JP2786068B2

JP2786068B2 - Ｃｒｋタンパクに対するモノクローナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ株

Info

Publication number: JP2786068B2
Application number: JP4260215A
Authority: JP
Inventors: 道行松田; 毅倉田
Original assignee: Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan
Current assignee: Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan
Priority date: 1992-09-29
Filing date: 1992-09-29
Publication date: 1998-08-13
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: JPH06253886A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、前癌遺伝子ＣＲＫの
発現産物であるＣＲＫタンパクに対するモノクローナル
抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ株に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】近年における遺伝子工学の進歩は目覚ま
しいものがあり、発癌のメカニズムについても遺伝子レ
ベルでの研究が活発に行なわれ、ヒトの発癌に関与する
多数の癌遺伝子および癌抑制遺伝子が明らかになってき
ている。また、それに伴って、癌の診断や基礎研究にお
いて、癌遺伝子に関連する抗体が広く利用されるように
なってきている。従来、このような癌遺伝子に関連した
抗体については、たとえばＮ−ｍｙｃ遺伝子産物と特異
的に反応する抗体に関する発明（特開昭６３−３１３５
９６号公報）が知られている。

【０００３】一方、ＣＲＫ遺伝子は、ニワトリＣＴ１０
ウイルスの癌遺伝子として最初に同定された前癌遺伝子
であり、現在では、マウス、ラット、サル、ヒト等にも
その存在が確認されている。この癌遺伝子ＣＲＫの発現
産物であるＣＲＫタンパクは、チロシンキナーゼの制御
タンパクであり（Mayer et al., Nature, ３３２，２７
２−２７５，１９８８；Matsuda et al., Molecular an
d Cellular Biology,12, 3482-3489, 1992 ）、しかも
ある種のチロシンキナーゼは癌の悪性化に伴って発現量
が増加することから、このＣＲＫタンパクもヒトの発癌
メカニズムに重要な役割を果している可能性がある。

【０００４】このような理由から、このＣＲＫタンパク
についての関心が高まりつつあり、その定量やタンパク
自体の精製が癌研究における重要な課題の一つになって
きている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このＣ
ＲＫ遺伝子に関連する抗体としては、これまでに、大腸
菌で発現させたニワトリＣＲＫタンパクを抗原とする抗
ＣＲＫタンパクウサギ血清が知られているのみであり、
モノクローナル抗体に関する報告は未だなされていな
い。

【０００６】従って、ＣＲＫタンパク、特にヒト由来の
ＣＲＫタンパクに対して高特異的な反応性を有するモノ
クローナル抗体を提供することは、このタンパクのヒト
発癌メカニズムに対する関与を理解するためにも、また
このタンパクによるチロシンキナーゼの制御機構を知る
うえでも極めて重要な意味を有するものである。この発
明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、
ＣＲＫタンパクに対して高特異的な反応性を有するモノ
クローナル抗体を提供することを目的としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ＣＲＫタンパクに対して特異的
な反応性を有するモノクローナル抗体、およびＣＲＫタ
ンパクに対して特異的な反応性を有し、かつＣＲＫタン
パクのリン酸化チロシン含有タンパク結合活性を阻害す
るモノクローナル抗体を提供する。

【０００８】またこの発明は、上記モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ株をも提供する。以下、この
発明についてさらに詳しく説明する。この発明のモノク
ローナル抗体は、前癌遺伝子ＣＲＫの発現産物であるＣ
ＲＫタンパクに対して高特異的な反応性を有するモノク
ローナル抗体である。なお、このＣＲＫタンパクについ
ては、ヒト、サル、ラット、マウスおよびニワトリにつ
いてその発現が確認されている。

【０００９】この発明のモノクローナル抗体は、この抗
体を産生するハイブリドーマ株を培養することによって
製造することができ、そのようなハイブリドーマ株の作
出は、免疫、細胞融合、融合細胞選択およびクローニン
グ（株化）の各工程よりなる公知の方法（Nature, ２５
６，４９５，１９７５）によって行なうことができる。

