JPH05304985A - ヒト免疫不全ウイルスのインテグラーゼに対するモノクローナル抗体、およびそれを産生する細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 インテグラーゼに対するモノクローナル抗
体、およびそれを産生するハイブリドーマ株を開発す
る。 【構成】 ＨＩＶのインテグラーゼを発現しうる大腸菌
をマウスに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球と
ミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマ株
を培養することによって、ＨＩＶのインテグラーゼと抗
原抗体反応するモノクローナル抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は後天性免疫不全症候群
（以下、ＡＩＤＳという）の原因と考えられているヒト
免疫不全ウイルス（以下、ＨＩＶという）のインテグラ
ーゼに対するモノクローナル抗体、およびインテグラー
ゼに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ株に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、種々の抗体がＡＩＤＳの診断、ま
たはＨＩＶの基礎研究のために利用されてきている。こ
れまでの研究から、ＨＩＶがヒトに感染するためには、
ＨＩＶ遺伝子のｐｏｌ領域の遺伝子産物（例えば、逆転
写酵素領域、プロテアーゼ領域、インテグラーゼ領域な
ど）が必須であると考えられている。

【０００３】このうち、逆転写酵素に対する酵素阻害活
性を有するモノクローナル抗体については、１９９０年
７月にエイズ研究会で発表されている。また、プロテア
ーゼに対するモノクローナル抗体については既に市販さ
れている。

【０００４】しかし、インテグラーゼに対するモノクロ
ーナル抗体については、インテグラーゼ遺伝子をバキュ
ロウイルスに組み込み製造する方法が試みられているも
のの失敗に終わっており（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、１
５５５−１５５８（１９９０））、インテグラーゼのア
ミノ酸配列を元に作製された２０塩基対程度の合成ペプ
チドを抗原とした抗インテグラーゼウサギ血清が報告さ
れているに過ぎない。本発明者らは、インテグラーゼに
対するモノクローナル抗体を得るべく、バキュロウイル
スに代えてワクチニアウイルスを用いることも検討した
が、やはりインテグラーゼに対するモノクローナル抗体
は得ることはできなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、イ
ンテグラーゼに対するモノクローナル抗体を開発すべく
さらに鋭意研究した結果、ＨＩＶのインテグラーゼを発
現しうる大腸菌をマウスに免疫し、そのマウスから得ら
れたリンパ球とミエローマ細胞とを融合して得られたハ
イブリドーマ株を培養することによって、ＨＩＶのイン
テグラーゼと抗原抗体反応するモノクローナル抗体を得
ることができることを見いだし、本発明を完成するに至
った。

【０００６】かくして、本発明によれば、 （１）ヒト免疫不全ウイルスのインテグラーゼに対して
抗原抗体反応しうるモノクローナル抗体 （２）ヒト免疫不全ウイルスのインテグラーゼを発現し
うる大腸菌を動物に免疫し、その動物から得られたリン
パ球とミエローマ細胞とを融合して得られたＨＩＶのイ
ンテグラーゼに対するモノクローナル抗体産生能を有す
るハイブリドーマ株が提供される。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ
−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどを挙げることができるが、好ま
しくはＨＩＶ−Ｉ）のインテグラーゼと抗原抗体反応す
るモノクローナル抗体である。

【０００８】ＨＩＶのインテグラーゼは分子量約３２，
０００のタンパク質であり、本発明のモノクローナル抗
体は、このインテグラーゼのどのエピトープと反応する
ものであっても良い。そのようなモノクローナル抗体の
具体例としては、インテグラーゼの遺伝子（ＤＮＡ）を
ＥｃｏＲＩで開裂したときの５’側部分に対応するポリ
ペプチドと抗原抗体反応しうるモノクローナル抗体６Ｆ
４（実施例１（４）参照）が例示される。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株は、ＨＩＶのインテグラーゼと抗原抗体
反応するモノクローナル抗体を産生するものである。そ
の具体例として、ハイブリドーマ株６Ｆ４株（実施例１
（４）参照、ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１１）が例示され
る。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体を作製するハ
イブリドーマは、ＨＩＶのインテグラーゼ遺伝子を大腸
菌に組み込み、それを動物に免疫すること以外は常法に
従って行われる。以下にその一般的な方法を以下に説明
する。

