JPH0789998A - 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマInfo
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- JPH0789998A JPH0789998A JP5239275A JP23927593A JPH0789998A JP H0789998 A JPH0789998 A JP H0789998A JP 5239275 A JP5239275 A JP 5239275A JP 23927593 A JP23927593 A JP 23927593A JP H0789998 A JPH0789998 A JP H0789998A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ミクロシスチン−ＬＲをハプテンとする抗原
で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミエロー
マとの細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
生される抗ミクロシスチン−ＬＲモノクローナル抗体お
よびそれを産生するハイブリドーマ。 【効果】 本発明によれば、ミクロシスチンの免疫測定
法に有用な、ミクロシスチンに対する特異性が高く、安
定した品質のモノクローナル抗体が供給される。
で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミエロー
マとの細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
生される抗ミクロシスチン−ＬＲモノクローナル抗体お
よびそれを産生するハイブリドーマ。 【効果】 本発明によれば、ミクロシスチンの免疫測定
法に有用な、ミクロシスチンに対する特異性が高く、安
定した品質のモノクローナル抗体が供給される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ミクロシスチンモノ
クローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマに
関する。
クローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマに
関する。
【０００２】
【従来の技術】ミクロシスチン（Microcystin)は藍藻類
により産生される毒素である。ミクロシスチン−ＬＲ
（以下、ＭＬＲということがある）はミクロシスチンの
中で最も強力な毒性を有するものの１つであり、マウス
でＬＤ50値が３２．５または１００μg/kgと、その急性
毒性は青酸カリよりはるかに強い。慢性毒性について
は、ラットを用いた動物実験により、肝発ガンプロモー
ター活性を有することが明らかにされている。藍藻類に
よる家畜の死亡が最初に報告されたのは１８７８年で、
１９１３年には魚の大量死が報告され、１９４０年代以
降には北アメリカをはじめオーストラリア、南アフリ
カ、北欧などの放牧の盛んな国々で頻発した。１９８０
年代になると、世界各地の湖沼、ダム湖に有毒藍藻類が
発生していることが明らかにされ、特に湖沼の富栄養化
に伴っての異常発生は今や社会問題となっている。
により産生される毒素である。ミクロシスチン−ＬＲ
（以下、ＭＬＲということがある）はミクロシスチンの
中で最も強力な毒性を有するものの１つであり、マウス
でＬＤ50値が３２．５または１００μg/kgと、その急性
毒性は青酸カリよりはるかに強い。慢性毒性について
は、ラットを用いた動物実験により、肝発ガンプロモー
ター活性を有することが明らかにされている。藍藻類に
よる家畜の死亡が最初に報告されたのは１８７８年で、
１９１３年には魚の大量死が報告され、１９４０年代以
降には北アメリカをはじめオーストラリア、南アフリ
カ、北欧などの放牧の盛んな国々で頻発した。１９８０
年代になると、世界各地の湖沼、ダム湖に有毒藍藻類が
発生していることが明らかにされ、特に湖沼の富栄養化
に伴っての異常発生は今や社会問題となっている。
【０００３】ミクロシスチンを湖沼などの水あるいは藻
類から検出する方法としては、高速液体クロマトグラフ
ィーやバイオアッセイ法等が用いられており、最近では
免疫測定法も試みられている。さて、免疫測定法で特異
的にミクロシスチンを測定するためには、特異性の高い
抗体が必要であることは論ずるまでもない。ミクロシス
チン−ＬＲのような低分子化合物に対する抗体を作製す
る場合は、低分子化合物それ自身が免疫原性を持たない
ので、蛋白質などの高分子キャリアーと結合させてハプ
テン抗原とし、動物を免疫するのが通常の方法である。
ミクロシスチン−ＬＲに対する抗体の作製も、ミクロシ
スチン−ＬＲをポリリジンまたはウシ血清アルブミンに
結合させたハプテン抗原でウサギを免疫して行われてき
た〔たとえば、F. S. Chu, X. Huang, R. D. VVei and
W. W. CarmiChael, Appl. Environ. Microbiol., 55, 1
928(1989) 参照〕。しかしながら、現在までに免疫測定
法への応用が報告されている抗ミクロシスチン抗体はポ
リクローナル抗体であり、量的制限や抗体のロット差等
の問題点があった。そこで一般に広く用い得るミクロシ
スチンの免疫測定法を開発するために、均一な抗体を無
制限に供給することを可能にするモノクローナル抗体の
作製が強く待ち望まれている。
類から検出する方法としては、高速液体クロマトグラフ
ィーやバイオアッセイ法等が用いられており、最近では
免疫測定法も試みられている。さて、免疫測定法で特異
的にミクロシスチンを測定するためには、特異性の高い
抗体が必要であることは論ずるまでもない。ミクロシス
チン−ＬＲのような低分子化合物に対する抗体を作製す
る場合は、低分子化合物それ自身が免疫原性を持たない
ので、蛋白質などの高分子キャリアーと結合させてハプ
テン抗原とし、動物を免疫するのが通常の方法である。
ミクロシスチン−ＬＲに対する抗体の作製も、ミクロシ
スチン−ＬＲをポリリジンまたはウシ血清アルブミンに
結合させたハプテン抗原でウサギを免疫して行われてき
た〔たとえば、F. S. Chu, X. Huang, R. D. VVei and
W. W. CarmiChael, Appl. Environ. Microbiol., 55, 1
928(1989) 参照〕。しかしながら、現在までに免疫測定
法への応用が報告されている抗ミクロシスチン抗体はポ
リクローナル抗体であり、量的制限や抗体のロット差等
