JP5984670B2 - Fdp測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法 - Google Patents
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Description
D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応する第1のモノクローナル抗体、
X画分及びD画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分及びY画分とは反応する第2のモノクローナル抗体、及び
D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応し、FDPに対する反応性が第1のモノクローナル抗体とは異なる第3のモノクローナル抗体
から選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を感作した担体を含むFDP測定用試薬が提供される。
さらに、本発明によれば、上記のFDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を感作した担体粒子の懸濁液と、生体試料とを混合する工程と、抗原抗体反応により生じる、前記担体粒子の凝集の度合を測定する工程とを含むFDP測定方法が提供される。
また、本発明のFDP測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法によれば、一次線溶物及び二次線溶物に対して均等に反応するので、検体として血清及び血漿の両方を使用することができる。
本明細書において、「フィブリン分解産物」とは、二次線溶物とも呼ばれ、トロンビンなどの酵素の作用により血液中のフィブリノゲンが凝固されて形成されるポリマーである安定化フィブリンが、プラスミンなどの酵素によって分解されて生じるタンパク質群である。フィブリン分解産物としては、DD画分、DD/E画分、XDP画分などが挙げられる。XDP画分としては、DD/E画分の多量体、例えばDD/E画分の3量体であるDXD/YY画分、DD/E画分の5量体であるYXY/DXXD画分、DD/E画分の7量体であるDXXD/YXXY画分などが挙げられる。また、当該技術においては、XDP画分はDダイマーとも総称される。
本明細書において、「フィブリノゲン分解産物」とは、一次線溶物とも呼ばれ、血液中に存在するフィブリノゲンがプラスミンなどの酵素によって分解されて生じるタンパク質群である。フィブリノゲン分解産物としてはX画分、Y画分、D画分及びE画分が挙げられる。
したがって、ある抗FDPモノクローナル抗体と、別の抗FDPモノクローナル抗体との間で、特異的に反応できるFDPの種類が互いに異なるとき、これらの抗体のFDPに対する反応性は互いに異なると決定される。また、互いに同じ種類のFDPと反応する場合は、ある抗FDPモノクローナル抗体を感作した担体と、別の抗FDPモノクローナル抗体を感作した担体とをそれぞれ用いたFDP測定において、凝集の度合いが互いに有意に異なるとき、これらの抗体のFDPに対する反応性は互いに異なると決定される。
第1のモノクローナル抗体は、D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応する抗体である。
第2のモノクローナル抗体は、X画分及びD画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分及びY画分とは反応する抗体である。
第3のモノクローナル抗体は、D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応し、FDPに対する反応性が第1のモノクローナル抗体とは異なる抗体である。
(抗原の取得)
抗原として用いるFDPは、プラスミンのようなフィブリン及びフィブリノゲンを分解できる酵素をフィブリン及びフィブリノゲンに作用させて得ることができる。なお、FDPの原料となるフィブリン及びフィブリノゲンは市販されている。また、フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビン、第XIII因子及びカルシウム塩を作用させて得ることができる。
上記のようにして得られる抗原を、アジュバントと任意に混合し、適当な緩衝液に溶解又は懸濁して得られる抗原液で、動物を免疫することができる。該抗原液中の抗原の濃度は、50〜500μg/ml程度が好ましい。抗原の免疫原性が低い場合は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアータンパク質を任意に抗原と結合させてもよい。
免疫法は、使用する抗原の種類やアジュバントの有無により適宜選択することができる。例えばマウスを用いる場合、アジュバント混合抗原液0.05〜1ml(抗原10〜200μg)を腹腔内、皮下、筋肉内又は尾静脈内に注射し、初回免疫から約4〜21日毎に1〜4回追加免疫を行い、さらに約1〜4週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することにより、抗原液にアジュバントを用いずに免疫を行ってもよい。追加免疫の約5〜10日後に血液を採取して抗体価を測定する。抗体価は、後述する抗体価アッセイのような当該技術において公知の方法にしたがって測定できる。最終免疫から約3〜5日後に、免疫された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。
モノクローナル抗体は、当該技術において公知の方法、例えばKohler及びMilstein, Nature, 256, 495-497 (1975)に記載の方法にしたがって作製できる。
