KR102005452B1 - 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 효과적으로 암의 예방 또는 치료가 가능하다.

Description

암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prognosing or treating cancer}

암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

치료용 항체 개발은 현재 매우 활발하게 이루어지고 있다. 이는 기존의 합성 신약으로는 치료가 난이한 분야에 대한 해결책을 제시하고 있으며, 합성 신약을 대체하고 있는 중이다. 현재 16개의 치료용 항체가 시판 중에 있으며, 전세계적으로 약 300여개 이상의 회사에서 7000여종 이상의 항체가 개발 중에 있다. 이러한 항체 제품은 의약품 시장을 지속적으로 성장시키고 있다.

신생 혈관 형성(angiogenesis)은 모든 암 조직 내의 세포 분화에 필수적인 것으로, 신생 혈관 형성 억제를 위해서는 타겟은 이미 알려져 있으나, 단독 치료제는 효율성이 낮아 아직 전무한 상태이며, 또한, 여러 종류의 암에 범용적으로 적용되는 치료제도 아직까지 개발되어 있지 않은 상태이다.

아넥신은 20여년 전부터 리포코르틴, 칼팍틴, 엔도넥신 등으로 불리던 단백질을 10여년 전부터 통일시켜 부르기 시작한 단백질의 이름이다. 아넥신은 칼슘과 포스포리피드(phospholipid)에 결합하며, 엔도넥신-폴드 (endonexin-fold)라고 불리는 'GXGTDE'(서열번호 118) 모티프를 포함하는 약 70개 아미노산 서열이 4번 반복 (8번 반복이 되는 경우도 존재)되는 독특한 보존된 도메인을 갖는다. 종래에 발표된 아넥신들은 상기 보존된 도메인을 포함하고 있으며, 상기 서열의 보존 여부로 아넥신 단백질인지 아닌지를 결정짓는다. 아넥신 단백질은 포유류에서 사상균에 이르기까지 다양한 생명체에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 인간으로부터 아넥신 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ 및 XIII 등이 보고되고 있다. 아넥신 단백질은 뼈의 구조 형성에 관여할 뿐만 아니라 막 트래피킹, 막투과 채널 활성, 포스포리파아제 A2의 억제, 응고 억제, 미토겐 시그널의 전달 및 세포-매트릭스 상호작용 조정 등 다양한 생물학적 현상에 관여하는 것으로 알려져 있다.

관련 기술은 아넥신 A1에 결합하는 항체를 이용한 물질의 전달 방법을 개시하고 있으나, 항체를 이용한 암 치료에 대한 언급은 하고 있지 않다. 다른 관련 기술은 암의 멀티 마커에 대한 저해제를 조합하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있으나, 마커로써 아넥신 A1을 이용한다는 것은 개시되어 있지 않다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 아넥신 A1을 암의 마커로 이용하여 암을 예방하거나 치료하기 위한 조성물이 여전히 요구된다.

일 구체예는 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)의 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 융합 단백질은 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함한다.

용어, "융합 단백질(fusion protein)"은 2 이상의 단백질을 포함하며, 상기 2 이상의 단백질이 그 자체로 화학적으로 결합되거나, 또는 링커를 통하여 결합되어 형성된 단백질 복합체를 의미한다.

상기 융합 단백질이 특이적으로 결합하는 표적 중 하나인 아넥신은 포유류에서 사상균에 이르기까지 다양한 생명체에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 엔도넥신-폴드(endonexin-fold)라고 불리는 'GXGTDE'(서열번호: 118) 모티프를 포함하는 약 70개 아미노산 서열이 4번 반복(8번 반복되는 경우도 있음)되는 독특한 보존된 도메인을 갖는다. 아넥신은 막 트래피킹, 막투과 채널 활성, 포스포리파아제 A2의 억제, 응고 억제, 미토겐 시그널의 전달 및 세포-매트릭스 상호작용 조정 등 다양한 생물학적 현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 아넥신 A1은 아넥신의 서브패밀리로, 리포코르틴 I으로도 알려져 있다. 예를 들어, 아넥신 A1은 ANXA1 유전자에 의해 암호화될 수 있다. ANXA1은 Ca^{2 +} 의존적 포스포리피드-결합 단백질인 아넥신 패밀리에 속하고 세포막의 세포질 측면에 위치할 수 있다. 아넥신 A1 단백질은 포스포리파제 A2 저해 활성을 갖는, 분자량이 약 40 KDa일 수 있다. 또한, 아넥신 A1은 정상 세포에서는 세포 내에 위치하다가 암의 생성에 대한 결과로 세포 외막으로 이동하는 특징을 가지고 있기 때문에, 암의 마커로써 사용될 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질에서 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 부위는 상기 폴리펩티드를 매개로 하여 암 세포의 표면에 존재하는 아넥신 A1에 특이적으로 결합할 수 있다.