の問題点があった。そこで一般に広く用い得るミクロシ
スチンの免疫測定法を開発するために、均一な抗体を無
制限に供給することを可能にするモノクローナル抗体の
作製が強く待ち望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な抗ミクロシスチンモノクローナル抗体を提供すること
にある。本発明の他の目的は、ミクロシスチン類に対し
て特異性の高い抗ミクロシスチンモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを提供することにある。本発明
の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかと
なろう。
な抗ミクロシスチンモノクローナル抗体を提供すること
にある。本発明の他の目的は、ミクロシスチン類に対し
て特異性の高い抗ミクロシスチンモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを提供することにある。本発明
の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかと
なろう。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ハプテン抗
原で免疫し、目的とする抗原に特異的に作用する抗体を
産生するクローンを選びだして単クローンとすることに
より、特異性の高い抗体を製造することができることを
見出し、かかる事実に基づいて本発明を完成するに至っ
たものである。また、一般に抗血清の製造を目的とし
て、動物を免疫する都度新たにハプテン抗原を作製する
従来の方法では、ハプテン抗原の作り方や動物の個体
差、免疫の仕方によって、その都度、力価、特異性、抗
体サブクラスの異なった抗体が得られ、そのため、この
抗体を測定試薬に応用した場合、測定結果に微妙な影響
を与えるが、本抗体産生ハイブリドーマを用いて抗体を
製造すれば、その都度抗原を作る必要もなく、また、動
物の個体差にわずらわされずに常に安定した品質の抗体
が得られる。これは本発明のもう一つの利点である。
原で免疫し、目的とする抗原に特異的に作用する抗体を
産生するクローンを選びだして単クローンとすることに
より、特異性の高い抗体を製造することができることを
見出し、かかる事実に基づいて本発明を完成するに至っ
たものである。また、一般に抗血清の製造を目的とし
て、動物を免疫する都度新たにハプテン抗原を作製する
従来の方法では、ハプテン抗原の作り方や動物の個体
差、免疫の仕方によって、その都度、力価、特異性、抗
体サブクラスの異なった抗体が得られ、そのため、この
抗体を測定試薬に応用した場合、測定結果に微妙な影響
を与えるが、本抗体産生ハイブリドーマを用いて抗体を
製造すれば、その都度抗原を作る必要もなく、また、動
物の個体差にわずらわされずに常に安定した品質の抗体
が得られる。これは本発明のもう一つの利点である。
【０００６】上記本発明の目的および利点は、本発明に
よれば、第１に、ミクロシスチン−ＬＲをハプテンとす
る抗原で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミ
エローマとの細胞融合により形成されたハイブリドーマ
から産生される抗ミクロシスチンモノクローナル抗体に
よって達成される。本発明の目的を達成するための第一
段階は、抗体を産生する新規な単クローンハイブリドー
マを確立することである。このハイブリドーマを確立す
る方法の具体的詳細は実施例で示すが、簡単には次の３
工程からなる。 １．免疫 ２．細胞融合 ３．ハイブリドーマの選択と単クローン化
よれば、第１に、ミクロシスチン−ＬＲをハプテンとす
る抗原で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミ
エローマとの細胞融合により形成されたハイブリドーマ
から産生される抗ミクロシスチンモノクローナル抗体に
よって達成される。本発明の目的を達成するための第一
段階は、抗体を産生する新規な単クローンハイブリドー
マを確立することである。このハイブリドーマを確立す
る方法の具体的詳細は実施例で示すが、簡単には次の３
工程からなる。 １．免疫 ２．細胞融合 ３．ハイブリドーマの選択と単クローン化
【０００７】ミクロシスチン−ＬＲは単独では抗原にな
り得ないため、ミクロシスチン−ＬＲを蛋白質と結合さ
せて免疫抗原とする。蛋白質としては一般に入手出来る
ものなら特に制限はないが、通常入手し易いウシ血清ア
ルブミンなどが有利に用いられる。ミクロシスチン−Ｌ
Ｒと蛋白質との結合には、公知の方法、たとえば前記の
Chu, F. S.らの方法が有効に採用される。蛋白質の結合
方法としては、例えば１−エチル−３，３−ジエチルア
ミノ−プロピル−カルボジイミドを用いて、ミクロシス
チン−ＬＲをウシ血清アルブミンや卵白アルブミンと結
合させる。
り得ないため、ミクロシスチン−ＬＲを蛋白質と結合さ
せて免疫抗原とする。蛋白質としては一般に入手出来る
ものなら特に制限はないが、通常入手し易いウシ血清ア
ルブミンなどが有利に用いられる。ミクロシスチン−Ｌ
Ｒと蛋白質との結合には、公知の方法、たとえば前記の
Chu, F. S.らの方法が有効に採用される。蛋白質の結合
方法としては、例えば１−エチル−３，３−ジエチルア
ミノ−プロピル−カルボジイミドを用いて、ミクロシス
チン−ＬＲをウシ血清アルブミンや卵白アルブミンと結
合させる。
【０００８】免疫する動物は、細胞融合に使用する腫瘍
細胞株によって決められる。一般にはラット、マウスが
多く用いられる。マウスの種類の中でも、免疫グロブリ
ンを産生しない腫瘍細胞株の確立されているＢＡＬＢ／
ｃ系統がよく用いられる。ハプテン抗原は、等張緩衝液
あるいは生理食塩水などに溶解して使用するが、マウス
１匹当たり１回に１０μg から３００μg を投与するの
が好ましい。免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はア
ジュバンドと共に投与することが多い。アジュバンドと
しては、ミョウバン、結核死菌、核酸などが使用され
る。免疫は２〜４週間隔で行い、最終免疫にはアジュバ
ンドを使用せず、生理食塩水等に溶解した抗原を腹腔内
あるいは静脈内に投与する。最終免疫２〜４日後にリン
パ節あるいは脾臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融
合に供する。一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株と
