JPWO2002042333A1 - Cd14/tlr結合阻害作用を有する抗cd14モノクローナル抗体 - Google Patents
Cd14/tlr結合阻害作用を有する抗cd14モノクローナル抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002042333A1 JPWO2002042333A1 JP2002544466A JP2002544466A JPWO2002042333A1 JP WO2002042333 A1 JPWO2002042333 A1 JP WO2002042333A1 JP 2002544466 A JP2002544466 A JP 2002544466A JP 2002544466 A JP2002544466 A JP 2002544466A JP WO2002042333 A1 JPWO2002042333 A1 JP WO2002042333A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- human
- amino acid
- cells
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本発明は、配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域は他の蛋白質と相互作用可能な部位であるとの知見に基づいた該領域の一部を含むエピトープを特異的に認識する抗体を提供する。該抗体は、ヒトCD14と他の蛋白質との相互作用を阻害し、細胞活性化を抑制することができる。本発明は、また該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、該特定領域のアミノ酸を含むペプチド、該ペプチドを免疫源とする抗体の作成方法、ないしCD14、TLRおよび被検物質との接触工程を含む敗血症治療薬のスクリーニング方法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、抗CD14抗体及びその断片、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ペプチド、抗体の作成方法、および敗血症用医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体、CD12とToll Like Receptor(TLR)との結合阻害剤である該抗体、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列をCDRとして有する抗CD14モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、該アミノ酸配列を有するペプチドおよび敗血症用医薬組成物に関する。
背景技術
CD14は、356個のアミノ酸からなる糖蛋白であり、グリコシルホスファチジルイノシトール(glycosylphosphatidylinositol:GPI)によりマクロファージ、単球、クッパー細胞、好中球および一部B細胞の膜上にアンカリングされて存在する。
ヒトCD14は、膜結合型CD14(以下mCD14ともいう)のほかに可溶型CD14(以下sCD14または可溶性CD14ともいう)がある。そして血中には分子量の異なる複数のsCD14が存在することが報告されている(Labeta MO:Eur.J.Immunol.,23:2144,1993)。
ヒトCD14は、グラム陰性桿菌内毒素のLPS受容体として知られており(Wrightら:Science,249:1431,1990)、血中のLBP(LPS binding protein)からLPSを受け取り、複合体を形成する。
mCD14を発現しているマクロファージ等は、LPSとsCD14の複合体により活性化され、炎症性サイトカインの産生を誘導する(Hailmann Eら:J.Immnol.,156:4384,1996)。
mCD14を発現していないといわれている血管内皮細胞や血管平滑筋細胞は、sCD14とLPSの複合体(以下sCD14/LPSともいう)により炎症性サイトカインの産生が誘導される(Loppnow Hら:Infection & Immunity,63:1020,1995)。
また、グラム陰性菌ばかりでなくグラム陽性菌の菌体成分やマイコバクテリアにも反応し、リポタイコ酸(LTA)、ペプチドグリカン(PepG)等の受容体として機能し、細胞の炎症性サイトカインの産生を誘導する(Cleveland MGら:Infect immunity,64:1906,1996)。
LPSまたはLTA等のCD14を介する細胞のサイトカイン産生は、生体に障害的な作用を及ぼし、敗血症を引き起こす。一般に、敗血症の初期症状には悪寒、多汗、発熱、衰弱等がみられ、引き続いてショックを起こす低血圧、好中球減少症、汎発性血管内血液凝固症候群、成人性呼吸窮迫症候群、呼吸不全、多臓器不全等、重篤な臨床症状が生じる。
ヒトCD14のLPSのシグナルを細胞に伝達する機能は、その領域が一部明らかになっている。N末端1〜152番目がCD14の機能発現に必須な領域であり(Juan TSら:J.Biol.Chem.,270:1382,1995)、また7〜14番目および57〜64番目がLPSとの結合に必須な部分である(Juan TS:J.Biol.Chem.,270,29:17237(1995)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270,10:5219(1995))。
しかし、ヒトCD14のN末端153番以降の有する機能については、まったく明らかになっていない。
また、CD14/LPSの細胞へのシグナル伝達におけるToll like receptor(TLR)の関与が近年研究されている。現在までにヒトTLR1、2、3、4及び5(Fernand R:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:588,1998)並びにTLR6(Takeuchi O:Gene,231:59,1999)がクローニングされている。
TLR2若しくはTLR4を欠損したマウスによる研究により、TLR4がグラム陰性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を、TLR2がグラム陽性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を担っている可能性があることが報告されている(Takeuchi Oら:Immunity,11:443,1999)。またTLR2がLPSの細胞内へのシグナル伝達に関与すること、さらにTLR2が細胞表面上でLPSに直接反応すること、CD14存在下では反応が増強されることが報告されている(Ruey−Bing Y:Nature,395:284,1998)。
しかしながらCD14とTLRとの相互作用において、CD14がTLRもしくはTLRと他の機能の解明されていない低分子物質であるアクセサリー分子の複合体と直接結合するか否かは明らかになっておらず、さらにTLRとCD14の結合領域もまったく未知である。
LPSのヒトCD14を介するシグナル伝達を制御するヒト抗CD14抗体として、ヒトCD14の7〜14番目に結合する3C10抗体(Steinman:J.Exp.Med.,158:126(1983)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270:29,17237(1995))および57〜64番目に結合するMEM−18抗体(Bazil:Eur.J.Immunol.,16:1583(1986)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270,10,5219(1995))が知られており、敗血症治療薬への応用が開示されている。
さらに、LPSの結合を抑制し、サイトカインの放出を抑制する28C5抗体および23G4抗体、並びにLPSの結合は一部しか抑制せず、サイトカインの放出を抑制する18E12抗体(特表平8−510909号)が開示されている。
また、グラム陽性細菌及びマイコバクテリアとの作用に対する抗CD14抗体も開示されている(特表平10−505839号)。
しかし敗血症治療薬として用いる場合、LPSの結合領域を認識する抗体、またはLPSの結合を抑制する抗体は、形成したLPS/CD14のシグナル伝達を抑制する効果は期待できない。また、LPSのCD14への結合を特異的に阻害するため、グラム陽性菌の菌体成分及びマイコプラズマ等によるシグナル伝達を抑制する効果も期待できない。また、18E12抗体はCD14の認識部位が明らかになっておらず、サイトカインの放出を抑制する機序も不明である。
また上記のとおり、CD14/LPSの細胞へのシグナル伝達におけるTLRの関与が知られているが、この関与を阻害する物質が、シグナル伝達を調節することが可能か否かは定かではなく、また阻害する物質はまったく知られていない。
発明の開示
本発明は、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体、及びその生物学的に活性のある断片、特定のアミノ酸配列をCDRとして有する抗体、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ヒトCD14の特定領域のアミノ酸を含むペプチド、該ペプチドを免疫源とする抗体の作成方法、敗血症用医薬組成物を提供することを目的とする。
発明者らは、上記のような従来の問題点を克服するため鋭意検討を行い、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をCDRとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはTLRとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトCD14抗体が該作用をするために必要な認識領域のCD14における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びCD14とTLRとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
すなわち、本発明は、下記(1)〜(11)の抗CD14抗体、(12)の抗CD14ヒト化抗体の作成方法、および(13)の医薬組成物を提供する。
(1)配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体。
(2)CD14とToll Like Receptor(TLR)との結合阻害剤である上記(1)の抗体。
(3)モノクローナル抗体である上記(1)または(2)に記載の抗体。
(4)上記(3)の抗体の生物学的に活性のあるFab、Fab’、(Fab’)2である断片。
(5)ハイブリドーマF1024−1−3(受託番号FERM BP−7511)により産生されるF1024−1−3モノクローナル抗体。
(6)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)のうち少なくとも一つを有する抗CD14モノクローナル抗体。
(7)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つを有するヒト化抗体またはキメラ抗体。
(8)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも一つを含むペプチド。
(9)上記(3)〜(5)のいずれかの抗体若しくは抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
(10)配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むペプチド。
(11)上記(10)のペプチドを免疫原として用いる、CD14とTLRの結合阻害剤である抗体の作成方法。
(12)配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗CD14ヒト化抗体の作成方法。
(13)上記(1)〜(8)に記載の抗体若しくはペプチドのいずれかを有効成分として含む敗血症用医薬組成物。
本発明は、さらに下記(14)〜(17)のモノクローナル抗体を提供する。
(14)ラットモノクロナール抗体である上記(3)のモノクロナール抗体。
(15)ヒトモノクロナール抗体である上記(3)のモノクロナール抗体。
(16)ウサギ、イヌ、サルのCD14と交差反応性を有する上記(3)、(13)または(14)のモノクロナール抗体。
(17)ヒト抗体である上記(3)、(15)または(16)のモノクロナール抗体。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体である。
配列番号1に記載のアミノ酸配列はヒトCD14のアミノ酸配列である。また配列番号1に記載される356アミノ酸からなる蛋白質はヒトCD14の全長である。
ここでエピトープとは抗原決定基であり、抗体と特異的に結合する構造部位をいう。
抗体が認識する領域は一次配列上連続したアミノ酸残基を認識するものとは限らず、蛋白質のとる立体構造を認識するエピトープを有する抗体もある(抗体の蛋白工学、1〜4頁 三木敬三郎等編 講談社サイエンティフィック1991年)。例えば、一次配列上不連続なアミノ酸残基を認識している抗体は、該不連続なアミノ酸残基が立体構造的には、抗体が認識するのに十分近い距離に存在するために、該不連続なアミノ酸残基をエピトープとする場合がある。
