JP2017083410A - トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業が不要であるラテックス凝集法においてアンチトロンビンの影響を回避してヒト血液中トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）を正確に定量できる試薬および方法を提供すること。【解決手段】被検者由来の血液試料中のＴＡＴをラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した、第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。【選択図】図５

Description

本発明は、生体試料中のトロンビン（Ｔ）・アンチトロンビン（ＡＴ）複合体(ＴＡＴ)を測定する試薬および方法に関する。

トロンビン・アンチトロンビン複合体(ＴＡＴ)は血液凝固が進行するときに血液中に産生されるタンパク質複合体で、血液中のＴＡＴの定量は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の血栓症の診断にとって有用である。しかしながら、ＴＡＴの存在量は遊離アンチトロンビンの存在量の約１００，０００分の１であるため、測定が容易ではない。
現在主流のＴＡＴ定量法は、シーメンス社のエンザイグノスト（登録商標）ＴＡＴ ｍｉｃｒｏ等の酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用いる試薬キット、およびＬＳＩメディエンス社のステイシア（登録商標） ＣＬＥＩＡ ＴＡＴ等の化学発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ)を用いる試薬キットを用いる方法があるが、いずれも固相・液相分離(Ｂ／Ｆ分離)が必要な測定法で、煩雑な洗浄作業が要り、手作業あるいは専用機器が必要である。

特許文献１〜４には、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用いる試薬系が報告されたが、いずれも体外で合成したＴＡＴをバッファーで希釈することで作製したサンプルの測定であり、ラテックス凝集法を用いて、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬の報告は無い。また、これらの文献はいずれも、抗体の特異性に依存してＴＡＴ測定試薬の構築をしているか、添加剤によってその交差反応性による影響を回避しているものである。特許文献５は、交差反応性を有さない抗体を使用するサンドイッチ測定法によるＴＡＴ測定について開示しているが、臨床的に利用するためには十分な感度ではない。
従って、測定が簡便なラテックス凝集法において、高感度・高精度に生体試料中のＴＡＴを測定する試薬及び方法が求められていた。

本発明者らは、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用い、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬を報告した（特許文献６，７）が、臨床応用のためにはさらなる改善の余地があった。

特開２００１−２８９８５０号公報 特開２００１−２２１８００号公報 特開平７−２３８０９９号公報 特開２００２−３１６９９９号公報 特開平３−４８１５８号公報 特願２０１５−０７４１６８号 特願２０１５−０７４１７３号

図１に記載されたように、ラテックス凝集法によるＴＡＴの測定では、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体、およびトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体の２種類の抗体が使用される。そして、原理的にはＴＡＴが存在するときのみに両抗体が結合してラテックス凝集が起こり、ＴＡＴの定量が可能となる。
しかしながら、特許文献６，７で用いられているようなＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応してＴＡＴに対する反応がアンチトロンビンに対する反応の１００倍以上のモノク
ローナル抗体を用いても、ＤＩＣの治療などで用いられるアンチトロンビン製剤中の物質の影響で非特異的な反応が生じ、不正確な測定結果となることがあることが本発明者らの検討によってわかった。これはおそらくアンチトロンビン製剤中に変性したアンチトロンビンの多量体が存在することに起因すると考えられる。このようなアンチトロンビン多量体は通常のアンチトロンビンに比べよりＴＡＴを形成した際のアンチトロンビンの構造に近いと考えられ、さらに多量体を形成していることにより、ＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上のモノクローナル抗体によって認識され、それ単独で凝集が生じ、これが非特異反応として本反応に上乗せされてしまうと考えられた。このようなアンチトロンビン多量体による非特異的反応はＢ／Ｆ分離が可能な測定法では生じない問題であり、本発明者が初めて発見したラテックス凝集法を用いたＴＡＴ測定試薬に特有の問題である。
なお、従来ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定試薬におけるアンチトロンビンの影響回避法としては特許文献１、２のような方法が知られているが、アンチトロンビン製剤により非特異的凝集が引き起こされること、およびその回避策については何ら示唆されていない。
したがって、本発明の課題は、Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業を必須としないラテックス凝集法を用いた、生体試料中のＴＡＴの測定試薬および測定方法において、アンチトロンビンの影響を回避して正確にＴＡＴの測定を行うことのできる試薬及び方法を提供することである。

