３０日が好ましい。短すぎると血中の抗体
価か充分に上がらず、また４５日を超えるとＮａｔｉｖ
ｅなα−ト・ロンビンに結合する抗体量（割合・）が著
減する。免疫間層はおよそ１週間間開で１〜３回に投与
するのが好ましい。最終免疫（静注）後、３日経過した
ら全採血する。

Ｍ　精製 抗原としで用いｌごヒト・トロン・ビンをセファ［ツー
スに固定化してガラス・、を作成し、該カラムを用いζ
抗血清中からヒ１−・）・口〉・ビンに特異的に結合す
るポリ・クローナル抗体をアフイニティ精製する。充分
洗浄後、酢酸溶液で抗体を溶出する６該抗体を透析５濃
＠後、抗原固定ＩＥ　Ｌ。

］’　Ｓノ（を用いて、ヒト・ブＵｉトロンビンに対す
る交叉反応性、シＹ、・ｉ−０ンビンおよび′″丁４Ｔ
に対する結合の強さを検定ｊ、　、　　）　ｒｖンビン
およびＴＡＴに対し、て２択的に強く結合し、免疫学的
測定に使用できる抗体活性を右゛１゜、てい６　、こと
を確認！、′て゛丁’ＡＴ測定用（１：供する、前述・
力Ａ、ｌ：　＜して得らｔｔ　、４＝抗ヒト・トロンヒ
ンボリクローナ）Ｌ抗体は、完♀ｑｊＪＬｆ＜の抗体の
ままで使用することができる、：とは４．）ちるんの、
二と　その本質的紡合能が維持されている限り、その断
片、例えばＦａｂ　、　Ｆａｉ＝’あるいはＦ　（ａｂ
’　Ｌでアラてもよい。しかし７好ましいのは完全な形
の抗体又はそのＦ（ａｂ’）２断片であり、最も好呼し
いのけ完全な形の抗体である７゜ 本発明の免疫測定糸て＃！Ｍ’：’、ピ、ζａ）−・１
（ｔ）の特性ヲ有する抗ヒト・ｔ−Ｉフンピ）ポＩＪり
「７−・−ナル抗体を２不溶性担体に対し比較的低い密
度で結合させる点に特徴を有している９かくすることに
より、ヒト検体中のＴＡＴを高感度に且つ安定して測定
することが可能となる。

本発明において、不溶性担体に結合させるべき抗ヒト・
トロンビンポリクローナル抗体は、その不溶性担体に対
する飽和結合量の２〜２５％、好ましくは４〜２０％の
範囲である。飽和結合量の２％より少ない抗体の結合量
では４．充分な感度でＴＡＴの測定は困難であり、一方
２５％よりも多い抗体の結合量では血清干渉が起り易く
なり、ＴＡＴの測定悪魔が大巾に低下する傾向を示す。

ここで飽和結合量は、使用する不溶性担体に対する抗ヒ
ト・ト［ｌンビンボリクローナル抗体の通常の条件下に
おける最大結合Ｉであって、例えば下記の条件下で測定
した値を飽和結合量として見做すことができる。

すなわち、濃度１００μｇ　、’　ｍｌの抗トロンビン
ポリクローナル抗体溶液（０，１２５Ｍ　　Ｎａ１ｌを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４；　ＰＢＳ）に
不溶性担体を浸潤するように加え、４°Ｃで１２時間静
置し７、洗浄後、担体に吸着し、ている抗体の結合量を
飽和結合量とし５て定めることができろ。

前記本発明の抗し’Ｉ’　　１”　’７・ビンボｉ、１
り１；−ナル抗体を固定する不溶性４Ｕ体、にｆ−、て
は１例えばボリスヂｊノン８．ぜ１；エキトパ〆、ホリ
プ゛ロビレン・、ボリエスデ／＋、　　ボ！Ｊ　７”　
：７リル二：トリル、弗素樹脂、架橋デ吉・ストラン、
ボリザ・ツカライドなどζフ゛〉高分子、その他紙、ガ
ラス、金属、７ガ’＋′ＴＩ＝−・スＪ゛上び。

これらの組合せなどを例示することができるにの中でポ
リスチレン、ボリノ゛ロビ１／ンが好まし、い。

またイ・溶性担体の形状としては　例えばト１７・イ状
、球状７繊維状１．棒状２盤状、容器状、セル、試＠管
などの種々の形状であることがてさる、この中でウニ“
ル等のトＬ５・イ状、球状、棒状等が好ましい、２ 前記した本発明の不溶性担体に対する飽和結合ｌの２−
・２５％の抗体結合割合は、通常の平滑な表面を有する
不溶性担体の場合５不溶性担体の表面の１，２当り、約
０．０’ｌ−・（１，ｉ　ｕ　ｆの量のポリクローナル
抗体が結合していることになる９ このような本発明の比較的低い密度でポリクローナル抗
体を不溶性担体に結合させるなめには、不溶性担体の性
留およびポリクローナル抗体の濃度から予め簡単な実験
により、その濃度と抗体の結合量の関係を調べておき、
所望の結合量になるように抗体の濃度を決めるのが、比
較的簡便な方法である。

例えば、表面が平滑なポリスチレン製のウェルプレート
に対して０本発明の前記範囲のポリクローナル抗体を結
合させるには、その抗体溶液濃度を１１．ｔ　ｇ　、′
ｍ１−５メｔ　、？、、”ｍｌと！Ｌ”　、　１ｔ）Ｏ
；、ｔ　Ｕ　、／’ウェルの割合で前記溶液を］■之、
ｄ　’＜”、蚕′−・晩放置後、Ｐ　Ｂ　Ｓて２　！Ｏ
Ｉ！洗浄すればよい、。

−２Ｌｉ、抗トロンビン〕オテリクローナル抗体が結合
している結合１未知の不溶性担体の結合１の測定方法と
！、＝ては１、例えば本発明の結合量既知の第１次杭木
と同１．２条件Ｉ・て°゛］゛八″ｉへを反ｉ５さｉ、
か、（゛製織化した抗へＴＩエポフク−７−す！−ど杭
体で検出１．７一方前述しか飽和結合量を求める片法で
その不溶性担体に対する飽和結合量を調べて、その値を
比較することによって抗ヒト・トロンビン抗体の結合割
合を求めることができる。

