JPH0475597A - ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素に対するモノクローナル抗体、その製法及びその抗体産生株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の原因と
考えられているヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと
略す。）の逆転写酵素（ＲＴと略す。）に対するモノク
ローナル抗体の製法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、種々の抗体がＡＩＤＳの診断またはＨＩＶの基礎
研究のために利用されてきている。

これまでの研究から、ＨＩＶがヒトに感染するためには
、ＨＩＶ遺伝子のｐｏｌｉｌ域の遺伝子産物（例えば、
逆転写酵素領域、プロテアーゼ領域、エンドヌクレアー
ゼ領域などの各遺伝子産物など。

）が必須であると考えられている。

そして、これらの遺伝子産物のうちのＲＴに関しては、
ＲＴの酵素活性を阻害するポリクローナル抗体の量が、
ＡＩＤＳの病期が進行するにつれて減少又は消失するこ
とが示されている（Ｌａｕｒｅｎｃｅ。

Ｊ、　、５ａｕｎｄｅｒｓ、Ａ、ａｎｄ　Ｋｕｌｋｏｓ
ｋｙ、Ｊ、　：　５ｃｉｅｎｃｅ、２５β−、１５０１
〜１５０４　（１９８７）　、５ａｎｏ、に、　ｅｔ　
ａｌ、　：Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　
２５．２４１５〜２４１７（１９８７））　−従って、
従来知られていないＲＴに対して高い特異的な反応性を
有し、かつそのＲＴ活性を阻害することができるモノク
ローナル抗体を作製することは、ＡＩＤＳの病態を把握
する上で非常に重要な意義を有するものである。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、ＨＩＶのＲＴに対して高い特異的な反
応性を有し、かつそのＲＴ活性を阻害することができる
モノクローナル抗体の製法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ＨＩＶのＲＴを発現できるワクシニアウィル
スをマウスに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球
とマウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリ
ドーマ株を培養することによって、ＨＩＶのＲＴに対し
て高い特異的な反応性を有し、かつそのＲＴ活性を阻害
することができるモノクローナル抗体を得ることができ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、 （１）ＨＩＶのＲＴに対して高い特異的な反応性を有し
、かつそのＲＴ活性を阻害するモノクローナル抗体 （２）ＨＩＶのＲＴを発現できるワクシニアウィルスを
マウスに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球とマ
ウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドー
マ株を培養することを特徴とする前記記載のモノクロー
ナル抗体の製法 （３）請求項１記載のモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマ株 に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ（例えば、ＨＩ
Ｖ−１、ＨＩＶ−２などを挙げルコとができるが、好ま
しくはＨＩＶ−１がよい。）のＲＴに対して高い特異的
な反応性を有し、かつそのＲＴ活性を阻害することがで
きるモノクローナル抗体である。そして、そのようなモ
ノクローナル抗体は、ＨＩＶのＲＴを発現できるワクシ
ニアウィルスを免疫原としてマウスに免疫し、そのマウ
スから得られたリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融
合することによって得られたハイブリドーマ株を培養す
ることによって製造することができる。

本発明におけるマウスの免疫原としては、ＨＩＶのＲＴ
を発現できるワクシニアウィルスを免疫原として用いる
場合には、例えば、ＨＩＶのＲＴを発現する組換えワク
シニアウィルスなどを挙げることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶのＲＴである約
６５にの蛋白質及びそのプロセシングによって形成され
る約５１にの蛋白質のいずれに対しても高い特異的な反
応性を有し、かつそのＲＴ活性を阻害することができる
が、ＨＩＶのＲＴを発現しない大腸菌の抽出液（大腸菌
を超音波で破砕し、遠心して得られた上滑）とは反応性
が認められないものである。