この課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者は、ＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応し、ＴＡＴに反応するモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子と抗トロンビンモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子を用いた凝集反応の検出値から、ＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応し、ＴＡＴに反応するモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子のみの凝集反応の検出値を差し引くことで、アンチトロンビンの影響を回避して正確なＴＡＴの測定値が得られることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した、第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[２] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を前記第１の試薬と反応させ、次いで前記第２の試薬と反応させ、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[３] 前記被検者由来の血液試料が、アンチトロンビン製剤を投与された患者由来の試料である、[１]又は[２]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[４] 前記第１抗ＴＡＴ抗体がアンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体がトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、[１]乃至[３]のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定試薬。
[５] 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体である、[４]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[６] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、および、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬のそれぞれに試料を反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
[７] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
試料を、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、次いで、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬に反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
[８] 前記被検者がアンチトロンビン製剤を投与された患者である、[６]又は[７]に記載のＴＡＴ測定方法。
[９] 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であって、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体が、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、[６]乃至[８]のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定方法。

本発明によれば、ラテックス凝集法の試薬により、生体試料中の微量なＴＡＴをアンチトロンビンの影響を回避しつつ、正確に測定（定量）することが可能である。これにより、アンチトロンビン製剤投与患者血漿でも正確にラテックス凝集法によるＴＡＴ測定が可能になり、ＤＩＣの治療にも用いられるアンチトロンビン製剤の投与がなされた患者検体中のＴＡＴを正確に測定できることは診断上有用である。

ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定方法の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図。 間接阻害ＥＬＩＳＡ法によるクローンＴＡＴ−５の各抗原への結合性を評価した結果を示す図。 アンチトロンビン製剤添加血漿を用いた本発明方法の評価結果を示す図。 アンチトロンビン製剤投与非特異検体と通常検体を用い、本発明方法を対照法と比較した結果を示す図。

本発明のＴＡＴ測定試薬は、
被検者由来の血液試料中のＴＡＴをラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬がラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする。

以下に、本発明のＴＡＴ測定試薬の一例を、実施の一態様として記載するが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。
本発明のＴＡＴ測定試薬は、生体試料中のＴＡＴを測定するための、２種類のＴＡＴ抗
体をそれぞれ結合させたラテックス粒子を用いた、サンドイッチ系でのラテックス凝集法による免疫測定試薬である。

本発明に使用することができる抗体は、例えば、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体とトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体を組み合わせて使用することができる。
第１抗ＴＡＴ抗体としては、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよい。ＴＡＴに対する反応性と遊離アンチトロンビンに対する反応性に少なくとも１００倍以上の差を有する抗体が好ましく用いられる。第１抗ＴＡＴ抗体のＴＡＴに対する反応性は遊離アンチトロンビンに対する反応性より少なくとも１００倍以上であればよく、２００倍以上がより好ましく、１，０００倍以上であることがさらに好ましく、１０，０００倍以上であることが特に好ましい。交差反応性は少ないほどよいので上限は特にないが、例えば、１００，０００倍未満、または５０，０００倍未満であってもよい。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離アンチトロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。

ここで、本発明においてアンチトロンビン側に結合するとは、試料中に最も多く存在している遊離した状態のアンチトロンビンが、遊離トロンビンと結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のアンチトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するアンチトロンビンを複合体型構造アンチトロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するアンチトロンビンを遊離型構造アンチトロンビン（遊離アンチトロンビン）と称した場合、アンチトロンビン側に結合するとは、複合体型構造アンチトロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造アンチトロンビンは、複合体型構造アンチトロンビンと異なる構造を有する。それは、遊離型構造アンチトロンビンは、遊離トロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在するためである。

