JP2006105633A

JP2006105633A - Ｄダイマー測定用試薬およびこれに用いるモノクローナル抗体

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Publication number: JP2006105633A
Application number: JP2004289442A
Authority: JP
Inventors: Hiroo Takeshita; 浩生竹下; Kenji Muneo; 顕士棟尾
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2024-09-30
Also published as: JP4448754B2

Abstract

【課題】ＤＤ／Ｅ画分の多量体およびＤＤ／Ｅ画分の単量体を測定可能なＤダイマー測定試薬を提供する。さらにこれに使用するモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体を感作した担体からなるＤダイマー測定用試薬であって、ＤＤ／Ｅ画分の４量体の反応性に対して、少なくとも１０％のＤＤ／Ｅ画分に対する反応性を有するＤダイマー測定用試薬。また受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により寄託されたハイブリドーマおよび当該ハイブリドーマが産生する抗体。
【選択図】なし

Description

本発明は、臨床検査の分野においてＤダイマーを測定するために用いられるＤダイマー測定用試薬およびこれに用いられるモノクローナル抗体に関する。

Ｄダイマーを測定する方法として種々知られている。例えば特許文献１にはヒトフィブリノゲンのブラスミン分解産物中のＤモノマー及びヒトフイブリンのプラスミン産物中のＤダイマーと特異的に反応するがフイブリノゲンもＸ、Ｙ及びＥとは反応しない性質を有するモノクローナル抗体が知られている。
Ｄダイマーはヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物の総称であり、ＤＤ／Ｅ画分やＤＤ／Ｅ画分が構成単位となったＤＤ／Ｅ画分の多量体の総称である。Ｄダイマーの測定は凝固・線溶系を亢進する各種血栓症やＤＩＣの診断マーカーとして広く使用されている。ＤダイマーはＤＤ／Ｅ画分やＤＤ／Ｅ画分が構成単位となったＤＤ／Ｅ画分の多量体の総称であり、これらを総合的に測定することにより、ＤＩＣ患者を特異的に捕らえることができることが期待される。
しかしながら、特許文献１には、ＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の多量体を総合的に測定するＤダイマー測定試薬について記載がない。

特開昭６３−７９９００号公報

本発明の目的は、ＤＤ／Ｅ画分の多量体およびＤＤ／Ｅ画分の単量体を測定可能なＤダイマー測定試薬を提供することにある。さらにこれに使用するモノクローナル抗体を提供することにある。

本発明の第一の観点はＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体を感作した担体からなるＤダイマー測定用試薬であって、ＤＤ／Ｅ画分の４量体の反応性に対して、少なくとも１０％のＤＤ／Ｅ画分に対する反応性を有するＤダイマー測定用試薬に関する。
また、本発明の第二の観点は受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に関する。
さらに、本発明の第三の観点は受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により寄託されたハイブリドーマに関する。

試料中のＤＤ／Ｅ画分単量体および多量体のＤダイマーを測定することが可能となるＤダイマー測定用試薬の提供が可能となる。

本発明の実施形態に用いるＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。

（抗体の作製）
抗体は、マウス由来に限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスである。抗体はＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭなどでもよい。

抗体は従来公知の免疫学的手法により、例えば抗原としてＤＤ／Ｅ画分を用い、好ましくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血清などから得ることができる。また、モノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載する方法で作製することができる。

（抗体作製に使用する抗原）
例えばＤＤ／Ｅ画分の単量体または多量体を抗原として使用することができる。ＤＤ／Ｅ画分の多量体は２〜５量体を挙げることができ、６量体以上になると水に溶けにくくなる。また、抗原はフィブリノゲンから調製することができる。また、ヒトまたは哺乳類などから精製して得ることができるし、遺伝子工学的手法によっても得ることができる。さらに市販品を用いてもよい。使用する抗原と特に限定されないがＤＤ／Ｅ画分の３量体以上を含むものが好ましい。

（免疫方法）
精製抗原、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現させた抗原やその部分ペプチドを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解あるいは懸濁したものを抗原液として使用する。抗原液は通常抗原物質を50〜500μg/mL程度含む濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることができる。当該抗原で免疫感作する動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはBALB/cマウスである。

このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することができる。ここで使用可能なアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ribi（ＭＰＬ）、Ribi（ＴＤＭ）、Ribi（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチン（Boredetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。