【００１１】（１）免疫源の作製 本発明において用いられる遺伝子は、ＨＩＶのインテグ
ラーゼ遺伝子のほか、それと同等の機能を有する程度に
修飾（自然或は人為的に塩基の脱落、挿入されたものを
含む）されたものであっても良く、また融合タンパク質
として発現させるように、インテグラーゼ遺伝子を適当
な遺伝子と連結させてたものであってもよい。インテグ
ラーゼ遺伝子と連結させるその他の遺伝子としては、グ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（分子量約
２６，０００、以下、ＧＳＴという）、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子などが挙げられるが、ＧＳＴ遺伝子の３’
末端にＨＩＶのインテグラーゼをコードする遺伝子を連
結させた遺伝子を用いることが好ましい。

【００１２】この遺伝子を、常法に従って適当なベクタ
ーに組み込み、これを大腸菌に移入して、免疫源とす
る。組み換えベクターとしては、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＫ
Ｋ−２２３−３のようなプラスミドや、λファージ、Ｍ
１３ファージなどのファージが挙げられる。作製した組
み換えベクターを常法に従って大腸菌に移入し形質転換
体を得、これを免疫源とする。

【００１３】（２）免疫動物リンパ球の調製 免疫方法は常法に従えば良く、上記（１）で作製した形
質転換体を免疫用の動物に投与することで行うことがで
きる。免疫用の動物は、基本的には如何なる動物を用い
ても良いが、通常、抗体産生量を維持するには、マウ
ス、ラット、ハムスターなどミエローマ細胞が既に得ら
れている動物を使用するのが好ましい。

【００１４】動物への免疫後のリンパ球の採取は、その
免疫動物の充分な抗体価を確認後、最終免疫から数日後
の血液、リンパ液、脾臓などから得ることができるが、
脾臓から得た方が好ましい。

【００１５】（３）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、常法に従いミエローマ細胞が用いられ
る。ミエローマ細胞の具体例としては、マウス由来のＭ
ＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８／６５３（以下、６
５３という）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ
３Ｕ１という）、Ｐ３−ＮＳ１（以下、ＮＳ−１とい
う）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（以下、ＳＰ２／Ｏとい
う）などやラット由来のＩＲ９８３Ｆ、Ｙ３−Ａｇ１．
２．３、ＹＢ２／０などのが例示されるが、なかでも６
５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１やＳＰ２／Ｏなどの細胞外に
抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が好ま
しい。

【００１６】（４）細胞融合 細胞融合は常法に従って行えば良く、例えば、前記のよ
うにして免疫されたマウスのリンパ球とミエローマ細胞
との細胞数を（４〜２０）：１の割合で、細胞融合に支
障をおこさない細胞懸濁溶液、例えば、一般に用いられ
るリンパ球培養用培地成分（例えば、ＩＭＤＭ、ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰＭＩ１６４０などの培
地成分）溶液、等張緩衝液などを用いてよく混合し、遠
心分離した後のペレット（細胞塊）にセンダイウイルス
（以下、ＨＪＶという）またはポリエチレングリコール
（以下、ＰＥＧという）溶液を添加することによって行
うことができる。

【００１７】ペレットに添加する溶液は、好ましくはポ
リエチレングリコールであり、更に好ましくは平均分子
量が１０００〜８０００で３０〜６０重量％のポリエチ
レングリコールである。細胞融合を促進するために、コ
ルヒチン、ジメチルスルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニ
ンなどを添加することもできる。

【００１８】細胞融合に用いるミエローマ細胞として
は、免疫された動物と異種の動物由来のものを使用する
こともできるが、得られるモノクローナル抗体産生ハイ
ブイリドーマ株の抗体産生量および安定性の面を考える
と、免疫された動物とは同種のミエローマ細胞を用いた
方がよく、更に好ましくは同種、同系の動物を用いる。