そのような特徴を有するモノクローナル抗体は、ＨＩＶ
のＲＴを発現できるワクシニアウィルスを免疫原として
用いて作製したハイブリドーマ株〔例えば、７Ｃ４株（
微工研条寄第３０１２号）など］などを培養することに
よって生産することができる。そして、そのようにして
得られた本発明のモノクローナル抗体のＲＴ活性を阻害
する程度は、例えば、Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｌａｕｒｅｎｃ
ｅらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　　：２３５．１５０１〜
１５０４（１９８７））、Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｄ、　Ｈｏ
ｆｆｍａｎらの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　：　１４７．
３２６〜３３５（１９８５）　　］ニ準した測定では、
５０％以上の阻害活性を示すものである。

このようなハイブリドーマの作製は、例えば、Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ　＆　Ｋｈｉ５１ｅｒの方法（Ｎａｔｕｒｅ、
　２５６．４９５（１９７６）　）に準じて行うことが
できる。そのようなハイブリドーマ株の好ましい作製方
法について、概略を以下順次説明する。

モノクロ−ル　　　　ハイブリドーマ　の（ｉ）免疫動
物リンパ球の調製 マウスへの免疫方法は、ＨＩＶのＲＴ領領域コードする
遺伝子を挿入したワクシニアウィルス〔例えば、１〜５
　Ｘ　１０．”　ＰＦＵ／ｎ１１含む緩衝液（例えば、
ＭＥＭなどの培地成分を含む溶液など）〕又は形質転換
菌から分離されたＨＩＶのＲＴ〔例えば、大腸菌に発現
させて得られたレコンビナントＲＴなどを１０〜８００
μｇ／Ｉ１１含む緩衝液（例えば、ＭＥＭなどの培地成
分を含む溶液など）〕を免疫原として、１０〜５００μ
！でマウスに１回または敗退間隔で数回投与することで
行うことができる。

リンパ球は、その免疫マウスの充分な抗体価を確認後、
最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから
得ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｉ）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、および
ラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　（Ｙ
３）などのミエローマ細胞を用いることができるが、６
５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１，５Ｐ２１０などの細胞外に
抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が好ま
しい。

（市）細胞融合 細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球とミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（ＩＭ
ＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰＭ１１６４
０などの培地成分）溶液、等張緩衝液などを用いて良く
混合し、遠心分離した後のベレット（細胞塊）に、ＨＶ
Ｊ（センダイウィルス）またはＰＥＧ　（ポリエチレン
グリコール）溶液を添加することによって行うことがで
きるが、好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのがよく、さら
に好ましくは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜
６０重量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよい。この時、細
胞融合を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホ
キシド、ポリーＬ−アルギニンなどを添加することもで
きる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
動物と異種の動物由来のものを使用することもできるが
、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の
抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された動
物とは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さらに
好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｉｖ）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができるし、あるいはＩ　Ｌ−６を
含むリンパ球培養用培地などを使用することもできる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒボキサンチン、チミジン、ウシ
胎児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に
用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるウシ
胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（Ｖ）抗体産生ハイブリドーマの選択 前記（ｉｖ　）で得られたハイブリドーマが、巨的とす
る抗体を産生しているか否かの検定は、例えば、ＥＬＩ
ＳＡ法（酵素免疫測定法）、免疫プロッティング法、プ
ラーク形成法、凝集反応法、ＲＩＡ（ラジオアイソトー
プを用いた方法）、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）などで抗
体産生ウェルを検索し、さらに、その抗体がＨＩＶのＲ
Ｔ活性を阻害するか否を検討することによって行うこと
ができるが、検定数が非常に多い場合の抗体産生ウェル
の検索では、先ずＥＬＩＳＡ法で探索するのが好ましい
。

こ０ＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

ＨＩＶのＲＴ［例えば、ＨＩＶから分離されたＲＴ、Ｒ
Ｔを生産した形質転換菌から分離されたＲＴ（例えば、
前記記載の大腸菌ＲＴなと）、ＲＴの一部分を合成した
ペプチドなど〕を固定化した（ＨＩ　ＶのＲＴと反応性
を有する抗体が存在している場合には、その固定化に要
する量は木ＥＬＡＩＳＡで抗体の存在を確認できる程度
の量でよい。）ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル（測定ウ
ェル）に、ハイブリドーマ培養上清を加えて一定時間静
置する。

そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動物
由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識抗
体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。

標識される抗体は、測定ウェルに結合したハイブリドー
マ培養上清由来の抗体だけと反応して結合することがで
きる限り特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウ
サギ、ヤギなどから得られた血清、またはマウス細胞な
どを用いて作製されたハイブリドーマ株が産生したモノ
クローナル抗体を挙げることができる。）をこれらの測
定ウェルに加えて一定時間静置する。

次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応
した基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、酵
素活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウェ
ル中にＨＩＶのＲＴとの反応性を有する抗体を産生ずる
ハイブリドーマが存在していたことがわかる。

ＨＩＶのＲＴとの反応性を有し、かっＨＴＶのＲＴの活
性を阻害する抗体を産生ずるハイブリドーマの検索は、
Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｌａｕｒｅｎｃｅらの方法（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　　：　２３５．１５０１〜１５０４（Ｉ９８７
）〕、Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｄ。Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　：　１４７．３２６〜３３５（１９
８５）　）に準じて、ＤＮＡへの（”Ｈ）　Ｄｅｏｘｙ
ｔｈｙｍｆｄｉｎｅ　ｔｒｒｐｈｏｓｈａｔｅの取り込
み量を測定し、その取り込みを阻害する培養ウェルを探
索するすることによって知ることができる。

このようにして、細胞増殖が認められ、ＨＩＶのＲＴに
対して反応性を有し、がっＨＩＶのＲＴ活性を阻害する
抗体を産生じているハイブリドーマを得ることができる
。

ＨＩＶのＲＴとの反応性を有する抗体を産生ずるハイブ
リドーマが存在していたウェルについては、ＥＬＩＳＡ
の他に、さらにウェスタンブロッティング法によってＨ
ＩＶのＲＴとの反応性を再Ｔｉ！認することが好ましい
。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マニプレーション法（倒立顕
微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、 Ｆ　Ａ　ＣＳ　（Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ）を用いた方法などで
クローニングすることができる。この時、前記のいずれ
かのクローニング方法によって（Ｖ）で見出した抗体産
生ハイブリドーマを培養し、その増殖が認められた培養
ウェルの上清を用い、（Ｖ）の抗体産生ハイブリドーマ
の選択で行ったＥＬＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生
ウェルを検索する。

このようにして、ｆ（ＩＶに対して特異性が高く、かつ
ＨＩＶのＲＴ活性を阻害する抗体価が高いモノクローナ
ル抗体を産生ずるパイブリドーマ株を選択することがで
きる。

モノクローナル−の１１法 ＨＩＶに対して特異性が高く、がっＨＩＶのＲＴ活性を
阻害する抗体価が高いモノクローナル抗体の生産は、前
記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株をフラスコ内で培養
したり、または動物の腹腔内で培養することによって行
うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養
用培地（例えば、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣ
ｏｙ、ＲＰＭ１１６４０などの培地成分を含む培地）で
細胞濃度が上限に達するまで培養することによって行う
ことができる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心
操作で得た培養上滑中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株の動物脂腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。

このような方法によるＨＩＶのＲＴに対して特異性が高
く、かつＨＩＶのＲＴ活性を阻害する抗体価が高い該モ
ノクローナル抗体の生産は、マウス、ラット、ハムスタ
ーなどの適当な動物の腹腔内にこの動物の免疫能を低下
させる物質、例えば、プリスタンなどの鉱物油を投与し
、数週間後に５ＸＩ　０Ｓ−１０’個の前記（ｖｉ）で
得たハイブリドーマ株細胞を投与し、その腹腔内にこの
株細胞を数週間で高密度に増殖させることによって行う
ことができる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心
操作で得た腹水上清中に含まれている。そして、その抗
体濃度は、フラスコ内培養で得た時の培養上清の抗体濃
度の１０〜１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛋白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、Ｆ（Ｉ
ＶのＲＴに対して高い特異的な反応性を有しくＨＩ　Ｖ
のＲＴである約６５にの蛋白質及びそのプロセシングに
よって形成される約５１にの蛋白質のいずれに対しても
高い特異的な反応性を有す）、かつＨＩＶのＲＴ活性を
阻害するが、ＨＩＶのＲＴを発現しない大腸菌の抽出液
（大腸菌を超音波で破砕し、遠心して得られた上清）と
は反応しないものである。