生体内におけるＴＡＴとＴＡＴを形成していない遊離アンチトロンビンの存在割合は健常人の測定値幅を参考として１：６０，０００〜１：１１０，０００の間と考えられるが、一般的には約１：１００，０００で存在していると考えられる。また、敗血症や肝疾患患者においてその存在割合が変化する場合が知られているが、遊離アンチトロンビン量が少なくなる場合でも１：５０，０００程度であるとされている。従って、第１抗体が遊離アンチトロンビンにも反応性を示すとＴＡＴの定量が困難になる。そこで、ＴＡＴを定量するには、遊離アンチトロンビンへの反応性が低い抗体を使用する必要があり、そのために、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上の抗体を用いる。

本発明において、「ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上」とは、各抗原に対する親和性の比が１００倍以上である場合や、後述の、間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したときの、一定割合の阻害率を示すのに必要な抗原量の比が１００倍以上である場合などが挙げられる。

ＴＡＴに対する反応性が、遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体（第１抗体）は後述の実施例に記載された方法で得ることができるが、以下に第１抗体を間接阻害ＥＬＩＳＡで評価またはスクリーニングする場合について説明する。
まず、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第１抗体の候補抗体）を用意する。このような抗体は、後述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法等により抗体を得たのち、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体を
選択すればよい。もちろん、あらかじめ、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体が存在する場合はそれを以下の評価系に供すればよい。

すなわち、候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ、又はＴＡＴの反応を阻害し得る抗原を含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。

例えば、まず、該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、一定量のＴＡＴをプレート等の基材に固相する。基材に固相する抗原（ＴＡＴ）の量は、当業者であれば、使用する抗原の分注量と評価対象の抗体の種類との関係を考慮して、適宜設定することができる。
該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、各濃度（例えば０．０４〜１μｇ／ｍＬ）の上記第１抗体の候補抗体を、上記ＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて、基材上のＴＡＴに結合した抗体の量を測定する。吸光度が１．０付近（表１の記載方法だと１０００）となる抗体濃度を決定する。この抗体濃度を、抗原による阻害時の抗体濃度とすることができる（表３；反応時濃度（μｇ／ｍＬ））。
次に上記方法で決定した濃度の候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴまたは遊離アンチトロンビンを含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
なお、抗体残存率は、抗原による吸収が未実施の時に得られる検出値を１００％として算出できる。

抗体の遊離アンチトロンビンに対する反応性が高い場合はＴＡＴに結合できる抗体の量が減るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が少なくなり（抗体残存率が低くなり）、一方、抗体が遊離アンチトロンビンに対する反応性が低い場合はＴＡＴに結合できる抗体が多く残るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が多くなる（抗体残存率が高くなる）。
この抗体残存率を、最初にＴＡＴと抗体とを反応させた（阻害反応をＴＡＴで行った）後に、反応液を固体化ＴＡＴと反応させたときの抗体残存率と比較する。

そして、例えば、遊離アンチトロンビンを５０μｇ／ｍＬ加えて阻害反応させたときの抗体残存率が５０％であった場合、同じ抗体残存率を示すのに必要なＴＡＴの量を上記のＴＡＴで阻害したときの結果から算出する。ＴＡＴで阻害したときに、抗体残存率５０％を達成するのに必要なＴＡＴ阻害抗原の量が０．５０μｇ／ｍＬ未満であれば、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上とすることができる。
このようにして選択された抗体を第1抗体として選択することができる。なお、第1抗体は、モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０^−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。

第１抗ＴＡＴ抗体として、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体を選択した場合、第２抗ＴＡＴ抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよく、トロンビンに対して特異的に反応する抗体を使用することができる。試料中において、遊離トロンビンはほとんど存在しないため、遊離ト
ロンビンに対して交差反応性を有する抗体であっても利用できることが多い。当業者であれば、適宜選択して使用することができる。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離トロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本発明においてトロンビン側に結合するとは、試料中に存在している遊離した状態のトロンビンが、アンチトロンビンに結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するトロンビンを複合体型構造トロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するトロンビンを遊離型構造トロンビンと称した場合、トロンビン側に結合するとは、複合体型構造トロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造トロンビンは、複合体型構造トロンビンと異なる構造を有する可能性が考えられる。それは、遊離型構造トロンビンは、アンチトロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在することによる。