【００１９】（５）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、例えば、細胞融合操作後の細
胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、牛胎
児血清を含むリンパ球培養用培地（ＨＡＴ培地）で培養
後、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、ウエス
タンブロッテング法、プラーク形成法、凝集反応法、Ｒ
ＩＡ（ラジオアイソトープを用いた方法）、間接蛍光抗
体法（ＩＦＡ）などで目的とするモノクローナル抗体産
生ウェルを検索すればよい。検定数が非常に多い場合の
抗体産生ウェルの検索では、まずＥＬＩＳＡ法で検索す
るのが好ましい。更に、この抗体がＨＩＶのインテグラ
ーゼ活性を阻害するか否かは、例えばウエスタンブロッ
ティング法によって確認すればよい。

【００２０】ハイブリドーマの培養は、通常、培養プレ
ートの各ウェル（培養ウェル）に抗体産生ウェルの検索
に適した細胞個数を入れて行われる。このとき、必要に
応じてハイブリドーマの増殖促進物質またはそれを産生
する細胞（例えば、胸腺、脾臓、リンパ節由来のリンパ
球など）をフィーダー細胞として使用することができる
し、或はＩＬ−６を含むリンパ球細胞培養用培地を使用
することもできる。

【００２１】ＨＡＴ培地で増殖することによって選択さ
れたハイブリドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した
細胞個数に達するまで、ＨＡＴ培地で数日間培養し、更
に一般的に用いられる牛胎児血清を含有するリンパ球培
養用培地で培養する。

【００２２】このようにして得られたハイブリドーマが
目的とする抗体を産生しているか否かをＥＬＩＳＡ法
（酵素免疫測定法）で検討する場合、以下のようにして
行えば良い。即ち、ＨＩＶのインテグラーゼやインテグ
ラーゼ産生形質転換菌などを固定化したＥＬＩＳＡプレ
ートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培養
上清を加えて一定時間静置する。インテグラーゼの量
は、本試験で検出可能な程度の量でよい。

【００２３】これらの測定ウェルを洗浄した後、各測定
ウェルに結合した動物由来の抗体と反応しうる酵素標識
抗体を、各測定ウェルに加えて一定時間静置する。標識
に用いる酵素は、例えば、ペルオキシターゼ、アルカル
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどを挙げるこ
とができる。

【００２４】標識される抗体は、測定ウェルに結合した
ハイブリドーマ培養上清由来の抗体だけと反応するもの
であれば特に限定されず、例えばマウス、ラット、ウサ
ギ、ヤギなどから得られた血清、またはマウス細胞など
を用いて作製されたハイブリドーマ株が産生したモノク
ローナル抗体を挙げることができる。

【００２５】つぎに、これらの測定ウェルを洗浄し、用
いた酵素に対応した基質溶液を加えて酵素活性を測定す
る。そして、酵素活性が認められれば、その培養上清を
とった培養ウェル中にＨＩＶのインテグラーゼと抗原抗
体反応する抗体を産生するハイブリドーマが存在してい
たことがわかる。このようにして、細胞増殖が認めら
れ、ＨＩＶのインテグラーゼと抗原抗体反応するモノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマを得ること
ができる。

【００２６】（６）ハイブリドーマの株化（クローニン
グ） 株化は常法によって行えば良く、例えば、抗体産生が認
められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界希釈
法、シングル・セル・マニピュレーション法（倒立顕微
鏡下、１ウェルに１個のハイブリドーマを入れる方
法）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡ
ＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃ
ｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニン
グすることができる。

【００２７】このとき、前記のハイブリドーマを培養
し、その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、
（５）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬＩ
ＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。こ
のようにして、ＨＩＶのインテグラーゼと抗原抗体反応
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を
選択することができる。

【００２８】（７）モノクローナル抗体の製造方法 本発明のモノクローナル抗体の産生方法は、上記のハイ
ブリドーマ株を用いること以外は常法に従えば良く、ハ
イブリドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物
の腹腔内で培養することによって行うことができる。ハ
イブリドーマ株のフラスコ内培養での該モノクローナル
抗体の産生は、例えば０〜２０％牛胎児血清を含む一般
的に用いられるリンパ球培養用培地（具体例は前述）で
細胞濃度が上限に達するまで培養することによって行う
ことができる。このとき、該モノクローナル抗体は、遠
心操作で得た培養上清中に含まれている。