本発明の免疫測定系において、標識抗体を結合した第２
抗体として用いられる抗ＡＴ［［ポリクローナル抗体と
しては、ＡＴＩ［Ｉに結合するものであれば特に限定は
なく、またこれらの抗体は完全な形の抗体のままで用い
うろことはもちろんのこと、その本質的結合能が維持さ
れる抗体断片、例えばユニバレントの抗体、Ｆａｂ、　
　Ｆａｂ’　　（Ｆａｂ’）２等として用いることもで
きる。これらのなかでＦ　ａ　ｂ　’２が感度の面から
好ましい。かかる抗ＡＴＩポリクローナル抗体は、従来
公知の方法でヒト・Ａ　’Ｔ”　ＩＩｆを抗原として兎
、山羊等に免疫して得られ、Ｆａｂは得られた抗Ａ　′
Ｔ　Ｉ［［ポリクローナル抗体をＮ１５ｏｎ。

ｆｆらの方法（Ａ、　Ｎ１５ｕｏｆｆ　ｅｔ　ａｔ、、
　Ａｒｃｈ、　Ｂｆｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
８９．２３０．　１９６０ｇ照、７）、二１と）あるい
は石川らの方法く１酵素免疫測定法第３版」医学書院参
照のこと）にし、たが・ってペプシンで分解し、得られ
た（Ｆａｂ’）２を還元反応に付して得られる。

標識物質と、かかろ抗Ａ　Ｔ　ＩＩＩポリクローナル抗
体との結合はグルタルｒルデヒド法、マレイミド法等、
常法に従って行うことがて゛きるが、ながで６２抗体の
硫黄源−ｒを介して、標識物質を結合したものが好まｌ
い、かかる場合−標識物質はあらかじめ°？レイミド化
など１１，７、硫黄原子とり）反応性を高めておくこと
？２、できろ、こ、：、て・抗Ａ　’１”　ＴＪＪポリ
クロ−・ナル抗体標識物質を結合しかものを第２吹拭体
として用いる。

本発明において用いられる標識物質としては、酵素、蛍
光物質、発光！！−！７１＠および放射性Ｏ１質等を使
用するのが有利であり、特に酵素であることが好まｉ６
い１．酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−Ｄ−ガラクト・シダーゼ、蛍光物質
とし、ては、フルオＬ・・ノセ・ｆンイソチオシアネー
ト、フィコビリｙｔコテイン等、発光物質とし、ではイ
ソルシノール、ルミ／ゲニン等、そして放射性物質とし
ては、１２５【、１　ｉ　、１４Ｃ１３Ｈ等を用いるこ
とができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学
的測定法に使用し得るものであれば、他のものでも使用
できる。

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するた
めに基質、必要により発色剤が用いられる。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質と
してＨ２Ｏ２を用い、発色剤としてｌ　２＋　＝アジノ
ジー［３−エチルベンズチアゾリニ／、スｌレホン酸］
アンモニウム塩（ＡＢ’ｒＳ）、５−アミノサリチル酸
、０−フェーレンジアミン、４−アミノアンチピリン、
３．３’、５．５’　−一一デ・トラメチルベンジン等
、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質
として０−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフル
オレセ・イン−ジー　（β−Ｄ−ガラクトヒラ７．ノシ
ド）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド等を用いることができる５ 前記した本発明め第１抗体および第２抗体を使用して免
疫学的に丁ＡＴを測定するヒト検体としては、ＴＡＴが
含有しているヒト体液であればよく、例えば血液、尿あ
るいはそれらの処理物または分画物が好ましく、通常血
清または血漿が適当である。

本発明において用いられるヒト検体試料は、０．６〜１
．５モル濃度の塩化ナトリウムを含有する緩衝液を用い
て希釈して使用することが好ましい。

ｌＨｆ液中の塩化ナトリウムが０．６モルよりも少ない
とＡＴｎｌが不溶性担体に直接結合し易くなり、第２吹
拭体が不溶性担体に直接結合したＡＴＩＩＩと結合して
しまい好ましくない。また、緩衝液中の塩化ナトリウム
が１．５モルよりも多いと、抗原抗体反応が阻害されて
しまう。

次に本発明によるＴ　Ａ　Ｔの免疫学的測定方法、それ
に用いる測定試薬およびキットを具体的に説明する。

ＴＡＴの　疫掌的測　　法； 前記（ａ）〜（ｄ）の特性を有する抗ヒト・トロンビン
ポリクローナル抗体をその結合量が前記範囲となるよう
に適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に固定
化する。次いで不溶性担体と測定しようとするヒト検体
試料との非特異的結合を避けるために適当な物質（例え
ば牛血清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体を必要に応じて緩衝液で希釈された被検体試料と一
定時間および一定温度で接触させ反応さ、せる。この間
に第１抗体とヒト検体試料中のＴ’　Ａ　Ｔが結合する
。次いで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物質（例
えば酵素）で標識したＡＴＩ［Ｉに対するポリクローナ
ル抗体（第２抗体）の溶液（例えば水溶液）を、第１抗
体に結合したＴＡＴと一定時間および温度で接触させ反
応させる。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担
体上に存在する第２抗体に標識された標識物質の量を測
定する。

かくしてその値から検体試料中のＴＡＴの量を算出する
ことができる。

測定試薬およびキットの構成 Ｔ　Ａ、　Ｔの免疫学的測定用の測定試薬は、上述した
第１抗体試薬と第２抗体試薬とからなる。

また、ＴＡＴの免疫学的測定用のキットは、ｌ）前記第
１抗体、 ２　前記第２抗体、 ３）溶解剤、 ４　洗浄剤、 ５　標準物質及び ６　標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定す
るための基質及び反応停止剤 を組合せて構成される。

