CN116478284B

CN116478284B - 抗微囊藻毒素lr的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用

Info

Publication number: CN116478284B
Application number: CN202310714495.3A
Authority: CN
Inventors: 刘亚茹; 李书鹏; 王蓓丽; 熊静; 郭丽莉; 李亚秀; 韩亚萌
Original assignee: BCEG Environmental Remediation Co Ltd
Current assignee: BCEG Environmental Remediation Co Ltd
Priority date: 2023-06-16
Filing date: 2023-06-16
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2043-06-16
Also published as: CN116478284A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提出了一种抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；重链可变区包含免疫球蛋白重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区包含免疫球蛋白轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3。将抗MC‑LR单克隆抗体用于微囊藻毒素LR的检测，尤其是食品或水体中微囊藻毒素LR检测，如基于单克隆抗体能够建立常用的间接竟争ELISA检测方法或胶体金试纸条测定准确度高，具有良好的稳定性，检测结果准确且检测成本低，能够满足实际市场批量的快速检测要求，很好地实现对污染水质、污染食源的随时监控和监测。

Description

抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

微囊藻毒素LR(Microcystin-LR，MC-LR)是分布最广、危害最大的淡水蓝藻毒素之一，因此世界卫生组织（WHO）规定在饮用水标准指导中MC-LR的最低限量为1ng/mL。它属于具有生物学活性的环状七肽化合物，主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)产生，能够强烈抑制蛋白磷酸酶1&2A 的活性，拥有很强的致肝癌率，而且100℃的煮沸加热条件下无法有效破坏其结构，活性炭也不能完全将其吸附，目前MC-LR对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。除了通过饮用水进入人体外，MC-LR还可积累在水生有机体中，据报道，鱼、软体动物和浮游生物都能积累大量微囊藻毒素LR，进而通过食物链进入人体。国内外实验室在对于MC-LR的检测方面工作已经有了大量的研究，具体检测方法涵盖了化学分析法、免疫分析法、蛋白磷酸酶抑制法、细胞毒性法和生物分析法等。目前现行的MCs国标检测方法以液相色谱法为主，虽然方法具有较高的选择性，但存在成本高、样品取样量较大、前处理方法复杂等问题。相比之下，免疫分析检测法具有检测快速、灵敏度高、易于执行、成本低等技术优势。目前迫切需要检测成本低、特异性强、灵敏度高的针对MC-LR的单克隆抗体，并结合常规配套的免疫快速检测技术，以更大范围应用于食品安全和水体污染等领域。

目前现有技术中已通过一些筛选方法得到一些微囊藻毒素LR的抗体，但是这些的抗体存在如下缺点：一、抗体性质不均一，在工业上应用较为受限。二、抗体专一性不强，应用于免疫检测时容易受到微囊藻毒素MC-RR的干扰，检测灵敏度不够高。三、稳定性差，在应用时由于其活性条件的限制，工业成本相对较高的。因此，目前仍然迫切需要检测成本低、特异性强、灵敏度高的针对MC-LR的单克隆抗体，以结合常规配套的免疫快速检测技术，更大范围应用于食品安全和水体污染等领域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供特异性强、灵敏度高且具有更强的广谱识别能力的抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体，在此基础上提供一种用于快速简便检测微囊藻毒素的免疫检测方法，为MC-LR的精确检测奠定基础。本发明采用如下的技术方案：

一种抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；

所述重链可变区包含免疫球蛋白重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述HCDR1的氨基酸序列为RYNMS，所述HCDR2的氨基酸序为SINAAPITQWEDSVKN、所述HCDR3的氨基酸序列为SSRLGASEYSFDD；

所述轻链可变区包含免疫球蛋白轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；所述LCDR1的氨基酸序列为GLDNSVSADTMAAMN，所述LCDR2的氨基酸序列为LAQELENAQE、所述LCDR3的氨基酸序列为QLRSPPEHA。

可选地，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1有至少95％同一性的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:2有至少95％同一性的氨基酸序列。