【００２９】ハイブリドーマ株の培養で得られた該モノ
クローナル抗体は、例えばタンパク質の一般的な精製法
に適用されている塩析、透析、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを行う
ことによって精製され、高純度のモノクローナル抗体と
なる。

【００３０】ハイブリドーマ株を動物腹腔内で培養する
場合、動物としてはマウス、ラット、ハムスターなどを
用いることができるが、細胞融合に用いた細胞が由来す
る動物と同種の動物を用ることが好ましく、特に同種・
同系の動物を用ることが好ましい。

【００３１】培養に当たっては動物の腹腔内にこの動物
の免疫能を低下させる物質、例えばプリスタンなどの鉱
物油あるいはメチルテトラペンタデカンを投与してもよ
く、マウスを使用した場合、数週間後に５×１０⁵ 〜１
０⁷ 個の株細胞に増殖させることができる。

【００３２】この方法の場合には生成する該モノクロー
ナル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれてお
り、そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得たと
きの培養上清の抗体濃度に比較してきわめて高く、例え
ば１０〜１，０００倍とすることも可能である。前記の
ようにして得た該モノクローナル抗体は、ＨＩＶのイン
テグラーゼとは抗原抗体反応する。

【００３３】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、本発明
によって初めて入手可能となったものであり、ＨＩＶに
関する基礎研究のための試薬、及びＡＩＤＳを簡単、迅
速、且つ正確に診断するための臨床検査測定試薬などと
して有用である。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例によって具
体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の範
囲を限定するものではない。

【００３５】（実施例１） 形質転換大腸菌ＧＥＸ−Ｉ
Ｎの調製（免疫源の調製） （１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコード
する遺伝子とインテグラーゼをコードする遺伝子を有す
る組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＩＮの作製 ＨＩＶ由来インテグラーゼタンパク質をコードするプラ
スミドｐＢＨ１０（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｄ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＤｒ．Ｇａｌｌｏ研
究室より入手）をサイト−ディレクテッド・ミュータジ
ェネシスキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＮｄｅＩサイトを挿入し、これをＨｉｎｄ
ＩＩＩとＮｄｅＩで消化後、低融点アガロース電気泳動
で、約８００ｂｐの断片を分離し、フェノール抽出によ
りその断片を回収した。回収したＤＮＡ断片の両端はＳ
１ヌクレアーゼにて平滑末端とし、インテグラーゼのみ
をコードするｃＤＮＡを得た。

【００３６】ついで、プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ（ファ
ルマシア社製）を制限酵素ＳｍａＩで処理し、先に得た
インテグラーゼ遺伝子を挿入、連結し、組み換えプラス
ミドを得た。遺伝子が組み込まれたことの確認は、イン
テグラーゼ遺伝子をプローブとしたコロニーハイブリダ
イゼーション法により選択し、さらに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで先に得た組み換えプラスミドを処理すると、正方向
にインテグラーゼ断片が挿入されている場合は約４８０
ｂｐの断片、逆方向の場合は約４２０ｂｐの断片が得ら
れるため、断片の長さの判定から、正方向にインテグラ
ーゼ断片が挿入されている組み換えプラスミドを選択
し、得られた組み換えプラスミドをｐＧＥＸ−ＩＮと命
名した。

【００３７】（２）形質転換大腸菌の作製と精製 大腸菌ＭＶ１１９０株のコンピテント細胞に上記（１）
で得た組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＩＮを導入し、イ
ンテグラーゼ遺伝子が導入された大腸菌をインテグラー
ゼＤＮＡをプローブとしたコロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより選択し、得られた形質転換大腸菌をＧＥＸ−
ＩＮと命名した。

【００３８】続いて、このＧＥＸ−ＩＮの１コロニーを
２５ｍｌのＬＢ培地で一晩培養後、さらに１ｌのＬＢ培
地で３時間振盪培養（３７℃）した後、イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧとい
う）濃度が１ｍＭになるように加え、更に６時間培養し
続けた。この培養液を７，０００×ｇで１０分間遠心分
離し、大腸菌を回収し、リン酸緩衝整理食塩水溶液（以
下、ＰＢＳという）で３回洗浄した。