免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無などにより、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液0.05〜１ｍＬ（抗原物質10〜200μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することで、当該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与することもできる。抗体価は追加免疫の約５〜１０日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。

（モノクローナル抗体の作製）
モノクローナル抗体（以下「ＭｏＡｂ」という。）は、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975）にしたがって作製することができる。骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14などを用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞の保存方法は自体公知の手法に従って行えばよく、例えばウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養したものについて凍結により保存される。また細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約30〜60％のＰＥＧ（平均分子量1,000〜6,000）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を1〜10：1、好ましくは5〜10：1の混合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH6〜8の条件下で、約30秒〜3分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播種して培養を続ける。

融合操作後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株を死滅させ、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエルを確認する。

生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、該上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗体の検出および抗体価の測定を行うことができる。このように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な抗体を産生しているハイブリドーマを得る。

さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈して培養することにより目的とする抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマクローンは、約10％（v/v）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて、-70〜-196℃で保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時37℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。

ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。

ハイブリドーマからのＭｏＡｂの取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択することができる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数mg/mLの高濃度のＭｏＡｂを得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるＭｏＡｂの取得は、抗体産生量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。

抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したBALB/cマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約106個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。

一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくすることが望ましい。さらに好ましくは、ハイブリドーマを常法により無血清培地に馴化させ、無血清培地を用いて培養することである。無血清培地で培養することにより、抗体精製が容易になる。

腹水や培養上清からのＭｏＡｂの精製は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用することで、容易に達成される。

さらに、ＭｏＡｂが、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能であり、簡便である。

上記手法により少なくともＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有するＭｏＡｂを作製した。当該抗体は、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により平成１６年２月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生され、ＤＤ−Ｍ１６５３と命名される。この具体例に限定されるものではなく、少なくともＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体であればよい。また、抗体は単独で用いてもよいし、複数の抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。

従って、抗体を単独または組み合わせてＤダイマー測定試薬に使用することにより、試料中のＤＤ／Ｅ画分の多量体だけでなくＤＤ／Ｅ画分の単量体のＤダイマーを測定することが可能となる。

（免疫学的測定試薬）
Ｄダイマー測定試薬はＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体を感作した担体からなるＤダイマー測定用試薬であって、ＤＤ／Ｅ画分の４量体の反応性に対して、少なくとも１０％のＤＤ／Ｅ画分に対する反応性を有すればよく、好ましくは１０〜２０％有するものが好ましい。さらに好ましくはＤＤ／Ｅ画分の２量体に対しても反応性を有するものが好ましい。

Ｄダイマーの測定方法は、抗体を不溶性担体に担持した粒子と検体とを反応させ免疫反応により生じる凝集の度合いによってＤダイマーを測定する。

不溶性担体としては有機高分子粒子、無機物質粒子、赤血球などが挙げられる。有機高分子粒子としては例えば、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、セルロース、ラテックス粒子が挙げられる。好適にはラテックス粒子を挙げることができ、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどの粒子をあげることができる。また、無機物質粒子としてはシリカ、アルミナなどが挙げられる。また粒子の平均粒径は、測定機器などによって適宜選択されるが、０．０５〜０．５０μｍのものが挙げられる。

抗体を不溶性担体に担持させる方法としては、物理的吸着法と化学的結合法があり、担持操作の簡便性という点で物理的吸着法が好適に使用される。

緩衝液、増感剤、界面活性剤、無機塩を適宜添加することができる。
緩衝液としてはｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９に緩衝作用をもつものが好ましく、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸、グッド緩衝液等が挙げられ、グッド緩衝液としては、MES緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、PIPES緩衝液、Bis-Tris-Propane緩衝液、ACES緩衝液、MOPS緩衝液、BES緩衝液、TES緩衝液、HEPES緩衝液、HEPPS緩衝液、Tricine緩衝液、Tris緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液が挙げられる。

凝集速度を促進することなどを目的として、増感剤としてを添加することができる。増感剤としては特に限定されず、ポリビニルピロリドン、ポリアニオン、ポリエチレングリコール、多糖類等を挙げることができる。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げることができる。

検体中の塩濃度の影響を抑えることなどを目的とし無機塩を添加することができる。無機塩としては塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を挙げることができる。