しては、初期にはＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
等があったが、これらは自身免疫グロブリンを産生する
ので、最近ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３−Ｎ
Ｓ−１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇｌ４（ＳＰ２／Ｏ）、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８・６５３（６５３）等が汎用されてい
る。
細胞株によって決められる。一般にはラット、マウスが
多く用いられる。マウスの種類の中でも、免疫グロブリ
ンを産生しない腫瘍細胞株の確立されているＢＡＬＢ／
ｃ系統がよく用いられる。ハプテン抗原は、等張緩衝液
あるいは生理食塩水などに溶解して使用するが、マウス
１匹当たり１回に１０μg から３００μg を投与するの
が好ましい。免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はア
ジュバンドと共に投与することが多い。アジュバンドと
しては、ミョウバン、結核死菌、核酸などが使用され
る。免疫は２〜４週間隔で行い、最終免疫にはアジュバ
ンドを使用せず、生理食塩水等に溶解した抗原を腹腔内
あるいは静脈内に投与する。最終免疫２〜４日後にリン
パ節あるいは脾臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融
合に供する。一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株と
しては、初期にはＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８
等があったが、これらは自身免疫グロブリンを産生する
ので、最近ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３−Ｎ
Ｓ−１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇｌ４（ＳＰ２／Ｏ）、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８・６５３（６５３）等が汎用されてい
る。
【０００９】細胞融合には、腫瘍細胞に比べリンパ球を
５〜２０倍量多く用いる。ＤＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙ培
地、ＲＰＭＩ１６４０培地、あるいは等張緩衝液等で洗
浄した腫瘍細胞とリンパ球を混合後、遠心分離し、ペレ
ットとする。ペレットをほぐした後、ＨＶＪ（センダイ
ウイルス）あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
で細胞を融合させるが、一般には取扱いの便利な平均分
子量１，０００〜８，０００のＰＥＧの４０〜６０％溶
液を０．５〜２ml使用する。融合を促進するためにコル
ヒチン、ジメチルスルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニン
等を添加することもあるが、必須ではない。
５〜２０倍量多く用いる。ＤＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙ培
地、ＲＰＭＩ１６４０培地、あるいは等張緩衝液等で洗
浄した腫瘍細胞とリンパ球を混合後、遠心分離し、ペレ
ットとする。ペレットをほぐした後、ＨＶＪ（センダイ
ウイルス）あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
で細胞を融合させるが、一般には取扱いの便利な平均分
子量１，０００〜８，０００のＰＥＧの４０〜６０％溶
液を０．５〜２ml使用する。融合を促進するためにコル
ヒチン、ジメチルスルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニン
等を添加することもあるが、必須ではない。
【００１０】ＰＥＧ溶液で融合反応を１〜１０分間程度
行った後、ＤＭＥＭ培地やＲＰＭＩ１６４０培地等を１
０〜５０ml徐々に加え、融合反応を停止させる。停止
後、遠心し、上清を除去する。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を５〜２０％含むＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０
培地を加え、２４穴の培養プレートに、リンパ球が１穴
当たり１×１０5 〜５×１０6 個となるよう１mlずつ分
注する。あるいは９６穴培養プレートに、リンパ球が１
穴当たり１〜２×１０5 個となるよう０．１mlずつ分注
する。両方共にフィーダー細胞を添加した方が好まし
い。フィーダー細胞としては、ラットの胸腺細胞、脾細
胞、マウスの胸腺細胞、脾細胞等が用いられ、濃度が
０．５〜２×１０6/mlとなるように添加する。
行った後、ＤＭＥＭ培地やＲＰＭＩ１６４０培地等を１
０〜５０ml徐々に加え、融合反応を停止させる。停止
後、遠心し、上清を除去する。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を５〜２０％含むＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０
培地を加え、２４穴の培養プレートに、リンパ球が１穴
当たり１×１０5 〜５×１０6 個となるよう１mlずつ分
注する。あるいは９６穴培養プレートに、リンパ球が１
穴当たり１〜２×１０5 個となるよう０．１mlずつ分注
する。両方共にフィーダー細胞を添加した方が好まし
い。フィーダー細胞としては、ラットの胸腺細胞、脾細
胞、マウスの胸腺細胞、脾細胞等が用いられ、濃度が
０．５〜２×１０6/mlとなるように添加する。
【００１１】次に、ヒポキサンチン１×１０4 M 、アミ
ノプテリン４×１０-7M 、チミジン１．６×１０-5M を
含むＲＰＭＩ１６４０培地（またはＤＭＥＭ培地）、即
ちＨＡＴ培地に培地を換えて行く。ＨＡＴ培地交換の方
法は、一般には、融合の翌日に培養プレートに融合時に
分注した容量と等容量のＨＡＴ培地を加え、更に翌日Ｈ
ＡＴ培地で半量を交換する。その後２〜３日毎にＨＡＴ
培地で半量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目にアミ
ノプテリンを除いたＨＡＴ培地、即ちＨＴ培地で半量交
換し、更にその１〜３日後より１〜３日毎に培地の半量