例えばエピトープとして、該領域の一部の連続したアミノ酸が挙げられるが、上記したように、該領域の不連続なアミノ酸も含まれる。すなわちヒトCD14の269番から315番までの領域に存在する限り、連続若しくは不連続なアミノ酸の集合または連続若しくは不連続なアミノ酸が点在した2ケ所以上のアミノ酸の集合も「ヒトCD14の269番から315番までの領域のエピトープ」に含まれる。好ましくは連続した8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体である。
また本発明の抗体は、269番から315番以外の領域を含むエピトープを認識する抗体も含まれる。例えば、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8以上のアミノ酸残基と、ヒトCD14の269番から315番まで以外の領域の数アミノ酸残基により形成されるエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトCD14と結合する。ヒトCD14とはsCD14またはmCD14を問わない。また、どちらか一方のCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。例えばsCD14は、血中に存在し、mCD14はマクロファージに存在する。
ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識するとは、例えば、後述する実施例11の方法と同様に、ヒトCD14のN末端1〜315番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド(sCD14(1−315))とは結合するがsCD14(1−268)と結合しないことにより、判断できる。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識することにより、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。
CD14は細菌菌体成分と結合し、その結合したCD14/細菌菌体成分複合体がTLRと結合し、シグナルを細胞に伝達し、細胞を活性化する。これらのシグナル伝達機構により細胞が活性化されると、細胞から炎症性サイトカインが放出され、細胞障害、敗血症等の炎症が惹起される。
本発明の抗体は、菌体成分による細胞活性化をCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有することにより抑制し、細胞障害、敗血症等の炎症を抑制する。
「CD14とTLRとの結合」を詳細に説明すると、CD14と細菌菌体成分とが結合したCD14/細菌菌体成分複合体とTLRとの結合である。細菌菌体成分には、LPS、LTA若しくはペプチドグリカン(PGN)若しくはリポアラビノマンナン等、マイコプラズマ等が挙げられる。例えばLPSとCD14が結合した複合体であるLPS/CD14はTLR、特にTLR2若しくはTLR4、と会合することにより、細胞へシグナルを伝達する。TLRにより細胞内へシグナルが伝達されると、MyD88、IRAK及びNIKを経由してNF−κBが活性化される等により、細胞の活性化が起こる。本発明の抗体はこの過程において、LPS/CD14とTLRとの結合を阻害する。
「CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する」とは、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する限り限定はされないが、例えば後述する実施例2、または4の系により測定し判断することができる。
また、本発明の抗体は、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する抗体が好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が10μg/ml以下で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化若しくはIL−8産生を30%以上抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する抗体である。さらに好ましくは50%以上抑制する抗体である。特に好ましくは70%以上抑制する抗体である。
また、本発明の抗体は、外因性のLPS/CD14による内皮細胞のサイトカインの産生を60%以下に抑制する抗体が好ましい。より具体的には、抗体の濃度が1μg/ml以上で、10ng/mlのLPS、300ng/mlの外因性のCD14存在下での内皮細胞のIL−6産生を60%以下に抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、40%以下に抑制する抗体である。
また、CD14とTLRとの結合には、直接的な結合、他の因子を介する結合または他の因子により活性化される結合が挙げられる。血中若しくはin vitroでは動物由来の血清存在下で結合する場合が挙げられる。例えば、MD2存在下で、TLR4若しくはTLR4の2量体の構造が安定した時に結合する場合が挙げられる。本発明の抗体は、いずれかの場合の結合を阻害する機能を有していればよい。例えば血中若しくはin vitroでは動物由来の血清存在下で、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗CD14抗体が挙げられる。
本発明の抗体がCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有するのは、該領域がCD14とTLRとの結合に関連がある領域であるからである。このためヒトCD14の269番から315番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識する抗体は、該領域の機能を変化させることによりCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。
また、CD14とTLRとの結合に関連がある領域として、エピトープとする領域が、ヒトCD14の269番から315番までに完全に含まれる抗体が好ましい。より好ましいエピトープとする領域は、実施例のF1024−1−3抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトCD14の285番から315番までの領域である。また好ましくは、ヒトCD14の269番から307番までの領域である。さらに好ましくは、連続したアミノ酸をエピトープとして特異的に認識する抗体が好ましい。
また、本発明の抗体は、実施例のF1024−1−3抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトCD14の285番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体が好ましい。該抗体はCD14の294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
Proは他のアミノ酸と異なりα炭素に結合したN原子が環構造に組み込まれ>NH基になっているため、ポリペプチドはPro骨格により1次構造が制限され、蛋白質の立体構造に影響を与える。すなわち、ProはNH基がないため水素結合を形成できず、α−ヘリックスを形成できない(プロテインバイオテクノロジー、F.フランク編、培風館)。該抗体がCD14の294番目のProをポイントミューテーションすることにより結合しなくなるが、これはCD14の立体構造が変化したことが原因である。すなわち、該抗体は、294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
また、本発明の抗体は抗ヒトCD14抗体であるが、該領域と同等のヒト以外の哺乳動物のCD14の領域に対する抗体であっても、後述する抗ヒトCD抗体と同等の効果を示す抗体であれば、本発明に含まれる。
配列番号2に記載のアミノ酸配列は、ヒトCD14の269番目から315番目のアミノ酸配列である。
この配列番号2に記載のアミノ酸配列の領域の一部若しくは全部からなり、連続した8以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体は、本発明の抗体に含まれる。好ましくはヒトCD14の285番目から307番目までの領域のアミノ酸配列の一部若しくは全部からなり、連続した8以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成された抗体である。またペプチドが立体構造をとることを考慮すると、好ましくは連続した10以上、より好ましくは連続した15以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体である。
本発明の抗体は、CD14と特異的に結合することにより、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。CD14とはsCD14またはmCD14を問わない。また、どちらか一方のCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体も含まれる。例えば、血中に存在するsCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体若しくはマクロファージ等に存在するmCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体が挙げられる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体の有する機能を明確にするため、若しくは明確に発揮させるためには、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作成の容易さの面では、ラットが好ましい。医薬品組成物の構成物の面では、ヒト抗体が好ましい。ヒト抗体には、ヒト抗体産生マウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれる。この他にもヒト化抗体、ファージ抗体若しくはキメラ抗体等も本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体は、定常領域と、フレームワーク領域がヒト由来で、相補性決定領域が非ヒト由来である抗体である。ファージ抗体は繊維状ファージのコート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示させ、作製する抗体であり、単鎖Fv(scFv)フォームあるいはFabフォームが主に使用される。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とからなる抗体である。
本発明の抗体はその分子種は特に限定されない。いずれのクラス、サブクラス及びイソタイプに分類される抗体であってもよい。また、生物学的に活性のあるFab、Fab’、(Fab’)2等の抗体断片も、本発明に含まれる。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる。例えば、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
配列番号1に示されるアミノ酸の配列の全部の蛋白質または269番から315番までの領域の連続した8個以上からなるペプチドを免疫原として免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマの中から、後述する本発明の第五の態様のスクリーニング方法により、クローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。また、sCD14(1−315)と結合し、sCD14(1−268)とは結合しないクローンを選択しても、本発明の抗体を作成することができる。好ましくは、285番から307番までの領域の連続した8個以上からなるペプチドを免疫原とすることである。より好ましくは連続した10個以上、特に好ましくは連続した15個以上のアミノ酸からなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはP3、P3U1、SP2/O、NS−1、YB2/0及びY3−Ag1,2,3等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行なうことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行なう。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば3日後、に摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。
免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Milstein等の方法(Methods in Enzymol.,73巻3頁)等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール(PEG)を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。
