KR100456790B1

KR100456790B1 - 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적인 단클론 항체

Info

Publication number: KR100456790B1
Application number: KR10-2003-0067207A
Authority: KR
Inventors: 김효준
Original assignee: (주)에스제이바이오메드
Priority date: 2002-09-28
Filing date: 2003-09-27
Publication date: 2004-11-10
Also published as: WO2004029094B1; WO2004029094A1; AU2003264980A1; KR20040028538A

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(adenylate kinase isozyme3: AK3)에 특이적인 단클론 항체, 이를 포함하는 심장질환 진단을 위한 조성물 및 키트 및 이를 이용한 심장질환마커의 검출방법에 대한 것이다.

Description

미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적인 단클론 항체{Monoclonal Antibody Specific for Human Mitochondrial Adenylate Kinase Isozyme3}

본 발명은 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(AK3)에 대한 특이성(specificity) 및 친화도(affinity)가 높은 AK3에 특이적인 단클론 항체에 대한 것이다.

40대 이후에 성인병의 일종으로 급성 심근경색을 포함한 심장질환이 많이 발생하고 있으며, 이로 인한 사망자도 증가하는 추세이다. 국내 종합병원, 대학병원에서도 월 평균 병원 당 200회 이상의 심장질환의 진단이 이루지고 있다. 미국에서는 매년 수 백만명에 달하는 사람들이 흉부 통증으로 병원 응급실을 찾고 있다.

종래에 흉부 통증 환자의 심장질환을 진단하는 일반적인 방법은 심전도계를 사용하는 것이었다. 심전도계(ECG)를 사용한 심근경색의 진단은 심전도의 Q파와 비정상적인 ST-T파의 변화로 심근경색을 판정하였다. 그러나, 급성 심근경색으로 응급실을 찾은 환자 중 약 50% 이상이 잘못된 진단 결과를 얻었으며, 이 중 5%의 심근경색증 환자가 오진으로 심근경색으로 진단받지 못하였으며, 이들 중 16%가 이로 말미암아 사망에까지 이르게 되었다.

이러한 문제점들을 해결하기 위하여 심근경색에 대한 생물학적 마커들이 개발되기 시작하였다. 심근경색에 대한 이상적인 생물학적 마커는 다음과 같은 특징을 가져야 한다. 첫째, 단지 심근세포에만 존재함으로써 심근이 손상되었을 때 혈액내로 방출되어야 한다. 둘째, 심근상해 후에 빠르게 혈액내로 방출되어야 하는데 이것은 생물학적 마커가 세포내에 어디에 존재하는가와 그것의 크기에 의존하게 된다. 세째, 심근상해의 정도와 방출된 생물학적 마커의 양 사이에 선형적인 비례관계가 있어야 한다. 넷째, 분석시 특별한 훈련이나 기술이 요구되지 않아야 하며 검사에 필요한 시약이 저렴하고 안정적이어야 한다. 다섯째, 흉부에 통증을 느낀 뒤 혈청 또는 혈장내에 생물학적 마커의 양이 증가되어야 한다. 여섯째, 방출된 생물학적 마커는 연속적인 심근경색을 확인할 수 있도록 빠르게 제거되어야 한다.그러나, 상기의 조건들을 모두 만족시키는 생물학적 마커는 현재까지 존재하지 않고 있다.

현재 생물학적 마커를 이용한 심근 경색증의 진단에는 크레아틴 인산화 효소 (CK) 매쓰 분석(mass assay)과 트로포닌 테스트가 활용되고 있다. CK는 근육조직에는 MM형, 뇌 및 척수에는 BB형이, 그리고 골격근이나 심장근에서는 하이브리드형인 MB형이 존재하므로 조직 손상이나 암에 대한 마커로 이들의 혈청 농도가 활용된다. 특히, CK-MB는 급성 심근경색증의 정도를 나타내는 효소로 알려져 있으며, 이들은 화상 및 외상을 포함하여 심장, 골격근 질환에 이르기까지 모든 근질환에 있어서 혈액 역가의 약 5%의 변화폭을 보인다.

그러나, CK-MB를 이용한 심근경색의 진단방법은 경시효과와 탐지한계점 등의 문제점이 있고 약 20% 정도의 거짓 신호(false signal)가 나타나 정확도가 떨어지는 단점이 있기 때문에 완벽한 진단 수단은 되지 못하고 있다.

현재 세계보건기구(WHO)의 기준에 의한 심근경색 진단의 근거는 (1) 전형적인 흉부통증, (2) ECG의 Q파의 이상, (3) 상기에서 언급된 효소학적 최대 정상수치 2배 이상의 효소 유출량 증가 중 2가지가 해당될 때 심근경색으로 확진하도록 하고 있다.

한편, 넬 보이스 등(Boyce N. et al., (1996) Clinical Laboratory News, 22(1), 1-14)은 상기와 같은 종래의 심장 손상 마커로 크레아틴 인산화 효소(CK-MB)를 사용하는 방법의 오진 가능성을 줄이기 위해 심장 트로포닌 T(cTnT) 테스트를 개발하였다. 이 방법은 FDA (United States Food and Drug Administration)로부터 공인을 받아 Boehringer Manheim Diagnostics사 (Manheim,독일)에 의해 제품화되어 미국에서는 96년 11월부터 사용되어 오고 있으나, 골격근 유래의 트로포닌 T와 교차 반응성이 있는 것으로 확인되어, 현재에는 트로포닌 I 테스트를 사용하고 있다.

그러나, cTnT 및 cTnI 테스트의 경우, 모두 발병 후 8 내지 10여 시간의 경시조건이 요구되는 단점을 극복하지 못하였으므로(Eisenbrey et al, (1995) The Journal of American Medical Association, 74, 1343-1344) 이 방법 또한 만족스러운 대체법은 아니고 CK-MB 테스트의 보조 수단으로 사용될 뿐이다.

또한, 상기의 모든 진단방법은 고가의 분석장비와 심장전문의 및 고도의 훈련을 받은 인력을 필요로 하기 때문에 소수의 대학병원 및 종합병원에서만 제한적으로 활용가능할 뿐만 아니라 검사 비용이 매우 고가인 문제점을 갖는다.

이에 대하여 본 출원인은 대한민국 특허출원 제2000-0005808호에서 면역조직 화학검사 결과, hAK1의 경우 모든 조직에서 검출되었으나 hAK2는 간, 뇌, 심근, 심장, 폐에서 검출되고 hAK3는 간, 심근, 심장, 폐에서 검출 되었으며, 뇌, 심근 및 골격근에 대한 웨스턴 블롯팅에서도 AK1은 모든 조직에서 확인 되었으나 AK2 및 AK3는 골격근에서는 발현되지 않았고 심근 특이적인 발현을 보임을 확인하고 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적인 항체를 사용함으로써 상기한 바와 같은 기존의 심장질환 진단용 생물학적 마커들의 정확도 및 검사의 편의성 측면에서의 문제점들을 획기적으로 해결할 수 있다고 기술한 바 있다.

그럼에도 불구하고, 진단 키트의 속성상 거짓 음성(false positive)이 환자의 생명에 치명적인 위협이 되며, 이로 인하여 진단 의사가, 의료 과오 소송에 휘말릴 위험이나 제조 회사가 제조물 책임 소송에 휘말릴 위험이 크므로 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 대한 특이성과 친화도가 종래의 그것보다 크게 개선되어 진단 마커로서의 신뢰도가 고도로 향상된 단클론 항체의 개발이 당업계에서 시급히 요청되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 찾아내어, 이들 단클론 항체가 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 대해 고도의 특이성과 친화성을 나타냄으로써 심장질환마커인 AK3를 정확하게 검출할 수 있다는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

발명의 요지

본 발명은 CDR(complementarity determining region)이 (a) 서열번호 41 내지 46, (b) 서열번호 47 내지 52, (c) 서열번호 53 내지 58, (d) 서열번호 59 내지64, (e) 서열번호 65 내지 70, (f) 서열번호 71 내지 76, (g) 서열번호 77 내지 82, (h) 서열번호 83 내지 88, (i) 서열번호 89 내지 94 및 (j) 서열번호 95 내지 100으로 이루어진 그룹중에서 선택되고 선택된 그룹의 6개의 CDR중 4개 이상을 포함하는, AK3에 특이적인 단클론 항체에 관한 것이다.

상기 단클론 항체는 바람직하게는 (a) 내지 (j) 그룹중에서 선택된 6개의 CDR을 갖는다. 보다 바람직하게는, KCLRF-BP-00058 내지 KCLRF-BP-00066의 하이브리도마에 의해 생산된다.

또한, 본 발명은 서열번호 102 내지 106의 펩타이드를 인식하는 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적인 단클론 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 107의 펩타이드를 인식하는 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적인 단클론 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00058 내지 KCLRF-BP-00066으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단클론 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 단클론 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 포함하는 심장질환마커 검출을 위한 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 포함하는 심장질환 진단키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 심장질환마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 검출 방법에서, 항원-항체 복합체의 형성은 바람직하게는 ELISA로 검출하며, 보다 바람직하게는 샌드위치 ELISA로 검출한다.

도 1은 아데닐레이트 인산화 효소(AK) 이소자임의 세포내의 정성적 분포도이다.

도 2는 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(AK3)의 PCR 생성물에 대한 전기영동 결과도이다.

도 3은 pCR2.1-AK3의 유전자 지도이다.

도 4는 pCR2.1-AK3의 제한효소 절단 패턴을 도시한 도면이다.

도 5는 pQE30-AK3의 제한효소 절단 패턴을 도시한 도면이다.

도 6은 pQE30-AK3의 유전자 지도이다.

도 7은 항-AK3 단클론 항체의 AK 이소자임들에 대한 교차 반응성을 도시한 그래프이다.

본 발명은 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(AK3)에 대해 고도의 특이성 및 친화성을 나타내는 단클론 항체를 제공한다.