可选地，所述重链可变区具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；

可选地，所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG1恒定区和人轻链κ恒定区。

在优选的实施方案中，重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由Chothia编号系统定义；在优选的实施方案中，重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由ABM编号系统定义；在优选的实施方案中，重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由Kabat编号系统定义；在优选的实施方案中，重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由IMGT编号系统定义。进一步地，重链可变区中含有的3个CDR和/或轻链可变区中含有的3个CDR由Kabat编号系统定义。

可选地，所述单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

可选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)。

可选地，单克隆抗体还包括：哺乳动物免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体1，变体1与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；以及，哺乳动物免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体2，变体2与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换。

在本发明中，单克隆抗体可以包括这样的变体3，变体3与其所源自的抗体相比差异仅在于一个或多个氨基酸残基的保守置换；例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；与其所源自的抗体具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体的上述生物学功能。

可选地，单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区是IgG重链恒定区；单克隆抗体的轻链恒定区是κ轻链恒定区。

可选地，单克隆抗体带有标记。

抗体标记的目的在于将标记物链接到抗体上，与待检测物特异性反应形成多元复合物，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。本方案中的标记并不特指某一种标记方式，具体的，可以是酶标记、生物素化标记、荧光标记、胶体金标记等；在此不做限定。

本发明还提出了上述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括如下步骤：

培养包含编码所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，从所述细胞或所述细胞的培养物中回收所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明的制备方法在允许单克隆抗体表达的条件下，培养宿主细胞；从培养的宿主细胞培养物中回收单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

本发明还提出了一种核酸，所述核酸编码上述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

可选地，所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体重链可变区基因核酸序列如SEQ IDNO.9所示，轻链可变区基因核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提出了一种宿主细胞，所述宿主细胞中包含上述的核酸。

本发明还提出了一种组合物，所述组合物包含上述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明还提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

试剂盒可采用双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，包括上述单克隆抗体mc-3LR42。具体地，该酶联免疫试剂盒采用双抗夹心法，由包被有捕获抗体的酶标板、酶标记的检测抗体、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液组成。

本发明还提出了上述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸、宿主细胞、组合物、试剂盒在检测微囊藻毒素LR中的应用。进一步的，包括在检测食品或水体中的微囊藻毒素LR的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和重链可变区；所述重链可变区包含免疫球蛋白重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述HCDR1的氨基酸序列为RYNMS，所述HCDR2的氨基酸序为SINAAPITQWEDSVKN、所述HCDR3的氨基酸序列为SSRLGASEYSFDD；所述轻链可变区包含免疫球蛋白轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；所述LCDR1的氨基酸序列为GLDNSVSADTMAAMN，所述LCDR2的氨基酸序列为LAQELENAQE、所述LCDR3的氨基酸序列为QLRSPPEHA。

本发明筛选获得的抗 MC-LR 单克隆抗体对于微囊藻毒素的交叉反应率具有较好的广谱识别能力，具有较高的交叉反应率，并且其对MC-LR具有较高的特异性和灵敏度。因此，可以将上述的抗 MC-LR 单克隆抗体用于微囊藻毒素LR的检测，尤其是食品或水体中的微囊藻毒素LR的检测。基于单克隆抗体能够建立常用的间接竟争ELISA检测方法或胶体金试纸条测定准确度高，具有良好的稳定性，检测结果准确且检测成本低，能够满足实际市场批量的快速检测要求，很好地实现对污染水质、污染食源的随时监控和监测。

附图说明

图1示出了重组制备的抗体mc-3LR42的SDS-PAGE鉴定抗体结果。

图2a示出了抗体纯化效果鉴定的SDS-PAGE凝胶电泳银染结果，泳道:蛋白Marker；泳道1-3分别为洗脱缓冲液洗脱的抗体-mc-3LR42、除盐后的抗体mc-3LR42和洗涤缓冲液纯化后的抗体mc-3LR42几乎全部已于洗脱缓冲液中。

图2b示出了抗体纯化效果鉴定的蛋白免疫印迹实验结果，泳道:蛋白Marker；泳道2-4分别为结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液不同缓冲液中的抗体mc-3LR42，纯化后的抗体mc-3LR42绝大部分已于洗脱缓冲液中，与银染结果相吻合。