第２抗ＴＡＴ抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であれば特に制限されない。モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０^−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。抗体を選択する方法については、第１抗ＴＡＴ抗体と同様にして作製した抗体を使用することができる。

また、本発明に使用する抗体として、例えば、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、即ちトロンビンやアンチトロンビンには反応しないが、ＴＡＴにのみ特異的に反応する抗体であって、エピトープが異なる２種類の抗体を組み合わせて使用することもできる。

上記の第１抗ＴＡＴ抗体及び第２抗ＴＡＴ抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれも使用することができる。これらの抗体は、当業者であれば、公知の手法に従って取得することができる。
抗体作製用に免疫原を免疫する動物としては、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が使用可能であり、特にポリクローナル抗体作製にはウサギ、ヤギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であり、この場合はマウス、ラット或いはウサギ等が好ましい。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。

免疫原としては、上述したように、ＴＡＴを使用してもよいし、ビトロネクチンが結合したＶＴＡＴを免疫原として作製した抗体を本願発明の使用することもできる。また、第１抗体の場合はアンチトロンビンを、第２抗体の場合にはトロンビンを使用してもよい。
これらの免疫原は、生体から採取された試料を原料として精製されたＴＡＴを使用してもよいし、遊離トロンビンと遊離アンチトロンビンを混合してｉｎｖｉｔｒｏで合成したＴＡＴを使用してもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得られるＴＡＴでもよいし、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを免疫原として使用してもよい。
また、立体構造の違いを部分的なペプチドのみで免疫させることが可能である場合、具体的に抗体の結合部位を特定して抗体を作製したい場合には第１抗体の場合はアンチトロンビン、第２抗体の場合はトロンビンの部分ペプチドを用いて作製することもできる。その場合の抗原としてのペプチド配列の選択やペプチド断片の合成方法、免疫方法は既知の方法を使用することができる。

本発明で使用される抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望の抗体のフラグメントであって、しかも、もとの抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）₂フラグメントに調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）₂がより好ましい。

本発明で使用する抗体は、まず、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法などによりＴＡＴ抗体（候補抗体）を得て、その後、ＴＡＴ抗体（候補抗体）の中から、上記のような手法及び基準で、第１抗体および第２抗体を選択することにより得ることができる。

第１抗体と第２抗体の組み合わせはラテックス凝集法においてＴＡＴの測定が可能であれば特に制限されないが、血漿などの生体試料中に含まれるマトリクス（バックグラウンド）の影響が最少の抗体組み合わせを選出することが好ましい。
ＴＡＴ測定試薬に求められる感度は、健常人と患者とを明確に区別できる基準値、或いはその２倍の濃度を測定できることが必要であるため、本発明の試薬は生体試料中の１０〜１５ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることが好ましく、３〜４ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ程度の濃度でも定量できる試薬であることがさらに好ましい。

上記の第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を結合させるラテックス粒子はラテックス凝集反応に使用し得るものであれば特に制限されないが、平均粒子径が０．０５μｍ〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．４μｍであることがより好ましい。
使用するラテックス粒子の種類は、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数種のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、平均粒子径０．０５μｍ〜０．５μｍという場合、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。当業者にとって、粒径が異なるラテックス粒子が含まれることは常識の範囲内であり、当業者であれば、その粒径の分布に大きく偏りの無い粒子群を含む溶液を使用してラテックス試薬の構築することが可能である。
なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析により算出される。

本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ₂）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる粒子を挙げられる。

ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
ラテックス粒子に抗体を結合させる際には、抗体が、上記のＴＡＴに対する反応性および特異性を維持できる条件で行う。抗体とラテックス粒子をどのように固相させて試薬の調製を行うかは、当業者であれば適宜設計することができる。

本発明のＴＡＴ測定法は、ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であってＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体（第１抗ＴＡＴ抗体）を含む第１の試薬に試料を反応させる工程（第１工程）、ラテックス粒子に結合した前記第１抗ＴＡＴ抗体、およびラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第２抗ＴＡＴ抗体）を含む第２の試薬に試料を反応させる工程（第２工程）、並びに試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程（第３工程）、を含む。