免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を1/10量ないし等量を使用することが好ましい。
細胞融合をPEG(平均分子量1,000〜4,000)を使用して行なう方法ではPEG濃度は特に限定されないが50%で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド(DMSO)等の補助剤を添加してもよい。
融合は37℃に加温したPEG溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、1〜5分間反応後、培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地(HAT培地)等の選択培地で1日〜7日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。例えばELISA法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。また、ハイブリーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
また、ヒト抗体は石田らが開発した方法(PNAS,97:722,2000)を用いて作製できる。すなわち、まず、Trans−chromosome)(Tc)マウスは石田らの方法に従い、ヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)をミクロセル融合法によりマウスES細胞に導入し、Joynerらの方法(ジーン ターゲティング、実験法シリーズ、メディカル・サイエンス・インターナショナル)にしたがい、それぞれの染色体断片を有するキメラマウスを作製する。次に、作製した2種類のキメラマウスを交配することによりヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)の両者を有するキメラマウスを作製する。マウス由来の内因性のマウス抗体の産生を失わせる為、Capecchiらの方法(Mol.Cell.Biol.12:2919−2923、1992)に従い内因性のIg重鎖とκ鎖をノックアウトしたダブルKOマウスを作製し、ヒト染色体断片を導入したキメラマウスと交配させ、ヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)を含み、内因性のIg重鎖とκ鎖をノックアウトしたトランスクロモソームマウスを作製する。作製したTcマウスは血中にヒト由来の抗体を産生し、一部マウスγ鎖を有する抗体も存在するが、マウスIg(κ)は検出されない。得られたTcマウスは数代経っても染色体は維持され、その子孫を以下の抗CD14ヒトモノクローナル抗体の作製に使用できる。
Tcマウスに精製したCD14抗原50μgを、タイターマックスゴールド(Titer Max Gold, CytRx 社)と混合後、皮下に投与し、3週間後同様に追加投与を行う。抗体価の上昇は、抗原を固相化したプレートに希釈した抗血清を反応させ、続いて抗ヒトIgG抗体を用いて結合した血清中のヒト抗体を検出する。細胞融合は、抗体価の上昇したマウスの腹腔に抗原を50μg投与し、3日後に行う。具体的には、採取した脾細胞をマウスミエローマ細胞(SP2/O−Ag14)と混合後、PEG4000(Merck)により融合し、G418(1mg/mL)を含むHAT培地によりハイブリドーマを選択する。出現したハイブリドーマを抗ヒトIgGκ抗体、抗IgG抗体、抗IgG2抗体、抗IgG3抗体または抗IgG4抗体を2次抗体としてスクリーニングし、CD14と結合するヒト抗体を産生するハイブリドーマを選択する。さらに実施例2に記載のスクリーニング方法により、本発明のヒトCD14抗体を得ることができる。
また、ヒト化抗体は公知の方法(Nature,321:522,1986)を用いて、ファージ抗体は公知の方法(Annu Rev.Immunol,12:433,1994)を用いて、キメラ抗体は公知の方法(Nature,312:643,1984)を用いて作製できる。
また、ヒト化抗体及びキメラ抗体の作成方法の詳細は後述する。
本発明の抗体の断片であるFab、Fab’、(Fab’)2等も公知の方法(石川栄治、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター)で作製できる。
ポリペプチドは、ヒト血清中の可溶型CD14を公知の方法により精製して調製することができる。また、一般的に使用されるペプチド合成機(ペプチドシンセサイザー432A型、パーキンーエルマージャパン)等を用いた方法、遺伝子組換え法(東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社)等が挙げられる。
例えば、269番から315番までの領域の連続した8個以上のアミノ酸からなるペプチドは432A型ペプチド合成機を用いてFmoc法により合成でき、TFAによる脱保護、樹脂からの切断の後、C18 HPLCカラム(Capcell−pak、資生堂)を用いて精製し、目的のペプチドを調製することができる。
本発明の抗体の好適な例として、ラットにヒト血清中より精製したCD14蛋白質を抗原として免疫した免疫細胞とミエローマ細胞を細胞融合して取得したハイブリドーマF1024−1−3が産生するF1024−1−3抗体が挙げられる。ハイブリドーマF1024−1−3は平成12年9月29日付けで日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(IPOD)に寄託し(受託番号P−18061)、さらに平成13年3月16日付で原寄託から国際寄託に移管した(受託番号FERM BP−7511)。
また、F1024−1−3抗体のCDRをVL−CDR1、VL−CDR2、VL−CDR3、HL−CDR1、HL−CDR2及びHL−CDR3をそれぞれ配列番号3、4、5、6、7及び8として図16に示す。本発明のモノクローナル抗体には、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つは有する抗CD14モノクローナル抗体が含まれる。好ましくは、VL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号3〜5に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、HL−CDR1〜CD3のうちの一つ以上が対応する配列番号6〜8に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗CD14モノクローナル抗体である。さらに好ましくは、VL−CDR1〜HL−CDR3がそれぞれ配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を有する抗CD14モノクローナル抗体である。
該抗CD14モノクローナル抗体は、そのサブタイプは限定されない。F1024−1−3抗体のサブタイプのIgGだけでなく、IgA,IgD,IgE及びIgMも含まれる。これらはF1024−1−3抗体の超可変部位(CDR)の配列を維持し、抗体の重鎖をκ鎖からλ鎖へ、または軽鎖をγ鎖からα鎖、δ鎖、ε鎖若しくはμ鎖へ、置換して遺伝子工学的手法により、作成することができる。
本発明には、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つは有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体が含まれる。好ましくは、VL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号3〜5に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、HL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号6〜8に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体である。さらに好ましくは、VL−CDR1〜HL−CDR3がそれぞれ配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体である。
また、配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を少なくとも一つ含むペプチドも本発明に含まれる。好ましくは、配列番号3〜8にいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。またN末端からC末端に向かって配列番号3から順に配列番号8までのアミノ酸配列を含むペプチドも好ましい。また6つのアミノ酸配列の間に適当なリンカーが入っても良い。
上記のモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体はペプチドのCD14/TLR結合阻害作用は、後述する実施例2のスクリーニングにより判定できる。
具体的なキメラ抗体、ヒト化抗体の作成法を説明する。ヒト定常領域および再編成した可変領域DNAは、公知の操作法に従って種々のヒト細胞、好ましくは不死化B細胞から単離しうる。同様な方法により非ヒト材料から非ヒト抗体配列を単離することができる。DNA配列のための材料の細胞ならびに発現および分泌のための宿主細胞は、種々の材料、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(セルライン及びハイブリドーマのカタログ、第5版(1985)、ロックビル、MD、本引例をもって本明細書の一部と成す)から得ることができる。
これらの「天然に存在する形態」の抗体鎖に加えて、他の「実質的に同一な」修飾された抗体重鎖および軽鎖が当業者に周知の種々の組み換えDNA技術を利用して容易にデザインされそして製造されうる。例えば、鎖は、いくつかのアミノ酸の置換、末端及び中間での付加や欠失等によって、その1次構造レベルにて天然の配列から変化することができる。或いは、1又はそれ以上の抗体活性(例えば、結合活性)を有するような、一次の抗体構造の部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができよう。特に、多くの遺伝子と同様に、抗体遺伝子も分離した機能的領域を含有し、各領域は異なる生物活性を有することが注目される。一般に、所望のエピトープ結合成分をコードする遺伝子の修飾は、種々の良く知られた技術、例えば、特定部位の突然変異誘発(ギルマンアンドスミス、Gene8:81−97(1979)及びロバーツら、ネーチャー328:731−734(1987)、本引例を持って本明細書の一部と成す、参照)によって、容易に達成できる。
より好ましい本発明の態様において、エピトープ結合成分は、「キメラ」または「ヒト化」された抗体遺伝子によってコードされる(CoおよびQueenNature、351巻、501頁、1991年)。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する抗体遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変(V)セグメントは、ヒト定常(C)セグメント、例えば、γ1及びγ4と連結されうる。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からのV又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体からのC又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
「フレームワーク領域」とは、Kabat等による定義(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)の如く、単一種中の種々の抗体の内で、比較的保存されている(即ち、CDR以外の)抗体軽鎖及び重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク 領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一(約85%又はそれ以上)であるところのフレームワーク領域である。
「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのCDRを含む抗体を云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である、即ち少なくとも約85〜90%、好ましくは少なくとも95%同一である。従って、恐らくCDRを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、1以上の天然のヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化抗体は、キメラマウス可変領域/ヒト定常領域抗体を含まない。