图3示出了抗体mc-3LR42通过HPLC精纯的结果。

图4示出了单克隆抗体mc-3LR42亲和常数的测定（横坐标单位μg/mL）。

图5示出了绘制的单克隆抗体mc-3LR42抑制曲线（横坐标单位ng/mL）。

具体实施方式

以下实施例仅出于更详细地说明本发明的目的而提供。因此，根据本发明的目的，本领域技术人员显而易知实施例并不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1

1.抗 MC-LR 单克隆抗体的制备

MC-LR样品的制备：从太湖蓝藻治理实验基地打捞足实验用的蓝藻藻泥，先过筛除去大的机械杂质，离心除去水，置于低温冰箱在-80℃冻结，待冻结好后用冷冻干燥机进行冷冻干燥成藻粉，藻粉在冰乙酸中浸提，按照1g/100mL的体积重量比进行添加，提取2h，收集上清过Spe-pak C18柱进行纯化，将甲醇收集液进行旋蒸，得到的固体进一步通过HPLC高效液相色谱进行精纯MC-LR，收集备用。

2.MC-LR人工完全抗原的合成

利用乙胺硫醇盐琉基的较强亲核加成反应特点，在微囊藻毒素的第七位氨基酸不饱和双键Mdha位置处引入1个氨基，并通过该氨基与载体蛋白的羧基偶联，考虑到目前已知的牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)、鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA) 、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)的特点，分析MC-LR在1kD左右，OVA成本低但是偶联后的复合物不稳定，KLH分子量较大并且结构复杂，BSA的应用技术成熟，不仅具有稳定的理化性质及形态结构，而且其偶联后的状态较为稳定，复合物的溶解性较好，且成本较低，因而选择其作为载体蛋白。偶联步骤：基于较为常用的偶联技术，采用戊二醛二步法将MC-LR偶联到载体蛋白BSA上。向溶液中缓慢滴加400μL 10 mmol/L CdCl2溶液，混匀后用1mol/LKOH溶液调pH 至7.0，之后在25℃恒温摇床中缓慢振荡反应6 h，取出后在去离子水中透析2 d，每天早中晚各换一次去离子水，透析完成后即获得MC-LR完全抗原MC-LR-BSA。

3.杂交瘤细胞的筛选及抗体检测

取6周龄雌性BALB/c小鼠4只进行免疫，共进行3次免疫。每次每只小鼠抗原免疫用量为80μL人工完全抗原MC-LR-BSA，具体免疫程序见表1。第2次免疫后10 d尾静脉采血，通过ELISA间接法测抗体效价，确定是否有针对抗原的抗体生成。效价不达标，则第3次继续弗氏不完全佐剂皮下进行免疫。最后一次直接注射人工完全抗原MC-LR-BSA，3d后取小鼠脾脏，选脾细胞准备进行后续的融合。

表1：完全抗原MC-LR-BSA免疫程序

对所有细胞培养孔的上清进行抗体检测，具体方法为：(1)包被:用pH 9.6包被液稀释MC-LR，向酶标板每孔加50 uL，每孔抗原量为20ng，置于40℃包被过夜；用洗涤液洗涤3次并拍干。(2)封闭:稀释液稀释小鼠血清至12%左右，滴加于酶标板，每孔50uL。(3)加入杂交瘤培养上清液，50-100 uL/孔，细胞原孔补加等量RPMI-1640培养基，阳性对照为稀释200X免疫小鼠的血清，阴性对照为Sp2/0细胞上清，温育2h后，洗涤3次拍干。(4)滴加1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，每孔50 uL重复温育。(5)每孔滴加邻苯二胺OPD底物溶液100 uL，将酶标板置于无光处，待到底物显色适中时每孔滴加适量终止液，用自动酶标分析仪测。本次试验一共设置了8个浓度梯度，分别是1:500，1:1000，1:2000，1: 4000，1:8000，1:16000，1: 32000，1: 64000，其中每个浓度设有三个平行对照孔，最后以三个孔的平均值与阴性对照孔的比值确定效价的大小，发现血清的效价比较接近1:32000，说明我们用于细胞融合的试验小鼠的免疫效果良好，可以用于细胞融合。