【００３９】これを最終濃度０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ
（ナカライ・テスク社製）を加えた４ｍｌのＰＢＳに懸
濁し、３０秒間３回超音波破砕した。さらに、１０，０
００×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清をグルタチオ
ンセファロースアフィニティークロマトグラフィー（Ｇ
ｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ使
用：ファルマシア社製）により融合タンパク質を粗精製
し、続いてカットオフ分子量１０Ｋｄで限外濾過し０．
５ｍｌになるまで濃縮した。この濃縮サンプルを免疫原
とした。

【００４０】また、得られた濃縮サンプル中のタンパク
質は、ＨＩＶ感染者血清を１００倍希釈したものを用い
たウエスタンブロットにより、５８Ｋｄのバンドとして
確認された。

【００４１】（参考例２） ＥＬＩＳＡ用抗原の調製 実施例１で得た形質転換大腸菌（ＧＥＸ−ＩＮ）を炭酸
緩衝液（水１ｌ中に１．６ｇ Ｎａ₂ＣＯ₃、２．９ｇ
ＮａＨＣＯ₃、０．１６ｇ ＮａＮ₃を含む）で１０μｇ
／ｍｌの最終濃度に希釈してＥＬＩＳＡ用抗原とした。

【００４２】（実施例２） （１）マウスの免疫及び脾臓リンパ球の調製 参考例１で得た大腸菌ＧＥＸ−ＩＮを１．５×１０⁸／
ｍｌを含むＭＥＭ溶液（２％牛胎児血清含有）を５０μ
ｌずつＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週齢）の両後肢足
蹠皮下に投与した。初回免疫から４週間後に前記と同様
に調製した大腸菌ＧＥＸ−ＩＮの溶液を同マウスの尾静
脈に１００μｌ投与した。

【００４３】更に、初回免疫から６週間後に前記と同様
に調製したワクチニアウイルスｍＯＩＮの溶液を同マウ
スの尾静脈に１００μｌ投与した。このようにして最終
免疫から３日後のマウスより摘出された脾臓を、１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ溶液（細胞培養用培地粉末を
蒸留水に溶解したもの）を入れたシャーレ中で洗い、新
たに用意したＭＥＭ溶液の中に移して、注射筒と注射針
とを用いてＭＥＭで還流した。このようにして得た浮遊
リンパ球を、ＭＥＭ溶液に懸濁して、１２００×ｇ、５
分間遠心分離し、ＭＥＭ溶液に再懸濁し、細胞融合に使
用するマウス脾臓リンパ球とした。

【００４４】（２）細胞融合 ３．７５×１０⁷個の対数増殖期にある８−アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）と上記
（１）のマウスの脾臓リンパ球１．５×１０⁸個とを５
０ｍｌ容プラスチック製コニカル遠心管にいれ、混合
し、ついで、上清を１２００×ｇ，５分間遠心分離した
後に、同遠心管を軽く叩いてペレットをほぐした。この
ペレットを激しく振盪しながら、この中に、５０％ＰＥ
Ｇ４０００容液１ｍｌを３７℃下、１分間かけて加え、
更に１分間激しく振盪した。

【００４５】同遠心管を穏やかに振盪しながらＭＥＭ溶
液を、最終的に１０ｍｌになるように、３７℃下、数分
間かけて加えた。その後、室温で３５０×ｇ、６分間遠
心分離し、上清を吸引除去した。同遠心管を軽く叩いて
ペレットをほぐし、７０ｍｌのＨＡＴ培地（１×１０^{- 4}
Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．
６×１０^-5Ｍチミジン、牛胎児血清を含有するＩＭＤＭ
培地、３７℃に保温）に懸濁して、９６ウェルの培養プ
レート７枚の各培養ウェルに１００μｌ分注して、５％
ＣＯ₂、３７℃、湿度１００％でインキュベーターを用
いて培養した。

【００４６】（３）ハイブリドーマの選択 上記（２）の培養開始から２週間後、細胞増殖が認めら
れた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、ＨＩＶの
インテグラーゼ対する抗体が含まれているか否かを以下
のＥＬＩＳＡ法により検討した。まず、９６ウェルＥＬ
ＩＳＡプレートの各分析ウェルに、参考例２で調製した
ＥＬＩＳＡ用溶液を５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静
置した後、２％スキムミルクを含むＰＢＳ緩衝液で、室
温下、２時間ブロッキングした。