본 발명의 단클론 항체들은, 종래의 심근 경색증 진단용 마커로서 알려진 크레아틴 인산화 효소(cKMB) 또는 트로포닌 T 테스트, 트로포닌 I 테스트와는 달리, 공지의 아데닐레이트 인산화효소 이소자임 1 및 이소자임2에 대해 매우 약한 교차 반응성을 나타내고 심근에만 선택적으로 존재하는 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화효소 이소자임3에 대해서는 선택적인 고도의 결합 친화성을 나타내므로 심장환 진단에 특히 적합하다.

본 명세서에 사용된 용어 "미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(AK3)"은 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체 뿐만 아니라, AK3의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다.

아데닐레이트 인산화 효소는 하기 반응식 1과 같이 세포내 XTP, ADP 및 AMP의 가역적 인산기 전이반응을 촉매하여 아데닌 뉴클레오타이드간의 신속한 동적평형을 유지시켜주는 효소이다:

XTP + AMP ⇔ XDP + ADP

상기 효소는 세포 대사활동 및 신호전달과 관련된 인산화 반응에 필수적인 효소중의 하나로, 에너지 대사, 세포자살(Apoptosis), 종양발생(tumorigenesis) 등에 관여하는 효소로 알려져 있으며, 생물계에서 약 40여종이 보고되었다(Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M., & Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10148-10152). 척추 동물계의 세포에는, 도 1에 도시한 바와 같이, 세포질에 존재하는 AK1 (EC 2.7.4.3), 미토콘드리아 막간 공간(mitochondria intermembrane space)에 존재하는 AK2, 미토콘드리아 매트릭스에 존재하는 AK3 (EC 2.7.4.10) 등 3종류의 이소자임이 다양한 서브타입으로 존재하고 있는 것으로 보고되었다(Kuby, S. A., Palmieri, R. H., Frischat, A., Wu, L. H., Maland, L., & Manship, M. (1984) Biochemistry 23, 2392-2399; Sachsenheimer, W., & Schulz, G. E. (1977) J. Mol. Biol. 114, 23-36; Egner, U., Tomasselli, A. G., & Schulz, G. E. (1987) J. Mol. Biol. 195, 649-658).

사람 AK3는 223개의 아미노산으로 이루어진 인산 전이 효소로 뉴클레오시드트리포스페이트-아데닐레이트 포스포트랜스페라제 (nucleosidetriphosphte-adenylate phosphotransferase)라고도 한다. 사람 AK3의 유전자 배열 및 아미노산 1차 배열은 Xu 등(Xu, G., O'Connell, P., Stevens, J. and White, R. (1992) Characterization of human adenylate kinase 3 (AK3) cDNA and mapping of the AK3 pseudogene to an intron of the NF1 gene. Genomics 13 : 537-542)에 의해 밝혀졌다. 사람 AK3의 아미노산 서열이 서열번호 101에 나타나 있다.

AK3은 아래 반응식 2와 같은 반응을 촉매한다(Chiga,M., Rogers, A.E., Paut, G.W.E. (1961) J. Biol. Chem., 236, 1800; Albrecht, G.J., (1970) Biochemistry, 9:2426):

GTP + AMP ⇔ GDP +ADP

사람에 있어서 AK 효소의 유전적 결함은 유전성의 용혈성 빈혈을 유발함이 밝혀졌으며(Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. and Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10148-10152), 근육 및 뇌 조직에서 크레아틴 인산화 효소와 AK에 의해 티아민 트리포스페이트가 생합성되는 것이 밝혀졌다.

그동안 AK3 효소에 관한 연구는 타 효소에 비해 활발하지 못하였으며, AK3 효소의 인체에서의 조직 특이성이 본 출원인에 의해 출원된 대한민국 특허출원 제2000-0005808호에 개시된 바 있다.

본 발명자는 상기한 특허출원에서 AK3이 심근에서는 발현되지만 골격근에서는 발현되지 않음을 최초로 확인하고, 이를 심근세포 상해와 관련된 순환기 질환에 대한 심장질환 마커로 사용할 수 있음을 기술하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 "단클론 항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또다른 장점을 갖는다.

AK3에 대해 특이적인 단클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단중 하나의 집단은 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고나서, 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따른 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 SJB3-31(KCLRF-BP-00066), SJB3-32(KCLRF-BP-00058), SJB3-33(KCLRF-BP-00059), SJB3-34(KCLRF-BP-00060), SJB3-35(KCLRF-BP-00065), SJB3-36(KCLRF-BP-00061), SJB3-37(KCLRF-BP-00062), SJB3-38(KCLRF-BP-00063) 및 SJB3-39(KCLRF-BP-00064)는 기탁기관 KCLRF(Korean Cell Line Research Foundation)에 2002년 8월 7일자로 기탁되었으며, SJA3-86(KCLRF-BP-00030)는 KCLRF에 2000년 5월 19일자로 기탁되었다.

본 명세서에서, "하이브리도마 SJB3-31이 생산하는 단클론항체"를 "SJB3-31"로 명명하였으며, 마찬가지로 기타의 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론 항체도 같은 방식으로 명명하였다.

본 발명자는 상기한 하이브리도마에 의새 생산되는 항-AK3 단클론 항체의 ScFv(single chain fragment variable)를 제작하였으며, 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 서열분석하고, Kabat Numbering Scheme을 이용하여 CDR(complementary determining region)을 결정하였다(http://www.bioinf.org.uk/abs). 이와 같이 서열분석된 가변 영역의 핵산 서열 및 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 40에 나타나 있다. 또한, 이들 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열이 서열번호 41 내지 100에 나타나 있으며 다음 표 1에 요약되어 있다:

용어 '가변'이란 항체들 간에 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 특이성을 나타내는데 사용된다는 것을 일컷기 위해 사용된다. 항체의 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포하는 것이 아니라 CDR(complementarity determining region)에 집중된다. 단클론항체의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 가지며 이들 영역이 AK3를 인식함으로써 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 CDR은 각각의 단클론 항체마다 특징적인 서열을 가지며 하나의 단클론 항체가 특정 에피토프를 인식하기 위해 이들 6개의 CDR의 일부 또는 모두가 상호작용할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 CDR(complementarity determining region) 서열이 (a) 서열번호 41 내지 46, (b) 서열번호 47 내지 52, (c) 서열번호 53 내지 58, (d) 서열번호 59 내지 64, (e) 서열번호 65 내지 70, (f) 서열번호 71 내지 76, (g) 서열번호 77 내지 82, (h) 서열번호 83 내지 88, (i) 서열번호 89 내지 94 및 (j) 서열번호 95 내지 100으로 이루어진 그룹중에서 선택되고 선택된 그룹의 6개의 CDR중 4개 이상을 포함하는, 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3(AK3)에 특이적인 단클론 항체를 제공한다.

바람직한 양태에서, AK3에 특이적인 단클론 항체는 상기 그룹 (a) 내지 (j)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 CDR을 포함한다.

보다 바람직한 양태에서, AK3에 특이적인 단클론 항체는 SJB3-31 내지 SJB3-39(KCLRF-BP-00058 내지 KCLRF-BP-00066)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 하이브리도마에 의해 생산된다.

본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00058 내지 KCLRF-BP-00066으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단클론 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 단클론 항체를 제공한다.

항원을 검출하는데 단클론 항체를 사용하는 경우의 잇점은 단일 에피토프를인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다: 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제 분해하여 생성된 단편을 면역블롯팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용하여 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.

본 발명자들은 본 발명의 단클론 항체가 인지하는 AK3상의 에피토프를 규명하고자 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 이용하였으며, 본 발명의 AK3 특이적 단클론 항체가 인식하는 다음과 같은 에피토프를 밝혀내었다:

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 102의 에피토프는 단클론 항체SJB3-31, SJB3-34 및 SJB3-39에 의해 인식될 수 있고, 서열번호 103의 에피토프는 단클론 항체 SJB3-33, SJB3-36 및 SJB3-35에 의해 인식될 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 102 내지 서열번호 106의 펩타이드를 인식하는 AK3에 특이적인 단클론 항체를 제공한다.

상기 에피토프는 파아지 디스플레이 라이브러리 키트를 이용하여 밝힌 것으로서, 이러한 에피토프를 토대로 하여 AK3의 아미노산 서열을 밝힌 서열번호 101의 단백질 서열중 60번 내지 68번의 아미노산 서열 KSLLVPDH에 해당하는 서열번호 107의 AK3내의 선형 에피토프를 지정할 수 있었다.

추가의 양태로서, 본 발명은 서열번호 107의 펩타이드를 인식하는 AK3에 특이적인 단클론 항체를 제공한다.

단클론 항체의 결합 친화성은 예를 들어 문헌[Munson et al., Anal Biochem., 107:220, 1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석법에 의해 결정할 수 있다. 본 발명의 단클론 항체의 결합 친화도가 하기 표 3에 나타나 있다. 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 단클론 항체 SJB3-31 내지 SJB3-39의 결합 친화도는 단클론 항체 SJA3-86의 결합 친화도에 비해 10배 이상의 결합 친화도를 나타내었으며, 특히 본 발명의 AK3 특이적 단클론 항체 SJA3-1-17에 비해서는 100배 이상의 결합 친화도를 나타내었다. 상기한 단클론 항체들의 중쇄/경쇄의 이소타입, pI 및 중쇄/경쇄 유전자 위치(CDR을 제외)가 다음의 표 3에 나타나 있다:

또다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 포함하는 심장질환마커 검출을 위한 조성물을 제공한다.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 심장질환마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 "심장질환마커"란 심장과 관련된 조직, 심근에서 발현되어 이의 검출을 통해 심장 관련 조직의 이상을 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 단클론 항체를 포함하거나 이를 사용하는 조성물, 키트 또는 방법에서 심장질환마커는 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3을 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "심장질환"이란 심근세포 상해와 관련된 순환기 질환으로서, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 심부전증 등을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "생물학적 시료(biological sample)"란 체액 또는 체액의 일부로서, 구체적으로 인체로부터 분리된 뇨, 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료중의 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 상기 효소와 이를 인지하는 단클론 항체의 결합물을 의미한다.