용어, "특이적으로 결합(specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 2 이상의 폴리펩티드 또는 단백질 사이에서 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 분자간에 특이적인 상호 작용을 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항원 및 항체가 특이적으로 상호 작용하여 면역학적 반응을 하는 것이 이에 포함될 수 있다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 예를 들어, 4 내지 200개, 4 내지 100개, 또는 4 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는 것일 수 있다. 4개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 아넥신 A1에 낮은 결합 친화도를 가질 수 있다. 200개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 아넥신 A1에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어, 유전자 클로닝 방법 및 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같이 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 상업적으로 구입 가능한 폴리펩티드 라이브러리(예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리, 박테리오파지 M13-폴리펩티드 라이브러리 등)를 통해 실험적으로 획득할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 전장(full length) 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

전장 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)일 수 있다. 비-인간, 예를 들어, 마우스의 인간화 항체는 마우스의 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린의 쇄 또는 그의 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 기타 항원-결합 서브서열일 수 있다.

비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 필수적으로 설치류 동물의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체에 상응하는 서열 대신 치환시켜 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메릭 항체이며, 실질적으로 온전한 인간 항체의 가변 영역보다 적은 영역이 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(framework, FR) 잔기가 설치류 동물의 항체에 있는 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간화 항체일 수 있다.

상기 인간 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변영역의 서열이 인간으로부터 유래한 항체를 의미하며, 인간 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업자에게 널리 알려진 다양한 기술, 예를 들어, 유전적 재조합 기술과 세포공학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.

상기 인간 항체는 이펙터 부분이 인간 면역계의 다른 부분과 더욱 양호하게 상호작용할 수 있고, 인간 면역계가 인간 항체를 외부 물질로 인식하지 않아서 생체 내로 유입된 항체에 대한 면역 반응이 전체 외래 비-인간 항체 또는 부분 외래 키메라 항체 등에 비하여 덜 할 수 있다. 또한, 생체 내로 유입된 인간 항체는 자연 발생 인간 항체와 실질적으로 동일한 반감기를 가지므로 투여되는 복용량과 회수를 줄일 수 있다. 한편, 용어 "키메릭(chimeric)"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2 개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.

또한, 용어, "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')₂, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

일반식 I

X₁-Trp-Gly-His-X₂- X₃- Trp(서열번호 119)

상기 X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X₃는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 서열번호 9 내지 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 것일 수 있다. 이들은 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 아미노산 서열일 수 있다. 이들은 X₁-Trp-Gly-His-X₂- X₃- Trp(서열번호 119)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 아닐 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 상기 세포 독성 림프구의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 표면 마커는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD28, CD56, CD57 및 TCR로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 세포 독성 림프구의 표면 마커에 결합하는 폴리펩티드는 서열번호 116 또는 서열번호 117의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 서열번호 116은 마우스의 항-CD3의 V_H 및 V_L을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열이며, 서열번호 117은 인간의 항-CD3의 V_H 및 V_L을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

일 구체예에 따르면, 상기 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 전장 항체 또는 항원 결합 단편인 것일 수 있다. 전장 항체 또는 항원 결합 단편에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 아넥신 A1 또는 세포 독성 림프구의 표면 마커를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, Arg, Lys과 His은 모두 양전하를 띤 잔기이고, Ala, Gly과 Ser은 유사한 크기를 가지며, Phe, Trp과 Tyr은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, Arg, Lys과 His; Ala, Gly과 Ser; 및 Phe, Trp과 Tyr은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 아넥신 A1 또는 세포 독성 림프구의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 통해, 인터넷 상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 융합 단백질은 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 세포 독성 림프구의 활성을 유도하는 폴리펩티드를 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다.

상기 융합 단백질은 링커, 예를 들어, 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 세포 독성 림프구의 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 충분한 거리로 이격시켜 각각의 단백질이 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되도록 할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Gly₄-Ser(서열번호 120), (Gly₄-Ser)₃(서열번호 121) 또는 Gly₄-Ser-Gly₅-Ser(서열번호 122)일 수 있다. 상기 링커는 상기 융합 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 불필요하거나, 또는 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

또한, 펩티드 링커는 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결될 수 있다. 특히, 상기 펩티드 링커가 상기 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 모두 연결되어 있는 경우, 상기 펩티드 링커는 각각 시스테인을 포함할 수 있으며, 각각의 시스테인 사이에 이황화결합이 일어나 상기 2개의 시스테인 사이에 상기 폴리펩티드가 존재할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물을 암의 예방 또는 치료를 위한 것으로, 상기 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 예를 들면, 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있으므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 F(ab')₂ 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

다른 양상은 약학적 유효량의 아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)의 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동물의 암 치료 방법을 제공한다.

상기 암 치료 방법에 사용되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 한편, 상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

다른 양상은 아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)의 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 상기 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

형질 전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환된 세포를 YT 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음, 세포 밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 IPTG를 배지에 첨가하여 lacZ 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고 배양함으로써, 세포 내 또는 배지로 분비된 단백질을 얻을 수 있다.

세포 내 또는 배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화(solubility fractionation), 크기 분별 여과 및 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합된 레진 칼럼, 6x His에 융합된 경우에는 Ni^{2 +}-NTA His-결합 레진 칼럼을 이용하여 원하는 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.

일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 효과적으로 암의 예방 또는 치료가 가능하다.