なお、試料を独立の反応系で第１の試薬および第２の試薬それぞれに反応させる場合は、第１工程と第２工程はいずれを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。この場合は、第２の試薬は、２種類のラテックス粒子にそれぞれ２種類の抗体を結合させたものでもよいし、１種類のラテックス粒子に２種類の抗体を結合させたものでもよい。
それぞれ独立の反応系で検出された、試料を第２の試薬と反応させたときの検出値から試料を第１の試薬と反応させたときの検出値を差し引き、得られた値に基づいてＴＡＴの値が算出される。これにより、アンチトロンビンによる非特異凝集の影響が除かれたＴＡＴの正確な量を測定することができる。

一方、他の態様として、試料をまず第１抗ＴＡＴ抗体を結合したラテックス粒子と反応させて検出値を測定し、次いで、同じ反応系に第２抗ＴＡＴ抗体を結合したラテックス粒子を加えて、試料を第１抗ＴＡＴ抗体及び第２抗ＴＡＴ抗体と反応させて検出値を測定し、後者から前者を差し引き、得られた値に基づいてＴＡＴの値を算出することも可能である。

本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＴＡＴを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではないが、生体試料であることが好ましく、哺乳動物由来の試料であることがより好ましく、ヒト由来の試料であることが更に好ましい。生体由来の試料としては、血清、血漿が特に好適に使用できる。好ましくは、アンチトロンビン製剤を投与された被検者由来の血液試料であって、更に好ましくはアンチトロンビン製剤を投与された被検者由来の血漿である。
アンチトロンビン製剤としては、献血ノンスロン（登録商標）５００注射用、献血ノンスロン（登録商標）１５００注射用（日本製薬）、アンスロビン（登録商標）Ｐ５００注射用、アンスロビン（登録商標）Ｐ１５００注射用（化学及血清療法研究所）、ノイアート（登録商標）静注用５００単位、ノイアート（登録商標）静注用１５００単位（日本血液製剤機構）、アコアラン（登録商標）静注用６００（協和発酵キリン）が例示される。

反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化する抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜
決定することができる。

本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＴＡＴを測定するために必要な反応時のラテックス粒子の濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。

本発明の試薬は、抗体を固定化したラテックス粒子以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤、非特異反応抑制剤、増感剤などを更に含有することができる。本発明の試薬に添加可能な増感剤としては、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。また、本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。

前記緩衝液としては、例えば、ｐＨ５．８〜６．６に緩衝能を有する緩衝液を使用することができる。６．０〜６．４であることがより好ましく、６．１〜６．３であることがさらに好ましく、６．１５〜６．２５であることが特に好ましい。１試薬系であれば、試薬のｐＨが上記範囲に調整されていればよいし、２試薬系であれば、混合したときにｐＨが上記範囲になるように構成されていればよい。例えば、緩衝液成分を主体とした試薬１と、抗体を固相したラテックス粒子を含む試薬２から構成される場合に、試薬１のｐＨが上記範囲に調整されており、両試薬を混合したときに、混合液のｐＨが上記範囲になるような態様が挙げられる。
ｐＨはｐＨ調節剤によって調節されてもよいが、緩衝液により調整されることが好ましい。トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用され、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。

本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

ラテックス粒子の凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＴＡＴ濃度を定量することができる。本発明では、ダブルカイネティック法を使用し、試料と第１の試薬混合時に生じる吸光度変化量とさらに第２の試薬を添加した後に生じた吸光度変化量とから、目的とする成分の量と比例関係を有する吸光度変化量を求め、予め標準液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速
度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。

本発明の試薬は、標準物質として使用し得るＴＡＴを含んでもよい。ＴＡＴは生体から精製されたＴＡＴでもよいし、遺伝子組み換えなどで合成されたＴＡＴでもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得ることができる。また、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等において、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを混合してＴＡＴを合成することもできる。