〔実施例〕

以下、本発明を参考例及び実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定す
るものではない。

参考例１ （ＨＩ　ＶのＲＴを発現する形質転換ワクシニアウィル
ス（ＷＲＲＴ）及び形質転換菌（Ｅ、　Ｃ，ＲＴ）の作
製〕 単層培養したウサギ腎臓細胞株（ＲＫ１３）にＷＲＲＴ
を接種しくｍ、ｏ、ｉ、　：　ＩＰＦＵ／ｃｅｌ１以上
）、２日間培養後に細胞を回収し、これをＭＥＭ　（１
％牛脂児血清含有）に懸濁し、３回凍結・融解した後に
超音波破砕し、遠心分離（１５００Ｇ、１０分間）する
ことによって免疫原である上清を得た。　　　Ｈｘｖ−
ｉゲノムを含むプラスミドクローンｐＢＨ１０（Ｒａｔ
ｔｎｅｒら：　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｂｕｓ、　Ｒｅｔ
ｒｏ。

Ｌ、５７〜６９　（１９８７）　）と下記の２本の合成
りＮＡ断片 ５’　　ＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＧＧＣＣＴＡ
ＴＴＡＧＣＣＣＴ↑ ｔｕ　　１ ５’　　ＡＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＴＣ
ＴＴＡＧＡＴＧＧ八↑ Ｈｉｎｄｌｌｒ を用い、Ｆｌｅｘｎｅｒらの方法（Ｖｉｒへｌｏｇｙ　
１６６、３３！ｌｌ〜３４９　　（１９８８）　）によ
ってＨＩＶ−１のＲＴドメインＤＮＡ断片１．６８Ｋｂ
を調製した。

この断片を、前記Ｆｌｅｘｎｅｒらの方法によってワク
シニアウィルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に導
入た組換えワクシニアウィルス（ＷＲＲＴ）を作製した
。

また、前記ＨＩＶ−１のＲＴドメインＤＮＡ断片を、大
腸菌発現プラスミドｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア
社製）のＥｃｏＲ１部位に挿入したプラスミドｐＫＫＲ
Ｔを作製し、このプラスミドを持った形質転換大腸菌を
Ｅ、　　Ｃ，ＲＴと命名した。

参考例２ ＣＥＬＩＳＡ用抗原の調製〕 参考例１の形質転換大腸菌（Ｅ、　　Ｃ，ＲＴ）を２５
０ｄのＬＢ培地（ｌｏｇ／ｆ　　トリプトン、５　ｇ　
／１　　酵母エキス、１０ｇ／ｌ　　ＮａＣ１，１００
μｇ／ｙｄ　　アンピシリン）で６時間振とう培養（３
７°Ｃ）した後、１ｍＭになるようにｌ５ｏｐｒｏｐｉ
１−β−Ｄ−ｔｈｉｏ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓ
ｉｄｅ　　（Ｉ　ＰＴＧ）を加え、さらに６時間培養を
続けた。この培養液を遠心して（７０００Ｇ、１０分間
）大腸菌を回収し、これをＰＢＳで３回洗浄し、４ｄの
ＰＢＳにｉｇ濁し、３回凍結・融解した後に超音波破砕
し、遠心分離（１５００Ｇ、１０分間）することによっ
てＥＬＩＳＡ用の抗原溶液である上清を得た。ＥＬＩＳ
Ａでは、この上清を炭酸緩衝液（１，６ｇ／　１２　　
Ｎａ２Ｃｏｘ　、２．９６　ｇ／　ｉ！Ｎａ　ＨＣＯ３
，０，１６ｇ／　Ｉ　　Ｎａ　Ｎ３　）で３００倍に希
釈して使用した。