被検体中のＤダイマー濃度を測定する場合の測定試薬としては、第一試薬と第二試薬からなる２試薬型からなる試薬形態の他、一試薬からなる試薬形態であってもよい。好ましくは測定精度の観点などから第一試薬と第二試薬からなる２試薬型が好く、以下に例示する。

第一試薬は緩衝液からなり、第二試薬は抗体感作ラテックス粒子からなり、適宜増感剤、界面活性剤、無機塩を適宜添加することができる。好ましい例としては第一試薬は緩衝液、増感剤、及び無機塩からなり、第二試薬は抗体感作ラテックス粒子からなる試薬が好ましい。

上記測定試薬を用いて測定する場合は、第一試薬と検体を反応セル中で混合した後第二試薬を添加して抗体感作ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に測定する方法や、第一試薬と第二試薬を反応セル中で混合した後、検体を添加して抗体感作ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に測定する方法等が採用される。

検体としては、血清、血漿、尿等を挙げることができる。

例えば上記例示形態の試薬を用いて凝集反応を行い、既知濃度のＤダイマー溶液と検体の各々について生じた凝集の度合を光学的に観察し比較することで検体中のＤダイマー濃度が測定され得る。具体的には、まず既知濃度のＤダイマー溶液を二濃度（Ｄダイマー濃度が０μｇ／ｍｌの溶液を含むのが好ましい）以上測定し、得られた光学密度変化量とＤダイマー濃度の関係から検量線を作成する。次に被検体を測定しその光学密度変化量から検量線を利用して濃度を求め、その値をＤダイマー濃度とする。抗体感作ラテックス粒子の凝集の度合を光学的に検出する方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透過光強度を測定する光学機器で行う。測定波長は３００〜２４００ｎｍ、好ましくは３００〜１０００ｎｍ、より好ましくは３００〜８００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。測定方法については公知の方法に従い、用いる抗体感作ラテックス粒子の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行われる。また、これらの方法を併用することも可能である。

免疫反応の条件は公知の条件が採用されるが、反応時の温度は１０〜５０℃特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決定することができる。

以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。

（実施例１）モノクローナル抗体（MoAb）を産生するハイブリドーマの作製
（１）免疫原（抗原）の調製
フィブリノゲン(Sigma社)100mg(5.3mg/mL)に、塩化カルシウム、ヒトトロンビン(吉富製薬社)およびファクターXIII(ERL社)をそれぞれ終濃度25mM、2U/mLおよび1.25μg/mLとなるよう加え、37℃で18時間反応させ、フィブリノゲンをフィブリンに変換させた。12000×ｇで20分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。フィブリンを1mm立方以下に切断し、50mMトリス緩衝液(pH7.4)2.5mLに浮遊させ、プラスミン(Sigma社)25μL(1U/mL)を添加した。攪拌しながら37℃で3時間反応させた後、アプロチニンを終濃度1000U/mLとなるように加えて分解反応を停止させた。12000×ｇで20分間遠心し、その上清を50mMトリス緩衝液(pH7.4)で平衡化したLysine-sepharose 4Bのカラム(Volume 3mL)に充填し、クロマトグラフィーを行った。分子量マーカーを用いるSDS-PAGEにより、DD/E画分の3量体上の画分を85%程度含まれるDダイマー溶液を回収し、これを免疫原とした。

（２）被免疫動物５〜８週令の近交系BALB/c系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（23±1℃、湿度70％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。

（３）免疫方法上記（１）で調製した免疫原を抗原として用い、100μg/0.5mLとなる様にＰＢＳで調製し、同量（0.5mL）のフロイント完全アジュバント（freund's comlete adjubant:Difco社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４匹の雌のBALB/cマウスの腹腔に１匹あたり200μL投与した。さらに２週間毎に、Ribiアジュバントにて100μg/mLとなるように調製した上記抗原をマウス当たり20μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ribiアジュバントで100μg/mLとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後、抗原をＰＢＳで100μg/mLに調製し、マウス尾静脈より注射して最終免疫した。