【００４７】ついで、ＥＬＩＳＡプレートに０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄した後、上記
（２）で得たハイブリドーマ細胞の培養上清を各分析ウ
ェルに５０μｌずつ入れて室温で１時間静置した。な
お、陰性対照にはＨＡＴ培地を用い、陽性対照には本発
明での細胞融合に用いたマウスの血清を１０００倍に希
釈したものを用いた。

【００４８】つぎに、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェ
ルを前記ＰＢＳ洗浄液で４回洗浄し、マウス免疫グロブ
リンに対するペルオキシダーゼ標記した抗体溶液ＩｇＧ
＋ＩｇＭ（ＴＡＧＯ社製）を、５０μｌずつ、各分析ウ
ェルに分注し、室温で１時間静置した。そして、ＥＬＩ
ＳＡプレートの各分析ウェルを前記ＰＢＳ洗浄液で４回
洗浄後、１ｍｌ中に１ｍｇのＡＢＴＳ反応液（１ｍｇ／
ｍｌ ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｌｂ
ｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｉｎｉｃ
ａｃｉｄ）、２８ｍＭクエン酸、４４ｍＭリン酸水素
二ナトリウム、０．００３％過酸化水素）を５０μｌず
つ各分析ウェルに分注し、室温で、３０分間反応後、マ
イクロプレート用の吸光度測定装置を用いて、各ウェル
の４０５ｎｍ（対照４９０ｎｍ）における吸光度を測定
し、抗原抗体反応の有無を調べた。

【００４９】この結果、培養プレート中の６８６個の培
養ウェルのうち、４個のウェルにＨＩＶのインテグラー
ゼに対する抗体の産生が認められた。これらの抗体を産
生した４個の培養ウェルについて、ウエスタンブロッテ
ィング法を行ったところ、この培養ウェル４個の中の２
個でＨＩＶのインテグラーゼに反応した抗体が認められ
た。即ち、この２個の培養ウェルには、ＨＩＶの逆転写
酵素と反応する抗体を産生するハイブリドーマが存在す
ることが確認された。

【００５０】（４）ハイブリドーマの株化（クローニン
グ） ２０％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ培地を用いて、上記
（３）で得られたインテグラーゼに反応した抗体を含有
した２個の培養ウェルについて限界希釈法でハイブリド
ーマをクローニングした。ハイブリドーマ培養には、９
６ウェル培養プレートを用い、各ウェルにハイブリドー
マ１個／フィーダー細胞を含むリンパ球培養用培地１０
０μｌとし、室温で培養した。

【００５１】培養開始後、１０日目から単一コロニーと
して観察される培養ウェルの上清を採取して、参考例２
で調製した溶液を用いて、上記（３）と同様の方法でＥ
ＬＩＳＡ法により抗体産生ウェルのスクリーニングを行
い、ハイブリドーマ株を少なくとも２株ずづ得、これら
を再クローニングした。得られたハイブリドーマ株を６
Ｆ４株と命名し、この６Ｆ４株が産生したモノクローナ
ル抗体を６Ｆ４と称する。

【００５２】（実施例２） フラスコ培養でのＨＩＶの
インテグラーゼに対するモノクローナル抗体の産生 １５％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で、実施例１で得
た６Ｆ４株の培養細胞を死滅直前（細胞数はどれくらい
になるまでか）まで培養し、その培養液を１５００×
ｇ、５分間遠心分離して得られた上清中に、ＨＩＶのイ
ンテグラーゼに対するモノクローナル抗体（６Ｆ４）が
９８μｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ法により測定）含有されて
いた。