用いる骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒトなどいずれの哺乳動物に由来する細胞であってもよく、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が挙げられる。骨髄腫細胞の中には免疫グロブリン軽鎖を産生する種類の骨髄腫細胞があり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがある。したがって、免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653、SP2/o-Ag14などを用いるのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来の細胞が好ましい。
本発明の試薬に用いられる第2のモノクローナル抗体としては、例えば受託番号NITE BP−951として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292−0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマ「FDP3−2935」により産生される抗体(以下、「FDP3-2935抗体」ともいう)が挙げられる。
本発明の試薬に用いられる第3のモノクローナル抗体としては、例えば受託番号NITE BP−952として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292−0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマ「DD−M1051」により産生される抗体(以下、「DD-M1051抗体」ともいう)が挙げられる。
本発明の試薬キットは、イムノアッセイ、例えば上記の少なくとも2種のモノクローナル抗体を感作したラテックス粒子と、生体試料中のFDPとを反応させるアッセイ(ラテックス凝集法)などにより、該試料中のFDPを検出するための試薬キットである。
本発明の試薬キットに用いられる第1、第2及び第3のモノクローナル抗体の一例としては、それぞれFDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及びDD-M1051抗体が挙げられる。
まず、緩衝液を含む第1試薬と生体試料とを混合してインキュベートする。ここで、生体試料としては被験者から得られる血清、血漿、尿などが挙げられる。第1試薬と生体試料とを混合する際の容量比は、5:1〜50:1程度であればよい。また、インキュベート時間は1〜10分間程度であればよい。
生体試料中のFDPの濃度及び/又は量は、濃度既知のFDP標準物質の測定により得られる検量線を用いて、測定した吸光度の変化量から算出できる。
なお、本発明のFDP測定方法に用いられる第1、第2及び第3のモノクローナル抗体の一例として、それぞれFDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及びDD-M1051抗体が挙げられる。
第1、第2及び第3のモノクローナル抗体として、それぞれFDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及びDD-M1051抗体を用いて、各抗体のフィブリン及びフィブリノゲン分解産物に対する反応性の違いを、以下のようなELISA法により検討した。
(7-1)フィブリノゲン分解産物(FbgDP)の調製
フィブリノゲン(Sigma社)241 mg(39.7 mg/ml)に、プラスミン(Sigma社)を終濃度60 mU/mlとなるように添加して、37℃で8時間反応させた。その後、アプロチニンを終濃度1U/mlとなるように加えて、分解反応を停止させた。得られた反応液を12000×gで20分間遠心し、得られた上清を、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)で平衡化したリジン-sepharose 4Bカラム(ボリューム8ml)に充填してクロマトグラフィーを行った後、スピンカラムにてセファロースを除き、FbgDP溶液を調製した。得られたFbgDP溶液のタンパク質濃度を、タンパク質定量試薬(Bio-Rad社)を用いて測定した。また、FbgDP溶液の一部を、後述する本発明のFDP測定用試薬のFDPへの反応性の確認に用いた。
得られたFbgDP溶液を、限外ろ過用遠心チューブ(アミコン15 50K;ミリポア社)によりサンプル緩衝液(62.5 mM Tris、192 mMグリシン、1%SDS(pH6.8))で2回置換した。得られた溶液をSephacryl S-300(GE Healthcare社)に充填し、ペリスタポンプを用いて流速70〜80μl/分で流して、10分ごとにフラクションを回収した。得られた各フラクションについて分子量マーカーを用いるSDS-PAGEにより解析して、X画分、Y画分及びD画分が含まれるフラクションをそれぞれ回収した。これをアミコン15 50K(ミリポア社)によりリン酸緩衝液(PBS)で2回置換して、FbgDP抗原とした。
フィブリノゲン(Sigma社)92 mg(23 mg/ml)に、塩化カルシウム、ヒトトロンビン(三菱ウェルファーマ社)及び第XIII因子(ニプロ社)をそれぞれ終濃度25 mM、4U/ml及び0.05 U/mlとなるよう加え、37℃で一晩反応させて、フィブリノゲンをフィブリンに変換させた。反応液中に生じたフィブリンゲルをトリス緩衝液(TBS(pH7.4))50 mlで洗浄し、4℃、3000×gで10分間遠心し、フィブリンゲルを回収した。この操作を2度繰り返した後、50 mlシリンジを用いてフィブリンゲルを砕いた。フィブリンゲルをTBS(pH7.4)4.6 mlに再懸濁した。懸濁液にプラスミンを終濃度75 mU/mlとなるように添加して、37℃で6時間反応させた。その後、アプロチニンを終濃度1U/mlとなるように加えて、分解反応を停止させた。得られた反応液を12000×gで20分間遠心し、得られた上清を、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)で平衡化したリジン-sepharose 4Bカラム(ボリューム3.5 ml)に充填してクロマトグラフィーを行った後、スピンカラムにてセファロースを除き、FbnDP溶液を調製した。得られたFbnDP溶液のタンパク質濃度を、タンパク質定量試薬(Bio-Rad社)を用いて測定した。また、FbnDP溶液の一部を、後述する本発明のFDP測定用試薬のFDPへの反応性の確認に用いた。