도 1은 일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질이 암 세포에 작용하는 예를 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터에 삽입되는 NdeI-XhoI 절편의 모식도이다.
도 3은 일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 항-CD3를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질의 정제 결과를 나타내는 사진이다. 각 레인에서 L은 loading, FT는 flow-through, W는 washing, 숫자는 이미다졸의 몰농도(mM)를 의미한다.
도 4는 분리된 아넥신 A1-양성/음성 세포에 대한 AA1BPxCD3-활성화된 T 세포의 효과를 나타낸다. PMBC로부터 생성된 세포독성 T세포 클론을 표적 세포(Ramos, SNU-1, SNU-2)와 혼합하고, 10:1의 이펙터 대 표적세포 (E:T) 비율에서 표시된 농도의 AA1BPxCD3로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 특이적인 표적 세포 용해는 %로 나타내었으며, 3회 수행하여 평균값을 구하였다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 일 구체예에 따른 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질(140)이 암세포(120)에 작용하는 예를 나타낸 것으로, 상기 융합 단백질(140)은 암세포(120)의 표면에 존재하는 아넥신 A1(130) 및 세포 독성 림프구(100)의 표면에 존재하는 표면 마커(110) 양쪽에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 암세포(120)의 주변에 세포 독성 림프구(100)를 위치하도록 하여 세포 독성 림프구가 분비하는 세포 독성 과립(cytotoxic granule)을 통해 정상세포에 영향을 주지 않고 암세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다.

실시예 1: 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 스크리닝

(1) 바이오 패닝

아넥신 A1((주)제노텍에 의뢰하여 합성)를 플레이트에 고정시킨 다음, 파지 디스플레이 폴리펩티드 라이브러리(Dyax)를 첨가하여 결합시키고, 다양한 결합 시간 및 세척 조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드 발현 파지를 선별하였다.

패닝은 비드 패닝 방법을 사용하였다. 구체적으로, 스트렙트아비딘이 표면에 고정된 마그네틱 비드와 비오틴을 결합시킨 아넥신 A1를 혼합한 다음, 4℃에서 18 시간 동안 교반시켜 상기 단백질을 비드 표면에 고정하였다. 상기 단백질이 고정화된 마그네틱 비드를 탈지유(skim milk)로 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 상기 비드의 표면에 폴리펩티드를 디스플레이하고 있는 파지 용액을 넣어 주었다. 상기 결과물을 2시간 동안 교반시키면서 반응시키고, PBS 용액 (1.06 mM KH₂PO₄, 155.17 mM NaCl, 2.97 mM Na₂HPO₄-7H₂O)및 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액을 이용하여 세척한 후, 상기 항원과 결합한 파지만을 분리하였다. 상기 패닝 과정은 패닝 후 얻어진 파지 수에 따라 2회 또는 3회까지 진행하였다.

(2) 파지 ELISA 및 아넥신 A1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열 확인

상기 패닝 과정에서 얻어진 파지 클론들을 E. coli XL1-Blue에 각각 감염시킨 후, 37℃에서 14 시간 동안 배양하여 파지 용액을 얻었다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 아넥신 A1을 첨가한 다음, 4℃에서 18시간 동안 두어 상기 단백질을 플레이트 표면에 고정하였다. 상기 단백질이 고정된 플레이트를 탈지유로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 후, 100 ㎕의 파지 용액을 첨가하였다. 2 시간 동안 파지와 단백질을 상온에서 반응시키고, 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액을 이용하여 세척하였다. 이후, 파지에 특이적으로 반응하는 HRP가 컨쥬게이트된 항-M13 항체(GE Healthcare)를 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액으로 2회 세척하였다. 마지막으로 상기 플레이트 각 웰에 100 ㎕의 트리메틸벤지딘(trimethylbenzidine, TMB) 기질(Sigma)을 첨가하여 발색 반응을 유도시켰으며, 이후, 5 N의 H₂SO₄ 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD₄₅₀ 값을 플레이트 리더(Molecular Devices)로 측정하였다. 그 결과, 총 42개의 파지 클론이 아넥신 A1과 높은 반응성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 파지들의 단일 클론들로부터 상기 아넥신 A1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열을 확인하기 위한 프라이머 세트(TN-forward primer 및 TN-reverse primer; 서열번호 114 및 서열번호 115)를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분; 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 연속 반응을 30회 반복; 72℃에서 10분; 4℃로 냉각. 이후, 상기 반응으로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드 절편의 세정 및 염기 서열 분석(솔젠트)을 수행하였으며, 이로부터 상기 아넥신 A1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열을 확인하였다(표 1). 하기 표 1은 상기 파지에 디스플레이된 폴리펩티드에서 펩티드 링커 부분을 제외한 부분, 즉, 아넥신 A1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 아미노산 서열 및 그로부터 유추된 염기 서열을 나타낸다.