본 명세서에서 "검출 표지체(detection label)"란 항원-항체 복합체의 검출을 위한 표지체를 의미하며, 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 방사선동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되는 것은 아니다.

검출 표지체로 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스라디쉬(horseradish) 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사선동위원소로는⁵⁷Co,³H,¹²⁵I,¹²⁵I-볼톤(Bolton) 및 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry),입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으며, 반드시 이들로만 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 혈청 시료를 반응시킨후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다.

ELISA 검출 방법에 따라, 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임 3에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단클론 또는 다클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단클론 또는 다클론 항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체로 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 샌드위치 ELISA 검출 방법에서, AK3를 선별적으로 인지하는 단클론 항체(포획 항체: capture mAB)에 결합된 항원을 인지하는 항체는 바람직하게는 단클론 항체(검출 항체: detect mAB)이며, 이는 AK3를 선별적으로 인지하지만 항원과 복합체를 형성하는데 사용된 포획 단클론 항체와는 다른 에피토프를 인지하는 단클론 항체를 사용한다.

이러한 샌드위치 ELISA 검출 방법에 사용하기에 적합한 포획 항체로는 SJB3-34, SJB3-38 등을 사용할 수 있으며, 이들 단클론 항체를 배합하여 사용할 수도 있다. 또한, 검출 항체로는 SJB3-31, SJB3-35, SJB3-37, SJB3-36, SJB3-39, SJB3-32, SJB3-33 등을 사용할 수 있으며, 이중 SJB3-32 및 SJB3-36이 바람직하게 사용될 수 있으며, 이들 단클론 항체를 배합하여 사용할 수도 있다. 보다 바람직하게는, 포획 항체로서 SJB3-34를 사용하고, 검출 항체로서 SJB3-32 또는 SJB3-36을 사용한다.

구체적 예시로서, 지지체에 부착된 포획 단클론 항체를 생물학적 시료와 반응시키고 이어서 AK3에 특이적으로 결합하는 검출 단클론 항체를 결합시켜 이로부터 검출 표지 신호를 측정하거나 이들 복합체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 갖는 2차 항체를 첨가하여 이로부터 검출 표지 신호를 측정하여 AK3를 검출할 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단클론 항체를 포함하는 심장질환 진단키트를 제공한다.

본 발명의 심장질환의 검출을 위한 진단키트에 사용되는 단클론 항체는, 이 항체가 AK3를 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단클론 항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 심장질환 진단키트에는 AK3를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

이하 실시예를 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 태양을 설명하지만, 본 발명의 단클론 항체가 하기의 실시 태양에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

AK3 유전자의 클로닝

사람의 골격근으로부터 총 RNA 추출

RNA를 분리하기 위하여 100 mg의 근조직에 1 ml의 RNAzol(4M 구아니딘 티오시아네이트, 25 mM 나트륨 시트레이트, 0.5% 살코실(salcosyl), 0.1 M 2-머캅토에탄올)를 넣고 균질화시킨 후 클로로포름 100 ㎕를 넣고 15초 동안 진탕하고 15분 동안 얼음에 방치하였다. 12,000 xg에서 15분 동안 원심분리하여 수용액층을 새 튜브에 옮긴 후 동량의 이소프로파놀을 넣어 섞은 후 -70℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.

이어서, 12,000 xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 RNA 펠렛을 침전시킨 후, 75% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후 100 ㎕의 DEPC 처리수를 넣어 총 RNA를 추출하였다.

RT-PCR에 의한 AK3 cDNA의 작성

상기에서 분리한 총 RNA 10.5 ㎕와 500 ng/㎕의 올리고 dT 1㎕, 2.5 mM dNTPs 1.5㎕, 100 mM DTT 1㎕, 200 단위/㎕ MMLV 역전사효소 1㎕, 5X 역전사효소 완충액 6㎕, DEPC-처리수 9 ㎕를 혼합하여 총 부피를 30 ㎕로 하여 42℃에서 30분간 반응시키고, 75℃에서 30분 동안 불활성화시켰다. PCR 반응 혼합물의 조성은 합성한 cDNA를 주형으로 하여 2.5 mM dNTPs 8 ㎕, 5 단위/㎕ Ex taq DNA 폴리메라제 1 ㎕, 10 X DNA 폴리머라제 완충액 10 ㎕, 센스-프라이머와 안티센스-프라이머(100 pmol/㎕) 각각 1 ㎕를 첨가하였으며 증류수를 넣어서 전체 용적이 100 ㎕가 되게 하였다. 반응은 98℃에서 10초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연장시킨 후 4℃에서 소킹(soaking)하였다. 이 과정에서 두 프라이머, 즉 5'-GGATCCGCAATGGCTTCCAAACTCTGC-3'(센스)(서열번호 108) 및 5'-CAGGGTCAATATGCTTCTTTGG-3'(안티센스)(서열번호 109)을 사용하였으며 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 확인하였다(도 2).

AK3 서브클로닝 벡터(pCR2.1-AK3)의 구축

아가로스 겔로부터 680 bp의 AK3 PCR 생성물을 겔 추출 키트를 사용하여 정제하여 pCR 2.1(Invitrogen) PCR 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하였다(도 3). 결합 혼합물은 25 ng의 선형으로 만들어진 pCR 2.1 벡터 1㎕, PCR 생성물 5 ㎕, 4단위/㎕ T4 DNA 리가제 1 ㎕, 10X 리가제 완충액 1 ㎕, dH2O 2 ㎕를 혼합하여 총 부피가 10 ㎕로 하였고, 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 구축한 pCR2.1-AK3 플라스미드를 형질전환시키기 위해 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 균주 JM 109를 사용하였다. 이. 콜라이 JM 109 컴피턴트 세포(competent cell) 50 ㎕에 2 ㎕의 결합 혼합물을 넣고 얼음에서 30분 동안 방치한 다음 42℃에서 45초 동안 열쇽(heat shock)을 준 후 얼음에 2분 동안 담가 두었다가 SOC 배지 250 ㎕를 넣고 37℃, 225 rpm에서 1시간 동안 배양하고, X-gal과 IPTG를 포함하는 LB/암피실린 플레이트에 100 ㎕를 플레이팅하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 생성된 흰색 콜로니중 10개를 선택하여 50 ㎍/㎖ 암피실린이 함유된 LB 배지에 넣고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 산물은 플라스미드 prep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였으며, 분리한 플라스미드 DNA 5㎕, EcoRI 1㎕, EcoRI 반응 완충액 1 ㎕와 dH2O 3 ㎕를 섞어 1시간 반응시킨 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 PCR 생성물이 서브클로닝 되었는지 확인하였다(도 4). 서브클로닝이 정확하게 되었는지를 확인하기 위하여 PCR 생성물이 삽입된 플라스미드를 자동 서열결정기를 사용하여 염기서열을 확인하였으며, 이 때 사용한 프라이머는 M13 역방향 프라이머와 T7 프로모터 프라이머를 사용하였다.

[실시예 2]

AK3의 발현벡터의 구축 및 재조합 AK3의 분리 정제

AK3 유전자를 서브클로닝한 pCR2.1-AK3 벡터를 BamHI과 XhoI으로 이중 절단하여 자른 뒤 아가로스 겔로부터 삽입체를 용출하였다. AK3의 발현 벡터를 작성하기 위하여 pQE 30(Quiagene)을 BamHI과 SalI으로 절단하여 큰 단편을 아가로스 겔로부터 용출하여 사용하였다. 유전자 DNA의 결합은 pQE30 큰 단편 3 ㎕, 절단된 AK3 단편 5 ㎕, T4 DNA 리가제 1 ㎕, 10X 리가제 반응 완충액 1 ㎕ 를 혼합하여 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질전환에 사용된 숙주 세포는 이.콜라이(E. coli) M15를 사용하였으며 암피실린과 카나마이신이 함유된 LB 플레이트에 플레이팅하여 얻은 콜로니를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 밤새 배양하여 플라스미드를 분리한 후 EcoRI으로 절단하여 삽입체가 들어 있는가를 확인하였다(도 5 및 도 6). 유전자도입이 확인된 콜로니를 100 ㎍/㎖의 암피실린과 25 ㎍/㎖이 함유된 50 ㎖ LB 배지에서 밤새 배양한 후 50 ㎖를 새로운 LB 배지 1L에 접종하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 0.5 내지 0.7 정도가 되도록 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 후 IPTG 가 최종적으로 1 mM 농도가 되도록 첨가하여 4시간 동안 유도하였다. 유도된 배양액을 4,000 xg에서 20분간 원심분리하여 세포 펠렛을 얻은 후 결합 완충액(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween 20를 함유하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.9) 50 ml에 현탁시켜 -20℃에 밤새 저장하였다. 이를 얼음에서 녹인 후 세포를 용해시키기 위해 30초 동안 초음파 파쇄한 후 1분 동안 휴지기간의 사이클을 5회 수행하고 4℃에서 10,000 xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 가용성 단백질이 들어 있는 조제 추출물을 얻었다.