これらの抗体は、より特異的には、本発明は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体(アクセプター)抗体からのフレームワーク領域(FR)の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て(4つ)、より好ましくはすべて(各鎖について4つ)を含有し、そして、F1024−1−3抗体からの1以上、好ましくはすべて(各鎖について3つ)の相補性決定領域(CDR)を含有するヒト化抗体である。該抗体は、軽鎖/重鎖複合体の2つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、1以上、好ましくは全て(3つ)の供与体(ラット)抗体の相補性決定領域を含む。例えば、供与体(ラット)相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体(ラット)アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入する。さらに明確な例としては、本発明のヒト化抗体は、各々、配列表の配列番号3、4、5、6、7または8のいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるCDRの少なくとも一つ、好ましくはすべて(各鎖3つ)を含有するものである。ヒト化抗体における各CDRおよびフレームワークの位置は元の供与体抗体における位置と対応していることが望ましい。
一般に、本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖可変領域フレームワーク及び供与体抗体重鎖可変領域フレームワーク間において、65%以上95%以下、好ましくは70%以上90%以下の相同性(即ち、配列同一のパーセント)が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖及び軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、2つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる2以上のヒト抗体から由来してもよい。
ヒトフレームワーク領域に関しては、CDRを得る非ヒト抗体のフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト抗体配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は60%以上、より好ましくは65%以上である。また、好ましくは、受容体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト抗体重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の5つ、より好ましくは3つの中にある。ヒト化抗体の設計は、以下のように行うことができる。
1)アミノ酸が以下の(a)〜(c)のカテゴリーに該当する場合は、用いられるヒト抗体(受容体抗体)のフレームワークアミノ酸はCDRを供与する非ヒト抗体(供与体抗体)由来のアミノ酸で置換される。
(a)受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト抗体のその位置に稀であり、そして供与体抗体中の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に典型的である;
(b)該アミノ酸がCDRの1つに一次配列上近接もしくは隣接している;または、(c)該アミノ酸が供与体もしくはヒト化抗体の三次元モデルにおいてCDRの約5、好ましくは4、より好ましくは3オングストローム以内に原子を有する(Co等Proc,Natl.Acad.Sci.USA,88、2869、1991)。
2)受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体抗体の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。
ヒト化抗体の製造の詳細な説明については、Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029(1989)、WO90/07861およびWO92/11018、Co等Proc,Natl.Acad.Sci.USA,88,2869(1991)、CoおよびQueenNature、351巻、501頁、1991年、ならびに、Coら、J.Immunol.148:1149(1992)(これらの引例をもって本明細書の一部と成す)が参照される。
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては曖昧であることもあり、そして、代わりの様々な抗体が製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。このため、コンピューターモデリングによるCDRとFRの最適化を行えばよい。
相同性の高いヒト抗体V領域が見出された後、そのフレームワーク部分にF1024−1−3抗体のCDR配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシミュレーションする。このときに使用するプログラムとしてはABMODやENCAD(Biochemistry,29:10032、1990)が用いられる。この立体構造のシミュレーションにより、CDR領域のアミノ酸の配置がCD14との結合活性を最適に有するように、CDR近傍のFRのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、最適化が行える。
また、CDRとFRの最適化には、F1024−1−3抗体のFRの一部のアミノ酸配列をそのまま用いて、ヒト抗体V領域に移植する方法も可能である。F1024−1−3抗体のFR領域は図15に示す。ヒト抗体V領域にF1024−1−3抗体のCDRとFRの一部の配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシュミレーションする。このときに使用するプログラムとしては、ModelerおよびQUANTA/CHARMm(Molecular Sumilations社)が用いられる。軽鎖では3〜4箇所を、重鎖では7〜8箇所をラット由来のアミノ酸に変更することによりFRがラット抗体の構造に近くなり、CDR領域のアミノ酸の配置がCD14との結合活性を最適にすることが容易になる場合がある。
また、抗CD14抗体としての結合活性が維持されていれば、CDR領域のアミノ酸の1または2以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加をしてもよい。この場合、例えばGlyとAla、Val、LeuとIle、AsnとGln、CysとMetまたはLysとArg等、同族に分類されるアミノ酸同士の置換は、抗CD14抗体としての結合活性が維持されていやすいと理解される。また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の26から30の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており(チョチアおよびレスク、J.Mol.Biol.、196:901−917(1987))、その意味ではCDRと同様に移植することも可能である。
得られたアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗体を作成する。例えば、上記より決定したアミノ酸配列より、ヒト化抗体遺伝子配列を決定し、ヒト化モノクローナル抗体をコードする遺伝子を作製する。具体的にはヒトV領域の遺伝子よりCDRをエンコードするDNAを削除し、変わりにラット由来のCDRをエンコードするDNAを挿入する。さらに、分子モデリングにより変更するアミノ酸に応じて、対応するDNA配列をPCRを用いた部位特異的突然変異導入法等により改変し、組み替えヒトV領域遺伝子を作製する。これをヒト抗体の重鎖、軽鎖のC領域を含むベクターにクローニングし発現ベクターを得る。このとき使用するヒト由来の配列を変更することにより、ヒトIgG1、IgG3等の抗体のサブクラスを得ることができる。発現ベクターはマウスミエローマ細胞Sp2−O−ag14(ATCC CRL1581)やハムスター卵巣細胞CHOに遺伝子導入し、発現を行う。
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、ラット抗体に比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも3つの潜在的な利点を有する。
1)エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる(例えば、補体依存性細胞障害(CDC)又は抗体依存性細胞障害(ADCC)による、より効率的な標的細胞の破壊)。
2)ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はC領域を異物として認識せず、従って、このような注入された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
3)注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている(ショー、D.ら、J.Immunol.138:4534−4538(1987))。注入されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与量を与えることができる。
本発明の抗体は、ヒトCD14と特異的に結合し、CD14とTLRとの結合を阻害すること、すなわちCD14とTLRとの結合阻害剤であることにより、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に用いることができる。例えば、敗血症などの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のTNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用であり、より具体的には発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。また、本発明の抗体が抑制する細胞活性化の原因物質はLPSのみとは限定されない。例えば、LTA、PGN若しくはマイコプラズマ等と複合体を形成したCD14の細胞活性化を抑制する。すなわち、これらを原因とする疾患においても、上記に記載のとおり、治療または予防に有用である。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識するという機能を有するので、ヒトCD14の定性若しくは定量するツールとして有用である。例えば、検体と本発明の抗体を接触させ、抗原抗体複合体を形成させた後、該複合体を検出または定量する測定方法である。検体は血清、尿、体液または培養上清等が例示される。抗原抗体複合体の検出または定量法はELISA法またはRIA法等が例示される。
本発明の第二の態様は、本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明のハイブリドーマの好ましい例は、本発明の抗体の好ましい例であるF1024−1−3抗体を産生するハイブリドーマF1024−1−3(FERM BP−7511)である。
本発明の第三の態様は、配列番号1に記載のCD14の269番から315番までの領域のアミノ酸を連続8個以上含むペプチドである。好ましくは285番から307番までの領域のアミノ酸を連続8個以上含むペプチドである。また、好ましくは連続10個以上、特に好ましくは連続15個以上のアミノ酸からなるペプチドである。
本発明のペプチドは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明の第四の態様は、本発明の第三の態様のペプチドを免疫原として用いることを特徴とするCD14とTLRとの結合阻害剤である抗体の作成方法である。免疫原として用いるペプチドの好ましい例は、本発明の第三の態様の好ましいペプチドの例である。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
作成された抗体がCD14とTLRとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例2に記載した方法で行うことができる。
本発明の第五の態様は、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗CD14ヒト化抗体の作成方法である。本発明の抗CD14ヒト化抗体の作成方法は、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることである。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
さらに本発明の方法を実施するために、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化し、コンピュータ上でCDRとフレームワーク領域(FR)の立体構造をシミュレーションしてCDRとフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を最適化して、抗CD14ヒト化抗体のアミノ酸配列を決定することが好ましい。このようにして決定した抗CD14ヒト化抗体のアミノ酸配列の少なくとも重鎖または軽鎖の定常領域をエンコードするヒト抗体の遺伝子を含むベクターに、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDR及び最適化して変化させたFR若しくはFRの一部をエンコードするDNAを組み込めばよい。FRの一部とは、FRの一部の連続したアミノ酸配列のみならず、最適化するために置換する不連続のアミノ酸配列をも含む。このようにアミノ酸配列を最適化して抗CD14ヒト化抗体を作成する方法も、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化して最適化する限り、本発明に含まれる。