【００１０】その場合に、免疫工程において用いる免疫
原としては、たとえばヒトＣＲＫ遺伝子を挿入した発現
ベクター（ｐＥＴ３等）による形質転換大腸菌の発現産
物から精製したＣＲＫタンパクを挙げることができる。
あるいはまた、ヒトＣＲＫ遺伝子を、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと記す）発現ベク
ター（ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−２Ｔ；：ファルマシ
ア製品番号２７−４８０１−０１，２７−４８０３−０
１）のＧＳＴ遺伝子３′末端に挿入連結し、このベクタ
ーを導入した大腸菌から精製（たとえばグルタチオンセ
ファロースアフィニティークロマトグラフィーを使用）
したＣＲＫタンパクとＧＳＴとの融合蛋白質（以下、Ｇ
ＳＴ−ＣＲＫと記す）を免疫原とすることもできる。

【００１１】このようにして作出したハイブリドーマ株
の産生するこの発明のモノクローナル抗体は、ＣＲＫ遺
伝子の発現産物である分子量約28,000、40,000、42,000
のタンパク質、およびＧＳＴ（分子量約26,000）との融
合蛋白質によって形成される分子量約54,000のタンパク
質に対して、ウエスタンブロッティング法、免疫沈殿
法、免疫組織化学法を用いてスクリーニングした場合、
少なくとも２以上の上記方法において高い特異的な反応
性を示す。

【００１２】以下、この発明のハイブリドーマ株および
そのハイブリドーマ株を用いたモノクローナル抗体の好
ましい製造方法を、免疫動物としてマウスを用いた場合
について順次説明する。（１）免疫動物リンパ球の調製マウスへの免疫は、ＣＲＫ遺伝子をＧＳＴ遺伝子の３′
末端に連結挿入した発現ベクター（ｐＧＥＸ−ＣＲＫ）
により形質転換した大腸菌から、アフィニティークロマ
トグラフィーで精製したＣＲＫタンパク 200μl(濃度10
00μg/ml）をマウスに数週間隔で数回投与することで行
うことができる。

【００１３】リンパ球は、その免疫マウスの充分な抗体
価を確認後、最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、
脾臓などから得ることができるが、脾臓から得るのが好
ましい。（２）ミエローマ細胞の準備細胞融合には、マウス由来のMPC-11，P3-X63-Ag8・653
（653), P3-X63-Ag8-U1(P3U1), P3-NS1(NS-1), SP2/O-A
g14 (SP2/O)など、およびラット由来のIR983 F,Y3-Ag1.
2.3, YB2/0 などのミエローマ細胞を用いることができ
るが、653, P3U1,NS-1, SP2/O などの細胞外に抗体を産
生分泌しないミエローマ細胞が好ましい。（３）細胞融合細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球とミエローマ細胞との細胞数を（４〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分(IMDM,
MEM,DMEM,McCoy, RPMI1640などの培地成分）溶液、等張
緩衝液などを用いてよく混合し、遠心分離した後のペレ
ット（細胞塊）に、ＨＶＪ（センダイウイルス）または
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を添加すること
によって行うことができるが、好ましくはＰＥＧ溶液を
用いるのがよく、さらに好ましくは平均分子量が 1000
〜8000で３０〜６０重量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよ
い。この時、細胞融合を促進するために、コルヒチン、
ジメチルスルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニンなどを添
加することもできる。

【００１４】細胞融合に用いるミエローマ細胞として
は、免疫された動物と異種の動物由来のものを使用する
こともできるが、得られるモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株の抗体産生量および安定性の面を考慮した
場合には、免疫された動物とは同種のミエローマ細胞を
用いた方がよく、さらに好ましくは同系ののを用いた方
がよい。（４）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有した培地。この培地成分として
は一般に用いられるリンパ球培養用培地成分を用いるこ
とができる）で培養して行うことができる。

【００１５】ハイブリドーマの培養は、培養プレートの
各ウェル（培養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適し
た細胞個数を入れて行い、この時、ハイブリドーマの増
殖促進物質またはそれを産生する細胞（例えば、胸腺、
脾臓、リンパ節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞
として必要に応じて使用することができるし、あるいは
ＩＬ−６を含むリンパ球培養用培地などを使用すること
もできる。