발현된 AK3를 정제하기 위하여 킬레이트 수지(Pharmacia)를 사용하였으며 킬레이트 수지를 컬럼에 베드 부피가 5 ml가 되게 패킹한 후 증류수로 5 컬럼 용적으로 세정하여 에탄올을 제거한 후 5 컬럼 용적의 충진 완충액(charge buffer; 0.1%Tween 20를 함유하는 50 mM NiSO4)를 사용하여 Ni⁺를 킬레이트 수지에 결합시킨 후 3 컬럼 용적의 증류수로 세정하고 5 컬럼 용적 결합 완충액로 평형화시켰다. 상기에서 준비된 조제 추출물을 로딩한 후 10 컬럼 용적의 결합 완충액로 세정하고 비특이적 결합을 제거하기 위하여 5 컬럼 용적 세정 완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween 20를 함유하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.9)로 세정한 후 5 컬럼 용적의 용출 완충액(0.5 M NaCl, 1M 이미다졸, 0.1% tween 20)를 함유하는 10 mM Tris/HCl, pH 7.9)로 용출하였다. 이 때 모든 단계의 유속(flow rate)은 1 ml/min가 되게 하였다. 정제된 AK3로부터 염을 제거하고 농축시키기 위하여 투석 완충액(0.1% Tween 20를 함유하는 10 mM Tris/HCl, pH 7.9)에서 12시간 동안 3번 완충액을 교환시켜 주면서 염을 제거한 후 PEG 8000을 사용하여 농축하였다. 농축된 단백질은 BCA 단백질 정량 분석 키트를 사용하여 정량하여 정제 수율(purification yield)을 계산하였다(표 4).

재조합 AK3의 정제

정제 단계	전체 단백질(mg)	정제 수율(%)
균질물(homogenate)	949.05	100
가용성 분획	178.75	18
Ni-킬레이트 친화성 크로마토그래피	14.3	1.5

[실시예 3]

항-AK3 단클론 항체 생산 하이브리도마 세포의 제조

6주령의 Balb/c (H-2^dhaplotype) 마우스에 200μg의 상기 제조된 재조합 AK3단백질 용액 0.16 ml를 동일 용적의 프로인트 완전 애쥬벤트와 에멀젼을 만든 후 복강에 1차 주사하였고 3주 간격으로 2회 추가 접종하였다. 추가 접종의 경우 면역 보조약은 불완전 애쥬벤트를 사용하였다. 최종 부스팅은 마우스의 꼬리를 통한 정맥주사로 행하였다.

마우스의 항체 유발 여부를 혈청에서 ELISA 테스트를 통하여 확인한 후 무균상태에서 비장(spleen)을 절취하여 소 태아 혈청(Gibco BRL), 0.5% 겐타마이신(Gibco BRL) 등을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Gibco BRL) 배양액에서 세포 분산 용액을 만든 후, 미리 준비한 동일 마우스 계열의 종양세포인 Sp2/0-Ag14 세포주와 PEG처리에 의하여 세포융합을 시켰다.

면역 세포와 Sp2/O-Ag14 세포를 각각 1:10의 비율의 세포 수를 계수하여 수득한 후 50ml 원심분리 튜브에 넣고 1200 rpm에서 원심분리하여 타이트 펠렛(tight pellet)을 형성시켰다.

상층액을 완전히 제거한 후, 세포를 탭핑하여(tapping) 펠렛을 완전히 분산시키고 37℃의 PEG1500 용액 1ml 가하고 혼합한 다음 추가로 37℃의 혈청이 없는 배지(serum free medium)를 1ml 가하여 1분 동안, 그리고 혈청이 없는 배지 18 ml를 4분 동안 계속 가하면서 혼합하여 PEG에 의한 세포 용해가 일어나지 아니하도록 점진적으로 희석시켰다.

세포를 세척하기 위하여 500 rpm에서 원심분리 후 역시 상층액을 완전히 제거하고 배양액을 가하여 충분히 세포를 분산시켰으며, 96 웰 조직 배양 플레이트에 1.1×10⁵세포/150 ㎕/웰 씩 분주하여 이를 37℃, 5% CO₂배양기에서 1주일 동안 배양하여 하이브리도마 세포를 제조하였다.

[실시예 4]

단클론 항체의 제조

하이브리도마 세포의 선별

하이브리드 세포의 선별에 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine: HAT) 배지에서의 생존능을 이용하여 실시하였다. 세포 융합을 실시하고 1주일 후에 각 웰당 70 μl의 HAT 배지를 가한 후, 2일 후부터 콜로니 형성의 여부를 관찰하고 이들의 상층액을 취하여 AK3(100 ng/웰)로 처리한 96 웰 미세역가 플레이트를 이용하여 ELISA를 수행하였으며, 490 nm의 흡광도가 0.5 이상인 웰들만을 선택하여 0.5 ml 배양으로 이행하였다. 그 결과, 최초의 융합에서 총 1440 웰로부터 1263 웰이 집락을 형성하였으며 이들중 49개의 웰을 대상으로 하이브리도마 세포 클로닝을 수행하였다.

하이브리도마의 클로닝

한계희석법(limiting dilution method)에 의하여 하이브리도마 세포의 클로닝을 수행하였다.

클로닝은 소 태아 혈청, 겐타마이신과 HAT 보조제(supplement) 등을 포함한 DMEM 배지의 2개의 96 웰 플레이트에 각 웰당 0.5세포/웰의 농도가 분주되도록 세포를 연속 희석하였다.

희석된 세포를 최종적으로 0.5 세포/웰이 되도록 일정량을 취하여 준비된 클로닝 배지 30 ml에 가한 후 각 웰에 150 ㎕씩 분주하였다. 5일 후 HAT 배지를 첨가한 다음 5일 후에 양호하게 하이브리도마가 배양된 웰을 선정하여 ELISA 검정을 수행하여 항 AK3 항체를 분비하는 세포를 선별하였다.

클로닝은 3차까지 수행하는데 1차 클로닝 단계의 ELISA에서 490 nm의 OD에서 1.0이상의 수치를 나타내는 클론 26개를 선택하여 2차 클로닝을 1차와 동일한 방법을 통하여 수행하여 역시 490 nm의 OD에서 1.0이상의 수치를 나타내는 클론 23개를 대상으로 3차 클로닝을 수행하고 마지막에는 안정적인 활성을 보이는 클론 19개를 선택하였다.

클로닝을 3차까지 수행한 후 단클론성 항체가 유도된 각 웰의 배양 상층액에 대하여 ELISA방법으로 항체의 생산 및 분비를 확인하였으며, AK1 및 AK2에 대한 교차 반응성을 보이는 클론을 제거시키고 AK3만을 특이적으로 인식하는 하이브리도마 세포, SJA3-86, SJA3-1-17, SJB3-31 내지 SJB3-39를 선별하였다. 상기 항체중 SJA3-86 및 SJB3-31 내지 SJB3-39는 KCLRF(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁하였다: 2000년 5월 19일자로 SJA3-86(KCLRF-BP-00030)를 기탁하였으며, 2002년 8월 7일자로 SJB3-31(KCLRF-BP-00066), SJB3-32(KCLRF-BP-00058), SJB3-33(KCLRF-BP-00059), SJB3-34(KCLRF-BP-00060), SJB3-35(KCLRF-BP-00065), SJB3-36(KCLRF-BP-00061), SJB3-37(KCLRF-BP-00062), SJB3-38(KCLRF-BP-00063) 및 SJB3-39(KCLRF-BP-00064)을 기탁하였다.

최종적으로, 선택된 하이브리도마를 48 웰 플레이트에서 12웰 플레이트를 거쳐 175 cm²-T 플라스크까지 증식 배양하였다.

단클론 항체의 생산

선별된 세포주로부터 단클론 항체의 생산은 융합세포를 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배양액에서 5% 이산화탄소 존재하에서 배양한 배지 상층액으로부터 정제하거나 프리스탄(pristane) 0.5 ml을 주사하고 상태가 양호한 1×10⁷개의 융합세포를 Balb/c 마우스에 복강주사하여 복수 종양을 유발시켜 복수로부터 항체를 유도하였으며 친화성 칼럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 의하여 1 mg 항체/ml의 수율로 분리 정제하였다.

단백질 A(protein A)를 이용한 단클론 항체의 정제

마우스(Balb/c)의 복수에 0.5 ml의 프리스탄을 주사한 후 1 내지 2주 사이에 1×10⁷세포/ml/마리씩 주사하여 1주일 후 복수를 채취하였다. 칼럼에 단백질 A 패스트 플로우 레진(Protein A Fast Flow Resin) 10 ml를 충진시킨 후 증류수로 세척하고 280 nm에서의 흡광도를 0.1 범위로 잡고 기준선(base line)에 도달할 때까지 1 X PBS완충액을 흘려주었다.

그 후, 시료(복수 채취액)을 로딩하고 다시 1X PBS 완충액으로 평형을 이룬 후 용출 완충액(0.1 M Glycin-HCl pH3.5)으로 용출시켰다. 용출 분획을 0.25 용적의 3 M 트리스-HCl(pH7.5)로 중화시키고 센트리프렙 30(centriprep 30)으로 농축한 후 PBS 완충액을 이용하여 투석을 시키고 BCA 검정을 통하여 단백질을 정량하였다.

AK1 및 AK2와의 교차 반응성 측정

96 웰 미세역가 플레이트에 AK1, AK2 및 AK3를 웰당 100 ng을 100 ul씩 분주한 후 4℃에서 24시간 코팅시켰다. 항원 코팅시 pH 9.6의 0.05 M 중탄산염 완충액을 사용하며 코팅이 끝나면 0.05% Tween이 첨가된 PBS 완충액을 이용하여 각 웰들을 세척하였다. 세척 후에는 0.5% 카제인, 0.02% 아지드화나트륨과 0.05% Tween이 포함된 PBS를 웰마다 300 ul씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 차단 후에는 역시 0.05% Tween 첨가된 PBS 완충액을 이용해 각 웰들을 세척하였다.

48 웰로 옮겨 HAT 배지 1 ml에서 1일 동안 배양한 하이브리도마의 상층액 100 ul씩을 AK1, AK2, AK3가 코팅된 각 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 역시 0.05% Tween이 첨가된 PBS 완충액을 이용하여 각 웰들을 세척하였다.