（４）抗体価測定（抗体価アッセイ）
免疫開始時より定期的にマウス眼底網膜より少量の全血を採取し、血清を分離した後、ＤＤ／Ｅ画分に対する抗体価を以下の方法により調べた。
すなわち、前記実施例1で精製したDダイマー溶液をPBSで10μg/mLに希釈し、その100μLを96穴マイクロタイタープレートに加え、4℃で18時間静置後、0.05%Tween20含10mMリン酸緩衝液(pH7.0）(以下、洗浄液と称する）で3回洗浄した。続いて1%BSA含10mMリン酸緩衝液(以下、ブロッキング緩衝液と称する) を満たし、Dダイマー抗原固相とする。ここで、各ウェルにハイブリドーマ培養上清20μLおよびブロッキング緩衝液80μLを加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング緩衝液で2000倍希釈した抗マウスIgG-POD標識抗体(DAKO社) 100μLを各ウェルに加え、室温で30分間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回洗浄した後、ODP基質液(国際試薬社)100μLを各ウェルに加え、室温で15分間反応させた。続いて2N硫酸100μLを各ウェルに加え反応を停止し、490nmにおける吸光度を測定した。
なお、抗体陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コントロールとした。

（５）細胞融合のための細胞
最終免疫から３日後にBALB/cマウスの摘脾を行い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定し、7.0×10⁸個の脾細胞を得た。細胞融合は、8-アザグアニン（2-amino-6-oxy-８azapurine）耐性のBALB/cマウス由来骨髄腫培養細胞株（P3X63-Ag8・653、以下、「Ｘ６３細胞」という。）を親細胞株として用いた。Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（fetal calf serum : ＦＣＳ）10％を含むRPMI-1640培養液（20μg/mL，8-アザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前より８-アザグアニンを含有しない10％ＦＣＳ含有RPMI-1640培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はRPMI-1640培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、7×10⁷個の生細胞を得た。

RPMI-1640培養液で、ポリエチレングリコール-4000が50(W/V)％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が10：1となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー（Nature 第256巻，495-497 (1975)）およびヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー（Eur. J.Immunol.第6巻，511-519, (1976)）の方法に準じて細胞融合を行った。

その後、10％ＦＣＳを添加したRPMI-1640培養液に、1×10^-4Ｍのヒポキサンチン、4×10^-7Ｍのアミノプテリンおよび1.6×10^-5Ｍのチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が2.0×10⁶個/mLとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を50μLずつ、96穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度37℃、湿度95％、８％のＣＯ２雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約10日〜２週間後に、選択培地で増殖ハイブリドーマを確認した。

（６）スクリーニング
上記で得られたバイブリドーマ(1728株)のうち、ＤＤ／Ｅ画分に反応性を示す抗体を産生する株を以下の方法により選択した。

一次スクリーニング
上記（４）で用いたDダイマー抗原固相を使用して、Dダイマーに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した(258株)。
二次スクリーニング
一次スクリーニングで選択したハイブリドーマについて下記に示す抗フィブリノゲン抗体固相を用いて、Dダイマーと反応し、かつフィブリノゲンに反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択を行った。
抗フィブリノゲン抗体(DAKO社)をPBSで0.1mg/mLに希釈し、その100μLを96穴マイクロタイタープレートに加え、4℃で18時間静置後、洗浄液で3回洗浄した。続いてブロッキング緩衝液を満たし、抗フィブリノゲン抗体固相とする。ここで、フィブリノゲン溶液または前期実施例1で精製したDダイマー溶液をブロッキング緩衝液で0.1μg/mLに希釈し、100μLずつ抗フィブリノゲン抗体固相に分注して室温で1時間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回洗浄した後、各ウェルにハイブリドーマ培養上清20μLおよびブロッキング緩衝液80μLを加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング緩衝液で1000倍希釈した抗マウスIgG-POD標識抗体(DAKO社) 100μLを各ウェルに加え、室温で30分間反応させた。反応終了後、洗浄液で5回洗浄した後、ODP基質液(国際試薬社)100μLを各ウェルに加え、室温で15分間反応させた。続いて2N硫酸100μLを各ウェルに加え反応を停止し、490nmにおける吸光度を測定した。
Dダイマーと反応し、かつフィブリノゲンに反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択した(47株)。
三次スクリーニング
二次スクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、安定にDダイマーに反応しフィブリノゲンには反応しないMoAbを産生するNo.1653、No.432、No.1246、No.65のハイブリドーマ細胞を4クローン選択した。
なお、上記スクリーニングの抗体陰性コントロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液のみを添加し、陰性コントロールとした。得られた吸光度からＤＤ／Ｅ画分に反応性を示すMoAbを産生するハイブリドーマを特定することができる。