をＨＡＴを含まない通常の培地と交換する。
ノプテリン４×１０-7M 、チミジン１．６×１０-5M を
含むＲＰＭＩ１６４０培地（またはＤＭＥＭ培地）、即
ちＨＡＴ培地に培地を換えて行く。ＨＡＴ培地交換の方
法は、一般には、融合の翌日に培養プレートに融合時に
分注した容量と等容量のＨＡＴ培地を加え、更に翌日Ｈ
ＡＴ培地で半量を交換する。その後２〜３日毎にＨＡＴ
培地で半量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目にアミ
ノプテリンを除いたＨＡＴ培地、即ちＨＴ培地で半量交
換し、更にその１〜３日後より１〜３日毎に培地の半量
をＨＡＴを含まない通常の培地と交換する。
【００１２】ハイブリドーマの増殖の盛んな穴の細胞培
養上清を、種々の分析法（例えばＲＩＡ、プラーク法、
凝集反応、ＥＬＩＳＡなど）で試験し、目的の抗体産生
ハイブリドーマを選択する。
養上清を、種々の分析法（例えばＲＩＡ、プラーク法、
凝集反応、ＥＬＩＳＡなど）で試験し、目的の抗体産生
ハイブリドーマを選択する。
【００１３】ハイブリドーマを得たならクローニングを
行う。クローニングの方法としては、ＦＡＣＳ（Fluore
scent Activated Cell Sorter)を用いたり、ソフトアガ
ー（Soft Agar ）を用いてコロニーを拾い上げる方法、
一般によく用いられている限界希釈法などがある。クロ
ーニングは、コロニーが１つのハイブリドーマから形成
されるような細胞濃度で行う。限界希釈法では、９６穴
プレートの１穴当たり細胞が０．６個以下になるように
行う。どの方法を用いてもクローニングは２回繰り返し
行い、単一クローンとする。
行う。クローニングの方法としては、ＦＡＣＳ（Fluore
scent Activated Cell Sorter)を用いたり、ソフトアガ
ー（Soft Agar ）を用いてコロニーを拾い上げる方法、
一般によく用いられている限界希釈法などがある。クロ
ーニングは、コロニーが１つのハイブリドーマから形成
されるような細胞濃度で行う。限界希釈法では、９６穴
プレートの１穴当たり細胞が０．６個以下になるように
行う。どの方法を用いてもクローニングは２回繰り返し
行い、単一クローンとする。
【００１４】クローンを確立したなら、それを大量にin
vitroで培養するか、またはin vivo で培養することに
よって抗体を産生させる。in vitroで産生された抗体
は、他の抗体の混入はないが抗体濃度は低い。in vivo
で産生された抗体には宿主からの抗体が若干混じるが、
抗体濃度はin vitroのものに比し非常に高い。どちらの
方法で抗体を産生させるかは目的による。抗ミクロシス
チン−ＬＲモノクローナル抗体は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ
等に応用出来る。ＥＬＩＳＡに使用する時は、標準酵素
としてβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることが出来る。以下に
実施例を挙げて更に詳細に説明するが、実施例が発明の
範囲を拘束するものではない。
vitroで培養するか、またはin vivo で培養することに
よって抗体を産生させる。in vitroで産生された抗体
は、他の抗体の混入はないが抗体濃度は低い。in vivo
で産生された抗体には宿主からの抗体が若干混じるが、
抗体濃度はin vitroのものに比し非常に高い。どちらの
方法で抗体を産生させるかは目的による。抗ミクロシス
チン−ＬＲモノクローナル抗体は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ
等に応用出来る。ＥＬＩＳＡに使用する時は、標準酵素
としてβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることが出来る。以下に
実施例を挙げて更に詳細に説明するが、実施例が発明の
範囲を拘束するものではない。
【００１５】
抗ミクロシスチン−ＬＲモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマおよび抗体の作製： １）免疫抗原、分析用抗原の作製 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）６．４mgを０．０５M リ
ン酸緩衝液（pH７．０、ＰＢＳ）１mlに溶解し、続いて
この溶液にミクロシスチン−ＬＲ１mgを溶解した。この
溶液に１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＰＣ）の３．２mg /０．５mlＰＢＳ
溶液を混合し、２４時間室温で攪拌した。反応後、ＰＢ
Ｓに対して透析し、非透析画分を２，０００rpm で１０
分間遠心して不溶物を沈殿させ、上清をミクロシスチン
−ＬＲ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液とした。また、ＢＳＡの代
わりに卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いて、上記と同様
の操作でミクロシスチン−ＬＲ−ＯＶＡを作製した。更
にカサ貝の一種のヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、ミ
クロシスチン−ＬＲ−ＫＬＨも作製した。
ハイブリドーマおよび抗体の作製： １）免疫抗原、分析用抗原の作製 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）６．４mgを０．０５M リ
ン酸緩衝液（pH７．０、ＰＢＳ）１mlに溶解し、続いて
この溶液にミクロシスチン−ＬＲ１mgを溶解した。この
溶液に１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＰＣ）の３．２mg /０．５mlＰＢＳ
溶液を混合し、２４時間室温で攪拌した。反応後、ＰＢ
Ｓに対して透析し、非透析画分を２，０００rpm で１０
分間遠心して不溶物を沈殿させ、上清をミクロシスチン
−ＬＲ−ＢＳＡのＰＢＳ溶液とした。また、ＢＳＡの代
わりに卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いて、上記と同様
の操作でミクロシスチン−ＬＲ−ＯＶＡを作製した。更
にカサ貝の一種のヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、ミ
クロシスチン−ＬＲ−ＫＬＨも作製した。
【００１６】２）免疫 ミクロシスチン−ＬＲ−ＢＳＡまたはミクロシスチン−