세척이 끝난 각 웰에 항-마우스 IgG(Fc 특이적)-HRP 결합 염소 Ab(goat anti-mouse IgG(Fc specific)-HRP conjugation Ab(PIERCE #31439))를 1:1,000으로 PBS에 희석하여 100 ul씩 첨가한 뒤 37℃에서 1시간 30분동안 반응시킨 후 세척하고 OPD 기질을 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단클론 항체의 AK1, AK2 및 AK3에 대한 교차 반응성을 측정한 결과를 표 5에 나타내었다(도 7). 이러한 교차 반응성 측정을 통하여, 단클론 항체 SJA3-86에 비하여 단클론 항체 SJB3-31 내지 SJB3-39가 AK1 및 AK2에 대한 교차 반응 없이 AK3를 특이적으로 인식하므로 심근 경색 진단용 마커로서 훨씬 더 적합함을 알 수 있었다.

AK3에 대한 친화도(affinity)측정

해리 상수의 결정

고체상 방법 면역 검정에 따라 단클론 항체의 해리상수(Kd)를 구하였다. 해리도를 구하기 위해, 항원의 포화농도와 저농도를 구하게되는데 우선 적절한 항원농도를 결정하기 위해서 다양한 농도로 항원을 100 ul씩 분주한 후 플레이트를 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 플레이트를 PBST(PBS-0.05% Tween)로 3회 세척한 후 차단 용액(0.5% Casein-PBS) 200 ul씩을 분주하여 37℃ 에서 2시간 동안 반응시키고, 마찬가지로 PBST로 세척하였다. 단클론 항체를 고정 농도로 로딩하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세척과 2차 항체(염소 항-마우스-HRP)를 1/1,000으로 희석하여 처리하고, OPD 기질로 발색하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

항원 농도에 대한 OD 플롯으로부터 항원의 포화 농도(플레이트 I)와 친화도 검정을 위해 저농도(플레이트 II)를 결정하였다. 저농도는 포화 농도의 최소 20배 이하여야 한다.

플레이트 I과 플레이트 II를 상기의 결과에 따라 항원을 코팅하였으며, 처리되는 단클론 항체는 1.5 ug/ml = 10,000 pmol부터 2배로 단계적 희석하여 플레이트 I과 II에 각각 로딩하여 반응시켰다. 이어서, 2차 Ab를 1/1,000으로 희석하여 처리하고 OPD 기질을 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 알고 있는 항체 농도(mol/L)에 대한 포화 상태 항원에서의 흡광도에 대한 표준 곡선을 그리고 추세선식을 얻었다. 결합한 항체의 농도(X)는 표준 곡선의 선형 부분을 이용하여 플레이트 II에서의 흡광도로부터 계산되며, 유리 Ab 농도(d)는 d = B - X로 계산된다. B는 플레이트 II에 첨가된 총 항체의 농도이다. 결합된 Ab 부위(nX)는 X와 n의 결과로 계산되며, 여기서 n은 Ab 역가(valence)로서 Fab 단편은 1, IgG는 2, IgM은 10이다. X/d 비율은 nx에 대해 그려지고, Keq = -a(기울기)/pmol로 계산된다.

nX에 대한 X/d 비율의 플롯에서 Keq와 Kd수치를 계산하였으며, 그 결과가 표 6에 나타나 있다:

연속 희석에 의한 친화도 측정

SJB3-31, SJB3-32, SJB3-33, SJB3-34, SJB-3-39 및 SJA3-86을 연속 희석하여 상기한 ELISA에 의하여 흡광도를 측정함으로써, 각 단클론 항체 간의 AK3에 대한 친화도를 비교하였다(표 7):

Ab dilution factor	SJB3-31	SJB3-32	SJB3-33	SJB3-34	SJB3-39	SJA3-86
1000	1.6575	1.228	1.393	1.372	1.142	1.393
2000	1.672	1.205	1.427	1.393	1.175	1.398
4000	1.7185	1.163	1.345	1.291	1.154	1.252
8000	1.662	1.090	1.248	1.181	1.104	1.034
16000	1.449	0.962	1.123	1.053	0.989	0.732
32000	1.049	0.898	0.927	0.870	0.930	0.321

표 6 및 7에서 나타난 바와 같이, 항체의 희석 배수가 증가하여 단클론 항체의 농도가 감소함에 따라 SJA3-86의 흡광도는 SJB3-31, SJB3-34, SJB3-33, SJB3-32 및 SJB3-39에 비하여 급격히 감소하였으며, SJB3-31, SJB3-34, SJB3-33, SJB3-32 및 SJB3-39는 AK3에 대한 친화도가 SJA3-86보다 약 10배 이상(Kd값에 근거) 높아서 심근경색질환 마커로서의 이용에 보다 적합한 것으로 나타났다.

[실시예 5]

가변 영역의 서열 분석 및 CDR의 결정

하이브리도마 세포로부터 총 RNA의 분리

총 RNA의 분리는 RNeasy Mini Kit(Qiagen: Cat.No.74104)을 사용하여 분리하였다. 실험에 사용되는 모든 플라스틱 수단을 0.1% 디에틸 피로카보네이트-처리된 물(DEPC-dH₂O)를 처리하여 RNase 활성을 저해하였다. 배양된 단클론 항체 생산 하이브리도마 세포들을 수거하고, 5 X 10¹⁰세포당 완충액 RLT 600 ul을 가하고 피펫팅 또는 볼텍싱하여 세포를 분쇄하였다. 혼합물을 19 내지 22 니들(Gauge Needle)을 사용해 25 내지 35회 통과시켜 세포를 완전 분쇄한 다음, 70% 에탄올 600 ul을 첨가하여 피펫팅하여 섞어주었다. 키트에서 주어지는 스핀 컬럼에 혼합물을 600 ul정도 먼저 로딩하고 10,000 rpm 이상으로 25초 동안 원심분리하여 통과물을 버리고 나머지를 반복해서 모두 통과시켰다. 컬럼에 완충액 RW1 700 ul을 가하고 5분동안 인큐베이션한 후 10,000rpm 이상으로 25초 동안 원심분리하고 통과물은 버리고 컬럼을 키트에서 주어지는 새로운 2 ml 수집관으로 옮겼다. 컬럼에 완충액 RFE 500 ul 첨가후 10,000 rpm 이상으로 25초 동안 원심분리하고 다시 완충액 500 ul을 첨가하고, 막 건조를 위해 약 3분 동안 10,000 rpm 이상으로 원심분리하였다. 원심분리후 통과물을 버리고 컬럼을 새로운 1.5 ml 수집관으로 옮긴후 RNase-유리수 50 ul를 막에 직접 투입하여 1분 동안 인큐베이션한 후 용출시켰다. RNA 농도를 Genequant II (pharmarcia biotech)로 측정하였으며, 분리한 RNA를 1% 아가로즈 겔(0.5% TAE)에 1 ul를 전개하여 확인하였다.

총 RNA를 이용한 cDNA 합성

cDNA 합성에 cDNA cycle^TM키트 (Invitrogen)를 사용하였다. PCR 튜브에 상기에서 얻은 SJA3 RNA 400 ng 넣고 반응 용액의 용적이 11.5 ul이 되도록 DEPC-dH₂O를 넣었다. 올리고 dT 프라이머 1 ul를 넣고 잘 섞어 65℃ 수욕에서 10 분 동안, 상온에서 2분 동안 반응시켰다. 여기에 RNase 억제제 1.0 ul, 5 X RT 완충액 4.0 ul, 100 mM dNTPs 1.0 ul, 80 mM 나트륨 피로포스페이트 1.0 ul, AMV 역전사효소 0.5 ul를 가하고 가볍게 두드려 섞은 후, 42℃ 수욕에서 1 시간 동안, 95℃에서 2분 동안 반응시킨 후, 빠르게 얼음에 보관하였다. 1% 아가로즈 겔(0.5% TAE 완충액)에 전개하여 확인하였다.

항체 가변 영역의 증폭(PCR)

항체 가변 영역의 증폭에 DNA Thermal cycler 480(Perkin elmer)을 사용하였다. 항체 유전자의 중쇄와 경쇄를 증폭하기 위해, PCR 튜브를 2개 준비하였다. 하나의 튜브는 중쇄 프라이머 1, 2(Mouse ScFv module)를 각각 1 ul씩 넣었고, 다른 하나는 경쇄 프라이머 혼합물 1 ul를 넣었다. 10X 완충액 6 ul, dNTP 8 ul, 2.에서 얻은 cDNA 1 ug, Taq DNA 폴리머라제(TAKARA) 1 ul를 넣어 최종 용적이 60 ul가 되도록 준비하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 5분 동안 반응시킨 후, 98℃에서 10초 동안, 55℃에서 30초 동안, 72℃에서 40초 동안 1 세트로 30회 반복 반응시키고, 72℃에서 5분 동안 반응시켜 얼음에 보관하였다. 1.5% 아가로즈(0.5% TAE 완충액)에 전개하여 약 350bp 크기의 밴드만을 잘라내고 MIPSpinTM Gel Kit(Genotein)을 이용하여 용출시켰다.

본 실시예에 사용된 중쇄 프라이머와 경쇄 프라이머는 현재까지 밝혀진 마우스 항체의 FR1과 불변 영역의 보존된 서열의 일부를 이용한 프라이머 혼합물(마우스 ScFv 모듈(Product Code 27-9400-01, Amershampharmacia biotech사))이며, Kabat 데이터베이스에 정리된 자료를 바탕으로 제작되었다(http://imm-uno.bme.nwu.edu/).

항체 가변 영역과 pCLTA1의 결합

상기 단계에서 용출된 DNA 7 ul, 10X 완충액, pCLTA1 0.5 ul, T4 DNA 리가제 1 ul(MBI fermentas)를 최종 부피가 20 ul가 되도록 준비하여 16℃에서 밤새 반응시켜 결합시켰다.

