JP2005023015A

JP2005023015A - 抗２，４ージクロロフェノールモノクローナル抗体の製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法

Info

Publication number: JP2005023015A
Application number: JP2003189538A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Tanaka; 田中宏幸; Yukihiro Masayama; 正山征洋; Norio Miura; 三浦則雄
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2005-01-27

Abstract

【課題】環境モニタリングの為の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及びその関連化合物に対する抗体を提供する。
【解決手段】２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）は長年月除草剤として大量に散布され、土壌へ多量に蓄積している。２，４−Dは徐々に２，４−ジクロロフェノール（２，４−DP）へと代謝され蓄積される。２，４−DPは２，４−Dによる土壌や水の汚染の歴史的な背景を知るための重要なマーカー化合物であるが、本化合物に対する高感度分析法の開発は未だなされていない。本発明は抗２，４−DPモノクローナル抗体を作製し、競合的ELISAを確立し、数ｎｇ/ml濃度の２，４−DPおよび２，４−Dを簡便かつ再現性よく分析する手法を開発した。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明に属する技術分野】
本発明は水質や土壌汚染のマーカーである２，４ーＤＰ及び２，４ーＤに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５−４９７頁、１９７５年）以来急速に発展した。哺乳動物の脾細胞と癌細胞であるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハイブリドーマは用いた脾細胞が産生する抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられてきた。
【０００３】
一方、本出願人は通常は抗原とは成りえない２，４ーＤＰに対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを作製する。２，４ーＤは除草剤として大量に散布されてきたため、土壌に蓄積し２，４ーＤＰへと代謝される。このため土壌汚染や水質汚染のマーカーとして２，４ーＤＰおよび２，４ーＤの測定は不可欠となった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
土壌や水中の２，４ーＤＰや２，４ーＤの含有量は極めて低く、その検出は容易ではない。従って含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。これに対応出来うるのはＭＡｂ以外にない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上述の問題点を解決すべく研究を重ねた結果、細胞融合により２，４ーＤＰに対する、ＭＡｂを産生するハイブリドーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗２，４ーＤＰ抗体を大量に生産することに成功した。本抗体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を必要としないアッセイ系を完結した。
【０００６】
【発明実施の形態】抗２，４ーＤＰＭＡｂを生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。すなわち、（１）抗原として２，４ーＤーＢＳＡ複合体を免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。（２）ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合する。（４）得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選抜する。（５）抗２，４ーＤＰＭＡｂ生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハイブリドーマをクローニングする。これらの行程について詳細に説明する。
【０００７】
（抗体産生細胞の調整）
２，４ーＤーＢＳＡ複合体を動物に免疫する。免疫法としてはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使用される。
【０００８】
（骨髄腫細胞の調整）
細胞融合に使用する骨髄腫細胞は特に限定されず、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば８ーアザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ，Ｐ３ーＸ６３ーＡｇ８，Ｐ３ーＸ６３ーＡｇ８ーＵＩ，Ｐ３ーＮＳＩ／１ーＡｇ４ー１，Ｘ６３ーＡｇ８ー６．５．３，ＳＰ２１０ーＡｇ１４．ＦＯ，Ｓ１９４／５ＸＸＯ，Ｓ１９４５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１ー４５．６，ＴＧ．１．７等が用いられる。
【０００９】
（融合細胞）
細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のｅーＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混合比は通常１：４ー１：１０）することにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１０００ー６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０ー５０％である。
【００１０】
（ハイブリドーマの選択的増殖）
融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ｅーＲＤＦ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地（例えばＨＡＴ培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロプレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
【００１１】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、２，４ーＤーＨＳＡと反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体との反応により検索できる。
【００１２】
（クローニング）
抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い、ＭＡｂ産生ハイブリドーマを得る。以上の操作により抗２，４ーＤＰＭＡｂ産生ハイブリドーマ２Ｃ４を得た。このハイブリドーマは２，４ーＤＰに対する特異的なＭＡｂを産生する新規な細胞である。
【００１３】