ＬＲ−ＫＬＨのＰＢＳ溶液を等量のフロイントの完全ア
ジュバンドと混合してエマルジョンとし、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス（雌性、６週齢）の背部皮内に投与した（２５μ
g 抗原／マウス）。１４日後、フロイントの不完全アジ
ュバンドを用いて同様の方法で追加免疫した（２５μg
抗原／マウス）。更に、２１日後および２８日後に、４
０μg の各抗原を腹腔内投与または尾静脈に注射するこ
とにより追加免疫を行った。
ＬＲ−ＫＬＨのＰＢＳ溶液を等量のフロイントの完全ア
ジュバンドと混合してエマルジョンとし、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス（雌性、６週齢）の背部皮内に投与した（２５μ
g 抗原／マウス）。１４日後、フロイントの不完全アジ
ュバンドを用いて同様の方法で追加免疫した（２５μg
抗原／マウス）。更に、２１日後および２８日後に、４
０μg の各抗原を腹腔内投与または尾静脈に注射するこ
とにより追加免疫を行った。
【００１７】３）細胞融合 最終免疫より３日後、マウスの脾臓を摘出し、１０mlの
ＭＥＭ培地を入れたプラスチックシャーレ中で脾リンパ
球をほぐした。脾リンパ球は、遠心操作（１，０００rp
m 、１０分）を繰り返し、ＭＥＭ培地で３回洗浄した。
脾リンパ球１．０×１０8 個と８−アザグアニン耐性ミ
エローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２／Ｏ）２×１０
7 個を混合し、１，０００rpm で１０分遠心してペレッ
トとした。上清のＭＥＭ培地を吸引除去し、ペレットを
ほぐした。５０％ＰＥＧ４０００の１mlを１分間かけて
加え、用いたピペットで攪拌しながら３７℃で１分間反
応させた。続いて１mlのＤＭＥＭ培地１mlを３７℃で１
分間かけて加えた。同様の操作をもう１度行った後、３
７℃に温めておいたＭＥＭ培地７mlを２〜３分間で加え
た。直ちに、８００rpm で６分、室温で遠心して、上清
を除去した。３７℃に温めておいた２０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）−ＩＭＤＭ培地３０mlを加え、ペレットを懸
濁させた。更に３０mlの２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地を
加えて良く懸濁させた後、９６穴培養プレートにこの懸
濁液を１穴当たり０．１ml分注し、ＣＯ2 インキュベー
ター内で培養した。以下、細胞融合を行った日を第０日
として記述する。
ＭＥＭ培地を入れたプラスチックシャーレ中で脾リンパ
球をほぐした。脾リンパ球は、遠心操作（１，０００rp
m 、１０分）を繰り返し、ＭＥＭ培地で３回洗浄した。
脾リンパ球１．０×１０8 個と８−アザグアニン耐性ミ
エローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２／Ｏ）２×１０
7 個を混合し、１，０００rpm で１０分遠心してペレッ
トとした。上清のＭＥＭ培地を吸引除去し、ペレットを
ほぐした。５０％ＰＥＧ４０００の１mlを１分間かけて
加え、用いたピペットで攪拌しながら３７℃で１分間反
応させた。続いて１mlのＤＭＥＭ培地１mlを３７℃で１
分間かけて加えた。同様の操作をもう１度行った後、３
７℃に温めておいたＭＥＭ培地７mlを２〜３分間で加え
た。直ちに、８００rpm で６分、室温で遠心して、上清
を除去した。３７℃に温めておいた２０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）−ＩＭＤＭ培地３０mlを加え、ペレットを懸
濁させた。更に３０mlの２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地を
加えて良く懸濁させた後、９６穴培養プレートにこの懸
濁液を１穴当たり０．１ml分注し、ＣＯ2 インキュベー
ター内で培養した。以下、細胞融合を行った日を第０日
として記述する。
【００１８】４）ＨＡＴ選択 第１日に、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１×１０-4M 、
アミノプテリン４×１０-7M 、チミジン１．６×１０-5
M を含む２０％ＦＣＳ−ＩＭＥＭ培地）を１穴当たり
０．１ml加えた。第２、３、５、８および１１日目に培
地の半分を吸引除去し、ＨＡＴ培地０．１mlを加えた。
以後３〜４日毎に同様の操作でＨＴ培地（アミノプテリ
ンを除いたＨＡＴ培地）と交換した。ハイブリドーマは
ほぼ全穴に増殖してきた。
アミノプテリン４×１０-7M 、チミジン１．６×１０-5
M を含む２０％ＦＣＳ−ＩＭＥＭ培地）を１穴当たり
０．１ml加えた。第２、３、５、８および１１日目に培
地の半分を吸引除去し、ＨＡＴ培地０．１mlを加えた。
以後３〜４日毎に同様の操作でＨＴ培地（アミノプテリ
ンを除いたＨＡＴ培地）と交換した。ハイブリドーマは
ほぼ全穴に増殖してきた。
【００１９】５）ハイブリドーマの選択 融合して２週間後から３週間後までの間、３〜４日毎に
培養上清を各穴から集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。先
ず、ＰＢＳ５０μl 中に溶解した２μｇのミクロシスチ
ン−ＬＲ−ＢＳＡ、ミクロシスチン−ＬＲ−ＯＶＡまた
はミクロシスチン−ＬＲ−ＫＬＨをＥＬＩＳＡプレート
の各穴に分注し、４℃で一晩静置して抗原をプレートに
固定化した。Tween 20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗
浄した後、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避ける
ため、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液を１００μl
ずつ分注し、室温で１時間静置した。次に、同上緩衝液
で３回洗浄後、上記の各細胞培養上清を５０μl 分注
し、室温で１時間静置した。陰性対照として２０％ＦＣ
Ｓ−ＩＭＤＭ培地１００μl を分注した。更に同上緩衝
液で４回洗浄後、抗マウス免疫グロブリン抗体−アルカ
リホスファターゼ複合体溶液５０μl をプレートに分注
し、室温で１時間静置した。同上緩衝液で４回洗浄後、
ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム・６Ｈ2 Ｏ（１
mg/ml ）溶液を１００μl ずつ分注し、室温で１時間反