【００５３】（実施例３） マウス腹腔内でのＨＩＶに
インテグラーゼに対するモノクローナル抗体の生産 ＨＩＶのインテグラーゼに対する大量のモノクローナル
抗体を得るために、マウスの腹腔内で６Ｆ４株の細胞を
培養した。このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な
増加を示し、２週間目に腹水を１匹当り５ｍｌずつ採取
した。この腹水を１５００×ｇ、５分間遠心分離して、
腹水上清を得た。ＨＩＶのインテグラーゼに対するモノ
クローナル抗体（６Ｆ４）は、この腹水上清中に１ｍｇ
／ｍｌ（ＥＬＩＳＡにより測定）含有されていた。

【００５４】（実施例４） モノクローナル抗体６Ｆ４
の性質 （測定試験１） モノクローナル抗体６Ｆ４のクラス・
サブクラスの決定 モノクローナル抗体６Ｆ４のクラス・サブクラスの決定
は、マウス抗体の各クラスに特異的なペルオキシダーゼ
標識抗体溶液（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、Ｉ
ｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、κ型Ｌ鎖およびλ型Ｌ鎖に対
する西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗体）を
用いた実施例１（３）と同様の方法でＥＬＩＳＡ法、及
びマウス抗体の各クラス・サブクラスに特異的な抗体溶
液（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、κ型Ｌ鎖およびλ型Ｌ鎖に対する西洋ワ
サビペルオキシダーゼで標識された抗体）を用いたオク
タロニー法で行った。その結果、実施例１で得たモノク
ローナル抗体６Ｆ４は、ＩｇＭに属する抗体であり、Ｌ
鎖はκであることがわかった。

【００５５】（測定試験２） モノクローナル抗体６Ｆ
４の反応性の検討 モノクローナル抗体（６Ｆ４）は、ＨＩＶウエスタンブ
ロットキット（オーソ・ダイアグノスティック・システ
ム社製）を使用したウエスタンブロットで３２Ｋｄの単
一バンドとして確認され、この結果から、本発明のモノ
クローナル抗体は、ＨＩＶのインテグラーゼと抗原抗体
反応することがわかった。

【００５６】（測定試験３） モノクローナル抗体６Ｆ
４の反応部位の検討 （１）タンパク質の調製 実施例１（１）で作製したＧＳＴ遺伝子とインテグラー
ゼ遺伝子とを有するプラスミドｐＧＥＸ−ＩＮを制限酵
素ＥｃｏＲＩで処理し、インテグラーゼ遺伝子の前半部
分（５’側）を含む約５４００ｂｐの断片とインテグラ
ーゼ遺伝子の後半部分（３’側）である約４００ｂｐの
断片を得た。約５４００ｂｐの断片をライゲーション
し、得られたプラスミドをｐＧＥＸ−ＩＮＨと命名し
た。一方、約４００ｂｐの断片は、ＥｃｏＲＩで切断し
たｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）に挿入、連結
し、得られたプラスミドをｐＧＥＸ−ＩＮＥと命名し
た。

【００５７】このようにして得られたプラスミドをそれ
ぞれ、常法にしたがって大腸菌ＭＵ１１９０株（バイオ
ラッド社製）に形質転換させ、プラークハイブリダイゼ
ーション法により形質転換大腸菌を得、それぞれをＧＥ
Ｘ−ＩＮＨ、ＧＥＸ−ＩＮＥと命名した。これらの形質
転換大腸菌が発現したＨＩＶ由来の２種類のタンパク質
をアフィニティークロマトグラフィーによって精製し
た。

【００５８】（２）反応部位の検討 上記（１）で得られた２種類のタンパク質とモノクロー
ナル抗体６Ｆ４との反応性をウエスタンブロッティング
により検討したところ、インテグラーゼ遺伝子の前半部
分（５’側）を有する形質転換大腸菌ＧＥＸ−ＩＮＨが
発現したタンパク質とは反応したが、インテグラーゼ遺
伝子の後半部分（３’側）を有する形質転換大腸菌ＧＥ
Ｘ−ＩＮＥが発現したタンパク質とは反応しなかった。
このことから、モノクローナル抗体６Ｆ４は、インテグ
ラーゼの前半部分のエピトープと反応していることがわ
かった。一方、ＨＩＶ感染患者血清についても同様の検
討を行ったところ、インテグラーゼの後半部分のエピト
ープと反応していた。