ウェルを洗浄液で3回洗浄した後、該抗体固相の各ウェルに、上記で調製したFbgDP各抗原及びFbnDP各抗原を100μlずつ加え、室温で30分間反応させた。反応終了後、ウェルを洗浄液で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗フィブリノゲン抗体(DAKO社)を100μlずつ各ウェルに加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、ウェルを洗浄液で3回洗浄した後、ODP基質液(国際試薬株式会社)を100μlずつ各ウェルに加え、室温で15分間反応させた。続いて、2N硫酸を100μlずつ各ウェルに加えて、反応を停止し、490 nmにおける吸光度を測定した。
結果を表1に示す。
表1より、FDP3-797抗体及びDD-M1051抗体は、D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応することがわかった。また、FDP3-2935抗体は、X画分及びD画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分及びY画分とは反応することがわかった。
(1)緩衝液を含む第1試薬の製造
各試薬を表2に示される終濃度となるように混合した緩衝液を、1M水酸化ナトリウム水溶液でpHを7.1に調整した後、超純水で1リットルにメスアップすることにより緩衝液を製造した。
(2-1)FDP3-797抗体のラテックス粒子への感作
FDP3-797抗体の終濃度が1mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸/150 mM NaCl溶液に混合した。そして、この混合液と20%(重量比)ラテックス懸濁液(粒径0.238μm;JSR株式会社)とを混合した。
得られた混合液に、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸/150 mM NaCl溶液/2%BSA溶液を等量加えて混合した後、10℃、38400×gで30分間遠心した。上澄みを除去し、得られた沈殿物に、上澄みと等量の50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸/150 mM NaCl溶液/2%BSA/1.5%シュークロース溶液を添加して混合した。
得られた混合液を、氷冷条件で超音波破砕機(大岳社製)、超音波処理装置(Dr. Hielscher Gmbh UP-200S相当品)を用いソニケーションを実施し、FDP3-797抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液(抗体濃度39μg/ml)を得た。
FDP3-2935抗体の終濃度が1mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸/150 mM NaCl溶液に混合した。以下、上記の(2-1)FDP3-797抗体のラテックス粒子への感作において述べたことと同様にして、FDP3-2935抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液(抗体濃度39μg/ml)を得た。
DD-M1051抗体の終濃度が1mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸/150 mM NaCl溶液に混合した。以下、上記の(2-1)FDP3-797抗体のラテックス粒子への感作において述べたことと同様にして、DD-M1051抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液(抗体濃度39μg/ml)を得た。
ここで、FDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及びDD-M1051抗体の各抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液を、後述する図1及び図2において、それぞれA、B及びCと称する。これらの懸濁液を、「AとB」(図1及び図2のA/B)、「AとC」(図1及び図2のA/C)、「BとC」(図1及び図2のB/C)及び「AとBとC」(図1及び図2のA/B/C)の組み合わせでそれぞれ等量混合することにより、2種又は3種のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含むFDP測定用試薬を得た。以下、これらのFDP測定用試薬を第2試薬とした。
上記の実施例1で製造したFDP測定用試薬のフィブリン分解物及びフィブリノゲン分解産物に対する反応比率を、以下の手順によるラテックス凝集法により検討した。
上記の試験例1で調製したFbgDP溶液をTBSバッファーで希釈して、FbgDP検体(タンパク質濃度100μg/ml)とした。FbnDP溶液についても同様にして、FbnDP検体(タンパク質濃度100μg/ml)を調製した。
FbgDP及びFbnDPの各検体6μlの等量混合物と、上記の実施例1(1)で調製した第1試薬84μlとを混合し、37℃で20秒間反応させた。得られた反応液と、上記の実施例1(2)で調製した各第2試薬84μlとを混合し、ラテックス凝集反応を開始させた。反応開始から1分後及び2分後の波長800 nmにおける吸光度を、CS-2000i(シスメックス株式会社)を用いて測定した。これらの測定結果から、1分間あたりの吸光度の変化量を求めた。また、FbgDP及びFbnDPのそれぞれに対する反応性から反応比率を算出した。これらの結果をそれぞれ図1および図2に示す。