応後、４０５nmの光学密度を測定して、アルカリホスフ
ァターゼ活性を定量した。また、カルボジイミドを用い
て作製した抗原は、カルボジイミドの一部が分子内転移
を起こし、Ｎ−置換ウレアとして蛋白質に残るので、カ
ルボジイミドのみで処理したＢＳＡ、ＯＶＡ、ＫＬＨ
（ＥＤＰＣ−ＢＳＡ、ＥＤＰＣ−ＯＶＡ、ＥＤＰＣ−Ｋ
ＬＨ）を作製し、これらをプレートに固定化してＥＬＩ
ＳＡを行い、ミクロシスチン−ＬＲの結合蛋白質３種に
対して陽性を示し、かつ、ＥＤＰＣ処理蛋白質３種に対
して陰性を示した抗体を産生しているハイブリドーマ
を、抗ミクロシスチン−ＬＲＭＡｂ産生ハイブリドーマ
として選択した。
培養上清を各穴から集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。先
ず、ＰＢＳ５０μl 中に溶解した２μｇのミクロシスチ
ン−ＬＲ−ＢＳＡ、ミクロシスチン−ＬＲ−ＯＶＡまた
はミクロシスチン−ＬＲ−ＫＬＨをＥＬＩＳＡプレート
の各穴に分注し、４℃で一晩静置して抗原をプレートに
固定化した。Tween 20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗
浄した後、培養上清中の蛋白質の非特異的吸着を避ける
ため、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液を１００μl
ずつ分注し、室温で１時間静置した。次に、同上緩衝液
で３回洗浄後、上記の各細胞培養上清を５０μl 分注
し、室温で１時間静置した。陰性対照として２０％ＦＣ
Ｓ−ＩＭＤＭ培地１００μl を分注した。更に同上緩衝
液で４回洗浄後、抗マウス免疫グロブリン抗体−アルカ
リホスファターゼ複合体溶液５０μl をプレートに分注
し、室温で１時間静置した。同上緩衝液で４回洗浄後、
ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム・６Ｈ2 Ｏ（１
mg/ml ）溶液を１００μl ずつ分注し、室温で１時間反
応後、４０５nmの光学密度を測定して、アルカリホスフ
ァターゼ活性を定量した。また、カルボジイミドを用い
て作製した抗原は、カルボジイミドの一部が分子内転移
を起こし、Ｎ−置換ウレアとして蛋白質に残るので、カ
ルボジイミドのみで処理したＢＳＡ、ＯＶＡ、ＫＬＨ
（ＥＤＰＣ−ＢＳＡ、ＥＤＰＣ−ＯＶＡ、ＥＤＰＣ−Ｋ
ＬＨ）を作製し、これらをプレートに固定化してＥＬＩ
ＳＡを行い、ミクロシスチン−ＬＲの結合蛋白質３種に
対して陽性を示し、かつ、ＥＤＰＣ処理蛋白質３種に対
して陰性を示した抗体を産生しているハイブリドーマ
を、抗ミクロシスチン−ＬＲＭＡｂ産生ハイブリドーマ
として選択した。
【００２０】６）１mlの培養スケールへの拡大 どの穴の細胞が抗ミクロシスチン−ＬＲ抗体を産生して
いるかが判明したら、２４穴培養プレートへ植え換え、
１mlスケールでの培養を行った。ＨＴ培地０．５mlを２
４穴培養プレートに分注し、そこに９６穴培養プレート
における抗体産生穴の細胞懸濁液を移す。これを再懸濁
し、そのうちの２５０μl を元の９６穴培養プレートの
穴にもどした。これが複製となり、新しい細胞株の喪失
をふせぐことができる。２〜３日後、２４穴培養プレー
トに２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地０．５mlを加えた。そ
の翌日には細胞がほぼ全面に拡がり、良好な増殖を示し
たので、それらの培養上清を用いて遊離型ミクロシスチ
ンによる阻害試験を行い、抗ミクロシスチン抗体産生を
確認した。即ち、５）で述べたＥＬＩＳＡの実験系で
０．５μgのミクロシスチン存在下での各穴のミクロシ
スチン−ＬＲ−ＢＳＡに対する抗体活性を測定し、ミク
ロシスチンによる活性阻害の有無を調べた。その結果、
２４穴培養プレートに移した全てのハイブリドーマの培
養上清でミクロシスチンによる競合阻害が認められ、抗
ミクロシスチン抗体産生が、最終的に６穴で確認され
た。以上の操作によりミクロシスチン−ＬＲ−ＢＳＡ免
疫マウスより４クローン、ミクロシスチン−ＬＲ−ＫＬ
Ｈ免疫マウスより２クローンの抗ミクロシスチンＭＡｂ
産生ハイブリドーマが得られた。
いるかが判明したら、２４穴培養プレートへ植え換え、
１mlスケールでの培養を行った。ＨＴ培地０．５mlを２
４穴培養プレートに分注し、そこに９６穴培養プレート
における抗体産生穴の細胞懸濁液を移す。これを再懸濁
し、そのうちの２５０μl を元の９６穴培養プレートの
穴にもどした。これが複製となり、新しい細胞株の喪失
をふせぐことができる。２〜３日後、２４穴培養プレー
トに２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地０．５mlを加えた。そ
の翌日には細胞がほぼ全面に拡がり、良好な増殖を示し
たので、それらの培養上清を用いて遊離型ミクロシスチ
ンによる阻害試験を行い、抗ミクロシスチン抗体産生を
確認した。即ち、５）で述べたＥＬＩＳＡの実験系で
０．５μgのミクロシスチン存在下での各穴のミクロシ
スチン−ＬＲ−ＢＳＡに対する抗体活性を測定し、ミク
ロシスチンによる活性阻害の有無を調べた。その結果、
２４穴培養プレートに移した全てのハイブリドーマの培
養上清でミクロシスチンによる競合阻害が認められ、抗
ミクロシスチン抗体産生が、最終的に６穴で確認され
た。以上の操作によりミクロシスチン−ＬＲ−ＢＳＡ免
疫マウスより４クローン、ミクロシスチン−ＬＲ−ＫＬ
Ｈ免疫マウスより２クローンの抗ミクロシスチンＭＡｂ
産生ハイブリドーマが得られた。
【００２１】７）単クローン化 ２４穴培養プレートに増殖したハイブリドーマを、限界
希釈法によるクローニングで単クローン化した。クロー
ニング培地は、２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地である。抗
ミクロシスチン−ＬＲ抗体産生ハイブリドーマを計数
し、クローニング培地１ml中に１０個の細胞が含まれる
ように希釈した。この懸濁液を１００μl ずつ９６穴培
養プレート中の６０穴に分注した。５日目に１００μl
の培地を加えた。１０日目にＥＬＩＳＡにより活性を測
定し、活性のあるクローンを２４穴培養プレートで増殖
させた。更に、同様の方法で再クローニングを行い、抗
ミクロシスチン−ＬＲ抗体産生ハイブリドーマのクロー
ン６株（以下、１Ａ６、７Ｄ４、８Ｈ５、９Ｄ１、１Ｃ
２および１Ｈ４；６株という）を得た。これらクローン
の中でミクロシスチン−ＬＲとの反応性に優れるモノク
ローナル抗体を産生する８Ｈ５株をＡ−ＭＬＲ ８Ｈ
５．１Ｆ１２と命名した。
希釈法によるクローニングで単クローン化した。クロー