【００１６】ＨＡＴ培地で増殖することによって選択さ
れたハイブリドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した
細胞個数に達するまで、ＨＡＴ培地で数日間培養し、さ
らに、一般的に用いられるウシ胎児血清を含有するリン
パ球培養用培地で培養する。（５）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（４）で得られたハイブリドーマが、目的とする抗
体を産生しているか否かの検定は、例えば、ＥＬＩＳＡ
法（酵素免疫測定法）、ウエスタンブロッティング法、
ＲＩＡ（ラジオアイソトープを用いた方法）、間接蛍光
抗体法（ＩＦＡ）などで抗体産生ウェルを検索し、さら
に、その抗体がＣＲＫタンパクのリン酸化チロシン含有
タンパクとの結合を阻害するか否かを検討することによ
って行うことができるが、検定数が非常に多い場合の抗
体産生ウェルの検索では、先ずＥＬＩＳＡ法で検索する
のが好ましい。

【００１７】このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行
う。ＣＲＫタンパク〔例えば、細胞から分離されたＣＲ
Ｋタンパク、ＣＲＫタンパクを産生する形質転換菌より
分離されるＣＲＫタンパク、ＣＲＫの一部分を合成した
ペプチドなど〕を固定化した（ＣＲＫタンパクと反応性
を有する抗体が存在している場合には、その固定化に要
する量は本ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認できる程度の
量でよい。）ＥＬＩＳＡプレートの各ウェル（測定ウェ
ル）に、ハイブリドーマ培養上清を加えて一定時間静置
する。そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合し
た動物由来の抗体と反応して結合することができる酵素
標識抗体をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置す
る。標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシターゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。標識される抗体は、測定ウェル
に結合したハイブリドーマ培養上清由来の抗体だけと反
応して結合することができる限り特に限定されず、例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得られた血
清、またはマウス細胞などを用いて作製されたハイブリ
ドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げることが
できる。次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵
素に対応した基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そ
して、酵素活性が認められれば、その培養上清をとった
培養ウェル中にＣＲＫタンパクとの反応性を有する抗体
を産生するハイブリドーマが存在していたことがわか
る。

【００１８】ＣＲＫタンパクに対して特異的な反応性を
有し、かつリン酸化チシロン結合活性を阻害する抗体を
産生するハイブリドーマの検索は、Michiyuki Matsuda
等の方法（Molecular and Celuular Biology, 11, 1607
-1613, 1991 ）に準じて、ＣＲＫタンパクとリン酸化チ
シロンを含む蛋白との結合を測定し、その結合を阻害す
る培養ウェルを検索することによって知ることができ
る。

【００１９】このようにして、細胞増殖が認められ、Ｃ
ＲＫタンパクに対して反応性を有し、かつＣＲＫタンパ
クのリン酸化チシロン含有タンパク結合活性を阻害する
抗体を産生しているハイブリドーマを得ることができ
る。ＣＲＫタンパクに対して反応性を有する抗体を産生
するハイブリドーマが存在していたウェルについては、
ＥＬＩＳＡの他に、さらにウェスタンブロッティング
法、免疫組織化学法等によってＣＲＫタンパクとの反応
性を再認識することが好ましい。（６）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマ
は、限界希釈法、シングル・セル・マニピュレーション
法（倒立顕微鏡下、１ウェルに１個のハイブリドーマを
入れる方法）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方
法、ＦＡＣＳ(Fluorecent Activated Cell Sorter)を用
いた方法などでクローニングすることができる。この
時、前記のいずれかのクローニング方法によって上記
（５）で見い出した抗体産生ハイブリドーマを培養し、
その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、（５）
の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬＩＳＡ法
と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

【００２０】このようにして、ＣＲＫタンパクに対して
特異性が高く、かつＣＲＫタンパクのリン酸化チロシン
含有タンパク結合活性を阻害する抗体価が高いモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ株を選択すること
ができる。（７）モノクローナル抗体の生産ＣＲＫタンパクに対して特異性が高く、かつＣＲＫタン
パクのリン酸化チロシン含有タンパク結合活性を阻害す
る抗体価が高いモノクローナル抗体の生産は、前記
（６）で得たハイブリドーマ株をフラスコ内で培養した
り、または動物の腹腔内で培養することによって行うこ
とができる。

【００２１】すなわち、フラスコ内でのハイブリドーマ
株の培養によりモノクローナル抗体を生産する場合は、
例えば、０〜２０％ウシ胎児血清を含む一般的に用いら
れるリンパ球培養用培地（IMDM, MEM, DMEM, McCoy, RP
MI1640などの培地成分を含む培地）で細胞濃度が上限に
達するまで培養する。この時、モノクローナル抗体は、
遠心操作で得た培養上清中に含まれている。