好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化することである。
なお、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列の一例は図18に示した。FRを含む重鎖及び軽鎖をエンコードする塩基配列の一例は図17に示されている。
作成されたヒト化抗体がCD14とTLRとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例2に記載した方法で行うことができる。
本発明の第六の態様は、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程を含む敗血症用治療薬のスクリーニング方法である。敗血症用治療薬のスクリーニング方法とは、被検物質が敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質であるか否かを検討する方法である。また、複数の被検物質から敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質を選択する方法である。
本発明のスクリーニング方法は、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程を含む。
本発明のスクリーニング方法のCD14原としては、細胞に発現しているCD14、血中等に存在するsCD14、または遺伝子組換え法により作成されるsCD14が挙げられる。細胞に発現しているCD14は、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またsCD14は、少なくともヒトCD14の269番から315番を含むsCD14であれば、改変体であってもよい。CD14の立体構造の維持の点で、好ましくはCD14全長である。
TLR原としては、TLRを発現する細胞、遺伝子組換え法により作成されるTLR等が挙げられる。細胞に発現しているTLRは、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またCD14原とTLR原は同一の細胞であってもよい。
また、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程において、同時にCD14活性化物質も接触させることが好ましい。CD14活性化物質により、活性化されたCD14がTLRに結合しやすいからである。
CD14活性化物質は、CD14と結合することにより、複合体を形成し、CD14を活性化する機能を有する物質であれば特に限定されない。例えばLPS若しくはLTA等の菌体成分、マイコプラズマ等が挙げられる。
CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程は、これらが接触される工程であれば特に限定されない。例えば溶液中において直接接触させる、CD14若しくはTLRをプレート等に固定して、他を溶液中に混合しプレートに添加する、またはCD14若しくはTLRを発現する細胞の培養液中に他を添加する等が挙げられる。
CD14、TLRおよび被検物質、並びにCD14活性化物質を接触させる順番も特に限定されない。例えばこれらを同時に接触させる、CD14活性化物質およびCD14を先に接触させる、CD14活性化物質およびCD14をTLRと接触させる前に、CD14活性化物質およびCD14と被検物質を接触させる等の順番が挙げられる。
被検物質が敗血症用治療薬であるか否かの判定は、特に限定されない。例えば、CD14とTLRとの結合を直接観察し、被検物質が結合を阻害していれば、若しくはその結合阻害の程度に応じて、敗血症用治療薬であると判定若しくは選択する、またはCD14若しくはTLRを発現する細胞の活性化を測定することにより判定若しくは選択する等が挙げられる。
被検物質は特に限定されない。例えば、抗CD14抗体等の抗体、CD14改変ポリペプチド等のポリペプチド、低分子化合物等が例示される。
本発明のスクリーニング方法により、簡便に敗血症用治療薬が選択できる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、簡便に、敗血症用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法として有用である。
本発明の第七の態様は、CD14とTLRとの結合阻害剤を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤は、CD14が直接TLRに結合することを阻害する剤、若しくはCD14が第三物質を介してTLRに結合し複合体等を形成すること等を阻害する剤であれば特に限定されない。また、その阻害機構も限定されない。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤はその阻害する能力として、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する阻害剤が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が3μg/ml以上で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化を30%以上抑制する阻害剤が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する阻害剤である。
好ましくは、CD14とTLRとの結合阻害剤として本発明の抗体若しくは抗体の断片を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤若しくは本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、その力価として、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する力価が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化を30%以上抑制する力価が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する力価である。
ヒトCD14を介した細胞活性化による敗血症の経路において、CD14とTLRとの結合阻害剤はCD14とTLRとの結合を阻害することにより、CD14からTLRへのシグナル伝達が阻害されるため、TLR以降のシグナル伝達が遮断され、細胞活性化を抑制し、敗血症の治療効果を示す。
すなわち、本発明の医薬組成物は、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に有用である。例えば、敗血症、関節リウマチ、AIDS、自己免疫疾患、溶血性貧血、腫瘍、アトピー性疾患、アレルギー疾患、サルコイドーシス、マラリア、乾癬、発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などに有用である。特に、これらの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のTNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用である。これらの疾患の中でも、LPSが関与するグラム陰性細菌感染、LTA若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、またはマイコプラズマに伴う敗血症の治療または予防に有用である。すなわち、これらの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、血中にLPS、LTA若しくはマイコプラズマ等が高値である患者またはそのような状況に置かれることが予想される細菌感染者に予防効果が期待できる。
また、CD14とTLRとの結合阻害剤を有効成分として含んでいれば、製剤学的に許容される各種添加物を含んでいてもよい。例えば、担体、賦形剤、安定剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、干渉剤、保存剤、懸濁化剤、乳化剤、一般的に用いられる適当な溶媒の類(滅菌水や植物油等)、さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含んでいてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、抗生物質、ステロイド、各種サイトカイン抗体若しくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。これらは、有効成分である本発明の抗体と相加効果若しくは相乗効果を示し、より有効な医薬組成物と成ることができる。
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、特に限定されないが、例えば、本発明の抗体を有効成分とするときには、0.1mg/kg以上が好ましい。より好ましくは1〜10mg/kgの投与量である。本発明の医薬組成物を薬剤として用いるときの剤形は、坐剤、吸入剤、特に注射剤等が好適である。また種々の投与経路が可能であるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射が一般的であり、その他に直腸内投与、経皮吸収、経粘膜吸収等が挙げられる。また、投与時期若しくは回数は、患者の状態にも依存するが、予防投与、単回投与若しくは連続投与等が例示される。
また本発明は、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有し、以下▲1▼または▲2▼のいずれかであるCD14改変体ポリペプチドを開示する。
▲1▼配列番号1に記載のアミノ酸配列のN末端が1〜6番目のいずれかであり、C末端が246〜306番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
▲2▼配列番号1に記載のアミノ酸配列のN末端が1〜6番目のいずれかであり、C末端が269〜356番目のいずれかであり、かつ269〜307番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
以下には、ヒトCD14ポリペプチドのアミノ酸配列を主として説明し、ヒトCD14のアミノ酸配列を単にCD14のアミノ酸配列と称することもあるが、ヒト以外の哺乳動物のCD14であってヒトCD14の269番目から307番目のアミノ酸に相当する機能を有する部位が同様に改変され、本発明の改変体と同等の効果を示す範囲であれば、CD14はヒト以外の種のCD14ポリペプチドであってもよい。
「CD14改変体ポリペプチド」とは、CD14ポリペプチドの一部が欠失したポリペプチド、CD14ポリペプチドのアミノ酸の一部が置換したポリペプチド及びCD14ポリペプチドにアミノ酸を付加したポリペプチドが含まれる。また、これらの改変が組み合わさった改変体ポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドはCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。CD14とTLRとの結合を阻害する機能についての詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
また、本発明のポリペプチドは、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が10μg/ml以下で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化若しくはIL−8産生を30%以上抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、40%以上抑制するポリペプチドである。さらに好ましくは50%以上抑制するポリペプチドである。特に好ましくは70%以上抑制するポリペプチドである。
また、本発明のCD14改変体ポリペプチドは、該ポリペプチド自身ではLPS存在下で内皮細胞のサイトカインを誘導しないポリペプチドが好ましい。より具体的なアッセイ系においては、このポリペプチドの濃度が300ng/ml以下で、10ng/mlのLPS存在下での内皮細胞のIL−6産生を誘導しないポリペプチドが好ましい。
「誘導しない」とは、そのアッセイ系において、測定されるIL−6が検出限界以下であることである。たとえば、IL−6産生の測定において、human IL−6 EIA kit(PE Biosystems社)を使用する場合は、検出限界以下とは50pg/ml以下である。
また、本発明のCD14改変体ポリペプチドは、外因性のLPS/CD14による内皮細胞のサイトカインの産生を60%以下に抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が300ng/ml以上で、10ng/mlのLPS、300ng/mlの外因性のCD14存在下での内皮細胞のIL−6産生を60%以下に抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、40%以下に抑制するポリペプチドである。