选脾细胞用PEG4000与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以20 ng/mL包被酶标板，间接ELISA方法筛选，以有限稀释法克隆。通过三次阳性细胞孔的检测筛选，确定了41个孔检测值与阳性对照孔值较为接近，再将重复性比较好的孔进行克隆筛选。

4.单克隆抗体的纯化及亚型鉴定

经过前期亚克隆筛选，最终获得了能够稳定产生抗 MC-LR单克隆抗体的杂交瘤细胞株mc-3LR42，将该细胞株扩大培养用来制备腹水。将筛选出的2个杂交瘤细胞株分别注射入小鼠体内，收集产生的腹水。具体地，分别选取10只Balb/c经产小鼠，每只小鼠腹腔注射500 uL弗氏不完全佐剂，对小鼠进行“预刺激”，从而降低小鼠的正常免疫功能，促进腹水的产生。注射完弗氏不完全佐剂7-10天后，每只小鼠腹腔注射l×10⁶个杂交瘤细胞，注射后每天观察小鼠腹腔膨大情况。注射杂交瘤细胞11天后，小鼠腹腔出现明显膨大，用18号针头穿刺腹腔，通过重力进行腹水引流从而收获腹水。将收集得到的腹水3000 rpm离心10 min，取上清，-20℃保存备用。

收集的腹水先通过0.5μm的滤膜过滤，再通过Protein G柱纯化。纯化结果用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定。抗体热裂解后得到抗体重链(分子量约为50 kD )、轻链(分子量约为25 kD )。我们分别收集了抗体mc-3LR42共12管的洗脱液，合并浓缩最终得到的抗体，抗体mc-3LR42的浓度为9.02mg/mL。

5. 抗体mc-3LR42的重组制备

根据需要，在分离单个杂交瘤细胞后，我们采用RNA提取试剂盒说明书对抗体mc-3LR42的杂交瘤细胞株提取相应的RNA，取生长状态最好的杂交瘤细胞，离心洗涤后进行活细胞计数，每10⁵个细胞分装到一个EP管内，并加入1 mL的TRIzon Reagent充分混匀后，静置5 min，具体按照Taka.9108 Trizol RNA提取说明书进行。利用提取的RNA为模板，根据逆转录试剂盒说明书扩增出小鼠cDNA序列。以获得的cDNA为模板利用小鼠抗体可变区基因的通用引物扩增抗体的轻重链基因。PCR产物纯化后构建cDNA文库，使用Agilent 2100Bioanalyzer仪器配合Agilent high-sensitivity DNA chip检测获得cDNA片段大小分布。为了获得良好的文库，所得产物应该有较少或者没有短片段（＜500bp），并在1.5-2kb片段大小处出现峰值。选择质量较好的样本，进行文库构建工作。最终对cDNA文库质量进行检测，片段化后的DNA文库理想平均大小应为300-800bp的宽峰。文库测序由北京博奥晶典生物有限公司完成，使用illumina测序平台150bp paired-end双端测序方式。

参照BOLGER法（BOLGER A M, LOHSE M, USADEL B. Trimmomatic:a flexibletrimmer for Illumina sequence data [J].Bioinformatics, 2014, 30(15): 2114-2120.），本实验使用rnaSPAdes对scRNA-seq数据进行转录本de novo组装。rnaSPAdes相比于Bridger,Trinity等转录组de novo拼接软件，对单细胞数据进行了优化，降低了单细胞数据噪音对拼接的影响，使得候选转录本大大减少了假阳性转录物。然后使用igfinder寻找可能是抗体序列的转录本。最后，使用IMGT v-quest和IMGT blast对抗体序列的各区域进行注释。基因测序和合成提交浙江金斯瑞生物科技股份有限公司完成，通过IMGT数据库鼠源抗体序列比对结果，以及常用的鼠源抗体简并引物比对，我们进一步设计了分别扩增此抗体重链和轻链可变区的上下游引物，用于轻重链可变区的扩增基因，两侧同样分别引入限制性内切酶位点Sgf I和Mlu I。