実施例１ （ＨＩＶのＲＴに対するモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ株の作製〕 （ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製参考例１の
ワクシニアウィルスＷＲＲＴを１．５Ｘ１０”ＰＦｔＪ
／ｄ含むＭＥＭ溶液（２％牛脂児血清含有）を５０μｌ
づつＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、７週齢）の両
後肢足踵皮下に投与した。

この初回免疫から６週間後に前記と同様に調製したワク
シニアウィルスＷＲＲＴの溶液を、同マウスの尾静脈に
１００μ！投与した。

前記のようにして免疫されたマウスから摘出した（最終
免疫から３日目に摘出された）肺臓を、ＭＥＭ溶液（リ
ンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解したもの、１０ｍ
Ｍ　　ＨＥＰＥＳを含む）を入れたシャーレ中で洗い、
新たに用意したＭＥＭ溶液の中に移して、注射筒と注射
針とを用いてＭＥＭで潅流した。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＭＥＭ溶液に懸濁
して、遠心分離しく３５０Ｇ、５分間）、ＭＥＭ溶液に
再懸濁し、細胞融合に使用するマウス肺臓リンパ球とし
た。

（ハ）細胞融合 ３．７５Ｘ１０’個の対数増殖期にある８−アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ１胞（ＳＰ２１０）と前記の
（ａ）のマウスの肺臓リンパ球１．５×１０”個とを５
０ｍ１容プラスチツク製コニカル遠心管に入れ、混合し
、次いで、上清を遠心分離した後に（３５０Ｇ、６分間
）、同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥＧ４０００溶液（３７℃）を１分間かけて１　ｍ
　４２入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながらＭＥＭ溶液（３７℃
）を数分間かけて徐々に加え、最終的には１０ｍｆとし
、室温で遠心分離（１２０Ｇ、６分間）して、上清を吸
引除去した。

同遠心管を軽（たたいてペレットをほぐし、７０ｍ１の
ＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０
−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジン及
び２０％ウシ胎児血清を含有するＩＭＤＭ培地、３７°
Ｃに保温）に懸濁して、９６ウエルの培養プレート１９
枚の各培養ウェルに１゜Ｏμ２づつ分注して、ＣＯ２イ
ンキュベーターを用いて培養した（５％ＣＯ□、９５％
空気、３７℃、湿度１００％）。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択 前述（ｂ）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上滑中に、
ＨＩＶに対する抗体が含まれているか否かを、次に示す
ＥＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェ
ルに、参考例２の溶液を５０μｌづつ分注し、４°Ｃで
１晩静置した。

次いで、ＥＬＴＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄
した後、０．５％のＢＳＡ溶液ＣＰＢＳに溶解）を各分
析ウェルに１００μ！づつ分注して室温で３０分間静置
し、これらの各分析ウェルを洗浄液で２回洗浄し、前記
培養プレートの各培養ウェルの培養上清を、これらの各
分析ウェルに５０μβづつ分注して室温で２時間静置し
た（陰性対照には、融合前のマウス肺臓リンパ球とマウ
スミエローマ細胞との混合物を同様に培養して得た上清
を用いた。一方、陽性対照には、本発明での細胞融合に
用いたマウスの血清を洗浄液で１０倍に希釈したものを
用いた。）。

次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で４
回洗浄し、マウス免疫グロブリンに対するアルカリフォ
スファターゼ標識抗体溶液を、５０μβづつ、各分析ウ
ェルに分注し、室温で１時間静置した。そして、ＥＬＩ
ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で４回洗浄後、ｐ
−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・６ＨｚＯ溶液（１
ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌづつ各分析ウェルに分注し、
室温で３０分反応後、マイクロプレート用の吸光度測定
装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を測
定した。