実施例１ 合成ＴＡＴの調製
市販のヒトトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）とアンチトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）をＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ（日水製薬株式会社製）」、を９．６ｇ／Ｌで溶解）で希釈し、１：３のモル比で混合後、３７℃で３０分間反応させた。３０分後、ＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル、和光純薬社製）を０．７５ｍＭになるように添加し反応を停止した。
得られた反応物には未反応のトロンビン、アンチトロンビンが含まれるため、予め５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）によって精製した。
ＴＡＴ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。得られたＴＡＴは０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈し、ＣＬＥＩＡ試薬（ステイシア(登録商標) ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ、ＬＳＩメディエンス社製）を用いて値付けした。これを合成ＴＡＴとして使用した。

実施例２ 抗ＴＡＴ抗体の調製
細胞融合法は、安藤民衛・岩崎辰夫/著「単クローン抗体/ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社）に従って実施した。
実施例１で調製した合成ＴＡＴ ５０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）と混合し、投与抗原とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、４週令）に２週間間隔で３回投与し、４回目の投与は半量の２５μｇを静注した。
１週間後、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−Ａｇ．８と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メルク社製）を用いて細胞融合を実施した。
ＨＡＴ選択培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマを合成ＴＡＴに対する結合活性を指標にスクリーニングした。すなわち、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合成ＴＡＴをそれぞれ０．２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製）に５０μＬ／ウェル添加した。４℃、Ｏｖｅｒ Ｎｉｇｈｔで反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。
次に、培養上清各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。
３７℃、１時間反応後、同様に５回洗浄しｏ−フェニレンジアミン溶液（和光純薬社製）を各ウェル５０μＬ添加した。室温で５〜１０分間反応後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止した。
プレート分光光度計（ＥＬ３１２ｅ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）
で４９２ｎｍの吸光度を測定した。合成ＴＡＴとの反応が良好な抗体を産生している細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、スクリーニングを行い、合成ＴＡＴと反応する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。

実施例３ 抗トロンビン抗体の調製
実施例２と同様の方法で免疫抗原をトロンビンとして、抗トロンビン抗体を得た。トロンビンに対して特異的に反応する抗体を選択し、このうちの１クローンを抗トロンビン抗体（Ｔ−１）として使用した。

実施例４ 間接阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の評価
間接阻害ＥＬＩＳＡ法によって、各抗体の反応性の評価を行った。間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図を図２に示す。
評価しようとする０．０４〜０．４μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴを認識する抗体（抗ＴＡＴ抗体）候補を阻害抗原（プロトロンビン（エンザイムリサーチ社製）、トロンビン、アンチトロンビン、合成ＴＡＴ）と混合し、インキュベートした。一部阻害された該抗体候補を一次抗体として、９６ウェルプレートに固相化した合成ＴＡＴと結合させた。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を二次抗体として結合させ、発色基質を添加し吸光度を測定した。また、発色の変化率から、抗体の残存率を計算した。
特定の抗体（ＴＡＴ−５）について、各阻害抗原を用いた時の吸光度を表１に、吸光度から計算された抗体の残存率を表２に示した。
例えば、ＴＡＴの阻害抗原濃度が１０μｇ／ｍＬの時の残存率は、２８５／１０６６×１００＝２６．７（％）となる。各抗体の各抗原濃度について残存率を算出した。なお、表中において、Ｐｒｏ−Ｔはプロトロンビンを、Ｔはトロンビンを、ＡＴはアンチトロンビンを示す。

また、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬで阻害をかけた時の残存率と同等の阻害率となるＴＡＴ抗原量を算出し比較することで、アンチトロンビンに対するＴＡＴの反応性差（倍率）を求めた。この違いが大きければ、アンチトロンビンと比較しＴＡＴに対する特異性が強いこと意味する。計算はＴＡＴの阻害曲線（阻害抗原添加濃度対数-残存率％）を描き、スプライン関数を用いておこなった。
例えば、ＴＡＴ−５の場合、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬの残存率は、７４．０％でありその残存率と同様となるＴＡＴ抗原量は１．１４４ μｇ／ｍＬである。すなわち、反応性の差は５０／１．１４４＝４４倍となる。（図３）。