表2 设计的引物PCR

利用可保种型蓝白T载体（Blue-White Vector T，购自上海泽叶生物科技有限公司）构建重组表达载体，通过将合成的抗体重链和轻链基因，克隆至表达载体蓝白T载体中，分别构建成重链表达载体mc-3LR42-H和轻链表达载体mc-3LR42-K。其中抗体重链可变区基因核酸序列如SEQ ID NO.9所示，抗体轻链可变区基因核酸序列如SEQ ID NO.10所示。将两个载体一起共转染至HEK293细胞中，4天后收集含有重组抗体的细胞上清。通过使用Protein G磁珠纯化瞬时转染HEK293细胞上清以及小鼠腹水，得到了重组表达的抗体以及杂交瘤细胞分泌的抗体。随后，利用SDS-PAGE对纯化所得的抗体进行鉴定，结果见图1所示。其中SDS-PAGE结果可见两条明显条带，分子量大小分别约为50kDa和25kDa。该鉴定结果与克隆筛选结果一致，同时都符合鼠源抗体的分子量特征，并且无明显干扰蛋白存在。由此可以看出，重组载体构建成功，并且其能在HEK293细胞中成功表达为完整的抗体分子。

经检测，抗体的氨基酸序列如下表所示：

表3：抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体mc-3LR42

接下来的实验中，我们针对抗体mc-3LR42蛋白进行了稳定溶解体系的摸索，并且纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳银染结果如图2a所示，纯化后的Western blotting结果如图2b所示。可以看出，Western blotting免疫印迹实验结果与银染结果相一致，证明获得了纯化后的抗体mc-3LR42。

目前对抗MC-LR单克隆抗体相关的精纯方法并不统一，但实验室常规的纯化方法均是可行的。从免疫的角度出发，我们考虑检测中对抗体的纯度要求较高，因而我们采用HPLC高效液相色谱进行了精纯，，色谱柱TSK DEAE-5PW（TOYO Soda公司），流动相A液（Tris-乙酸0.01mol/L、pH8），流速1.0mL/min；流动相B液（Tris-乙酸0.015mol/L、pH8.5，含1 mol/L醋酸钠），流速1.0mL/min；紫外检测波长278nm，灵敏度0.2AUFS，洗脱二元梯度时间与流动相B液浓度关系0min-0%—33min-60%—45min-0%。最终，我们收集获得了纯度达到99.8%以上的抗MC-LR单克隆抗体，具体结果如图3所示，可见收集的峰为单一峰值，样品纯度极高，已经达到了抗体大范围工业应用的具体要求。

该抗MC-LR单克隆抗体亚型用鼠单克隆抗体分型试剂盒（罗氏 IsoStrip^TM）进行鉴定，测定OD₄₅₀值，值最高的阳性孔所对应的亚型即为该抗体mc-3LR42所属的亚型，结果如下表4所示。