前記キットにおいて（３）溶解剤としては、免疫学的測
定に通常使用されるものであればよく、例えばリン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨ
が６．０〜８．０の範囲のものが好適な例として示され
る。さらに（４）洗浄剤としては、同様に免疫学的測定
に一般的に使用されているものがそのまま使用される。

その例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液及びこれらの混合液が挙げられる。これら洗浄
剤にはさらにトリトンｘ１００、Ｔｗｅｅｎ　２０また
はＢｒ１ｇ　３５の如き非イオン系界面活性剤、ドデシ
ル硫酸ナトリウムの如きイオン系界面活性剤を加えられ
ていてもよい。

また（５）の標準物質としては、Ｔ　Ａ　Ｔとして精製
されたものが使用されるが、その目的から見て、ヒト・
アンチトロンビン■、その分解物及びヒト・トロンビン
を実質的に含みたいＴＡＴが使用される。かかるＴＡＴ
としては、以下に説明する本発明者らが見出した方法に
より、得なものを使用することが有利である。

製ＴＡＴおよび　のなめのプロセス 本発明者らの研究によれば、下記プロセス（Ｉ）および
（Ｉ）により精製されたＴＡＴが容易に得られ、このＴ
ＡＴは、ヒト・アンチトロンビン■、その分解物および
ヒト・トロンビンを実質的に含有しない。従って得られ
た精製ＴＡＴは、前記本発明の免疫測定系における標準
物質として使用できる。

Ｚ旦竺区」ユ上 （１）　　ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合
体の含有液をヘパリンを固定化した不溶性担体と接触さ
せてヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体を該
不溶性担体に吸着させ、（ｉｉ）　　該不溶性担体を洗
浄し、 （１ｉｌ）　　次いで該不溶性担体に吸着したヒト・ト
ロンビン・アンチトロンビン■複合体を溶出せしめ、（
ｉｖ）　　得られた溶出液からヒト・トロンビン・アン
チトロンビン■複合体を分離する、 ことを特徴とする前記含有液から精製ヒト・トロンビン
・アンチトロンビン■複合体の分離方法。

プロセス（■ン （ｉ）　　ヘパリンを固定化した不溶性担体の存在する
系中においてヒト・トロンビンとヒトアンチトロンビン
ＩＩＩとを反応させてヒト・トロンビン・アンチトロン
ビン■複合体を形成せしめ、（ｉｉ）　　該不溶性担体
に吸着したヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合
体を取得し、 （＋＋Ｄ　　次いで該不溶性担体に吸着したヒト・トロ
ンビン・アンチトロンビン■複合体を離脱せしめ、Ｍ　
得られた溶液からヒト・トロンビン・アンチトロンビン
■複合体を分離する、 ことを特徴とする精製ヒト・トロンビン・アンチトロン
ビン■複合体の製造方法。

前記プロセス（Ｉ）およびＮＩ＞において、不溶性担体
としては、本発明の免疫測定系で使用しうる前記したも
のを同様に使用することができるので、ここでは具体的
説明を省略する。

前記プロセス（Ｉ）において、ＴＡＴ含有液としては、
ヒト・トロンビンとヒト・アンチトロンビンＩＩＩとを
、例えば１　：　２へ＝２　：　１のモル比で反応させ
ることによって得られた反応液が好適に使用される。ま
たプロセス（１）および（ＩＩ）において、ＴＡＴを吸
着した不溶性担体からＴＡＴを溶出または離脱させるた
めに使用する媒体としては塩化ナトリウム水溶液を使用
するのが好ましく、その濃度としては０．１５〜０．７
５Ｍの範囲が適当である。

さらにプロセス（ＩＩ）の（１）において、ヘパリンを
固定化した不溶性担体の存在する系において、ＴＡＴを
形成する場合、前記不溶性担体が存在する容器、例えば
前記不溶性担体ピースを充填したカラム容器中に、ヒト
・トロンビンを先ず供給し、次いでヒト・アンチトロン
ビン■を供給するか、その逆の順序で供給するかあるい
は同時に供給することができるが、予めヒト・トロンビ
ンを供給し、次いでヒト・アンチトロンビン■を供給し
て、形成したＴＡＴを前記不溶性担体に吸着させること
が好ましい。

前記プロセス（Ｉ）および（ＩＩ）によれば、ヒト・ア
ンチトロンビン■、その分解物およびヒト・トロンビン
を実質的に含有しない高純度のＴＡＴを得ることができ
、これは前記免疫測定系における凛準物質として有利に
使用される。

以下実施例を掲げて本発明を詳述するが、本発明はこれ
らに同等限定を受けるものではない。

実施例１ トロンビンポリクローナル抗体の製造 ａ）　ヒト・トロンビンによるウサギ免疫精製ヒト・ト
ロンビンを生理食塩水で希釈し、下記衣１の要領でウサ
ギ免疫を行った。

表１ 全採血後、°ウサギ血液はガラス容器中に４°Ｃで一晩
放置し、抗血清を得た。ウサギ１羽から得られる抗血清
量は４５〜５０ｍ１であった。

ｂ）　ウサギ抗血清から抗体精製 ａ）により得られたウサギ抗血清４５ｍ１をセファロー
ス４Ｂカラムに通した後、ヒト・トロンビン固定化セフ
ァロース（１０ｍｇ　）ロンビン／ＩＯ＋ｎ＋セファロ
ース）に９ｍｌ／ｈｒの流速で通した。

０、５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７゜４）３００　ｍｌでカラムを洗浄しな。次に０．２
Ｍ　ＮａＣｌを含む１Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２，５）でカラ
ムに吸着している抗体を溶出しな。溶出抗体は、すぐに
Ｔｒｉｓ溶液で中和し、生理食塩水に対して充分透析し
た。抗体濃度はプロティン・アッセイキット（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ■）により決定した。最終的に４．８ｍｇの抗ト
ロンビンポリクローナル抗体を精製し得た。

実施例２　抗トロンビン抗体の解離定数の測定精製した
抗トロンビン抗体をＩｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ　（Ｂｉ。