【００２２】一方、動物腹腔内でのハイブリドーマ株の
培養によりモノクローナル抗体を生産する場合は、例え
ば、マウス、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹
腔内にこの動物の免疫能を低下させる物質、例えば、プ
リスタンなどの鉱物油あるいはメチルテトラペンタデカ
ンを投与し、数週間後に５×１０⁵〜１０⁷個の前記
（６）で得たハイブリドーマ株細胞を投与し、その腹腔
内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖させることによ
って行うことができる。この時、遠心操作で得た腹水上
清中に含まれているモノクローナル抗体濃度は、フラス
コ内培養で得たときの培養上清の抗体濃度の１０〜１，
０００倍である。なお、培養に用いる動物は、細胞融合
に用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行
うこともできるが、同種の動物を用いて行った方が好ま
しく、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方が
よい。

【００２３】ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物
腹腔内での培養で得られたモノクローナル抗体は、タン
パク質の一般的な精製法に適用されている塩析、透析、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィーなどを行うことによって精製され、高純度
のモノクローナル抗体となる。このようにして得たこの
発明のモノクローナル抗体は、ＣＲＫタンパクである分
子量約２８，０００、４０，０００、４２，０００の各
タンパク質に対して高特異的な反応性を有し、かつＣＲ
Ｋタンパクのリン酸化チロシン含有タンパク結合活性に
対する阻害作用を有する。このためこの発明のモノクロ
ーナル抗体は、ＣＲＫタンパクの免疫化学的定量方法に
用いるとができ、あるいはそのための試薬の材量（たと
えばＥＩＡ試薬の第１抗体または第２抗体）として用い
ることができる。さらにまた、上記の生理活性により、
抗癌剤の有効成分としても利用することができる。

【００２４】

【実施例】以下、参考例および実施例を示してこの発明
を具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定され
るものではない。参考例〔免疫原およびＥＬＩＳＡ用抗原の調製〕ＧＳＴとの融
合蛋白質として発現するＣＲＫタンパク（ＧＳＴ−ＣＲ
Ｋ）は次のようにして調製した。

【００２５】形質転換大腸菌（ｐＧＥＸ−ＣＲＫ）の１
コロニーを１ＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ，トリプトン、
５ｇ／Ｌ，酵母エキス、１０ｇ／Ｌ，NaCl、１００ｍｇ
／Ｌ，アンピシリン）で６時間振とう培養（３７℃）し
た後、１ｍＭになるようにIsopropyl −β−Ｄ−thioga
lactopyranoside,（IPTG）を加え、さらに６時間培養を
続けた。この培養を遠心（7,000 ×ｇ１０分間）して
大腸菌を回収し、これをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度
０．１％TritonＸを加えた４ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３
０秒間３回超音波破砕し、遠心分離（10,000×ｇ１０分
間）し、その上清からグルタチオンセファロースアフィ
ニティークロマトグラフィー（Glutathione Sepharose
４Ｂ；ファルマシア製品番号１７−０７５６−０１）に
より融合蛋白を精製し、免疫原およびＥＬＩＳＡ抗原と
して用いた。実施例１〔ＣＲＫタンパクに対するモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマの作製〕（ａ）マウスの免疫および脾臓リンパ球の調製精製したＧＳＴ−ＣＲＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌず
つＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、７週齢）の背部皮下に完全
フロイントアジュバントとともに投与した。初回免疫か
ら４週間後に前記と同様に調製したＧＳＴ−ＣＲＫの溶
液を不完全フロイントアジュバントとともに背部皮下に
注射した。さらに初回免疫から６週間後に前記と同様に
調製したＧＳＴ−ＣＲＫの溶液を、同マウスの眼底部静
脈に１００μｌ投与した。