表4：抗MC-LR单克隆抗体mc-3LR42亚型鉴定结果

结果显示，抗MC-LR单克隆抗体mc-3LR42为IgG1型。

实施例2

单克隆抗体mc-3LR42对MC-LR的亲和力测定

抗体的亲和力常数Ka表示该抗体与抗原之间的亲和力，高亲和力的抗体在实际使用过程中，可以减少抗原及抗体的使用量，同时对于建立间接竟争ELISA检测方法和胶体金免疫层析试纸条的制备提供了很多的优势。抗体亲和力常数值Ka在10⁷-10¹²mol/L时认为具有高亲和力，当Ka值低于10⁷mol/L则该抗体亲和力较低，会限制抗体进一步的发展应用，因此筛选出高亲和力的抗体显得尤为重要。本发明采用间接非竞争icELISA检测法（具体参考微囊藻毒素LR单克隆抗体的制备及其应用研究[D].安徽科技学院,2018.DOI:10.27869/d.cnki.gakjx.2018.000017），测定单克隆抗体的亲和力，将包被抗原（为实施例1中制备的精纯MC-LR）按照3倍梯度稀释为合适的3个浓度（依次为1μg/mL、0.33μg/mL、0.11μg/mL），抗体（实施例1中制备的精纯抗MC-LR单克隆抗体）按照2倍倍比稀释8个浓度，以抗体浓度的对数值为横坐标、对应浓度下的OD值作为纵坐标，用Origin 8.5软件进行非线性拟合得到标准曲线，通过拟合的曲线计算s0%吸光值对应的抗体浓度值，每两个抗体浓度设定为一组，计算每组抗体的亲和常数Ka，最后取其平均值。公式如下：

Ka=(n-1)/2([Ab']t-[Ab]t)

n:每组包被抗原浓度的比值。

[Ab]t和[Ab']t:每组不同包被抗原浓度下50%的OD_max时对应的抗体浓度(mol/L)。由图4的实验结果可以看到，当包被抗原浓度为1μg/mL、0.33μg/mL、0.11μg/mL时，每个包被浓度下的50% OD_max对应的抗体浓度分别为5.24μg/mL、3.65μg/mL和2.77μg/mL，根据抗体亲和力计算的公式计算得到单克隆抗体3LR42的Ka为2.83×10⁸mol/L，是具备较高的亲和力的抗体。

实施例3

单克隆抗体mc-3LR42对MC-LR的灵敏度鉴定

根据间接竞争ELISA检测程序，测定单克隆抗体的灵敏度即IC₅₀值，在抗体最佳工作浓度条件下测定倍比系列浓度标准品的抑制率，用Origin 8.5软件拟合建立标准曲线，计算得到该抗体的IC₅₀值。根据间接竟争ELISA测定条件的优化结果，我们选择浓度为0.01mol/L、pH为8.0的PSB缓冲溶液，作为标准品稀释液，进一步测定单克隆抗体mc-3LR42的灵敏度，借助Origin 8.5软件建立的标准曲线如图5所示。

根据Origin 8.5软件拟合的抗体mc-3LR42的标准曲线R²为0.995，计算得到单克隆抗体mc-3LR42抗体IC₅₀为1.74 ng/mL，检测限（LOD）为0.12ng/mL，检测线性范围（IC₂₀-IC₈₀）为0.26-2.9ng/mL，该抗体具备较高的灵敏度，可用于MC-LR的检测。

实施例4

单克隆抗体mc-3LR42的交叉反应率测定

我们测定了单克隆抗体mc-3LR42对另外一种常见的与MC-LR结构和功能以及毒性相似的微囊藻毒素RR（MC-RR）的识别能力。

表5：抗体mc-3LR42的交叉反应率

表5显示了用间接竞争ELISA测定MC-RR标准品的结果，MC-LR对单抗的IC₅₀值1.74ng/mL，与MC-RR的交叉反应率为90.2%，证明试验制备的单克隆抗体mc-3LR42也具有较好的广谱识别能力，对MC-RR具有较高的交叉反应率。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；

所述重链可变区包含免疫球蛋白重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述HCDR1的氨基酸序列为RYNMS，所述HCDR2的氨基酸序列为SINAAPITQWEDSVKN、所述HCDR3的氨基酸序列为SSRLGASEYSFDD；

所述轻链可变区包含免疫球蛋白轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；所述LCDR1的氨基酸序列为GLDNSVSADTMAAMN，所述LCDR2的氨基酸序列为LAQELENAQE、所述LCDR3的氨基酸序列为QLRSPPEHA；

所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链IgG1恒定区和轻链κ恒定区；

所述重链可变区具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体为鼠源抗体或人源化抗体。

3.根据权利要求1或2所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码根据权利要求1或2所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中包含权利要求4中所述的核酸。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1或2所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段。

8.权利要求1或2所述的抗微囊藻毒素LR的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的试剂盒在检测微囊藻毒素LR中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括在检测食品或水体中的微囊藻毒素LR的应用。