형질전환 및 배양

이. 콜라이 JM109 컴피턴드 세포 200 ul와 상기 단계의 결합 혼합물을 섞고 손끝으로 가볍게 두드려 섞어 얼음에서 30분 동안 반응시킨 후, 42℃ 수욕에서 1 분간 열쇽을 주고, 얼음에서 1분 동안 반응시켰다. 튜브에 LB 배지 800 ul를 넣고, 37℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 튜브를 스핀 다운하고 상층액을 제거한 후, LB 배지 100 ul를 튜브에 넣어, LB/Amp+ 플레이트(LB 배지에 Amp를 넣은 플레이트)에 바르고(smearing) 37℃에서 밤새 배양하였다.

가변 영역이 삽입된 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 JM109을 배양하기 위해 상기 준비된 플레이트에서 단일 콜로니를 분리하여 LB/Amp+ 배지(LB 배지에 Amp를 첨가한 것) 10 ml에 씨딩한 후, 37℃에서 250 rpm으로 밤새 배양하였다.

알칼리 분해 방법을 이용한 형질전환체의 확인

알칼리 분해 방법으로 플라스미드를 추출하였다. 1.5 ml 튜브에 상기에서 수득한 배양물 3 ml을 넣고, 상온에서 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 용액 I(50 mM 글루코즈, 25 mM Tris-Cl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0) 100 ul를 넣은 후, 볼텍싱하고 얼음에서 10분 반응시켰다. 튜브에 S용액 II(0.2N NaOH, 1% SDS) 200 ul를 넣고 약 5회 위아래로 돌려 섞은 후 얼음에서 약 10분 동안 반응시키고, 이어서 용액 III(3 M 칼륨 아세테이트, 5M 빙초산)150 ul를 넣고, 약 5회 위아래로 돌려 섞은 후 섞어 얼음에서 약 10분 동안 반응시키고, 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 새 튜브로 상층액을 옮겼다. 동일 용적의 페놀:클로로포름을 넣어 볼텍싱하였다. 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 상온에서 동일 용적의 클로로포름을 넣고 볼텍싱하여 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 2배 용적의 차가운 100% 에틸 알콜을 넣어준 후, 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 DNA 침전시켰다. 상층액을 완전히 제거한 후, 차가운 70% 에틸 알콜 1 ml로 약 5회 위아래로 돌려 펠렛을 섞고, 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 에틸 알콜이 완전히 마르도록 상온에서 약 5분 동안 건조시키고 TER(Tris EDTA pH 8.0/Ribonucliase A) 완충액 20 ul로 용출하여 -20℃에서 보관하였다.

제한효소 처리를 이용한 가변 영역 DNA의 확인

튜브에 가변 영역 DNA 10 ul, 10 X H 완충액 2 ul, Eco RI 제한효소 0.2 ul(TAKARA), Xho I 제한효소 0.2 ul(TAKARA), 3차 증류수 7.6 ul를 넣어 최종 용적을 20 ul로 맞추고, 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 1.5% 아가로즈(0.1% TAE)에 전개하여 확인하였다. 제한효소 절단 양상이 옳게 판정된 가변영역 유전자에 대하여 DNA 염기서열을 Sanger 방법에 의해 분석하였으며, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 DNA 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 내지 40에 나타내었다. 가변영역 서열을 Kabat Numbering Scheme을 이용하여 CDR을 결정하였으며이의 아미노산 서열을 각각 서열번호 41 내지 100에 나타내었다.

[실시예 6]

파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 이용한 에피토프 맵핑

파아지의 마이너 코트 단백질(minor coat protein)인 pIII에 12개의 아미노산이 추가로 발현되도록 유전자 조작을 하여 작성한 재조합 M13mp19의 랜덤 펩타이드 라이브러리(NEB사의 Ph.D.-12^TMPhage display library kit)를 이용하여 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 대한 단클론 항체와 선택적으로 결합하는 고친화도의 파이지를 선별하는 바이오패닝(biopanning)법에 의해 에피토프를 결정하였다. 바이오패닝은 아래와 같은 방법에 의해, 최소 4차 혹은 5차 반복까지 수행하였다.

바이오 패닝

페트리 접시(직경: 35 mm, Falcon)에 0.1 M NaHCO₃(pH8.6) 1 ml에 100 ㎍의 농도가 되게 mAb를 첨가하고 4℃ 에서 습기를 보존한 채 12시간 동안 반응시켰다. 차단 용액을 페트리 접시에 완전히 채운 다음 습기가 보존된 채로 4℃ 에서 2시간동안 진동반응 후에 TBS/Tween (0.1% Tween) 용액으로 충분히 세척하였다. mAb로 코팅된 페트리 접시에 1.5 X 10¹¹pfu/ml의 파아지 10 ㎕를 TBS/Tween (0.1% Tween) 990 ㎕에 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진동 반응시켜 mAb에 친화성을 갖는 파아지가 선택적으로 결합하도록 반응시켰다. 접시를 TBS/Tween (0.1% Tween) 용액으로 10번 세척한 후 분리용출 완충액(0.2M Glycine-HCl, pH2.2) 1 ml을 첨가하고 5분 동안 실온에서 진동 반응시켜 특이적으로 결합된 파이지를 항체로부터 분리시켰다. 용출된 M13mp19 파이지에 1 M Tris-HCl(pH 9.1) 용액 150㎕를 넣어 중화시켰다. 용출된 파이지를 OD₆₀₀0.2정도로 배양된 ER2738 이. 콜라이 20 ml에 접종하여 37℃ 에서 4.5시간 진동 배양한 후, 10,000 rpm, 4℃ 에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 80%를 취한 후, 1/6 용적의 PEG8000/NaCl을 첨가하고, 4℃에서 12시간 동안 방치한 다음, 상층액을 10,000 rpm, 4℃, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물을 취하여 1 ml의 TBS로 현탁 시키고, 14,000 rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 취하여, 1/6 용적의 PEG/NaCl을 첨가한 후, 1시간 동안 얼음에 방치한 다음, 14,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하였으며, 얻어진 침전물을 TBS(0.02% NaN3) 200 ㎕로 현탁하여 1차 바이오패닝을 종료하였다. 이후 동일한 방법으로 각각의 전단계에서 추출한 파아지 용액을 펩타이드 라이브러리의 출발물질로 사용하여 2, 3, 4 및 5차 바이오패닝을 진행하였다. 다만, TBS/Tween (0.5%Tween) 용액의 농도만 1차 바이오패닝 과정보다 고농도로 사용하였다.

DNA 염기서열 결정에 의한 모조(mimetic) 펩타이드의 아미노산 서열 확인

바이오패닝에서 추출한 AK3 특이적 mAb에 의해 선택된 파아지를 고형 한천 플레이트에서 희석 배양하여 플라크를 얻었다. 각각의 플라크를 LB 배지 3 ml에서 증식시켜 PEG 침전법에 의해 단쇄 DNA를 얻었으며, 이를 DNA 서열분석용주형(template) DNA로 사용하였다. 또한, M13mp19 삽입물로부터 96개 염기 다운하부(downstream)에 존재하는 안티-센스쇄와 상보적 염기서열의 올리고뉴클레오타이드인 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'(서열 110)((주)BioNex)을 합성하여 서열분석용 프라이머로 사용하였으며, DNA 염기서열은 Sanger 등의 방법을 이용하여 (주)Macrogen에서 수행하였으며, 표 2에 나타난 모조 펩타이드를 확인하였다. 단클론 항체 SJB3-31, SJB3-34, SJB3-31는 서열번호 102의 아미노산 서열 EHQTREL을 인식하였으며, 단클론 항체 SJB3-33, SJB3-36은 서열번호 103의 아미노산 서열 KSLSRHDH를 인식하였으며, 단클론 항체 SJB3-35는 서열번호 103의 아미노산 서열 KSLSRHDH 및 서열번호 104의 SPMLQLMTLLSR을 인식하였으며, 단클론 항체 SJB3-38은 서열번호 105의 아미노산 서열 GHIHSMRHHRPT 및 서열번호 106의 DNANSSIRSHTY를 인식하였다. 특히, 서열번호 103의 아미노산 서열은 클로닝 과정의 중간 단계의 다른 많은 항체들에서도 매우 강하게 인식되었으며, 사람의 AK3의 아미노산 서열과 비교한 결과 서열번호 107의 아미노산 서열 KSLLVPDH와 상동성이 매우 크며, 이 부분은 구형 단백질인 AK3의 표면에 위치한 부위[Egner, U., and Tomasselli, A.G., Schultz, G.E. (1987) J. Mol. Biol. 195: 649-658]로 항체의 결합이 용이한 에피토프로 결정되었다.

본 발명의 단클론 항체는 AK3에 대해 고도의 특이성과 결합 친화성을 나타내므로 심장질환의 진단 마커로서 사용하기에 보다 적합하여 거짓 음성(falsenegative) 결과로 인한 환자 생명의 위협 및 제조 회사의 의료 소송 위험부담을 획기적으로 감소시킬 수 있다.