このような検討の結果、培養プレート中の６５８個の培
養ウェルの中の１４個で、ＨＩＶのＲＴに対する抗体の
産生が認められた。

これらの抗体を産生じた１４個の培養ウェルについて、
免疫プロッティング法（Ｗ、　Ｂ、　）を行った。

その結果、ＨＩＶのＲＴに反応した抗体を含有する培養
ウェルは、１４個の中の１０個で認められた。即ち、こ
の１０個の培養ウェルには、ＨＩＶのＲＴと反応する抗
体を産生ずるハイブリドーマが存在することが確認され
た。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＩ　ＭＤ　Ｍ培地を用いて、前述の（
Ｃ）工程の場合において示した抗体産生が確認された１
０個の培養ウェルのうちの８個の培養ウェルについて限
界希釈法でハイブリドーマをクローニングした。

ハイブリドーマ培養には、９６ウエル培養プレートを用
い、（ハイブリドーマ１個）／フィーダー細胞（１ｘｌ
Ｏ’／ｄ）を含むリンパ球培養用培地１００μｊ２）／
ウェルで培養した。

前記の８個の培養ウェルの各々のクローニングにおいて
、１０日目頃から単一コロニーとして観察される培養ウ
ェルの上清を採取して、参考例２の溶液を用いたＥＬ　
Ｉ　ＳＡ法（前述の（Ｃ）工程と同様の方法）で抗体産
生ウェルのスクリーニングを行ない、各々のクローニン
グにおいてハイブリドーマ株を少なくとも２株づつ得、
これらを再クローニングした。

二のようにして得られた１４の再りローニング株の培養
上清を用いて、それらの抗体がＨＩＶのＲＴ活性を阻害
するか否かをＪｅｆｆｒｅｙ　Ｌａｕｒｅｎｃｅらの方
法（Ｓｃｉｅｒ＋ｃｅ　　：　２３５．１５０１〜１５
０４（１９８７）〕、Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｄ、　）Ｉｏｆ
ｆｍａｎらの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　：　１４７３２
６〜３３５（１９８５）　〕に準じて、次のようにして
検討した。

ＲＴ溶液（ＷＲＲＴを感染させたＲＫ−１３細胞を超音
波破砕後に遠心して得られたＨＩＶ−１のＲＴを含有す
る上清を、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰ
ＢＳで希釈したもの）１０μｌと前記の被検モノクロー
ナル抗体含有液（ＰＢＳ）１０μｌとを混合して、４°
Ｃ１３０分間反応させた後にＲＴ緩衝液（１００ｍＭ）
リス（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　　ジチオスレイトール
、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１００ｍＭ　　ＫＣｆ。

０．０５　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００，０，６ｍＭ
グルタチオン、１ｍＭ　　エチレングリコールビス四酢
酸、）２５μｆ加え、１５　ｎ　Ｍ　　”Ｈ−ｄＴＴＰ
を２μ！、１７５μｇ／ｉｄのｐｏｌｙＡ　（ｄＴ）＋
ｓを２ｕｆ加え、混合した後に３７°Ｃで１時間反応さ
せ、濾紙（ＤＥＡＥ−セルロース類）にこれを滴下して
浸みこませ、乾燥して４ＸＳＳＣで洗浄し、エタノール
で洗浄し、乾燥させてこの濾紙の放射線量（ＣＰＭ）を
液体シンチレーションカウンターで測定した。抗体を含
まない溶液を加えた場合の放射線量を１００％のＲＴ活
性（阻害活性Ｏ％）として、本発明の抗体のＲＴ活性の
阻害の程度を測定した結果、阻害の程度が５０％以上の
ものは２クローンあり、そのうちの１クローン（７０４
株）のものは９０％以上であった。

このようにして得られた株を７Ｃ４株（微工研条寄第３
０１２号）と称し、この株が産生したモノクローナル抗
体をＩＣ４と称す。

この株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体のク
ラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験Ｉで決定し
、各種化合物に対する反応性を測定試験■で検討した。