−Ｒａｄ社製）を用いて１２５Ｊ（ヨウ素−１２５）放
射標識化し、抗体溶液を調製した。

９６ウエル・マイクロタイタープレート（ＦＬＯＷＬＡ
Ｂ、社製、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）　、精製したヒト・トロ
ンビン、ヒト・プロトロンビン、ヒト・トロンビン・ア
ンチトロンビン■複合体の溶液各々を１μｇ／ｍ１の濃
度で５０μ、Ｑ　／ウェル加え、４℃で一晩吸着せしめ
た・。抗原溶液を除去後、１％Ｂ　Ｓ　Ａ、　０．１２
５Ｍ　　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファ　−（
ｐＨ７，２）１００μ、１！／ウエルで加え、室温で２
時間放置した。

ＢＳＡ溶液除去後、該プレートのウェルに０．０１〜５
μｇ　／　ｍｌの範囲で種々の濃度になるように調製し
な。１２５■標識化抗トロンビン抗体を加え、３７℃で
２時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含む１０
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，２）を１００μρ／ウ
ェル加え、３回ウェルを洗浄した。

ウェルをプレートから切抜き、プラスチック試験管に入
れて、ガンマカウンターで１２５■−放射活性を測定し
な（固相化抗原に結合した放射活性；、Ｂｏｕｎｄ　（
ｃｐｍ））。同時にウェルに加える前の抗トロンビン抗
体溶液の放射活性も併せて測定した（添加した抗体の全
放射活性；　Ｔｏｔａｌ　（ｃｐｍ）ｌ。

横軸に添加した抗トロンビン抗体の濃度を、縦軸にＴｏ
ｔａｌ　−Ｂｏｕｎｄ　　（固相化抗原に結合しなかっ
た放射活性；　Ｆｒｅｅ　（ｃｐｍ））とＢｏｕｎｄと
の比をとり、５ｃａｔｃｈａｒｄ　ｐｌｏｔから解離定
数（ＫＤ）を計算しな。

解離定数（ＫＤ） ヒト・トロンビン；　３．１７Ｘ　１０−７Ｍヒト・プ
ロトロンビン；５．０ＸＩＯ’″７Ｍ以上ヒト・トロン
ビン・アンチトロンビン■複合体；］、　２６Ｘ　１０
−７Ｍ 実施例３　ヒト・プロトンビンに対する　差反応性 抗ヒト・トロンビン抗体５μｇ／ｍｌヲ１００μｐ／ウ
ェルで９６ウエルプレートウエルに加え、４℃で一晩放
置し、抗体をウェル固相に吸着させた。

抗体溶液を除去後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μ
！Ｊ／ウエルで加え、室温で２時間放置してウェル固相
をブロッキングした。続いて１２５■標識化したヒト・
トロンビン・アンチトロンビン■複合体（Ｔ　Ａ　Ｔ　
）　１０ｎｇ／　ｍｌ　（一定濃度）と種々の濃度のヒ
ト・プロトンビンとを混合し、１００μρ／ウエルで加
え、室温で４時間、固相上の抗ヒト・トロンビン抗体と
反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０，１％
ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄後、ウェルをプレートか
ら切断し、試験管に入れてγカウンターで各々のウェル
の放射活性（ｃｐｍ）を測定した。

５　ＸＩＯ’　　（５００ｔｔ　ｇ／ｍｌ　）　ｎｇ／
ｍ１以上の濃度のヒト・プロトロンビンを添加すると、
プロトロンビンの影響を受は吸光度が上昇する。

すなわち換言すれば、ヒト・プロト白ンビンがＴＡＴ濃
度の５Ｘ１０’倍程度の濃度まで共存しても固相上の抗
ヒト・トロンビン抗体は選択的にＴＡＴを認識し、結合
することが判明した。すなわち、該抗体のプロトロンビ
ンに対する交差反応性は０．０５％以下である。

実施例４ 抗体の固相への吸着量の決定 トロンビンに対するポリクローナル抗体０．５ｍｇをＥ
ｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い
て１２Ｊ（ヨウ素）で放射標識化した。標識化された抗
体の割合は９８％であった。

放射標識化した抗体の濃度は波長２８０ｎｍにおける吸
光度を測定することにより０．８６ｍｇ／ｍｌと決定し
、比活性は５．ＯＸＩＯ８ｃｐｍ／ｍｇであった。

該抗体を０．５．１．２．５．５．１０．２０．４０．
８０゜１００μｚ　／　ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ
で希釈し、９６ウエルプレー）　（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ■
、ｈｉｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ。

ＰｖＣプレート〉に１００μｍ／ウェルの割合で加えた
。４℃で一晩放置後、ＰＢＳで２回、ウェルを洗浄した
。

各ウェルはプレートからカッターナイフ等で切り離し、
栄研チューブに入れγ−カウンターにより１２５■の放
射活性を測定した。その放射活性からウェルの固相に吸
着している抗体量〈８ｇ）を計算しな。また、抗体の不
溶性担体（ウェル）に対する飽和結合量は、０．６３２
μｇであり、各々の吸着量に関して飽和結合量に対する
割合〈％）を示し７た（表２）。

表 実施例５ 至適抗体固相吸着量の決定 実施例４と同様に、放射標識化していない抗トロンビン
抗体を吸着させな９６ウエ、ルプレートを用いて、実験
を行った。１亥。Ｂ　Ｓ　Ａ、−１月−ζ３を１５（１
μｇ、／ウェル加えて室温で２時間プロツギ〉′りしな
後、抗原溶？ｆｆ１（Ａ溶液；　Ｔ　Ａ　Ｔ　１０ｎｇ
／　ｍｌのみ、。

Ｂ溶液；　ＴＡＴ１０ｎｇ／ｍｌ＋ＡＴＩｆｆ５０μｇ
　／’ｍｌ＋プロトロンビン５０ＡＬｇ／ｍｌ）をそれ
ぞれ１００　μｆＪ　／ウェル加え、室温で１時間反応
させた。０４０５％Ｔｗｅｅｎ　２０および０．１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳで３回ウェルを洗浄後、パーオキシダ
ーゼ標識化した抗ＡＴ■抗体（Ｆａｂ’　）を１００μ
ρ／ウエルでウェルに加え、室温で１時間反応させた。