번호	아미노산 서열	염기 서열
1	QWGHTLW(서열번호 1)	cagtggggccataccctgtgg(서열번호 43)
2	KWGHEVW(서열번호 2)	aaatggggccatgaagtgtgg(서열번호 44)
3	WWGHEQW(서열번호 3)	tggtggggccatgaacagtgg(서열번호 45)
4	PWGHEIW(서열번호 4)	ccgtggggccatgaaatttgg(서열번호 46)
5	LWGHHIW(서열번호 5)	ctgtggggccatcatatttgg(서열번호 47)
6	LWGHQIW(서열번호 6)	ctgtggggccatcagatttgg(서열번호 48)
7	LWGHGMW(서열번호 7)	ctgtggggccatggcatgtgg(서열번호 49)
8	AWGHPFW(서열번호 8)	gcgtggggccatccgttttgg(서열번호 50)
9	MNRV(서열번호 9)	atgaaccgcgtg(서열번호 51)
10	SLNSIL(서열번호 10)	agcctgaacagcattctg(서열번호 52)
11	NLNAWF(서열번호 11)	aacctgaacgcgtggttt(서열번호 53)
12	VEWPWW(서열번호 12)	gtggaatggccgtggtgg(서열번호 54)
13	WLWPRL(서열번호 13)	tggctgtggccgcgcctg(서열번호 55)
14	IDYGLF(서열번호 14)	attgattatggcctgttt(서열번호 56)
15	VEGQQWW(서열번호 15)	gtggaaggccagcagtggtgg(서열번호 57)
16	WMGHSAW(서열번호 16)	tggatgggccatagcgcgtgg(서열번호 58)
17	GIHHPIW(서열번호 17)	ggcattcatcatccgatttgg(서열번호 59)
18	WGGHPIW(서열번호 18)	tggggcggccatccgatttgg(서열번호 60)
19	PWAKIFW(서열번호 19)	ccgtgggcgaaaattttttgg(서열번호 61)
20	MGSKMWG(서열번호 20)	atgggcagcaaaatgtggggc(서열번호 62)
21	MLWEDQD(서열번호 21)	atgctgtgggaagatcaggat(서열번호 63)
22	ELFDGYD(서열번호 22)	gaactgtttgatggctatgat(서열번호 64)
23	WPWEANH(서열번호 23)	tggccgtgggaagcgaaccat(서열번호 65)
24	EQYGFPF(서열번호 24)	gaacagtatggctttccgttt(서열번호 66)
25	SGFGHMIW(서열번호 25)	agcggctttggccatatgatttgg(서열번호 67)
26	ETRFHAIW(서열번호 26)	gaaacccgctttcatgcgatttgg(서열번호 68)
27	MLHHHQRE(서열번호 27)	atgctgcatcatcatcagcgcgaa(서열번호 69)
28	ALHNEPHT(서열번호 28)	gcgctgcataacgaaccgcatacc(서열번호 70)
29	AFHNDPAE(서열번호 29)	gcgtttcataacgatccggcggaa(서열번호 71)
30	LLFSDIGN(서열번호 30)	ctgctgtttagcgatattggcaac(서열번호 72)
31	LVLKGKWH(서열번호 31)	ctggtgctgaaaggcaaatggcat(서열번호 73)
32	SGNGKPFWM(서열번호 32)	agcggcaacggcaaaccgttttggatg(서열번호 74)
33	IQRGGVDWS(서열번호 33)	attcagcgcggcggcgtggattggagc(서열번호 75)
34	RDSQSWSWS(서열번호 34)	cgcgatagccagagctggagctggagc(서열번호 76)
35	LLESQNPQD(서열번호 35)	ctgctggaaagccagaacccgcaggat(서열번호 77)
36	IINGWNPIW(서열번호 36)	attattaacggctggaacccgatttgg(서열번호 78)
37	DWTTAYGPS(서열번호 37)	gattggaccaccgcgtatggcccgagc(서열번호 79)
38	IYDGNWSYWH(서열번호 38)	atttatgatggcaactggagctattggcat(서열번호 80)
39	STDSNWFFNA(서열번호 39)	agcaccgatagcaactggttttttaacgcg(서열번호 81)
40	MPENWISWYR(서열번호 40)	atgccggaaaactggattagctggtatcgc(서열번호 82)
41	VRTDWYSMLM(서열번호 41)	gtgcgcaccgattggtatagcatgctgatg(서열번호 83)
42	MIQTSSANRD(서열번호 42)	atgattcagaccagcagcgcgaaccgcgat(서열번호 84)

실시예 2: 항- CD3 및 아넥신 A1 결합 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질의 발현 벡터 제조

본 실시예에서는 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드의 한 종류인 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD3 폴리펩티드 및 상기 실시예 1에서 제조된 아넥신 A1 결합 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터를 제조하였다. 도 2에 표시한 바와 같은 구조를 포함하는 NheI-XhoI 절편을 (주)제노텍에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 합성된 NheI-XhoI 절편을 NheI 및 XhoI으로 절단한 다음, 상기와 동일한 제한 효소로 절단한 pET21b(Promega)에 삽입하여 발현 벡터를 완성하였다. 상기 NheI-XhoI 절편은 항-CD3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 2종(마우스 또는 인간) 및 아넥신 A1 결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 8종(서열번호 8, 서열번호 5, 서열번호 21, 서열번호 19, 서열번호 4, 서열번호 1, 서열번호 15, 서열번호 16의 순서)을 조합하여 총 16가지로 제작되었다. 상기 각각의 NheI-XhoI 절편을 서열번호 85 내지 서열번호 100에 나타내었다. 상기 각 절편으로부터 생산되는 융합 단백질의 이름을 M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7 및 H8이라 명명하였다.