【００２６】前記のようにして免疫されたマウスから摘
出された（最終免疫から３日目に摘出された）脾臓を、
ＭＥＭ溶液（細胞培養用培地粉末を蒸留水に溶解したも
の、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含む）を入れたシャーレ中
で洗い、新たに用意したＭＥＭ溶液の中に移して、注射
筒と注射針を用いてＭＥＭで液流した。このようにして
得た浮遊リンパ球を、ＭＥＭ溶液に懸濁して、遠心分離
（１２００×ｇ，５分間）し、ＭＥＭ溶液に再懸濁し、
細胞融合に使用するマウス脾臓リンパ球とした。（ｂ）細胞融合３．７５×１０⁷個の対数増殖期にある８−アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）と前記
（ａ）のマウスの脾臓リンパ球１．５×１０⁸個とを５
０ｍｌ容プラスチック製コニカル遠心管にいれ、混合
し、次いで、上清を遠心分離（１２００×ｇ，５分間）
した後に、同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし
た。

【００２７】このペレットを激しく振とうしながら、こ
の中に、５０％ＰＥＧ４０００溶液（３７℃）を１分間
かけて１ｍｌ入れ、さらに、１分間激しく振とうした。
同遠心管を穏やかに振とうしながらＭＥＭ溶液（３７
℃）を数分間かけて徐々に加え、最終的には１０ｍｌと
し、室温で遠心分離（３５０×ｇ，６分間）して、上清
を吸引除去した。

【００２８】同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐ
し、７０ｍｌのＨＡＴ培地（１×１０^-4Ｍヒポキサンチ
ン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０^-5Ｍチ
ミジン、ウシ胎児血清を含有するＩＭＤＭ培地、３７℃
に保温）に懸濁して、９６ウェルの培養プレート７枚の
各培養ウェルに１００μｌ分注して、ＣＯ₂インキュベ
ーターを用いて培養した（５％ＣＯ₂，３７℃、湿度１
００％）。（ｃ）ハイブリドーマの選択前述の（ｂ）の培養開始から１０日〜２週間目にかけ
て、細胞増殖が認められた培養プレートの各ウェルの培
養上清中に、ＣＲＫタンパクに対する抗体が含まれてい
るか否かを、次ぎに示すＥＬＩＳＡ法で検討した。

【００２９】先ず、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各
分析ウェルに、参考例のＧＳＴ−ＣＲＫ溶液（２μｇ／
ウェル抗原濃度）を５０μｌずつ分注し、４℃で１晩静
置した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを
洗浄液（０．０５％のTween ２０を含むＰＢＳ）で２回
洗浄した後、０．５％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解）を
各ウェルに１００μｌずつ分注して室温で３０分間静置
し、これらの各分析ウェルを洗浄液で２回洗浄し、前記
培養プレートの各培養ウェルの培養上清を、これらの各
分析ウェルに５０μｌずつ入れて室温で１時間静置した
（陰性対照には、ＨＡＴ培地を用いた。一方、陽性対照
には、本発明での細胞融合に用いたマウスの血清を１０
００倍に希釈したものを用いた）。

【００３０】次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェル
を洗浄液で３回洗浄し、マウス免疫グロブリンに対する
アルカリホスファターゼ標識抗体溶液を、５０μｌず
つ、各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。そし
て、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で４回
洗浄後、ＰＮＰＰ(paranitrophenylphosphate)溶液（１
ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ各分析ウェルに分注し、
室温で３０分間反応後、マイクロプレート用の吸光度測
定装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を
測定した。

【００３１】このような検討の結果、培養プレート中の
１８８０個の培養ウェルの中の２５個で、ＣＲＫタンパ
クに対する抗体の産生が認められた。これらの抗体を産
生した２５個の培養ウェルについて、免疫組織化学を行
った。その結果、ＣＲＫタンパクに反応した抗体を含有
する培養ウェルは、２５個の中の２５個で認められた。
即ち、この２５個の培養ウェルには、ＣＲＫタンパクと
反応する抗体を産生するハイブリドーマが存在すること
が確認された。（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地を用いて、前述
の（ｃ）工程において示した抗体産生が確認された２５
個の培養ウェルについて限界希釈法でハイブリドーマを
クローニングした。

【００３２】ハイブリドーマ培養には、９６ウェル培養
プレートを用い、（ハイブリドーマ１個／フィーダー細
胞を含むリンパ球培養用培地１００μｌウェル）で培養
した。培養開始後、１０日目頃から単一コロニーとして
観察される培養ウェルの上清を採取して、参考例の溶液
を用いたＥＬＩＳＡ法（前述の（ｃ）工程と同様の方
法）で抗体産生ウェルのスクリーニングを行い、ハイブ
リドーマ株を少なくとも２株ずつ得、これらを再クロー
ニングした。