３回ウェルを洗、浄後基質溶液（ＡＢＴＳ）を１００μ
ｆＪ／ウエルで加えて、３０分後の吸光度（波長４１５
ｎｍ）を測定しな。

抗原Ａ溶液の吸光度をａ、抗原Ｂ溶液の吸光度をｂとし
てＴＡＴの濃度精度Ｃを下のよう・に定義した。

Ｃ＝　　　　　Ｘ１００　　（％） Ｃは１００に近ければ、より精度が高いことになる。逆
に低ければＴＡＴ測定の際、共存するＡ、Ｔ■、プロト
ロンビンの影響を受けていることになる。

結果を図１に示す。

図１のように抗体の固相・＼の吸着量が４．０〜ハ％の
範囲であればＴ　Ａ　′Ｔ’を精度よく：測定すること
ができる。この吸着量は少なずさては測定感瓜か出す、
多すぎてはＡＴＩＩＩとプロ１〜ロンビンの影響を受け
る。

表面を研磨していないビーズ（以下、粗面ビーズＡと表
記、φ６．２８ｍｍ、表面積未知）と表面を充分に研磨
したビーズ（以下、開面ビーズＢと表記、φ６．２８ｍ
ｍ、表面積１．２４ｃｏ！　＞を各々１２５■標識１ヒ
した抗ヒト・トロンビン抗体溶液（０，５〜８０μｇ／
ｍｌ）に入れ、４℃で一晩放置し、抗体をビーズ固相へ
吸着させた。

ビーズをＰＢＳで２回洗浄後、試験管に入れてビーズに
吸着している抗体の放射活性（ｃｐｍ）を測定した。該
活性（ｃｐｍ）と抗体溶液の比活性（ｃｐｍ／μｇ）か
らビーズ固相への抗体吸着量（８ｇ）を計算した。その
結果、粗面ビーズＡの抗体吸着量は鏡面ビーズＢの１．
６０倍であることが判明した。

鏡面ビーズＢの表面積は１．２４ａｌｉであり、一方粗
面ビーズＡの表面積は表面に凹凸があるため不明である
。抗体吸着量の比から、粗面ビーズＡの見かけ上抗体が
吸着しうるのに有効な表面積は鏡面ビーズＢの表面積の
１．６０倍、すなわち１．２４ａ＆　Ｘ　１．６０＝　
１．９８２と計算できる。

抗体の固相（不溶性担体）に対する飽和吸着量は、図２
に示すように抗体溶液１００μｇ　／　ｍｌの時に、鏡
面ビーズＢでは０．６３３μｇ、粗面ビーズＡでは１．
０１０μｇである。これらの量を１００％として各吸着
量の割合（％）を求め、実施例５と同様にＴＡＴの測定
精度を計算した。その結果を図３に示す。粗面ビーズＡ
と鏡面ビーズＢは共に吸着量の割合が４．０〜２０％で
ＴＡＴを精度よく検出できることが判明した。

実施例７ 抗　　　　相の一価方法 １μｇ　／　ｍｌおよび５μｍ／ｍｌ濃度の抗体溶液を
９６ウエルプレートのウェルに添加し、実施例４に示し
た如くプレート固相に抗体を吸着させた。ここでプレー
ト固相に対する抗体の飽和結合量は０、６３０μｇであ
った。また別に抗トロンビン抗体が吸着しである（吸着
量未知）プレートを用意した。以下実施例５に示したよ
うにＢＳＡでブロッキング後Ｔ　Ａ　Ｔ　１０　ｎ　ｇ
／　ｍｌを反応させ、パーオキシダーゼ標識化抗ＡＴｌ
ｌ［抗体（Ｆａｂ’　）で検出した。基質（ＡＢＴＳ）
を加えて発色後、３０分の吸光度（Ａ４Ｇ！ｌ）を検定
し、表３に示しな。

表　　　３ 上記の如く吸光度が０．２８６〜０．４９４の範囲にあ
るものは抗体の飽和結合量に対する割合が４．０〜１９
．７％の範囲にあるものと考えられ、本発明の要領と同
じである。本実施例で使用した吸着量未知のプレートは
吸光度が０．５８３であり、０．２８６〜０、４９４の
範囲を超えているため、抗体の固相吸着量が異なるもの
である。

実施例８ ＴＡＴ標準物質の製造（１） 試験管にヒトＡＴＩＩ［溶液（０，５ｍｇ／ｍｆ、１ｍ
１２０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ　ｐＨ７，４溶液）を入れ、室温でマグネティック
スターラーで攪拌しながら、精製トロンビン溶液（０，
５ｍｇ　／ｍｌ、　Ｏｊ　ｍｌ　　２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ、　０．１５Ｍ　Ｎａｅｌ　ｐＨ７，４溶液）を
加えた。この際、トロンビン溶液は滴加し、約１０分程
度かけてＡＴｌ［溶液と混入した。その後、３７℃恒温
槽中で３０分間反応させ、ＴＡＴを生成させた。最後に
４０単位／　ｍｌのアプロチニン（トラジロール）を添
加し、反応を停止し、氷の中（０℃）に試験管を入れた
。続いてヘパリン−５ＰＷカラム（東ソー製）を用いる
高速液体クロマトグラフィーにより未反応のトロンビン
、ＡＴｌｌ［と生成したＴＡＴとを分離し、精製した。

分離の条件は下記の通りである。

１）　流速；　０．５　ｍｌ／ｍ１ｎ ２１　　ＮａＣｌ濃度勾配 Ａ液：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐｌ（７，４Ｂ
液：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−１，５Ｍ　Ｍａｉ
ｌ　ｐＨ７，４図４−　（１）にＴＡＴ溶出パターンを
示す。図４−（２）に精製したＴＡＴの５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ結果を示す。