したがって、上記の実施例1(2)で製造したFDP測定用試薬は、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬である。
また、図2より、いずれの抗体の組合せの測定試薬においても、FbgDPとFbnDPとに対しておおむね均一に反応することがわかった。これにより、本発明のFDP測定用試薬及び試薬キットは、一次線溶物が含まれる生体試料についてもFDPを高精度に測定可能であることが示された。
上記の実施例1で製造した本発明のFDP測定用試薬キットと、他社製品とを用いて血漿中のFDPを測定した。
本発明のFDP測定用試薬キットの第1試薬として、上記の実施例1(1)で製造した試薬を用いた。また、第2試薬として、上記の実施例1(2)で製造した、3種の抗体をそれぞれ個別に感作したラテックス粒子の懸濁液を含む試薬を用いた。また、検体としては、上記の実施例2で用いたFbgDP検体とFbnDP検体との等量混合物をパネル血漿として用いた。
よって、本発明のFDP測定用試薬及び試薬キットでは、他社製品に比べて、一次線溶物が含まれる生体試料についてもFDP濃度をより高精度に測定可能であることが示された。
Claims (9)
- 受託番号NITE BP−950として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第1のモノクローナル抗体、
X画分及びD画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分及びY画分とは反応する第2のモノクローナル抗体、及び
D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応し、FDPに対する反応性が前記第1のモノクローナル抗体とは異なる第3のモノクローナル抗体
からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を含むFDP測定用試薬。 - D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応する第1のモノクローナル抗体、
受託番号NITE BP−951として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第2のモノクローナル抗体、及び
D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応し、FDPに対する反応性が前記第1のモノクローナル抗体とは異なる第3のモノクローナル抗体
からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を含むFDP測定用試薬。 - D画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分、X画分及びY画分とは反応する第1のモノクローナル抗体、
X画分及びD画分とは反応しないが、XDP画分、DD/E画分、DD画分及びY画分とは反応する第2のモノクローナル抗体、及び
受託番号NITE BP−952として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第3のモノクローナル抗体
からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を含むFDP測定用試薬。 - 受託番号NITE BP−950として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第1のモノクローナル抗体、
受託番号NITE BP−951として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第2のモノクローナル抗体、及び
受託番号NITE BP−952として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2010年6月1日付けで受託されたハイブリドーマにより産生される第3のモノクローナル抗体
からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体を含むFDP測定用試薬。 - 前記2種のモノクローナル抗体のうち、一方のモノクローナル抗体を感作した第1担体および他方のモノクローナル抗体を感作した第2担体を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のFDP測定用試薬。
- 前記第1担体および第2担体が、粒子である請求項5に記載のFDP測定用試薬。
- 緩衝液を含む第1試薬;並びに
請求項1〜4のいずれか1項に記載の、第1のモノクローナル抗体、第2のモノクローナル抗体及び第3のモノクローナル抗体からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体のうち、一方のモノクローナル抗体を感作した第1担体粒子および他方のモノクローナル抗体を感作した第2担体粒子の懸濁液を含む第2試薬;
を含むFDP測定用試薬キット。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の、第1のモノクローナル抗体、第2のモノクローナル抗体及び第3のモノクローナル抗体からなる群より選択される、FDPに対する反応性が互いに異なる少なくとも2種のモノクローナル抗体のうち、一方のモノクローナル抗体を感作した第1担体粒子および他方のモノクローナル抗体を感作した第2担体粒子の懸濁液と、生体試料とを混合する工程と、
抗原抗体反応により生じる、前記担体粒子の凝集の度合を測定する工程と
を含むFDP測定方法。 - 前記凝集の度合の測定が、吸光度の変化の測定である請求項8に記載のFDP測定方法。
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