「LPS/CD14」とは、LPSとCD14とが結合した複合体である。
この活性の点においては、前記▲1▼のポリペプチドのうちでも、C末端が246番目〜285番目のいずれかであるCD14改変体ポリペプチドが好ましい。さらに好ましくは、C末端が246番目または285番目であるポリペプチドである。
またこの活性の点においては、前記▲2▼のポリペプチドのうちでも、C末端が269〜356番目のいずれかであり、かつ269〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドが好ましい。より好ましくは、C末端が284〜356番目のいずれかであり、かつ284〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドである。さらにはC末端が307番であり、かつ284〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上がLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドが好ましい。
また、細菌菌体成分をポリペプチド自身が除去するという面で、本発明のポリペプチドは細菌菌体成分と結合することが好ましい。例えば、LPSのCD14の結合部位は7〜14番目及び57〜64番目であり、その部位の配列はは本発明のポリペプチドは維持されている。
本発明のポリペプチドは機能を維持していれば、N末端のアミノ酸1〜6個が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。例えばN末端にさらにMetが付加されたポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。また、途中のアミノ酸配列は、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。
本発明のポリペプチドは、その特徴を失わない限り、いかなる修飾を受けてもよい。修飾としては、その蛋白質が動物細胞または酵母等の真核細胞の培養により産生される過程で受ける可能性のあるポリペプチドの翻訳過程または翻訳後の修飾及び化学的修飾等がある。
本発明のポリペプチドの製造方法を開示する。
形質転換体を作成し、培養し、必要に応じて遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次いで培養混合物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせて、本発明のポリペプチドの精製を行う「培養混合物」とは、形質転換体、形質転換体を含む培地、もしくは培養上清または細胞のライセートを意味する。本発明の製造方法において、産生された本発明のポリペプチドが細胞培養上清中に分泌される場合は、培養上清から該ポリペプチドを精製できる。一方、該ポリペプチドが形質転換体内に蓄積される場合には、リゾチーム処理、界面活性剤処理、凍結融解、加圧、超音波処理その他の方法から宿主細胞に適したものを適宜選択して細胞を溶解または破砕した後、遠心分離、濾過等の方法により可溶性画分または不溶性画分として該ポリペプチドを回収し、精製する。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を配列番号9〜11に示す。組換えベクターは、該DNAを任意の塩基配列を有する他のDNA断片とライゲーションする方法、または任意のベクターに導入する方法(Sambrook J.等、Molecular Cloning,a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York、1989参照)等で得ることができる。具体的には、DNAとベクターとをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、得られた各断片をDNAリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよく、市販品を利用してもよい。ベクターの代表的なものとしては、pUC118、pBR322、pSV2−dhfr、pBluescriptII、PHIL−S1、λZapII、λgt10、pAc700、YRP17、pEF−BOS、pEFN−II等が挙げられる。
形質転換体は、上記組換えベクターを、宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。
本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれを形質転換したものであってもよい。原核細胞としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。真核細胞としてはCOS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、Namalwa細胞等の哺乳動物細胞の他、Sf細胞等の昆虫細胞や酵母を挙げることができる。このうち、大腸菌、哺乳動物細胞、酵母を形質転換して得られた形質転換体は扱いやすく、高発現量が期待できるので好ましい。
哺乳動物細胞の中では、遺伝子のコピー数を増加させることができるため、CHO細胞のdhfr欠損株を宿主とすることが好ましい。また、酵母の中では、外来タンパク質の分泌生産量が多いために、ピキア(Pichia)属の酵母や付加糖鎖が哺乳類と類似しているSchizosaccharomyces pombeを宿主とすることが好ましい。
形質転換体の培養は、各種の成書を参考にして、一般的な手法で行うことができる(例えば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、1992、参照)。
遺伝子の発現誘導を行う場合には、組み込まれたプロモーターによって適当な薬剤を選択して使用する。例えば、trpプロモーターが組み込まれている場合には3β−インドールアクリル酸を用い、MMTVプロモーターの場合にはデキサメタゾンを、またAOX1プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使用するとよい。
遺伝子の増幅方法の代表的な例としては、dhfr欠損CHO細胞を宿主とし、dhfrを有するベクターを使用した際にメトトレキセートを用いる方法等が挙げられる。
当該製造方法で使用する形質転換体は、本発明の形質転換体であれば、限定されないが、好ましくは、COS細胞および、CHO細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
EF1αのプロモーターを有する組換えベクターでCHO細胞等の哺乳動物細胞を形質転換して得られた形質転換体は、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地で培養する。細胞は、約1〜10×104細胞/mlの濃度で植え込み、37℃、5%炭酸ガス/95%空気の条件で培養を行う。通常、2〜3日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で培地を、血清不含のD−MEMに交換する。さらに引き続き、2〜3日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。前述したようにメトトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることが好ましい。さらに好ましくはdhfr欠損CHO細胞を宿主とし、dhfrを有するベクターを使用することである。
上述の培養混合物から本発明のポリペプチドを精製する方法としては、通常ポリペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な方法を適宜選択して行う。
(実施例)
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
実施例1 抗ヒトCD14の作製
[投与抗原の調製]
精製抗ヒトCD14モノクローナル抗体3C10(ATCCより購入し、通常の方法により調製し、精製したもの)5mgを、ハイトラップNHS活性化樹脂(Hitrap NHS−activated)(アマシャム−ファルマシア)のマニュアルにしたがい樹脂に結合し、3C10結合アフニティーカラムを調製した。
可溶型CD14は、ヒト血清(日本バイオテストより購入)100mLを調製したカラムに添加し、続けてリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、PBSと記載する)にて洗浄した。
波長280nmの吸光度が低下したのを確認した後、0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)を用いてカラムから溶出し、ダイアフロー(グレースジャパン)を用いて濃縮した。
PBSで透析後、タンパク濃度を波長280nmの吸光度(係数1O.D.=1mg/ml)より算出した。その結果、精製可溶型CD14約200μgを得、SDS−PAGE分析により約55kDのバンドを確認した。
[抗CD14モノクローナル抗体の調製]
Wistarラット(SLCより購入)メス8週令のフットパッドに100μgの精製可溶型CD14とフロインド完全アジュバント(Difco)とを1対1で混合したものを投与し、3週間後腸骨リンパ節を摘出し、無菌的にリンパ球を採取した。
得られたリンパ球をマウスミエローマ細胞SP2/O−Ag14(ATCC CRL1581)と5対1で混合しポリエチレングリコール1500(Sigma)を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む10%胎児血清/RPMI1640に懸濁し、96穴プレート(Nunc)に播種した。
5%CO2、37℃の条件下で培養し、増殖してくるハイブリドーマが確認できた段階でアミノプテリンを除いた培地に交換した。
細胞融合から1週間後に培養上清をサンプリングし、精製可溶型CD14を固相化したプレートでCD14に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、精製可溶型CD14を1μg/mLでプレート(Maxisorp、Nunc)に固相化し、0.1%ウシアルブミンを含むPBSでブロッキングした。次に培養上清を添加し、37℃で1時間反応させた後、0.05%Tween−20を含む0.9%生理食塩水で洗浄した。
各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体(DAKO)を添加し、37℃で1時間反応させ、洗浄後0.02%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、10分間反応後0.5M硫酸で反応を停止した。
プレートの吸光度を450nmの波長で測定し、吸光度が0.2以上のウエルを抗CD14抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
選択したハイブリドーマは限界希釈法(単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈/著、講談社)によりクローニングし、10日後に同様にスクリーニングを行い、抗CD14抗体産生ハイブリドーマを17クローン得た。
次にハイブリドーマを10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640で培養した後、細胞を回収しHybridoma−SFM(Gibco)で抗体産生を行い、モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。培養上清からろ紙で細胞を除いた後、プロテインGカラム(Prosep−G、ミリポア)で精製し、17種類の精製ヒトCD14抗体を得た。
実施例2 ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング
1)[スクリーニング系の作成」
▲1▼ヒトTLR4発現プラスミドの構築
ヒトTLR4 cDNAは翻訳領域が約2.5kbよりなるため(Genbank accession NO.AF17765)、TLR4 cDNAのクローニングは5’端側1.1kbおよび3’端側2.3kbを別々に行った。
5’端側のクローニングにはセンスプライマー1(tcgaggaagagaagacacca)、アンチセンスプライマー1(ccatccgaaattataagaaaagtc)を設計し、ヒト肺(human lung)cDNA(CLONTECH社)を鋳型とし、PyrobestDNAポリメラーゼ(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返し、PCRを行った。3’端側のクローニングにはセンスプライマー2(cccatccagagtttagccct)、アンチセンスプライマー2(cccaagctttggaattactcacccttagc)を設計し、ヒト脾(human spleen)cDNA(CLONTECH社)を鋳型に同様にPCRを行った。増幅したDNA断片をpBluescript IISK(+)(STRATAGENE社)のEcoRVサイトに挿入して、得られたTLR4 cDNAの塩基配列を確認した。