３）３８〜３９分に溶出するピークを分取分取しなＴＡ
Ｔ溶液は０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸Ｉ
ｆｆ液（ｐＨ７，４）に対して充分に透析後、濃縮した
。複合体の濃度はプロティン・アッセイ　キット（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ■）を用いて決定した。

４０°Ｃ冷凍庫中に保存した。

精製ＴＡＴの純度指 一精製ＴＡＴの５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）− ヘパリンカラムから溶出・分取しなＴＡＴ溶液を１μｇ
及び２μｇ相当を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲ
ル濃度１０〜２０％、第一化学薬品■）にＡｐｐｌｙ　
Ｌ、電気泳動を行った。泳動後ゲルはＣＢＢ（クマジー
・ブリリアント・ブルー）染色しな。ゲル・スキャナー
（ＳＰＶ−９０００，島津■）を用いて染色した蛋白バ
ンドの検出を行った結果、ＴＡＴ蛋白の染色バンド（分
子量９５に〜１００Ｋ）以外には検出されなかった。

ヘパリン−５ＰＷカラム（東ソー製）に精製ヒト・トロ
ンビン溶液＜　０．５　ｗ／　ｍｌ　、　０．３　ｍｌ
　、　２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　０．１５Ｍ　　Ｎ
ａＣｌ　ｐＨ７，４溶液）を流入し、トロンビンをヘパ
リンに結合させた。続いて、ヒト・アンチトロンビン■
溶液（０，５■／ｍｌ、１．０ｍｌ、　２０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ　、　０．１５Ｍ　　Ｎａｅｌ　ｐＨ７，
４溶液）をヘパリン−５ＰＷカラムに流入し、室温で２
時間放置し、カラム中でトロンビン・アンチトロンビン
■複合体を形成させた。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ
　ｐ）Ｉ　７．４でヘパリン−５ＰＷを洗浄後、ＮａＣ
Ｉ濃度勾配を用いて、ＴＡＴを分離、精製した。

ヘパリン−５ＰＷカラムからのＴＡＴの分離・溶出パタ
ーンを図５に示す。

実施例９ パーオキシダーゼ標識化抗ＡＴＩ［［ポリクローナルＦ
ａｂ’の作成 ＡＴＩ［［に対する市販のウサギ抗血清１０ｍ１をＡＴ
■固定化セファロースに通し、抗ＡＴＩＩＩ抗体１．５
ｍｇを精製した。

精製抗ＡＴＩ［［抗体を石川らの方法に従い、酵素清化
およびゲル濾過を行い、Ｆａｂ’画分０．３ｍｇを得た
。次いでＳＨ化した酵素パーオキシダーゼ０．３ｍｇと
Ｆａｂ’画分を混合し、ゲルア過法によってパーオキシ
ダーゼ標識化抗ＡＴＩ［［ポリクローナルＦａｂ’を精
製した。濃度はプロティン・アッセイキットを用いて決
定した。

実施例１０ ヒト血漿　のＴＡＴの測定 ａ）　プロトロンビンの測定系に及ぼす影響の検定抗ト
ロンビンポリクローナル抗体を２μｇ／ｍ１の濃度で９
６ウエルのマイクロタイタープレートに加え、固相に吸
着させた。該抗体のプレート表面固相への飽和吸着量は
、０．６３０μｇであり、また固相への飽和結合量に対
する割合は７．８％である。

牛血清アルブミンで固相をブロッキング後、ＴＡＴを種
々の濃度になるように、プロトロンビン（２５μｇ／ｍ
ｌおよび５０μｓ／ｍｌ＞を含む溶液（希釈液；　２０
ｍＭ　　ＴｒｉＳ−）ｆｃＩ　−１，５Ｍ　ＮａＣｌ。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０．１単位／ｍｌヘパリン；
　ｐＨ７−４１で希釈し、ウェルに加えて３７℃で１時
間反応させた。１％ＢＳＡおよび　０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ　２０を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−０，１２
５ＭＮａＣｌ　ｐＨ７，４（洗浄液）で３回洗浄した。

希釈液で２００ｎｇ　／ｍｌの濃度に希釈したパーオキ
シダーゼ標識抗Ａ　Ｔ　ｍ　Ｐａｂ’をウェルに加え、
３７℃で１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄後、基質
溶液を加え発色させて、ＥＬＩＳＡ　ＡＮＡＬＹＺＥＲ
（東洋測器■、ＥＴＹ−９６）により、各ウェルの吸光
度を測定した。その結果を図６に示した。プロトロンビ
ンを２５μｇ／ｍｌ、５０Ｍｇ／ｍｌ添加しても複合体
の測定にはほとんど影響を及ぼさなかった。

ｂ）血漿中の夾雑蛋白の測定系に及ぼす影響ａ）でプロ
トロンビンの代りに、希釈液で種々の濃度になるように
希釈した血漿を用い、ＴＡＴの測定を行った。その結果
を図７に示した。

１．５モル濃度のＮａＣＩを含む緩衝液を用いて１７１
６〜１／４に希釈した血漿中では夾雑蛋白の影響を受け
ずＴＡＴの検出は可能であった。

以下、本発明の実施態様を示す。

（１）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
抗体を固定化した第１抗体および抗ヒト・アンチトロン
ビン■抗体に標識物質を結合した第２抗体とを用いるヒ
ト検体中のヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合
体の免疫学的測定方法において、 （１）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５　×
１０−９Ｍ〜３．５　×１０−９Ｍの範囲であり、（ｂ
）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５　×
１０−７Ｍ〜５．５　×１０−７Ｍの範囲であり、 （ｅ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に
対する解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５　×１
０−７Ｍの範囲であって且つ（ｄ）ヒト・プロトロンビ
ンに対する交差反応性が０．０５％以下であり、 （ｉｉ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合
で結合している、ことを特徴とする免疫学的測定方法。

（２）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、不
溶性担体に対して、その不溶性担体に対する該ポリクロ
ーナル抗体の飽和結合量に対して４〜２０％の範囲の割
合で結合している、前記（１）による測定方法。