皿定拭慧士 （ＨＩ　ＶのＲＴに対するモノクローナル抗体のりラス
・サブクラスの決定〕 ７Ｃ４株が産生した免疫グロブリンのクラス・サブクラ
スの決定は、マウス抗体の各クラス・サブクラスに特異
的なペルオキシダーゼ標識抗体溶液（ＩｇＧ＋、ＩｇＧ
ｚａ％ＩｇＧｚｂ、　ＩｇＧ１、ＩｇＭ、１ｇＡ、に型
り鎖またはλ型り鎖などに対する西洋ワサビペルオキシ
ダーゼで標識された抗体）を用いた前述の（Ｃ）工程と
同様のＥＬＩＳＡ法、およびマウス抗体の各クラス・サ
ブクラスに特異的な抗体溶液（Ｉ　ｇＧ＋　、Ｉ　ｇＧ
ｚ　ａ、ＩｇＧｚ　ｂ　、　Ｉ　ｇＧ３、Ｉ　ｇＭ、　
Ｉ　ｇＡ、に型り鎖またはλ型り鎖などに対する抗体）
を用いたオフタロニー法で行った。

その結果、７０４株が産生じたモノクローナル抗体（７
Ｃ４）は、ＩｇＧ、に属する抗体（Ｌ鎖はに）であるこ
とがわかった。

皿定拭辰↓ 〔ＨＩ　ＶのＲＴに対するモノクローナル抗体の反応性
の検討〕 モノクローナル抗体（７Ｃ４）の反応特異性について、
ＨＩＶのＲＴである約６５に蛋白質及びそのプロセシン
グによって生じる約５１に蛋白質、大腸菌ＲＴの約６５
Ｋ及び５１にの蛋白質との反応性をウェスタンブロッテ
ィング法によって検討した。

その結果、この、モノクローナル抗体はいずれの蛋白質
とも反応性を有していた。

実施例３ 〔フラスコ培養でのＨＩＶのＲＴに対するモノクローナ
ル抗体の生産］ １５％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で培養して得た
７Ｃ４株の培養細胞を１０ｍｆｆ１のＩＭＤＭ液（ウシ
胎児血清を含まない）に移しかえて、死滅直前まで培養
した。

ＨＩＶのＲＴに対するモノクローナル抗体（７Ｃ４）は
、培養液を遠心分離（１５００Ｇ、５分間）して得られ
た上滑中に３５μｇ／ｍ１（ＥＬＩＳＡにより測定）含
有されていた。

実施例４ 〔マウス腹腔内でのＨＩＶのＲＴに対するモノクローナ
ル抗体の生産〕 ＨＩＶのＲＴに対する大量のモノクローナル抗体を得る
ために、マウス腹腔内で７Ｃ４株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス（♀、６週齢、２週間前
にプリスタンを０．５　ｍ　ｉ！腹腔内に投与しでおく
）の腹腔内に、ＰＢＳで浮遊させた７Ｃ４株の細胞をｌ
Ｘｌ０’個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、２週間目に腹水（１０ｍｌ／匹）を採取した。この腹
水を遠心分離（１５００Ｃ；、５分間）して、腹水上清
を得た。

ＨＩＶのＲＴに対するモノクローナル抗体（７Ｃ４）は
、この腹水上清中に８．０ｍｇ／ｍｆ（ＥＬＩＳＡによ
り測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明のＨＴＶのＲＴに対して高い特異的な反応性を有
し、かっＨＩＶのＲＴ活性を阻害することができるモノ
クローナル抗体は、ＨｒＶに関する基礎研究のための試
薬、ＡＴＤＳを簡単で迅速に、かつ正確に診断するため
の臨床検査測定試薬、及び治療薬などへの利用を期待で
きるものである。

特許出願人　　宇部興産株式会社 特許出願人　　日本ゼオン株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと略す。 ）の逆転写酵素（以下、ＲＴと略す。）に対して高い特
   異的な反応性を有し、かつそのＲＴ活性を阻害するモノ
   クローナル抗体。
2. （２）ＨＩＶのＲＴを発現できるワクシニアウイルスを
   マウスに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球とマ
   ウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドー
   マ株を培養することを特徴とする請求項１記載のモノク
   ローナル抗体の製法。
3. （３）請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハ
   イブリドーマ株。