次に、これらプラスミドを用いて、翻訳開始コドンの856bp下流にあるEcoRIサイトにてTLR4 cDNAの5’端側及び3’端側を結合し、ホニュウ細胞発現ベクターpcDNA3.1(−)(Invitrogen社)に組み込み、ヒトTLR4発現プラスミドpcDNAT4を作製した。
▲2▼ヒトTLR4発現形質転換株の樹立
▲1▼で作製したプラスミドpcDNAT4を、ヒト胎児腎臓由来細胞株であるHEK293細胞(ATCC)に下記の方法で導入した。すなわちFuGENE6(ロシュ・ダイアグノスティックス社)25μlを6.3(gのpcDNAT4と添付プロトコールに従い混合し、75cm2フラスコにセミコンフルエントに増殖したHEK293細胞に添加した。5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した後に細胞を剥離し、1.2mgのG418(GIBCO−BRL社)及び10%非働化FBSを含むDMEM培地に再懸濁した。その後、週に2回培地交換を行い、20日間培養を続け、G418耐性株T4−14を得た。
2)[ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング]
T4−14細胞を10%非働化FBSを含むDMEM培地に懸濁し、1×105細胞/ウェル(well)で24ウェル−プレートに播き込み、5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した。その後、FuGENE6を用いて、リポータージーンpNFκB−Luc(CLONTECH社)を100ng/ウェル導入し、さらに24時間培養を続けた。終濃度1μg/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)、終濃度0.5μg/mlのsCD14(1−356)さらに抗CD14抗体3C10あるいは実施例1で得られた抗CD14抗体を終濃度1〜10μg/ml添加し、6時間培養を続けた後に、細胞をPassive Lysis Buffer(Promega社)で溶解し、ルチフェラーゼ(Luciferase)活性をLuciferase Assay System(Promega)を用いて添付のプロトコールにしたがって測定した。その結果、活性を有する抗体として、図1に示すように、10μg/mlの抗体添加系で、NF−κBの活性化を約50%阻止したF1024−1−3抗体を得た。
またF1024−1−3抗体のアイソタイプをRat MonoAB ID/SPキット(ZYMED)を用いてタイピングしたところ、IgG1/κであった。
実施例3 F1024−1−3抗体の交差反応性の確認
敗血症動物モデルにおけるF1024−1−3抗体の有用性を明らかにする目的でF1024−1−3抗体の各種動物由来CD14との交差反応性を検討した。まず、ヒトCD14(1−356)を50ng/ウェルでプレート(Maxisorp、Nunc)に固相化し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。
イヌ(ビーグル)、サル(カニクイ、アカゲ)、ウサギ(ニュージランド白色種)、ヒト(ポジティブコントロール)及びラット(ネガティブコントロール)の各血清をPBSで希釈したものを、ペルオキシダーゼ標識F1024−1−3抗体1μg/mLと混合し、ブロッキング液を除去したプレートに添加した。プレートを37℃で1時間反応し、洗浄液で5回洗浄後、0.02%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、10分間反応後0.5M硫酸で反応を停止した。プレートの吸光度を450nmの波長で測定した。4倍希釈血清の結果を図2に示す。
その結果、F1024−1−3抗体のヒトCD14への結合はウサギで52%、イヌで30%、アカゲで44%、カニクイで57%、ヒトで83%阻害され、F1024−1−3抗体はウサギ、イヌ、サルのCD14と交差反応性を示すことが示された。
次に、ウサギのCD14との結合をフローサイトメトリー法を用いて検討した。
ウサギ(ニュージランド白色種、北山ラベス)オス、2.2kgの耳動脈よりウサギ全血1mLをヘパリンで濡らしたシリンジで採血した。100μLに10mLのTris/NH4Cl溶液を加え、溶血させ、残った細胞分画を遠心して回収した。集めた細胞を5%牛血清/0.1%EDTA/PBS−でブロッキングし、再度遠心し、細胞を回収した。
次に細胞を1mLの5%牛血清/0.1%EDTA/PBS−に懸濁しF1024−1−3抗体、ヒトCD14(1−356)275ngでプレインキュベーションしたF1024−1−3抗体、ラットIgGをそれぞれ最終濃度1μg/mLとなるように添加し、4℃で1時間反応した。細胞懸濁液を0.25%牛血清/PBS−で3回洗浄後、1000倍に希釈したFITC標識抗ラット抗体(DAKO)に再懸濁し、4℃で30分間反応した。再度、細胞を洗浄し、FACS解析をFACSCalibur(BD社)で行い、蛍光強度を測定した。
図3に示すように、ウサギ単球はF1024−1−3抗体で染色され、ヒトCD14で前処理することにより、染色が阻害された。また、コントロール抗体(ラットIgG)では染色されなかった。したがって、F1024−1−3抗体は単球上のウサギCD14と結合することが確認された。
実施例4 F1024−1−3抗体のIL−6産生阻害活性
ヒト血管内皮細胞HUVEC(三光純薬社)を0.05% トリプシン0.53mM EDTAを含むPBS−で剥離後、健常人ヒト血清より抗CD14抗体を用いて可溶型CD14を除去した血清を2%含むRPMI1640培地(旭テクノガラス社)(以下2%CD14w/oHS/RPMIと表記)にて懸濁し、5×104細胞/ウェル(50μl/ウェル)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。
可溶型CD14を除去したヒト血清を14%含むRPMI1640培地を10μl、120ng/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)10μl、3.6μg/mlの血清由来可溶型CD14を10μl、及び900ng/mlのF1024−1−3抗体または3C10抗体40μlを加えて細胞に添加した。この混合液を20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をヒトIL−6 EIAキット(PE Biosystems社)で測定した。
IL−6の測定はヒトIL−6 EIAキット添付のプロトコールに従い、行った。即ち、培養上清100μlをIL−6抗体固相化プレートに移し、37℃で60分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し400μl/ウェルのWash Buffer 2で4回洗浄し、100μl/ウェルで抗ヒトIL−6抗体を添加し37℃、30分間インキュベーションを行った。反応液を除去、400μl/ウェルのWash Buffer 2で4回洗浄した後にペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を100μl/ウェル加え、さらに37℃、30分間インキュベーションを行った。
洗浄後発色基質(TMB)を100μl/ウェル添加し室温で15分間反応させた後に、停止液100μl/ウェルを加え反応を停止した。450nmの波長の吸光度を測定し、サンプル中のIL−6の産生量を算出した。なお、コントロール抗体のラットIgGおよび3C10抗体は精製標品を使用した。
その結果を図4に示す。抗体を加えないときのIL−6産生量を100%とした。F1024−1−3抗体及び3C10抗体にIL−6産生阻害活性が認められたが、F1024−1−3抗体は0.3μg/mLで60%以上産生を阻害した。3C10抗体はF1024−1−3抗体より、阻害が弱かった。F1024−1−3抗体は内皮細胞の炎症性サイトカイン産生阻害効果が3C10抗体よりも優れていることが明らかとなった。
また、実施例1のスクリーニングで選択された物質が、実際に細胞のサイトカインを抑制することが明らかとなった。
実施例5 F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体系形成後のIL−6産生抑制測定
実施例4と同様にヒト血管内皮細胞HUVEC(三光純薬社)を懸濁し、5×104細胞/ウェル(50μl/ウェル)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。可溶型CD14を除去したヒト血清を14%含むRPMI1640培地を10μl、120ng/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)10μl、3.6μg/mlの血清由来可溶型CD14を10μl混合し、37℃下1時間インキュベーションしてLPS/CD14複合体を形成させた。その後LPS/CD14混合液に900ng/mlのF1024−1−3抗体または3C10抗体40μlを加えて細胞に添加した。さらに20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をヒトIL−6EIAキット(PE Biosystems社)で測定した。
IL−6の測定はヒトIL−6 EIAキット添付のプロトコールに従い、行った。なお、コントロール抗体のラットIgGおよび3C10抗体は精製標品を使用した。
その結果を図5に示す。抗体を加えないときのIL−6産生量を100%とした。F1024−1−3抗体はIL−6産生阻害活性が認められたが、3C10抗体はコントロール抗体と同程度であり、LPS/CD14複合体形成後ではIL−6の産生抑制効果が認められなかった。以上の点より、F1024−1−3抗体は内皮細胞のLPS/CD14複合体形成後でも炎症性サイトカイン産生阻害効果があり、したがってすでにLPSが体内に進入した後の患者、すなわち敗血症と判断された後の患者でも症状の改善効果が期待できることが明らかとなった。
実施例6 F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体への結合試験
細胞膜上のCD14とLPSの結合に対する抗CD14抗体の影響について、フローサイトメトリー(Flow cytometry)法により解析を行った。ヒト単球系細胞株THP−1を40ng/mlの1α,25−ジヒドロキシビタミン(dihydroxyvitamin)D3(フナコシ社)で48時間培養し、分化誘導させた後に、10μg/mlの抗CD14抗体(3C10あるいはF1024−1−3抗体)を含むかまたは含まない培地(10%FBSを含むRPMI1640)中にて37℃、30分間インキュベーションした。その後に、FITC標識LPS(Sigma社)を終濃度1ng/mlで添加し、37℃でさらに15分間インキュベーションした。その後、直ちに等容量の氷冷したRPMI1640培地を添加し、FACSCalibur(BD社)を用い蛍光強度を測定した。
結果を図6に示す。図6に示すように、LPSのCD14結合によって観察される特異的蛍光が、3C10抗体により完全に抑制されたが、F1024−1−3では部分的にしか抑制されず、F1024−1−3抗体はLPSのCD14への結合を抑制していないことが示された。
実施例7 グラム陽性菌菌体成分に誘導されるIL−6産生阻害活性
ヒト腎由来細胞株U−373MG(ATCC)を0.05% Trypsin,0.53mM EDTAを含むPBS−で剥離後、RPMI1640培地(旭テクノガラス社)にて懸濁し、3×104cells/well(100μl/well)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。RPMI1640培地を70μl、1μg/ml(w/v)のStaphylococcus aureus cell suspendion(Sigma社)10μl、5μg/mlのsCD14(1−356)を10μl及び10μg/mlのF1024−1−3抗体10μlをウェルに添加し、さらに20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をhuman IL−6 EIA kit(IL−6 Eli−pair:GIBCO BRL社)で測定した。コントロールとして、CD14改変体ポリペプチド、F1024−1−3抗体の代わりにsCD14(1−356)を添加した。
IL−6の測定はhuman IL−6 EIA kit添付のプロトコールに従い、行った。すなわち、1%(w/v)BSA/PBS(−)にて4倍希釈した培養上清50μlをIL−6抗体固相化プレートに移し、ビオチン化抗ヒトIL−6抗体50μlを加え37℃で60分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し400μl/wellの0.05%(v/v)Tween−20/PBS(−)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を100μl/well加え、さらに37℃、20分間インキュベーションを行った。洗浄後発色基質(TMB)を100μl/wellを添加し室温で15分間反応させた後に、停止液(1M HCl)100μl/wellを加え反応を停止した。450nmの波長の吸光度を測定し、サンプル中のIL−6の産生量を算出した。F1024−1−3抗体のIL−6産生阻害活性は55.2%であった。
この結果より,F1024−1−3がグラム陽性菌菌体成分に誘導されるサイトカイン産生を抑制することが示された。