（３）該抗ヒト・アンチトロンビン■抗体は、抗ヒトア
ンチトロンビン■ポリクローナル抗体また。

はそれと同等のフラグメントである前記（１）による測
定方法。

（４）該ヒト検体は、０．６〜１．５モル／ｆＪ濃度の
塩化ナトリウムを含有する緩衝液に希釈して使用する前
記（１）による測定方法。

（５）該ヒト検体が、血清または血漿である前記（１）
による測定方法。

（６）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
抗体を固定化した第１抗体および抗ヒト・アンチトロン
ビン■抗体に標識物質を結合した第２抗体からなるヒト
検体中のヒト・トロンビン・アンチトロンビン■、複合
体を測定するための免疫学測定試薬であって、 （１）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５　×
１０−９Ｍ〜３．５　×１０−７Ｍの範囲であり、（ｂ
ｌ　ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５Ｘ
１０−７Ｍ〜５．５　×１０−７Ｍの範囲であり、 （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に
対する解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５　×１
０−７Ｍの範囲であって且つ（ｄ）ヒト・プロトロンビ
ンに対する交差反応性が０．０５％以下であり、 （Ｉｔ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合
で結合している、ことを特徴とする免疫学的測定試薬。

（７）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、不
溶性担体に対して、その不溶性担体に対する該ポリクロ
ーナル抗体の飽和結合量に対して４〜２０％の範囲の割
合で結合している、前記（６）による測定試薬。

（８）該抗ヒト・アンチトロンビン■抗体は、抗ヒト・
アンチトロンビン■ポリクローナル抗体またはそれと同
等のフラグメントである前記（６）による測定試薬。

＜９Ｈ１１不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクロー
ナル抗体を固定化した第１抗体、 （２）抗ヒト・、アンチトロンビン■抗体に標識物質を
結合した第２抗体、 （３）溶解剤 （４）洗浄剤 （５）標準物質及び （６）標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定
するための基質及び反応停止剤 を組合せてなるヒト検体中のヒト・トロンビンアンチト
ロンビン■複合体を測定するためのキットであって、 （１）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａｌヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５　×
１０−９Ｍ〜３．５　×１０−９Ｍの範囲であり、（ｂ
）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５　×
１０−７Ｍ〜５．５Ｘ１０−７Ｍの範囲であり、 （ｅ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に
対する解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５　×１
０−７Ｍの範囲であって、且つ（ｄｌヒト・プロトロン
ビンに対する交差反応性が０．０５％以下であり、 （ｉｉ）　　該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体
は、不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリ
クローナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合
で結合している、ことを特徴とする免疫学的測定キット
。

（１０）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、
不溶性担体に対して、その不溶性担体に対する該ポリク
ローナル抗体の飽和結合量に対して４〜２０％の範囲の
割合で結合している、前記（９）による測定キット。

（ｉｉ）該抗ヒト・アンチトロンビン■抗体は、抗ヒト
・アンチトロンビン■ポリクローナル抗体またはそれと
同等のフラグメントである前記（９）による免疫学的測
定キット。

（１２）　（ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が
２．５　×１０−７Ｍ〜３．５　×１０−９Ｍの範囲で
あり、（ｂ）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が
４．５　×１０−７Ｍ〜５．５　×１０−７Ｍの範囲で
あり、 （ｅ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複合体に
対する解離定数が０．５　×１０−７Ｍ〜１．５　×１
０−７Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロトロン
ビンに対する交差反応性が０．０５％以下である、 ことによって特徴付けられる抗ヒト・トロンビンポリク
ローナル抗体。

（１３）ウサギポリクローナル抗体である前記（１２）
による抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体。

（１４）ウサギに対し１回当りの免疫量が０．０５〜０
．２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり且つ合計の免疫量が０．
２５〜１．２５■／　ｋｇの範囲でヒト・トロンビンを
免疫し、そのウサギから抗ヒト・トロンビンポリクロー
ナル抗体を取得することを特徴とする前記（１２）に記
載の抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体の製造方法
。

（１５）ヒト・アンチトロンビンＩＩＩの分解物及びヒ
ト・トロンビンを実質的に含有しないヒト・トロンビン
・アンチトロンビン■複合体。

（１６）（ｉ）　　ヒト・トロンビン・アンチトロンビ
ン■複合体の含有液をヘパリンを固定化した不溶性担体
と接触させてヒト・トロンビン・アンチトロンビン■複
合体を該不溶性担体に吸着させ、 （ｉｉ）　　該不溶性担体を洗浄し、 ＋ｉｉＤ　　次いで該不溶性担体に吸着したヒト・トロ
ンビン・アンチトロンビン■複合体を溶出せしめ、 （ｉｖ）　　得られた溶出液からヒト・トロンビン・ア
ンチトロンビン■複合体を分離する、ことを特徴とする
前記含有液から精製ヒト・トロンビン・アンチトロンビ
ン■複合体の分離方法。

（１７）該含有液が、ヒト・トロンビンとヒト・アンチ
トロンビンＩＩＩとを反応させて得られた反応液である
前記（１６）による分離方法。

（１８）該溶出を塩化ナトリウム水溶液を用いて行う前
記（１６）による分離方法。

（１９）（ｉ）ヘパリンを固定化した不溶性担体の存在
する系中においてヒト・°トロンビンとヒトアンチトロ
ンビンＩＩＩとを反応させてヒト・トロンビン・アンチ
トロンビン■複合体を形成せしめ、 （ｉｉ）　　該不溶性担体に吸着したヒト・トロンビン
・アンチトロンビン■複合体を取得し、（ｉｉｉ＞　　
次いで該不溶性担体に吸着したヒト・トロンビン・アン
チトロンビン■複合体を離脱せしめ−１ Ｏ■　　得られた溶液からヒト・トロンビン・アンチト
ロンビン■複合体を分離する、 ことを特徴とする精製ヒト・トロンビン・アンチトロン
ビン■複合体の製造方法。