その他、抗体クローン２７種類について上記倍率の計算を行った。添加ＴＡＴとアンチトロンビンの量の違い（倍率）が１００倍以上となる抗体は１３種類、１０００倍以上となる抗体は7種類、１００００倍以上となる抗体は２種類存在した。５種類の抗体について、表３に示す。

実施例５ アンチトロンビン製剤添加血漿における効果
試薬１：１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ（同仁化学社製） ｐＨ６．２、７００ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬社製）、０．０５％ エマルゲン１５０（花王社製）、０．２０％ アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．１５％ ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）を試薬１として用いた。
試薬２：ＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体（ＴＡＴ−１）を吸着したポリスチレンラテックス粒子と、抗トロンビンマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子を、各抗体感作粒子が７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（試薬２Ａ）、もしくはＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子のみを７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（試薬２Ｂ）をそれぞれ試薬２として用いた。
サンプル：アンチトロンビン製剤としてノイアート静注用５００単位（日本血液製剤機構社製）を０．３３または０．６６単位／ｍＬになるように添加した正常ヒトプール血漿またはアンチトロンビン製剤未添加の正常ヒトプール血漿をそれぞれ測定した。
測定機器：ＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）
パラメータ：サンプル量１２μＬ、試薬１ ９０μＬ、試薬２ ９０μＬ、主波長７００ｎｍに設定し、試薬２添加後の１分当たりの吸光度変化量をΔＡｂｓ／ｍｉｎとして測定した。

結果・考察
結果を表４および図４に示す。試薬２Ａのみの結果ではアンチトロンビン製剤の濃度依存的な凝集が生じたが、試薬２Ｂの結果を差し引くことでその影響が大幅に軽減され、アンチトロンビン製剤の影響を受けることなくＴＡＴを定量できることがわかった。

実施例６ 非特異凝集を生じる実検体における効果
試薬１：実施例５と同様
試薬２：実施例５の試薬２Ａ、２Ｂを用いた。
対照法：Ｂ／Ｆ分離を行うステイシアＣＬＥＩＡ ＴＡＴ（ＬＳＩメディエンス社製）を対照法として測定した。
サンプル：非特異が反応が認められたことから、アンチトロンビン製剤が投与されたと推定されるクエン酸Ｎａ血漿２検体（非特異１、２）と通常のクエン酸Ｎａ血漿２検体（通常１、２）を用いた。
標準品：ＴＡＴキャリブレーター（ＬＳＩメディエンス）により値付けを行った。
測定機器・パラメータ：実施例５と同様に行った。試薬２Ａのみの結果から算出したΔＡｂｓ／ｍｉｎと（試薬２Ａ−試薬２Ｂ）の結果から算出したΔＡｂｓ／ｍｉｎそれぞれの結果からＴＡＴ濃度を算出した。

結果・考察
結果を図５に示す。非特異１、２について試薬２Ａのみの結果では対照法と大きな乖離を生じたが、試薬２Ｂの結果を差し引くことで対照法と近い測定値となった。また、非特異反応のない検体については差し引きの有無で測定値に変化はなく対照法と測定値が一致していた。したがって、本発明の方法により、簡便にアンチトロンビン製剤の影響を受け
ることなくＴＡＴを定量できることがわかった。

Claims (9)

1. 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した、第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
2. 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を前記第１の試薬と反応させ、次いで前記第２の試薬と反応させ、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
3. 前記被検者由来の血液試料が、アンチトロンビン製剤を投与された患者由来の試料である、請求項１又は２に記載のＴＡＴ測定試薬。
4. 前記第１抗ＴＡＴ抗体がアンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体がトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定試薬。
5. 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体である、請求項４に記載のＴＡＴ測定試薬。
6. 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
   ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、および、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬のそれぞれに試料を反応させる工程、並びに、
   試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
   を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
7. 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
   試料を、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、次いで、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬に反応させる工程、並びに、
   試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
   を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
8. 前記被検者がアンチトロンビン製剤を投与された患者である、請求項６又は７に記載のＴＡＴ測定方法。
9. 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であって、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である
   抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体が、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、請求項６乃至８のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定方法。