ニング培地は、２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地である。抗
ミクロシスチン−ＬＲ抗体産生ハイブリドーマを計数
し、クローニング培地１ml中に１０個の細胞が含まれる
ように希釈した。この懸濁液を１００μl ずつ９６穴培
養プレート中の６０穴に分注した。５日目に１００μl
の培地を加えた。１０日目にＥＬＩＳＡにより活性を測
定し、活性のあるクローンを２４穴培養プレートで増殖
させた。更に、同様の方法で再クローニングを行い、抗
ミクロシスチン−ＬＲ抗体産生ハイブリドーマのクロー
ン６株（以下、１Ａ６、７Ｄ４、８Ｈ５、９Ｄ１、１Ｃ
２および１Ｈ４；６株という）を得た。これらクローン
の中でミクロシスチン−ＬＲとの反応性に優れるモノク
ローナル抗体を産生する８Ｈ５株をＡ−ＭＬＲ ８Ｈ
５．１Ｆ１２と命名した。
【００２２】この抗ミクロシスチン−ＬＲＭＡｂ産生ハ
イブリドーマＡ−ＭＬＲ ８Ｈ５．１Ｆ１２は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７７８として寄託されている。
イブリドーマＡ−ＭＬＲ ８Ｈ５．１Ｆ１２は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７７８として寄託されている。
【００２３】８）モノクローナル抗体の生産 モノクローナル抗体は培養上清中に１０〜５０μg/ml分
泌される。ハイブリドーマを増殖させた後、ほとんど全
てのハイブリドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を
回収した。また、上記６株の各培養細胞のそれぞれ２×
１０6 個をＤＭＥＭ培地０．５mlに浮遊させ、ＢＡＬＢ
／ｃマウス（雌性、６週齢、予め３〜１０日前にプリス
タン０．５mlを腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内に
投与し、腹水を回収した。
泌される。ハイブリドーマを増殖させた後、ほとんど全
てのハイブリドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を
回収した。また、上記６株の各培養細胞のそれぞれ２×
１０6 個をＤＭＥＭ培地０．５mlに浮遊させ、ＢＡＬＢ
／ｃマウス（雌性、６週齢、予め３〜１０日前にプリス
タン０．５mlを腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内に
投与し、腹水を回収した。
【００２４】９）モノクローナル抗体のクラスの決定 それぞれのハイブリドーマクローンが産生する免疫グロ
ブリンのクラスは、各クラスに特異的な抗血清（抗Ｉｇ
Ｇ1 、ＩｇＧ2 ａ、ＩｇＧ2 ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を用
いたイムノブロット法（市販のキット）により決定し
た。その結果、上記株が産生するモノクローナル抗体の
うち、５株（１Ａ６、７Ｄ４、９Ｄ１、１Ｃ２、８Ｈ
５）はＩｇＧ1 に属することがわかった。また１Ｈ４株
のモノクローナル抗体はＩｇＡに属することがわかっ
た。
ブリンのクラスは、各クラスに特異的な抗血清（抗Ｉｇ
Ｇ1 、ＩｇＧ2 ａ、ＩｇＧ2 ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を用
いたイムノブロット法（市販のキット）により決定し
た。その結果、上記株が産生するモノクローナル抗体の
うち、５株（１Ａ６、７Ｄ４、９Ｄ１、１Ｃ２、８Ｈ
５）はＩｇＧ1 に属することがわかった。また１Ｈ４株
のモノクローナル抗体はＩｇＡに属することがわかっ
た。
【００２５】１０）モノクローナル抗体の反応性 市販ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートにミクロシスチン−
ＬＲの牛血清アルブミンとの結合体を固定し、これにモ
ノクローナル抗体およびミクロシスチン−ＬＲあるいは
その類縁化合物を混合して加え、４℃で１晩静置して固
定抗原との競合反応を行わせた後、マイクロプレートに
結合したモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＧ抗体（市販）を用いて検出した。抗マウス
ＩｇＧ抗体標識のパーオキシダーゼ活性は、テトラメチ
ルベンジジン、過酸化水素を基質として測定した。その
結果を第１表に示す。
ＬＲの牛血清アルブミンとの結合体を固定し、これにモ
ノクローナル抗体およびミクロシスチン−ＬＲあるいは
その類縁化合物を混合して加え、４℃で１晩静置して固
定抗原との競合反応を行わせた後、マイクロプレートに
結合したモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＧ抗体（市販）を用いて検出した。抗マウス
ＩｇＧ抗体標識のパーオキシダーゼ活性は、テトラメチ
ルベンジジン、過酸化水素を基質として測定した。その
結果を第１表に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】表中、モノクローナル抗体の反応性は、各
クローンから得られたモノクローナル抗体とミクロシス
チン−ＬＲとの競合率を１００とする相対値で示した。
第１表から明らかなとおり、それぞれのハイブリドーマ
が産生するモノクローナル抗体は、ミクロシスチン−Ｌ
Ａとはほとんど反応せず、またミクロシスチン−ＹＲ、
ミクロシスチン−ＲＲとはミクロシスチン−ＬＲと近似
した反応性を有していた。
クローンから得られたモノクローナル抗体とミクロシス
チン−ＬＲとの競合率を１００とする相対値で示した。
第１表から明らかなとおり、それぞれのハイブリドーマ
が産生するモノクローナル抗体は、ミクロシスチン−Ｌ
Ａとはほとんど反応せず、またミクロシスチン−ＹＲ、
ミクロシスチン−ＲＲとはミクロシスチン−ＬＲと近似
した反応性を有していた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 ミクロシスチン−ＬＲをハプテンとする
抗原で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミエ
ローマとの細胞融合により形成されたハイブリドーマか
ら産生される抗ミクロシスチンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ミクロシスチン−ＬＲをハプテンとする
抗原で予め免疫されたマウスのリンパ球とマウスのミエ
ローマとの細胞融合により形成され、抗ミクロシスチン
モノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブ
リドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5239275A JPH0789998A (ja) | 1993-09-27 | 1993-09-27 | 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5239275A JPH0789998A (ja) | 1993-09-27 | 1993-09-27 | 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0789998A true JPH0789998A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=17042338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5239275A Pending JPH0789998A (ja) | 1993-09-27 | 1993-09-27 | 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789998A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011527757A (ja) * | 2008-07-09 | 2011-11-04 | ジ インスティテュート フォー エスノメディスン | 神経障害に関連する神経毒性アミノ酸を検出するためのイムノアッセイ |
| WO2012142899A1 (zh) * | 2011-04-21 | 2012-10-26 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法 |
| CN106990246A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-07-28 | 天津农学院 | 一种微囊藻毒素‑lr酶联免疫检测试剂盒 |
| CN110194796A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-09-03 | 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) | 一种抗微囊藻毒素-lr单克隆抗体的制备方法 |
| CN116462755A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-07-21 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段 |
| CN116478284A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-07-25 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用 |
-
1993
- 1993-09-27 JP JP5239275A patent/JPH0789998A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011527757A (ja) * | 2008-07-09 | 2011-11-04 | ジ インスティテュート フォー エスノメディスン | 神経障害に関連する神経毒性アミノ酸を検出するためのイムノアッセイ |
| WO2012142899A1 (zh) * | 2011-04-21 | 2012-10-26 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法 |
| JP2014513939A (ja) * | 2011-04-21 | 2014-06-19 | 畿晋▲慶▼三▲聯▼（北京）生物技▲術▼有限公司 | 藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド系抗体、その遺伝子、およびその製造方法 |
| KR20140145951A (ko) * | 2011-04-21 | 2014-12-24 | 프로틴 디자인 랩, 리미티드 | 안티시아노 박테리아 재조합 항체 폴리펩티드 및 이의 유전자와 제조 방법 |
| US9359429B2 (en) | 2011-04-21 | 2016-06-07 | Protein Design Lab, Ltd. | Anti-cyanobacteria recombinant antibody polypeptide, gene thereof, and preparation method thereof |
| CN106990246A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-07-28 | 天津农学院 | 一种微囊藻毒素‑lr酶联免疫检测试剂盒 |
| CN110194796A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-09-03 | 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) | 一种抗微囊藻毒素-lr单克隆抗体的制备方法 |
| CN116462755A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-07-21 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段 |
| CN116478284A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-07-25 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用 |
| CN116462755B (zh) * | 2023-06-16 | 2023-10-03 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段 |
| CN116478284B (zh) * | 2023-06-16 | 2023-10-10 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用 |
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