또한, 발현되는 융합 단백질의 용해도(solubility)를 향상시키기 위하여, 상기 발현 벡터를 이용하여 상기 융합 단백질에 유비퀴틴이 결합된 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다. 유비퀴틴은 도 2에 나타낸 NheI-XhoI 절편에서 pelB 및 FLAG 사이에 위치하도록 하였다. 유비퀴틴이 결합된 상기 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터의 제작 방법은 다음과 같다.

먼저, 상기 제작된 발현 벡터를 주형으로 하고, NdeI으로 절단 가능한 링커를 포함하고, pelB의 5' 부분을 포함하도록 제작한 정방향 프라이머(5'-cgccatatgaaatacctgctgccgaccgctg-3' (pelB:NdeI-F; 서열번호 101)) 및 BamHI으로 절단 가능한 링커를 포함하고, pelB의 3' 부분을 포함하도록 제작한 역방향 프라이머(5'-cccggatccggccatggccggctggg-3' (pelB-NcoI:BamHI-R; 서열번호 102))를 사용하여 PCR을 수행하고, 수득한 PCR 산물을 NdeI 및 BamHI으로 절단한 다음, 정제하여 NdeI-BamHI 절편을 얻었다.

이후, pET21b 벡터의 BamHI과 EcoRI 절단 위치 사이에 유비퀴틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 103)를 포함하고 있는 벡터를 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, 정제한 다음, 상기 NdeI-BamHI 절편을 결합(ligation)시켰다. 상기 결합 산물은 시퀀싱을 의뢰하여 염기 서열을 확인하였다.

이후, FLAG-VH-링커-VL-(GGGGS)링커-아넥신 A1 결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 절편은 상기 제작된 발현 벡터 16종을 각각 주형으로 하고, 하기 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 정방향 프라이머는 EcoRI으로 절단 가능한 링커를 포함하고, 마우스의 VH에 해당하는 부분과 인간의 VH에 해당하는 부분을 각각 다르게 사용하였으며, 역방향 프라이머는 XhoI으로 절단 가능한 링커를 포함하고, 아넥신 A1 결합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부를 포함하도록 제작하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:

정방향 프라이머

5'-ccggaattcgactacaaagatgatgacgataaggatatcaaac-3' (Flag-mouse_a-CD3:EcoRI-F)(서열번호 104)

5'-ccggaattcgactacaaagatgatgacgataaggagctg-3' (Flag-human_a-CD3:EcoRI-F)(서열번호 105)

역방향 프라이머

5'-ccgctcgaggcaccaaaacggatgg-3' (pep1:XhoI-R)(서열번호 106)

5'-ccgctcgaggcaccaaatatgatggcc-3' (pep2:XhoI-R)(서열번호 107)

5'-ccgctcgaggcaatcctgatcttcccac-3' (pep3:XhoI-R)(서열번호 108)

5'-ccgctcgaggcaccaaaaaattttcgc-3' (pep4:XhoI-R) (서열번호 109)

5'-ccgctcgaggcaccaaatttcatgacc-3' (pep5:XhoI-R) (서열번호 110)

5'-ccgctcgaggcaccacagggtatgacc-3' (pep6:XhoI-R) (서열번호 111)

5'-ccgctcgaggcaccaccactgctgg-3' (pep7:XhoI-R) (서열번호 112)

5'-ccgctcgaggcaccacgcggaatg-3' (pep8:XhoI-R) (서열번호 113)

이후, 상기 얻어진 PCR 산물들은 EcoRI 및 XhoI으로 절단시킨 후 정제하고, 상기 제작된 결합 산물 또한 EcoRI 및 XhoI으로 절단시킨 후 정제하여, 상기 정제된 산물들을 서로 결합(ligation)시켰다. 결합된 산물을 시퀀싱을 의뢰하여 염기 서열을 확인하였다. 한편, 상기 융합 단백질에 유비퀴틴이 결합된 단백질 16종의 이름을 Ub-M1, Ub-M2, Ub-M3, Ub-M4, Ub-M5, Ub-M6, Ub-M7, Ub-M8, Ub-H1, Ub-H2, Ub-H3, Ub-H4, Ub-H5, Ub-H6, Ub-H7 및 Ub-H8이라 명명하였다.

실시예 3: 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 제조한 벡터를 이용하여 융합 단백질을 과발현시키기 위해, 상기 벡터(유비퀴틴이 결합된 융합 단백질을 코딩하는 벡터)로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다. 이때, 배양액으로 YT 배지를 사용하였으며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.1 mM의 IPTG를 넣고 18 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(13,000 rpm)를 이용하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni^{2 +}-NTA superflow 칼럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1M NaCl)로 세척한 다음, 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM 이미다졸)로 상기 융합 단백질을 용출하였다. 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 상기 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM 이미다졸)로 평형화된 Q 칼럼 (Amersham Biosciences)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 세척한 다음, 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl)으로 상기 단백질을 용출하였다. 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 투석 방법을 이용해 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.