（抗２，４ーＤＰＭＡｂの調整）
上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養することにより、その培養上清から本発明ＭＡｂが得られる。大量に生産する方法としては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗２，４ーＤＰＭＡｂを得る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗２，４ーＤＰＭＡｂを得る。
【００１４】
（抗２，４ーＤＰＭＡｂのＤＰＭＡｂのキャラクタリゼーション）
精製した抗２，４ーＤＰＭＡｂのサブクラスはＩＧｇ１、軽鎖はκであることを、通常の方法で決定した。
【００１５】
（発明の効果）
抗原の２，４ーＤのカルボキシル基に直接キャリアータンパクを結合して免疫したため、２，４ーＤの認識は低いと考えられるが、実際には本抗体は２，４ーＤＰはもとより、感度は低いものの抗原とした２，４ーＤをも認識しているので、通常のＥＬＩＳＡに用いることにより、両者の分析を再現性高く、高感度、かつ前処理が不要な方法で実施可能である。
【００１６】
【実施例】
（抗２，４ーＤＰＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造）
（抗原の調整）
２，４ーＤ５ｍｇをジオキサン１ｍｌに溶かした液ヘ，イソブチルクロロフォルメート１０μｌとＮートリエチルアミン１０μｌを加えて攪拌しながら２時間室温で反応。この反応液へＢＳＡ５ｍｇを水２ｍｌに溶かした溶液を添加し、室温下攪拌しながら１６時間反応する。反応後、４゜Ｃにおいて水に対して透析を５回繰り返し、最後に凍結乾燥し２，４ーＤーＢＳＡ５．２ｍｇを得た。ーなおＥＬＩＳＡで使用する２，４ーＤーＨＳＡについても同様な方法で作製した。
【００１７】
（抗原中のハプテン数の検討）
得られた２，４ーＤーＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入れ、マルデイトフマスにて測定する（図１）。
【００１８】
（免疫脾細胞の調整）
２，４ーＤーＢＳＡ抱合体５０μｇをフロイントーコンプリートーアジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇの２，４ーＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後に２，４ＤーＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００１９】
（ハイブリドーマの調整）
単離した免疫脾細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血球を溶血した後、ｅーＤＦ培地で細胞を３回洗う。マウス骨髄腫細胞もｅーＲＤＦＦ培地で３回洗浄した。両細胞数を計測し脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポロエチレングリコール（ＰＥＧ）４、０００を培地で希釈した５０％液を１．０ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置した後、ｅーＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけて添加した。１、０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０^ー２Ｍ、アミノプテリン４ｘ１０^−７Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０^−５Ｍを加えた（ＨＡＴー）１０％ＦＣＳ添加ｅーＲＤＦ培地を用いて沈殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加し、細胞の増殖を確認した。
【００２０】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、２，４ーＤＰーＨＳＡ抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡにより２，４ーＤＰに対するＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマイクロプレートに２，４ーＤーＨＳＡ抱合体０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（ＴーＰＢＳ）で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【００２１】
（抗２，４ーＤＰＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング）
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。
【００２２】
（抗２，４ーＤＰＭＡｂの調整）
上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅーＲＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。即ち、上清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液は水に対して４回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体をえた。
【００２３】
（競合的ＥＬＩＳＡによる定量）
２，４ーＤＰーＨＳＡ抱合体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌウエルに添加し１時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するために５％スキムミルク添加ＰＢＳ溶液３００μを加え１時間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度の試料溶液を加え、さらに抗２，４ーＤＰＭＡｂ溶液（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃度の２，４ーＤＰの吸光度から検量線を作成した（図２）。
【００２４】
抗２，４ーＤＰＭＡｂを用いて通常の方法により各種関連化合物のクロスリアクションを検討して表の結果を得た。２，４ーＤには約１５％のクロスリアクションを持つものの、他の化合物にはアフィニテイーを持たないことが明らかとなった。
【００２５】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例の抗原のハプテン数を調査したマススペクトログラフィー。
【図２】実施例のＭＡｂ抗体の検量線を示す片対数グラフ。

Claims

２，４ージクロロフェノール（２，４ーＤＰと省略）及び関連化合物に対する抗体。
前記２，４ーＤＰ及び関連化合物は２，４ージクロロフェノキシ酢酸（２，４ーＤと省略）である請求項１に記載の抗体。
２，４ーＤをイソブチルクロロフォルメートとＮートリエチルアミンで処理し、本反応物とタンパク質を結合させたものを抗原として抗体を作成する抗体の製造方法。
タンパク質と結合した２，４ーＤＰ関連化合物を吸着させたウエルに２，４ーＤＰ関連化合物溶液を添加し，更に請求項１に記載の抗体を加えてインキュベートした後にウエルを洗浄し，標識化免疫定量法を用いて２，４ーＤＰ関連化合物溶液中の２，４ーＤＰ関連化合物を定量する抗体を用いた抗原の定量方法。