【００３３】このようにして得られた株をＡＤ２株（微
工研菌寄第１３１７６号）と称し、この株が産生したモ
ノクローナル抗体を、ＡＤ２と称する。この株の培養上
清中に含まれるモノクローナル抗体のクラス・サブクラ
ス、Ｌ鎖の型を次の測定試験Ｉで決定し、各種化合物に
対する反応性を測定試験IIで検討した。測定試験Ｉ〔ＣＲＫタンパクに対するモノクローナル抗体のクラス
・サブクラスの決定〕ＡＤ２株が産生した免疫グロブリ
ンのクラス・サブクラスの決定は、マウス抗体の各クラ
スに特異的なペルオキシダーゼ標識抗体溶液（ＩｇＧ
１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，κ型Ｌ鎖またはλ型Ｌ鎖などに対する西洋ワサビペ
ルオキシダーゼで標識された抗体）を用いた前述の
（ｃ）工程と同様のＥＬＩＳＡ法およびマウス抗体の各
クラス・サブクラスに特異的な抗体溶液（ＩｇＧ１，Ｉ
ｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ，ＩｇＡ，κ
型Ｌ鎖またはλ型Ｌ鎖などに対する抗体）を用いた免疫
ブロッティング法で行った。

【００３４】その結果、ＡＤ２株が産生したモノクロー
ナル抗体（ＡＤ２）はＩｇＧ２ａに属する抗体（Ｌ鎖は
κ）であることがわかった。測定試験II 〔ＣＲＫタンパクに対するモノクローナル抗体の反応性
の検討〕モノクローナル抗体（ＡＤ２）の反応特異性に
ついて、ＣＲＫタンパクを発現している細胞で免疫組織
化学を行ない検討した。

【００３５】その結果、これらの、モノクローナル抗体
はＣＲＫ遺伝を発現している細胞とのみ反応し、ＣＲＫ
タンパクに特異的であることが分かった。実施例３〔フラスコ培養でのＣＲＫタンパクに対するモノクロー
ナル抗体の産生〕１５％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培
地で、ＡＤ２株の培養細胞を死滅直前まで培養した。

【００３６】ＣＲＫタンパクに対するモノクローナル抗
体（ＡＤ２）は、培養液を遠心分離（１５００×ｇ５
分間）して得られた上清中に１３３μｇ／ｍｌ（ＥＬＩ
ＳＡ法により測定）含有されていた。実施例４〔マウス腹腔内でのＣＲＫタンパクに対するモノクロー
ナル抗体の生産〕ＣＲＫタンパクに対する大量のモノク
ローナル抗体を得るために、マウス腹腔内でＡＤ２株の
細胞培養をした。

【００３７】ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、６週齢、２週間
前にプリスタンを０．５ｍｌ腹腔内投与）の腹腔内に、
ＰＢＳで浮遊させたＡＤ２株の細胞を１×１０⁶個投与
した。このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加
を示し、２週間目に腹水（５ｍｌ／匹）を採取した。こ
の腹水を遠心分離（１５００×ｇ５分間）して、腹水
上清を得た。ＣＲＫタンパクに対するモノクローナル抗
体（ＡＤ２）は、この腹水上清中に２ｍｇ／ｍｌ（ＥＬ
ＩＳＡ法により測定）含有されていた。

【００３８】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、ＣＲＫタンパクに対して特異的な反応性を有し、
かつＣＲＫタンパクのリン酸化チロシン含有タンパク結
合活性を阻害することのできる新しいモノクローナル抗
体と、この抗体を産生するハイブリドーマ株が提供され
る。このモノクローナル抗体によってヒトの癌細胞に関
する基礎研究のための試薬、あるいは新しい抗癌剤等の
開発が可能となる。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＣＲＫタンパクまたはヒトＣＲＫ融
合タンパクによって免疫されたマウスリンパ球とマウス
ミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマＡＤ
２株（微工研菌寄第１３１７６号）が産生するモノクロ
ーナル抗体であって、ヒトＣＲＫタンパクに対して特異
的な反応性を有し、かつヒトＣＲＫタンパクのリン酸化
チロシン含有タンパク結合活性を阻害するモノクローナ
ル抗体。
【請求項２】ハイブリドーマＡＤ２株（微工研菌寄第
１３１７６号）。