도 3은 SDS-PAGE의 결과에서 보는 바와 같이, 약 30 kDa의 융합 단백질(Ub-H2(서열번호 5를 포함하는 융합 단백질))이 정제되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 세포 배양, 세포주 및 T-세포 분리

인간 버킷림프 세포주(human Burkitt's lymphoma cell)인 Ramos(ATCC CRL-1596) 및 위암세포주 SNU1, SNU5 (ATCC CRL-5971, ATCC CRL-5973)를 American Type Culture Collection 으로부터 구입하였다. 상기 세포주는 공급자의 프로토콜에 따라 배양하였다. 혈액은행으로부터 공급받은 혈액으로부터 Ficoll-Paque 밀도구배 원심분리에 의해 말초혈액단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하였다. 이후, 상온에서 15분 동안 RBC 용해 버퍼(155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, and 0.1 mM EDTA)에 인큐베이션 하여 적혈구 세포(RBC)를 제거하고, 5분 동안 600 g에서 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상층액을 제거하고, 남은 세포를 PBS에 현탁하였다. 이후, 15분 동안 110 g에서 원심분리하여 다량의 혈소판을 제거하였다. PBMC를 배양 배지에 재현탁하고, 자극(stimulation)없이 준비 후 4일째 되는 날 사용하였다. CD8+ T 세포는 Human CD8 Subset Column kit (R&D Systems, Wiesbaden, Germany)를 사용하여 분리하였다.

실시예 5: 세포 독성 어세이

AA1BPxCD3의 세포독성 활성을 측정하기 위해 칼세인(calcein) AM 분비 어세이 방법을 사용하였다. 세포독성은 3시간 후에 확인하였다. Ramos, SNU-5 또는 SNU-1 세포 (1.5x10⁷ 개)를 세포 배양 배지 내에서 37℃에서 30분 동안 10 mM의 칼세인 AM (Molecular Probes)으로 라벨링하였다. 세포 배양 배지로 3회 세척한 다음, 세포 밀도를 RPMI 1640/10% FCS로 3x10⁵ 개 세포/ml가 되도록 맞추고, 3x10⁴ 개의 세포로 100 ㎕씩 어세이 반응에 사용하였다. 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서, 표시된 AA1BPxCD3 농도에서 3회 CD8+ T 세포 및 표적 세포를 동시배양하였다. 10:1의 E:T 비율을 위해, 표적 세포의 숫자를 웰당 3 x10⁴ 개의 세포가 되도록 유지시켰다. AA1BPxCD3를 원하는 온도에 따라 RPMI 1640/10% FCS에 희석시켰다. 총 반응 부피를 200 ㎕로 하여 3시간 동안 인큐베이션하였다. 용해된 세포로부터 분비되는 형광 칼세인을 형광 리더기(2104 EnVision® Multilabel Reader, USA)로 측정하였다. 대조군 형광 칼세인은 이펙터(effector) 및 AA1BPxCD3이 없는 표적 세포를 인큐베이션하여 결정하였다. 총 세포 용해를 결정하기 위해, 이펙터와 AA1BPxCD3이 없는 표지된 표적 세포의 혼합물을 1% 사포닌 20 ㎕를 첨가하여 10분 동안 용해시켰다. 특이적인 세포독성은 하기 식에 따라 계산하였다:

% 특이적 용해(specific lysis) = [(시료의 형광 - 대조군의 형광)/(총 용해물의 형광 - 대조군의 형광)] x 100

100: 세포 독성 림프구
110: 표면 마커
120: 암세포
130: 아넥신 A1
140: 융합 단백질

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Pharmaceutical composition for prognosing or treating cancer <130> PN090953 <150> KR2011-0073635 <151> 2011-07-25 <160> 122 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 1 Gln Trp Gly His Thr Leu Trp 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 2 Lys Trp Gly His Glu Val Trp 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 3 Trp Trp Gly His Glu Gln Trp 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 4 Pro Trp Gly His Glu Ile Trp 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 5 Leu Trp Gly His His Ile Trp 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 6 Leu Trp Gly His Gln Ile Trp 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 7 Leu Trp Gly His Gly Met Trp 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 8 Ala Trp Gly His Pro Phe Trp 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 9 Met Asn Arg Val 1 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 10 Ser Leu Asn Ser Ile Leu 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 11 Asn Leu Asn Ala Trp Phe 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 12 Val Glu Trp Pro Trp Trp 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 13 Trp Leu Trp Pro Arg Leu 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 14 Ile Asp Tyr Gly Leu Phe 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 15 Val Glu Gly Gln Gln Trp Trp 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 16 Trp Met Gly His Ser Ala Trp 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 17 Gly Ile His His Pro Ile Trp 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 18 Trp Gly Gly His Pro Ile Trp 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 19 Pro Trp Ala Lys Ile Phe Trp 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 20 Met Gly Ser Lys Met Trp Gly 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 21 Met Leu Trp Glu Asp Gln Asp 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 22 Glu Leu Phe Asp Gly Tyr Asp 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 23 Trp Pro Trp Glu Ala Asn His 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 24 Glu Gln Tyr Gly Phe Pro Phe 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 25 Ser Gly Phe Gly His Met Ile Trp 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 26 Glu Thr Arg Phe His Ala Ile Trp 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 27 Met Leu His His His Gln Arg Glu 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 28 Ala Leu His Asn Glu Pro His Thr 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 29 Ala Phe His Asn Asp Pro Ala Glu 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 30 Leu Leu Phe Ser Asp Ile Gly Asn 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 31 Leu Val Leu Lys Gly Lys Trp His 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 32 Ser Gly Asn Gly Lys Pro Phe Trp Met 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 33 Ile Gln Arg Gly Gly Val Asp Trp Ser 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 34 Arg Asp Ser Gln Ser Trp Ser Trp Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 35 Leu Leu Glu Ser Gln Asn Pro Gln Asp 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 36 Ile Ile Asn Gly Trp Asn Pro Ile Trp 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 37 Asp Trp Thr Thr Ala Tyr Gly Pro Ser 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 38 Ile Tyr Asp Gly Asn Trp Ser Tyr Trp His 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 39 Ser Thr Asp Ser Asn Trp Phe Phe Asn Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 40 Met Pro Glu Asn Trp Ile Ser Trp Tyr Arg 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 41 Val Arg Thr Asp Trp Tyr Ser Met Leu Met 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 42 Met Ile Gln Thr Ser Ser Ala Asn Arg Asp 1 5 10 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 43 cagtggggcc ataccctgtg g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 44 aaatggggcc atgaagtgtg g 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 45 tggtggggcc atgaacagtg g 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 46 ccgtggggcc atgaaatttg g 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 47 ctgtggggcc atcatatttg g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 48 ctgtggggcc atcagatttg g 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 49 ctgtggggcc atggcatgtg g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 50 gcgtggggcc atccgttttg g 21 <210> 51 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 51 atgaaccgcg tg 12 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 52 agcctgaaca gcattctg 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 53 aacctgaacg cgtggttt 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 54 gtggaatggc cgtggtgg 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 55 tggctgtggc cgcgcctg 18 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 56 attgattatg gcctgttt 18 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 57 gtggaaggcc agcagtggtg g 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 58 tggatgggcc atagcgcgtg g 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 59 ggcattcatc atccgatttg g 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 60 tggggcggcc atccgatttg g 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 61 ccgtgggcga aaattttttg g 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 62 atgggcagca aaatgtgggg c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 63 atgctgtggg aagatcagga t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 64 gaactgtttg atggctatga t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 65 tggccgtggg aagcgaacca t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 66 gaacagtatg gctttccgtt t 21 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 67 agcggctttg gccatatgat ttgg 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 68 gaaacccgct ttcatgcgat ttgg 24 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 69 atgctgcatc atcatcagcg cgaa 24 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 70 gcgctgcata acgaaccgca tacc 24 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 71 gcgtttcata acgatccggc ggaa 24 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 72 ctgctgttta gcgatattgg caac 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 73 ctggtgctga aaggcaaatg gcat 24 <210> 74 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 74 agcggcaacg gcaaaccgtt ttggatg 27 <210> 75 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 75 attcagcgcg gcggcgtgga ttggagc 27 <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 76 cgcgatagcc agagctggag ctggagc 27 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 77 ctgctggaaa gccagaaccc gcaggat 27 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 78 attattaacg gctggaaccc gatttgg 27 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 79 gattggacca ccgcgtatgg cccgagc 27 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 80 atttatgatg gcaactggag ctattggcat 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 81 agcaccgata gcaactggtt ttttaacgcg 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 82 atgccggaaa actggattag ctggtatcgc 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 83 gtgcgcaccg attggtatag catgctgatg 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide binding specifically to Annexin A1 <400> 84 atgattcaga ccagcagcgc gaaccgcgat 30 <210> 85 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and AWGHPFW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence AWGHPFW <400> 85 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcgcgtggg gccatccgtt ttggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 86 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and LWGHHIW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence LWGHHIW <400> 86 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcctgtggg gccatcatat ttggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 87 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and MLWEDQD <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence MLWEDQD <400> 87 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcatgctgt gggaagatca ggattgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 88 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and PWAKIFW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence PWAKIFW <400> 88 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcccgtggg cgaaaatttt ttggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 89 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and PWGHEIW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence PWGHEIW <400> 89 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcccgtggg gtcatgaaat ttggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 90 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and QWGHTLW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence QWGHTLW <400> 90 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgccagtggg gtcataccct gtggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 91 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and VEGQQWW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence VEGQQWW <400> 91 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgcgtggaag gccagcagtg gtggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 92 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including mouse anti-CD3 and WMGHSAW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(454) <223> mouse anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (455)..