<110> KIM, Hyo Joon <120> Monoclonal Antibody Specific for Human Mitochondrial Adenylate Kinase Isozyme3 <150> KR10-2002-0059211 <151> 2002-09-28 <160> 110 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <223> Variable region of SJB3-31 Heavy chain <400> 1 aag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg agg cct ggg gtc tca gtg 48 Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val 1 5 10 15 aag att tcc tgc aag ggt tct ggc tac aca ttc act gat tat gct atg 96 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met 20 25 30 cac tgg gtg aag cag agt cat gca aag agt cta gag tgg att gga att 144 His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Ile 35 40 45 att aat act tac tat ggt aat act agc tac aac cag aag ttc aag ggc 192 Ile Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 50 55 60 aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat atg gaa 240 Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 ctt gcc aga ctg aca tct gag gat tct gcc atc tat tac tgt gca agg 288 Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 aac tat agg tac gat ggt gct atg gac ttc tgg ggc caa ggg acc acg 336 Asn Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met 20 25 30 His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Ile 35 40 45 Ile Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Asn Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <223> Variable region of SJB3-31 Light chain <400> 3 gac att gag ctg acc cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gcg gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cac gtt cca ttc acg ttc ggc tcg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg aag gct 345 Arg Lys Ala 115 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Lys Ala 115 <210> 5 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <223> Variable region of SJB3-32 Heavy chain <400> 5 gag cag ctg cag gag tca gga gct gaa ctg atg aag cct ggg gcc tca 48 Glu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 gtg aag ata tcc tgc aag gct act ggc tac aca ttc agt agc tac tgg 96 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 20 25 30 ata gag tgg gta aag cag agg cct gga cat ggc ctt gag tgg att gga 144 Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 gag att tta cct gga agt ggt agt act gac tac aat gag aag ttc aag 192 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gcc aca ttc act gca gat aca tcc tcc aac aca gcc tac atg 240 Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcc gtc tat tac tgt gca 288 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 agt tct cat tac tac ggt cgt agc cac ggt aac tct tac tac ttt gac 336 Ser Ser His Tyr Tyr Gly Arg Ser His Gly Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 tcc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca acg tct ggt cga 384 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg 115 120 125 cct cga 390 Pro Arg 130 <210> 6 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 20 25 30 Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ser His Tyr Tyr Gly Arg Ser His Gly Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg 115 120 125 Pro Arg 130 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Variable region of SJB3-32 Light chain <400> 7 gaa ttc acc agc ctt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tcc ctg 48 Glu Phe Thr Ser Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 1 5 10 15 tct gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agt gca agt cag 96 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln 20 25 30 ggc att agc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act 144 Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 35 40 45 gtt aaa ctc ctg atc tat tac aca tca agt tta cac tca gga gtc cca 192 Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro 50 55 60 tca agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gat tat tct ctc acc atc 240 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75 80 agc aac ctg gaa cct gaa gat att gcc act tac tat tgt cag cag aat 288 Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn 85 90 95 agt aag ctt cca ttc acg ttc ggc tcg ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Ser Lys Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg acg tct ggt cga cct cga g 358 Arg Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Phe Thr Ser Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln 20 25 30 Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 35 40 45 Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn 85 90 95 Ser Lys Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <223> Variable region of SJB3-33 Heavy chain <400> 9 ctg cag gag tct ggg gga ggc ttt gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa 48 Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys 1 5 10 15 ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt ggc tat gcc ttg tct 96 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Leu Ser 20 25 30 tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg ctg gag tgg gtc gca tcc att 144 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile 35 40 45 agt cgt ggt ggt aac acc tac tat cta gac agt gtg aag ggc cga ttc 192 Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 acc atc tcc aga gat aat gcc agg aac atc ctg tac ctg caa atg agc 240 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser 65 70 75 80 agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt gta aga gaa ggg 288 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly 85 90 95 atc tac tat gat tac gac gtg gga gat tat cat gtt atg gac tac tgg 336 Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Gly Asp Tyr His Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Leu Ser 20 25 30 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile 35 40 45 Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly 85 90 95 Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Gly Asp Tyr His Val Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(312) <223> Variable region of SJB3-33 Light chain <400> 11 gtg ctc acc cag tct cca gca atc atg tcc gca tct cca ggg gag aag 48 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 1 5 10 15 gtc acc ata tcc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg tac tgg 96 Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp 20 25 30 tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat cgc aca 144 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr 35 40 45 tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct 192 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa gat gct 240 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala 65 70 75 80 gcc act tat tac tgc cag cag tat cat agt tac ccg tac acg ttc gga 288 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 ggg ggc acc aag ctg gaa atc aaa 312 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 12 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 1 5 10 15 Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 13 <211> 332 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> Variable region of SJB3-34 Heavy chain <400> 13 ggg gct tca gtg agg ata tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc aca 48 Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 1 5 10 15 aac tac tat ata cac tgg gtg aga cag agg cct gga cag gga ctt gag 96 Asn Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 20 25 30 tgg att gga tgg att tat cct gga att gtt aag act aag tac aat gag 144 Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ile Val Lys Thr Lys Tyr Asn Glu 35 40 45 aag ttc aag gac aag gcc aca ctg act gca gac aga tcc tcc agc aca 192 Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr 50 55 60 gcc tac atg cag ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat 240 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 65 70 75 80 ttc tgt gca agg gga ttt acg acg ggg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 288 Phe Cys Ala Arg Gly Phe Thr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 85 90 95 acc acg gtc acc gtc tcc tca cgt ctg gtc gac ctc gag ggg 330 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Leu Val Asp Leu Glu Gly 100 105 110 gg 332 <210> 14 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 1 5 10 15 Asn Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ile Val Lys Thr Lys Tyr Asn Glu 35 40 45 Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr 50 55 60 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 65 70 75 80 Phe Cys Ala Arg Gly Phe Thr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Leu Val Asp Leu Glu Gly 100 105 110 <210> 15 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <223> Variable region of SJB3-34 Light chain <400> 15 agg tcg acc aga cgt gaa aat gtg ctc acc cag tct cca gct tct ttg 48 Arg Ser Thr Arg Arg Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 1 5 10 15 gct gcg tct cta ggc cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa 96 Ala Ala Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu 20 25 30 agt gtt gat att ttt ggc aat agt ttt atg cac tgg tac caa cag aaa 144 Ser Val Asp Ile Phe Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 cca gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gaa 192 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 50 55 60 tct ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc 240 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe 65 70 75 80 acc ctc acc gtt gat cct gtg gag gct gat gat gct gca acc tat tac 288 Thr Leu Thr Val Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt cag caa aat aat gag gat ccc ata ttc acg ttc aag gct ggt gaa 336 Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Ile Phe Thr Phe Lys Ala Gly Glu 100 105 110 ttc ctg cag ccc ggg 351 Phe Leu Gln Pro Gly 115 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Ser Thr Arg Arg Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu 20 25 30 Ser Val Asp Ile Phe Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 50 55 60 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe 65 70 75 80 Thr Leu Thr Val Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Ile Phe Thr Phe Lys Ala Gly Glu 100 105 110 Phe Leu Gln Pro Gly 115 <210> 17 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> Variable region of SJB3-35 Heavy chain <400> 17 ctg cag gag tca ggg gct gag ctg gtg agg cct ggg gtc tca gtg aag 48 Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys 1 5 10 15 att tcc tgc aag ggt tct ggc tac aca ttc act gat ttt gct atg cac 96 Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Ala Met His 20 25 30 tgg gtg aag cag agt cat gca aat ggt cta gag tgg att gga att att 144 Trp Val Lys Gln Ser His Ala Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile 35 40 45 agt act tac tat ggt gat gct agg tac aac cag aag ttc aag ggc aag 192 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 gcc aca atg act gtt gac aaa tct tcc agc aca gcc tat atg gaa ctt 240 Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 65 70 75 80 gcc aga ctg aca tct gag gat tct ggc atc tat tac tgt gca aga aac 288 Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn 85 90 95 tat agg tac gac ggt gct atg gac tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc 336 Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc tcc tca aag gct ggt gaa ttc 363 Thr Val Ser Ser Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys 1 5 10 15 Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Ala Met His 20 25 30 Trp Val Lys Gln Ser His Ala Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile 35 40 45 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 65 70 75 80 Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn 85 90 95 Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 <210> 19 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <223> Variable region of SJB3-35 Light chain <400> 19 agg tcg acc aga cgt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg 48 Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag 96 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30 agc att gta cat agt tat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag 144 Ser Ile Val His Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln 35 40 45 aaa cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 192 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 50 55 60 ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat 240 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat 288 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca 336 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 aag ttg gaa ata aaa cgg aag gct ggt gaa ttc ctg cag 375 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe Leu Gln 115 120 125 <210> 20 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Ile Val His Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln 35 40 45 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe Leu Gln 115 120 125 <210> 21 <211> 391 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <223> Variable region of SJB3-36 Heavy chain <400> 21 cag ctg cag gag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga ggt tca atg 48 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Met 1 5 10 15 aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac acc atg 96 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met 20 25 30 aac tgg gtg aag cag agc ctt gga aag aac ctt gag tgg att gga ctt 144 Asn Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu 35 40 45 att aat cct tac aat ggt gct att agc tac agc cag aag ttc agg ggc 192 Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ile Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Arg Gly 50 55 60 aag gcc aca tta act gtt gac aag tca tcc agc aca gcc tac atg gag 240 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt aca aga 288 Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 85 90 95 ggg ggg ttt tac tac ggc tac gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa 336 Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca acg tct ggt cga cct cga ggc ggg 384 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg Gly Gly 115 120 125 gcc cgg t 391 Ala Arg 130 <210> 22 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Met 1 5 10 15 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met 20 25 30 Asn Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu 35 40 45 Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ile Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Arg Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 85 90 95 Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg Gly Gly 115 120 125 Ala Arg 130 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Variable region of SJB3-36 Light chain <400> 23 act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga caa cca gcc tcc atg tct 48 Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Met Ser 1 5 10 15 tgc aag tca agt cag agc ctc tta gat agt gat gga aag aca tct ttg 96 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Ser Leu 20 25 30 agt tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct cca cag cgc cta atc tct 144 Ser Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Ser 35 40 45 cag gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt 192 Gln Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 50 55 60 gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag 240 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat ttg gga gtt tat tat tgc tgc cat ttt cct cag acg ttc ggt gga 288 Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly 85 90 95 ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg aag gct ggt gaa 324 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu 100 105 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Met Ser 1 5 10 15 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Ser Leu 20 25 30 Ser Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Ser 35 40 45 Gln Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu 100 105 <210> 25 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <223> Variable region of SJB3-37 Heavy chain <400> 25 gag aag ctg cag gag tca gga cct gag ctg gtg aag cct gga ggt tca 48 Glu Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 atg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac acc 96 Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr 20 25 30 atg aac tgg gtg aag cag agc ctt gga aag aac ctt gag tgg att gga 144 Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 ctt att aat cct tac aat ggt gct att agc tac agc cag aag ttc agg 192 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ile Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Arg 50 55 60 ggc aag gcc aca tta act gtt gac aag tca tcc agc aca gcc tac atg 240 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt aca 288 Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 aga ggg ggg ttt tac tac ggc tac gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 336 Arg Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca acg tct ggt cga cct cga 381 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 120 125 <210> 26 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ile Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Arg 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 120 125 <210> 27 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> Variable region of SJB3-37 Light chain <400> 27 agg tcg acc aga cgt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc act ttg 48 Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu 1 5 10 15 tcg gtt acc att gga caa cca gcc tcc atg tct tgt aag tca agt cag 96 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 agc ctc tta gat agt gat gga aag aca tct ttg agt tgg ttg tta cag 144 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Ser Leu Ser Trp Leu Leu Gln 35 40 45 agg cca ggc cag tct cca cag cgc cta atc tct ctg gtg tct aaa ctg 192 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat 240 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 ttc aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat 288 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 tat tgc tgc cat ttt cct cag acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa 336 Tyr Cys Cys His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 atc aaa cgg aag gct ggt gaa ttc 360 Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Ser Leu Ser Trp Leu Leu Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Cys His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 <210> 29 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> Variable region of SJB3-38 Heavy chain <400> 29 ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ccg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 48 Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Pro Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 gga ttc act ttc agt agc tat gcc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg 96 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 20 25 30 gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac 144 Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr 35 40 45 acc tac tat cca gac agt gtg aag ggt cga ttc acc atc tcc aga gac 192 Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 aat gcc aag aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag 240 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu 65 70 75 80 gac acg gcc atg tat tac tgt gca aga act ggg aac tac ttt gac tac 288 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 85 90 95 tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca aag 324 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Pro Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 20 25 30 Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr 35 40 45 Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 85 90 95 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105 <210> 31 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> Variable region of SJB3-38 Light chain <400> 31 ccc ccc tcg agg tcg acc aga cgt gat gtt ttg atg acc caa act cca 48 Pro Pro Ser Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro 1 5 10 15 ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga 96 Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg 144 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 35 40 45 tac ctg cag aaa cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt 192 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 50 55 60 tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tgg 240 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Trp 65 70 75 80 ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg 288 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85 90 95 gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt cca ttc acg ttc ggc 336 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly 100 105 110 tgg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg aag gct ggt gaa ttc 378 Trp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 125 <210> 32 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Pro Pro Ser Arg Ser Thr Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 50 55 60 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Trp 65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly 100 105 110 Trp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 125 <210> 33 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> Variable region of SJB3-39 Heavy chain <400> 33 gtc caa ctg cag gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc 48 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat gcc 96 Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc gca 144 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 acc att agt agt ggt ggt agt tac acc tac tat cca gac agt gtg aag 192 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggt cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac ctg 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 caa atg agc agt ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt gca 288 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga act ggg aac tac ttt gac tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc 336 Arg Thr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 gtc tcc tca acg tct ggt cga cct cga g 364 Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 120 <210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Thr Ser Gly Arg Pro Arg 115 120 <210> 35 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> Variable region of SJB3-39 Light chain <400> 35 ccc ccc tcg agg tcg agg aga cgt gat gtt ttg atg acc caa act cca 48 Pro Pro Ser Arg Ser Arg Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro 1 5 10 15 ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat gga gcc tcc atc tct tgc aga 96 Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gly Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 tct agc cag agc att gtc cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg 144 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 35 40 45 tac ctg cag aaa cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtc 192 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 50 55 60 tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tgg 240 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Trp 65 70 75 80 ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg 288 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85 90 95 gga gtt tat tac tgc ttt cag ggt tca cat gtg cca ttt acg ttc ggc 336 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly 100 105 110 tgg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg aag gct ggt gaa ttc 378 Trp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 125 <210> 36 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Pro Pro Ser Arg Ser Arg Arg Arg Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gly Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 50 55 60 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Trp 65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly 100 105 110 Trp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ala Gly Glu Phe 115 120 125 <210> 37 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <223> Variable region of SJA3-86 Heavy chain <400> 37 atg gcc cag gtg aag ctg cag gag tca gga cct gag ctg gtg aag cct 48 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 gga gct tca atg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act 96 Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 ggc tac acc atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt gac 144 Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Asp 35 40 45 ttg att gga ctt att aat cct tac aat ggt ggt act agc tac aac cag 192 Leu Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln 50 55 60 aag ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca 240 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat 288 Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 tac tgt gca aga gat tgg cta ctc tat gat tac gac ggc tat gct atg 336 Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Leu Leu Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggc caa 351 Asp Tyr Trp Gly Gln 115 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Asp 35 40 45 Leu Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Leu Leu Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln 115 <210> 39 <211> 297 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(297) <223> Variable region of SJA3-86 Light chain <400> 39 tcc tta tct gcc tct ctg gga gaa aga gtc agt ctc act tgt cgg gca 48 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala 1 5 10 15 agt cag cac att ggt agt agc tta aac tgg ctt cag cag gaa cca gat 96 Ser Gln His Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp 20 25 30 gga act att aaa cgc ctg atc tac gcc aca tcc agt tta gat tct ggt 144 Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly 35 40 45 gtc ccc aaa agg ttc agt ggc agt agg tct ggg tca gat tat tct ctc 192 Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu 50 55 60 acc atc agc agc ctt gag tct gaa gat ttt gta gac tat tac tgt cta 240 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu 65 70 75 80 caa tat gct ggt tct cct ccc acg ttc ggc tcg ggg acc aag ctg gaa 288 Gln Tyr Ala Gly Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 85 90 95 ata aaa cgg 297 Ile Lys Arg <210> 40 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Gln His Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp 20 25 30 Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly 35 40 45 Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu 50 55 60 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Gly Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 85 90 95 Ile Lys Arg <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of SJB3-31 Heavy chain <400> 41 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> CDR2 of SJB3-31 Heavy chain <400> 42 Ile Ile Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly Lys <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR3 of SJB3-31 Heavy chain <400> 43 Asn Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Phe 1 5 10 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of SJB3-31 Light chain <400> 44 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> CDR2 of SJB3-31 Light chain <400> 45 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> CDR3 of SJB3-31 Light chain <400> 46 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of SJB3-32 Heavy chain <400> 47 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> CDR2 of SJB3-32 Heavy chain <400> 48 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly Lys <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> CDR3 of SJB3-32 Heavy chain <400> 49 Ser His Tyr Tyr Gly Arg Ser His Gly Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> CDR1 of SJB3-32 Light chain <400> 50 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> CDR2 of SJB3-32 Light chain <400> 51 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> CDR3 of SJB3-32 Light chain <400> 52 Gln Gln Asn Ser Lys Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of SJB3-33 Heavy chain <400> 53 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> CDR2 of SJB3-33 Heavy chain <400> 54 Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 Arg Phe <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> CDR3 of SJB3-33 Heavy chain <400> 55 Glu Gly Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Gly Asp Tyr His Val Met Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of SJB3-33 Light chain <400> 56 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> CDR2 of SJB3-33 Light chain 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Claims