【図面の簡単な説明】

図１は抗体の固相吸着割合とＴＡＴ測定精度との関係を
表わしなものである。図２は抗体の固相への吸着量を表
わしたものである。図３は抗体の固相吸着割合とＴＡＴ
測定制度との関係を表わしたものである０図４（１）は
、トロンビンとアンチトロンビン■との反応物をヘパリ
ン−５ＰＷカラム（ＴＯ８Ｏ製）にかけて得られた溶出
パターンであり、図４（２）は、精製したＴＡＴの５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ　（１０〜２０％）電気泳動写真である。 図５はヘパリン−５ＰＷカラム（ＴＯＳＯ製）中で生成
したＴＡＴのカラムからの溶出パターンである。図６は
ＴＡＴ測定系に及ぼすプロトンビンの影響について示し
たものである０図７はＴＡＴ測定系に及ぼす血漿中夾雑
蛋白の影響について示したちのである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
   抗体を固定化した第１抗体及び抗ヒト・アンチトロンビ
   ンIII抗体に標識物質を結合した第２抗体とを用いるヒ
   ト検体中のヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複
   合体の免疫学的測定方法において、 （ｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５×１
   ０＾−＾９Ｍ〜３．５×１０＾−＾９Ｍの範囲であり、
   （ｂ）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５
   ×１０＾−＾７Ｍ〜５．５×１０＾−＾７Ｍの範囲であ
   （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
   に対する解離定数が０．５×１０＾−＾９Ｍ〜１．５×
   １０＾−＾９Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロ
   トロンビンに対する交差反応性が０．０５％以下であり
   、 （ｉｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、
   不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリクロ
   ーナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合で結
   合している、 ことを特徴とする免疫学的測定方法。 （２）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクローナル
   抗体を固定化した第１抗体及び抗ヒト・アンチトロンビ
   ンIII抗体に標識物質を結合した第２抗体からなるヒト
   検体中のヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合
   体を測定するための免疫学的測定試薬であって、 （ｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５×１
   ０＾−＾９Ｍ〜３．５×１０＾−＾９Ｍの範囲であり、
   （ｂ）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５
   ×１０＾−＾７Ｍ〜５．５×１０＾−＾７Ｍの範囲であ
   り、 （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
   に対する解離定数が０．５×１０＾−＾９Ｍ〜１．５×
   １０＾−＾９Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロ
   トロンビンに対する交差反応性が０．０５％以下であり
   、 （ｉｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、
   不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリクロ
   ーナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合で結
   合している、 ことを特徴とする免疫学的測定試薬。 （３）（１）不溶性担体に抗ヒト・トロンビンポリクロ
   ーナル抗体を固定化した第１抗体、 （２）抗ヒト・アンチトロンビンIII抗体に標識物質を
   結合した第２抗体、 （３）溶解剤 （４）洗浄剤 （５）標準物質及び （６）標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定
   するための基質及び反応停止剤 を組合せてなるヒト検体中のヒト・トロンビン・アンチ
   トロンビンIII複合体を測定するためのキットであって
   、 （ｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、 （ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．５×１
   ０＾−＾９Ｍ〜３．５×１０＾−＾９Ｍの範囲であり、
   （ｂ）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が４．５
   ×１０＾−＾７Ｍ〜５．５×１０＾−＾７Ｍの範囲であ
   り、 （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
   に対する解離定数が０．５×１０＾−＾９Ｍ〜１．５×
   １０＾−＾９Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロ
   トロンビンに対する交差反応性が０．０５％以下であり
   、 （ｉｉ）該抗ヒト・トロンビンポリクローナル抗体は、
   不溶性担体に対し、その不溶性担体に対する該ポリクロ
   ーナル抗体の飽和結合量の２〜２５％の範囲の割合で結
   合している、 ことを特徴とする免疫学的測定キット。 （４）（ａ）ヒト・トロンビンに対する解離定数が２．
   ５×１０＾−＾９Ｍ〜３．５×１０＾−＾９Ｍの範囲で
   あり、（ｂ）ヒト・プロトロンビンに対する解離定数が
   ４．５×１０＾−＾７Ｍ〜５．５×１０＾−＾７Ｍの範
   囲であり、 （ｃ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
   に対する解離定数が０．５×１０＾−＾９Ｍ〜１．５×
   １０＾−＾９Ｍの範囲であって、且つ（ｄ）ヒト・プロ
   トロンビンに対する交差反応性が０．０５％以下である
   、 ことによって特徴付けられる抗ヒト・トロンビンポリク
   ローナル抗体。 （５）ヒト・アンチトロンビンIIIの分解物及びヒト・
   トロンビンを実質的に含有しないヒト・トロンビン・ア
   ンチトロンビンIII複合体。 （６）（ｉ）ヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII
   複合体の含有液をヘパリンを固定化した不溶性担体と接
   触させてヒト・トロンビン・アンチトロンビンIII複合
   体を該不溶性担体に吸着させ、 （ｉｉ）該不溶性担体を洗浄し、 （ｉｉｉ）次いで該不溶性担体に吸着したヒト・トロン
   ビン・アンチトロンビンIII複合体を溶出せしめ、 （ｉｖ）得られた溶出液からヒト・トロンビン・アンチ
   トロンビンIII複合体を分離する、 ことを特徴とする前記含有液から精製ヒト・トロンビン
   ・アンチトロンビンIII複合体の分離方法。 （７）（ｉ）ヘパリンを固定化した不溶性担体の存在す
   る系中においてヒト・トロンビンとヒト・アンチトロン
   ビンIIIとを反応させてヒト・トロンビン・アンチトロ
   ンビンIII複合体を形成せしめ、 （ｉｉ）該不溶性担体に吸着したヒト・トロンビン・ア
   ンチトロンビンIII複合体を取得し、 （ｉｉｉ）次いで該不溶性担体に吸着したヒト・トロン
   ビン・アンチトロンビンIII複合体を離脱せしめ、 （ｉｖ）得られた溶液からヒト・トロンビン・アンチト
   ロンビンIII複合体を分離する、 ことを特徴とする精製ヒト・トロンビン・アンチトロン
   ビンIII複合体の製造方法。