(508) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (509)..(826) <223> mouse anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (827)..(841) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (842)..(868) <223> peptide sequence WMGHSAW <400> 92 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggata tcaaactgca gcagtcaggg 120 gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 180 tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 240 ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 300 acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 360 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 420 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 480 ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 540 tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 600 atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 660 aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 720 ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 780 agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 840 tgctggatgg gccattccgc gtggtgcctc gagcaccacc accaccacca ctga 894 <210> 93 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and AWGHPFW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence AWGHPFW <400> 93 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgcgc gtggggccat ccgttttggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 94 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and LWGHHIW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence LWGHHIW <400> 94 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgcct gtggggccat catatttggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 95 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and MLWEDQD <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence MLWEDQD <400> 95 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgcat gctgtgggaa gatcaggatt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 96 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and PWAKIFW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence PWAKIFW <400> 96 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgccc gtgggcgaaa attttttggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 97 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and PWGHEIW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence PWGHEIW <400> 97 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgccc gtggggtcat gaaatttggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 98 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and QWGHTLW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence QWGHTLW <400> 98 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgcca gtggggtcat accctgtggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 99 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and VEGQQWW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence VEGQQWW <400> 99 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgcgt ggaaggccag cagtggtggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 100 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding fusion protein including human anti-CD3 and WMGHSAW <220> <221> misc_feature <222> (11)..(73) <223> pelB: periplasmic signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (74)..(97) <223> FLAG <220> <221> misc_feature <222> (98)..(475) <223> human anti-CD3 VH <220> <221> misc_feature <222> (476)..(520) <223> Linker between VH and VL <220> <221> misc_feature <222> (521)..(841) <223> human anti-CD3 VL <220> <221> misc_feature <222> (842)..(856) <223> (GGGGS) linker <220> <221> misc_feature <222> (857)..(883) <223> peptide sequence WMGHSAW <400> 100 atggctagca aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag 60 ccggcgatgg ccgactacaa agatgatgac gataaggagc tgcagctggt cgagtggggc 120 gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc 180 ttcagtggtt actactggag ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt 240 ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc 300 atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg 360 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc cgaggccgat ttttggggtg gttattaggg 420 ggctccaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 480 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacccagtct 540 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag 600 ggcattagca attatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 660 atctacgatg catccaattt ggaaacaggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 720 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 780 tgtcaacaga gttacagtac cccgtacact tttggccagg ggaccaaagt ggatatcaaa 840 ggaggtggtg gatcctgctg gatgggccat tccgcgtggt gcctcgagca ccaccaccac 900 caccactga 909 <210> 101 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB:NdeI-F primer <400> 101 cgccatatga aatacctgct gccgaccgct g 31 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB-NcoI:BamHI-R primer <400> 102 cccggatccg gccatggccg gctggg 26 <210> 103 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding ubiquitin <400> 103 atgcagattt ttgtgaaaac cctgaccggc aaaaccatta ccctggaagt ggaaccgagc 60 gataccattg aaaacgtgaa agcgaaaatt caggataaag aaggcattcc gccggatcag 120 cagcgcctga tttttgcggg caaacagctg gaagatggcc gcaccctgag cgattataac 180 attcagaaag aaagcaccct gcatctggtg ctgcgcctgc gcggcggc 228 <210> 104 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-mouse_a-CD3:EcoRI-F primer <400> 104 ccggaattcg actacaaaga tgatgacgat aaggatatca aac 43 <210> 105 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-human_a-CD3:EcoRI-F primer <400> 105 ccggaattcg actacaaaga tgatgacgat aaggagctg 39 <210> 106 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep1:XhoI-R primer <400> 106 ccgctcgagg caccaaaacg gatgg 25 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep2:XhoI-R primer <400> 107 ccgctcgagg caccaaatat gatggcc 27 <210> 108 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep3:XhoI-R primer <400> 108 ccgctcgagg caatcctgat cttcccac 28 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep4:XhoI-R primer <400> 109 ccgctcgagg caccaaaaaa ttttcgc 27 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep5:XhoI-R primer <400> 110 ccgctcgagg caccaaattt catgacc 27 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep6:XhoI-R primer <400> 111 ccgctcgagg caccacaggg tatgacc 27 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep7:XhoI-R primer <400> 112 ccgctcgagg caccaccact gctgg 25 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep8:XhoI-R primer <400> 113 ccgctcgagg caccacgcgg aatg 24 <210> 114 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TN-forward primer <400> 114 ggaggaagcg gccgcggtac tggcagc 27 <210> 115 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TN-reverse primer <400> 115 cctcctctct agagcggacc aggagc 26 <210> 116 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 scFv antibody (mouse) <400> 116 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Tyr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Leu Lys <210> 117 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 scFv antibody (human) <400> 117 Glu Leu Gln Leu Val Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Gly Arg Phe Leu Gly Trp Leu Leu Gly Gly Ser Asn Trp 100 105 110 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 180 185 190 Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 210 215 220 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 245 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> endonexin-fold <400> 118 Gly Xaa Gly Thr Asp Glu 1 5 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide specifically bind to Annexin A1 <400> 119 Xaa Trp Gly His Xaa Xaa Trp 1 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 120 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 121 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 122 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (11)

1. 아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 단백질의 말단에 연결된 세포 독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)의 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질로 이루어진 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열, 및 서열번호 9 내지 42의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드인 것이고,
   일반식 I
   X₁-Trp-Gly-His-X₂- X₃-Trp(서열번호 119)
   상기 X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X₃는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및 상기 세포 독성 림프구의 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 연결하는 링커를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 전장(full length) 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 상기 세포 독성 림프구의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 것인 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 표면 마커는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD28, CD56, CD57 및 TCR로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
9. 제7항에 있어서, 상기 세포 독성 림프구의 표면 마커에 결합하는 폴리펩티드는 서열번호 116 또는 서열번호 117의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 세포 독성 림프구의 세포 독성 활성을 유도하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 전장 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 약학적 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.

Images