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기탁번호 KCLRF-BP-00058 내지 KCLRF-BP-00066으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하이브리도마에 의해 생산되고, 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
제3항의 단클론 항체를 포함하는 심장질환마커 검출을 위한 조성물.
제3항의 단클론 항체를 포함하는 심장질환 진단키트.
제3항의 단클론 항체를 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 심장질환마커를 검출하는 방법.
제6항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성을 ELISA로 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 샌드위치 ELISA로 검출하는 방법.
(a) 서열번호 41 내지 46의 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖고 서열번호 102의 에피토프 서열을 인식하는 항체, (b) 서열번호 53 내지 58의 CDR 아미노산 서열을 갖고 서열번호 103의 에피토프 서열을 인식하는 항체, (c) 서열번호 59 내지 64의 CDR 아미노산 서열을 갖고 서열번호 102의 에피토프 서열을 인식하는 항체, (d) 서열번호 65 내지 70의 CDR 서열을 갖고 서열번호 103 또는 104의 에피토프 서열을 인식하는 항체, (e) 서열번호 71 내지 76의 CDR 서열을 갖고 서열번호 103의 에피토프 서열을 인식하는 항체, (f) 서열번호 83 내지 88의 CDR 서열을 갖고 서열번호 105 또는 106의 에피토프 서열을 인식하는 항체 및 (g) 서열번호 89 내지 94의 CDR 서열을 갖고 서열번호 102의 에피토프 서열을 인식하는 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는, 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
제9항의 단클론 항체를 포함하는 심장질환마커 검출을 위한 조성물.
제9항의 단클론 항체를 포함하는 심장질환 진단키트.
제9항의 단클론 항체를 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 심장질환마커를 검출하는 방법.
제12항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성을 ELISA로 검출하는 방법.
제13항에 있어서, 샌드위치 ELISA로 검출하는 방법.
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(a) 서열번호 2 및 4, (b) 서열번호 6 및 8, (c) 서열번호 10 및 12, (d) 서열번호 14 및 16, (e) 서열번호 18 및 20, (f) 서열번호 22 및 24, (g) 서열번호 26 및 28, (h) 서열번호 30 및 32, 및 (i) 서열번호 34 및 36 중에서 선택되는 중쇄와 경쇄의 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 미토콘드리아 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임3에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
제28항의 단클론 항체를 포함하는 심징질환마커 검출을 위한 조성물.
제28항의 단클론 항체를 포함하는 심장질환 진단키트.
제28항의 단클론 항체를 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 심장질환마커를 검출하는 방법.
제31항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성을 ELISA로 검출하는 방법.
제32항에 있어서, 샌드위치 ELISA로 검출하는 방법.