【００５９】（測定試験４） 哺乳動物細胞中で発現し
たインテグラーゼとの反応性の検討 （１）組み換えプラスミドの作製 ｐＡＫ８（特開平２−３０３４８２号公報記載）を制限
酵素ＨｉｎｆＩで消化後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理した
後、ＳａｌＩで消化し、ライゲーションしてプラスミド
ｐＡＫ９を作製し、これを制限酵素ＳａｃＩと制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩで切断される部
位を有する合成ＤＮＡクローニングサイトを挿入した
後、ＰｖｕＩＩでＴＫ遺伝子を切断し、プラスミドｐＡ
Ｋ１０を作製した。

【００６０】このｐＡＫ１０を制限酵素ＮｃｏＩで消化
後、ポリメラーゼにより平滑末端とし、さらにアルカリ
フォスフォフェラーゼ処理し、セルフライゲーションを
阻害したＤＮＡ断片とした。このＤＮＡ断片に、実施例
１（１）で用いたＨＩＶのインテグラーゼをコードする
ｃＤＮＡをライゲーションして得られた組み換えプラス
ミドをｐＡＫ−ＩＮと命名した。

【００６１】（２）組み換えワクチニアウイルスの作製 即ち、１０ｃｍの培養ディッシュに培養されたＲＫ−１
３（大日本製薬より購入）細胞に弱毒痘そうウィルス株
（特開昭６２−４４１７８号記載の弱毒痘そう株ｍＯ
株、財団法人千葉血清から分与）を０．１ｐｆｕ／細胞
の割合で接種し、６０分後、ウィルス液を捨てた。

【００６２】ついで、５μｇの組み換えプラスミドｐＡ
Ｋ−ＩＮを鮭精子ＤＮＡ ２５μｇと共に、水で溶か
し、４５０μｌにした後、樋高ら（蛋白質・核酸・酵
素、２７、３４０、１９８５）の方法によってＤＮＡ−
リン酸カルシウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌをワ
クチニアウイルスｍＯ株感染ＲＫ−１３細胞上に滴下し
た。

【００６３】３０分間３７℃、５％ ＣＯ₂インキュベ
ーターに静置し、５％牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ Ｍ
ＥＭ ４．５ｍｌを加えた。その３時間後培養液を交換
し、４８時間後、プラークが形成された培養細胞ごと３
度凍結融解し、３０秒間、氷冷下で超音波処理した。そ
の処理物を１０００×ｇで３０分間遠心分離し、その上
清を回収し、組み換えワクチニアウイルスを含むウィル
ス液とした。

【００６４】組み換えワクチニアウイルスのインテグラ
ーゼ遺伝子挿入を確認するため、６ｃｍのペトリ皿にコ
ンフレントに培養されたＴＫ陰性１４３細胞（大日本製
薬より購入）に上記ウィルス液（５×１０⁸ｐ．ｆ．
ｕ．／ｍｌ）を１０００μｌ接種し、４５分後、１％寒
天、１２％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌ ＢＵｄＲ を
加えたＥａｇｌｅ ＭＥＭを積層し、３日間培養後感染
細胞を０．０１％中性紅で染色した。形成されたそれぞ
れのプラークをパスツールピペットで単離し、Ｅａｇｌ
ｅ ＭＥＭ培地中に希釈した。単離したそれぞれのプラ
ークにつき、再度同様の操作を繰り返し、プラークを純
化した。

【００６５】（３）哺乳動物細胞中で発現したインテグ
ラーゼとの反応性の検討 この組み換えワクチニアウイルスが発現しているタンパ
ク質と、実施例１で得たモノクローナル抗体６Ｆ４とが
抗原抗体反応することをウエスタンブロッティングによ
り確認した。このことから、モノクローナル抗体６Ｆ４
は、哺乳動物細胞中で発現したインテグラーゼとも反応
することがわかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト免疫不全ウイルスのインテグラーゼ
   に対して抗原抗体反応しうるモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒト免疫不全ウイルスのインテグラーゼ
   を発現しうる大腸菌を動物に免疫し、その動物から得ら
   れたリンパ球とミエローマ細胞とを融合して得られた請
   求項１記載のモノクローナル抗体産生能を有するハイブ
   リドーマ株。