（実験例２）培養上清についての反応特異性
上記の選択したクローンの培養上清から精製したIgGを用いて下記に示す方法でラテックス試薬を調製し、DD/E画分、DD/E画分の３−５量体の混合物、X画分、Y画分、D画分、E画分、フィブリノゲン、SF画分と一定時間反応させたときの吸光度変化を測定して、各培養上清の特異性を確認した。

（ラテックス試薬の調製方法）
10%(w/v)ポリスチレンラテックス懸濁液(積水化学社、粒径0.245μm)0.5mLを、抗体を含むリン酸緩衝液(pH7.5)2.0mL(抗体濃度0.625mg/mL)に混合し、ボルテックスミキサーで混合した。この混合液を遠心分離(25000g×20分間)し、1%BSAを含むMOPSO緩衝液(pH7.1)2.5mLに懸濁させた。この懸濁液を遠心分離(25000g×20分間)し、2%BSAを含むMOPSO緩衝液(pH7.1)40mLに懸濁させた(感作ラテックス溶液)。種々の濃度のDダイマー溶液7μLをポリエチレングリコールを含むMOPSO緩衝液(pH7.1)の反応緩衝液中100μLを混合し、37℃で5分間反応後、上記感作ラテックス溶液100μLを添加し、波長800nmでの1分間あたりの吸光度変化量を測定することにより行った。

その結果表１に示す。

（実験例３）ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ株の樹立（クローニング）
上記のスクリーニングにより得られた４株の内、特異性が高く、DD/E画分、DD/E画分の３−５量体にも反応するNo.1653株を選択した。この細胞を受託番号FERMP-１９６８７号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。

（実験例４）マウスイムノグロブリンサブクラスの同定
受託番号FERMP-１９６８７号細胞が産生するMoAb（ＤＤ−Ｍ１６５３）のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製モノアブタイピングキット（MONOAb typing kit）を使用して同定した。その結果、ＤＤ−Ｍ１６５３はIgGであった。

（実施例５）Ｄダイマー測定試薬組成
10%(w/v)ポリスチレンラテックス懸濁液(積水化学社、粒径0.245μm)0.5mLを、実験例2で作製したDD-M1653抗体を含むリン酸緩衝液(pH7.5)2.0mL(抗体濃度0.625mg/mL)に混合し、ボルテックスミキサーで混合した。この混合液を遠心分離(25000g×20分間)し、1%BSAを含むMOPSO緩衝液(pH7.1)2.5mLに懸濁させた。この懸濁液を遠心分離(25000g×20分間)し、2%BSAを含むMOPSO 緩衝液(pH7.1)40mLに懸濁し第二試薬とした。また、ポリエチレングリコールを含むMOPSO緩衝液(pH7.1)を第一試薬とした。

（実施例６）Ｄダイマー測定試薬の反応性
表２に示す各種Ｄダイマーを検体として実施例４で作成したＤダイマー測定試薬の反応性を検討した。操作は検体7μLと第一試薬100μLを混合し、37℃で5分間反応後、第二試薬100μLを添加し、波長800nmでの1分間あたりの吸光度変化量を測定することにより行った。また、同様にエルピアエース D-Dダイマー(ヤトロン社)およびリアスオート・Ｄダイマー（国際試薬）についても反応性を検討した。その結果を表２に示す。

以上説明したように、ＤＤ／Ｅ画分の多量体およびＤＤ／Ｅ画分の単量体を測定可能なＤダイマー測定試薬を提供が可能となり、臨床検査の分野に貢献できる。

Claims

ＤＤ／Ｅ画分およびＤＤ／Ｅ画分の４量体に反応性を有する抗体を感作した担体からなるＤダイマー測定用試薬であって、ＤＤ／Ｅ画分の４量体の反応性に対して、少なくとも１０％のＤＤ／Ｅ画分に対する反応性を有するＤダイマー測定用試薬。
ＤＤ／Ｅ画分に対する反応性が１０〜２０％である請求項１に記載のＤダイマー測定用試薬。
ＤＤ／Ｅ画分の２量体に反応性を有する請求項１または２に記載のＤダイマー測定用試薬。
受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
受託番号ＦＥＲＭＰ−１９６８７号により寄託されたハイブリドーマ。
請求項４または５に記載の抗体を感作した担体からなるＤダイマー測定用試薬。