実施例8 LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体の有効性
敗血症モデルにおけるF104−1−3抗体の有効性を確認する目的で、LPS負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、F1024−1−3抗体の有効性を抗体前投与及び後投与の2種類のプロトコールにより検討した。
[F1024−1−3抗体の前投与効果]
(1)LPS前投与
LPS負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13875,1998)に準じ、LPS(Salmonella minnesota Re595、Sigma社)をニュージランド白色種(2.1−2.4kg、北山ラベス)に0、5、24時間毎に5μg/kgを耳静脈より投与することにより作製した。前投与群のプロトコールはF1024−1−3抗体を−1、4、23時間毎に2.5mg/kgを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。まず、体重により群れ分けを行い、各群5羽を選択し、−1時間に前採血を行なった。次に、1、3、5、7、23、25、28、48時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清GPT値、血清クレアチニン値、血清TNFα値を測定した。なお、白血球数はSysmex F−280(東亜医用電子)により、血清GPT値、血清クレアチニン値はDRI−CHEM5000(FUJI FILM)により測定した。
また、TNFαはDavidらの方法(Journal of Immunological Methods,68:167,1984)に準じて、L929細胞(ATCC)を0.25%トリプシン/PBS−で剥離後、5.5×105細胞/mLに再懸濁し、5.5×104細胞/ウェルでプレートに播種した。37℃、5%CO2下で一晩培養後、上清を除きTNF標準品(ヒトTNF、持田)または希釈した検体100μLを添加し、続けて最終濃度5μg/mLとなるようにアクチノマイシンD(Sigma)を添加して、37℃、5%CO2下で20時間培養した。
TNF量はプレートの培養上清を100μL除いた後、WST−1溶液(同仁化学)を10μL添加して、37℃で40〜90分間インキュベーション後、450nmの吸光度を測定し、産生された血清中のTNF量を吸光度の相対値として表示した。さらに、48時間後の生存率をもって、F1024−1−3抗体の有効性を判定した。
まとめを、表1に示す。その結果、F14024−1−3抗体投与群では48時間後の生存率は100%(5/5)であったのに対して、生食投与群では40%(2/5)であり、F1024−1−3抗体投与により生存率は有意に改善された。また、28時間後の各パラメータの値もF1024−1−3抗体投与群で生食投与群に比較して前値に近い値を示した。
さらに、図7に示すように血清中のTNFの産生量はF1024−1−3抗体投与により抑制され、in vivoにおいてもin vitro同様、炎症性サイトカインの産生をF1024−1−3抗体が抑制することが明らかとなった。
表1はF1024−1−3抗体のLPS負荷ウサギ敗血症モデルにおける前投与での死亡率の改善、各種パラメータの改善を示している。
さらに、グラム陽性菌に対する効果を確認する目的で、LPSの変わりにLTA/PepGを投与し、F1024−1−3抗体の白血球減少症の改善効果を検討した。すなわち、F1024−1−3抗体(2.5mg/kg)または生食をニュージランド白色種(2.1−2.4kg、北山ラベス)に投与し、1時間後LTA(Sigma)及びPepG(Fluka)160μg/mLを耳静脈より投与した。
LTA/PepG投与直前を0時間として、毎時間採血し白血球数を測定したところ、図8に示すように、生食投与群では白血球数の減少が観察されたのに対して、F1024−1−3抗体投与群では白血球数の減少が観察されず、F1024−1−3抗体がLTA/PepGに由来する白血球減少症に対しても効果を示し、グラム陽性菌に由来する敗血症に対しても有効性が確認された。
(2)[F1024−1−3抗体の後投与効果]
(1)の方法にしたがって、LPS負荷ウサギ敗血症モデルを作製した。後投与群のプロトコールはF1024−1−3抗体を4、23時間毎に2.5mg/kgを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。
まず、同様に群れ分けを行なったウサギ、各群5羽をより、−1時間に前採血を行なった。次に、プロトコールにしたがってLPSを投与し、さらに1、3、5、7、24、26、28、48時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清GPT値、血清クレアチニン値を同様に測定した。
まとめを、表2に示した。その結果、F14024−1−3抗体投与群では48時間後の生存率は100%(5/5)であったのに対して、生食投与群では80%(4/5)と有意な差が認めれなかったが、28時間後の各種パラメータではF1024−1−3抗体投与群は正常値に近い値であり、一方、生食投与群は細胞が傷害されたことを示す異常値であった。また、図9に示すように血清中のクレアチニン値は経過観察中に大きな変動は認められず、F1024−1−3抗体にLPS負荷により惹起される組織傷害を抑制する効果があることが確認された。
表2はF1024−1−3抗体のLPS負荷ウサギ敗血症モデルにおける後投与での各種パラメータの改善を示している。
実施例9 蛋白質相互作用解析装置を用いた阻害機構の解析
(1)[49kDa高分子量のCD14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製]
▲1▼49kDa高分子量のCD14蛋白質に特異的なペプチドの作製
配列番号1に記載の316番目から328番目の配列を、免疫に使用する49kDa高分子量のCD14特異的なペプチド(以下、ペプチド13と記載)として選択した。
なお、選択したペプチドをC末端でSH基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、C末端にシステインを挿入した。ペプチドの合成はABI432Aペプチド合成機(アプライド)を用いて行った。定法により樹脂よりペプチドを切り出し、C18逆相HPLC(CAPCELL−PAK、資生堂)を用いてペプチドを精製した。
▲2▼合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の作製
▲1▼で作製したペプチドを蒸留水で10mg/mLに溶解し、10mg/mLのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、PIERCE)と等量混合した。室温で2時間反応後、NAP−10カラム(ファルマシア)で脱塩しペプチド13キャリア抗原(以下、ペプチド13−KLHと記載)を得た。蛋白質濃度は使用したKLH量を液量で割ったものを用いた。
▲3▼49kDa高分子量のCD14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製
ペプチド13−KLH100μgを免疫源とし、実施例1(1)に記載の方法と同様に細胞融合を行った。HAT培地(GIBCO)によりハイブリドーマを選択し、1週間後、組換えヒトCD14蛋白質と反応する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。
まず0.01M炭酸緩衝液(pH9.5)により精製した組換えヒトCD14蛋白質を1μg/mLに希釈し、イムノプレート(Maxisorb、NUNC)の各ウエルに50μL添加した。37℃で1時間反応後、イオン交換水で5回洗浄し、0.5%BSAを含むPBSを各ウエルに100μL添加しブロッキングを行った。次に選択したハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し37℃で1時間反応させた後、0.05%Tween20を含む生理食塩水で3回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体(DAKO)を10%ウサギ血清を含むPBSで1000倍に希釈し各ウエルに50μL添加した。37℃で1時間反応後、同様に5回洗浄し0.01%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で10分間反応後、0.5M硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計(NJ−2100、日本インターメッド)で450nmの吸光度を測定した。その結果、高分子量のCD14蛋白質と反応したハイブリドーマを含むウエル(F1025−4−1)を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。
選択したハイブリドーマを10%FCS/RPMI−1640培地(GIBCO)で培養後、Hybridoma−SFM培地(GIBCO)で培養し抗体を産生させ、Prosep−Gカラム(Bioprossesing)を用いて抗体を精製した。精製したF1025−4−1抗体のサブタイプはラットIgG1/κであった。
▲4▼HRP標識抗体の作製
0.5mgのペルオキシダーゼ(東洋紡)を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した100mMの過ヨウ素酸を添加し25℃で20分間反応した。反応終了後1.5%エチレングリコールを添加し25℃で10分間反応後1mM酢酸緩衝液(pH4.4)に対して透析した。精製F1025−4−1抗体を10mM炭酸緩衝液(pH9.5)で透析し、0.5mgに対して1M炭酸緩衝液(pH9.5)を添加して活性化した0.5mgのペルオキシダーゼをそれぞれの抗体と等量に混合し25℃で2時間反応した。4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに2時間4℃で反応した。反応液をPBSに透析しペルオキシダーゼ標識抗体を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
(2)[F1024−1−3抗体の阻害機構の解析]
▲1▼組み換えTLR4の発現
COS−1細胞(ATCC:CRL1150)を3×105cells/75cm2のフラスコに接種し、37℃5%CO2下で一昼夜培養した。翌日、実施例2(1)記載のプラスミドpCDNAT4を用いてFuGENE6(Roche)記載のプロトコールにしたがって6.25μg DNA:25μl FuGENE6の比率で混合し、1%FBS/DMEM(Sigma、高グルコース)を15mL添加したフラスコに加え、37℃5%CO2下で48時間培養した。また、プラスミドを含まないで同様に操作したCOS−1細胞をネガティブコントロールとした。TLR4分子を細胞膜上に発現したCOS−1細胞(以下、TLR4−COSと記載する)、及び発現していないCOS−1細胞の上清を廃棄し、PBS−(Sigma)で2回細胞を洗浄した。次に1%EDTA/PBS−溶液を5ml添加し、軽く攪拌後、セルスクレイパー(COSTAR)を用いて細胞を培養フラスコより剥がし、50mLの遠沈管に回収した。フラスコをさらに5mLのPBS−で洗浄し、50mL遠沈管に加え、1000rpmで10分間遠心し、細胞を沈殿させた後上清を廃棄し、さらに2回PBS−で細胞を洗浄した。次に洗浄した細胞を40μmのセルストレイナー(FALCON)でろ過し、細胞数をカウントした。一度遠心し、5×105cells/mLとなるようにPBS−で希釈し4℃で保存した。
▲2▼抗FITC抗体固定化チップの調製
BIACORE3000(BIACORE社)の解析に使用するチップ上のセルに抗FITCモノクローナル抗体(OEMconcept社)を固定化するため、ビアコア社マニュアルに従い、NHS/EDC溶液(BIACORE社)によりセルを7分間活性化後、pH6.0の酢酸緩衝液で50μg/mLに希釈した抗体をマニュアルインジェクション法により添加し抗体を固定化後、エタナールアミンによりブロッキングを行った。リファレンスは未処理セルを使用した。▲3▼FITC−LPS/CD14複合体の調製
PBS−(pH7.4)で6μg/mLに希釈したFITC−LPS(Sigma、Serotype0111:B4)と上記で調製した組み換えsCD14(1−356)300μg/mLを1:1混合し、37℃で30分間静置することにより複合体を形成した。複合体の形成は抗FITC抗体固相化プレートと(1)で調製したペルオキシダーゼ標識抗CD14抗体(F1025−4−1)を用いたELISA系で確認した。すなわち、抗FITC抗体を10μg/mLでプレートに固相化し、0.5%牛血清アルブミン/PBS−でブロッキングした。次に調製したFITC−LPS/CD14複合体、FITC−LPS、sCD14の3種類のサンプルを抗体固相化ウエルに添加し、37℃で1時間反応した。各ウエルを洗浄後、1μg/mLに希釈したペルオキシダーゼ標識坑CD14抗体と反応させ、洗浄後TMB発色基質溶液(BioFix、フナコシ)により反応させ、適度な発色が得られた段階で、硫酸で反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。その結果、FITC−LPS、sCD14単独では吸光度の上昇が見られないのに対してFITC−LPS/CD14複合体でのみ吸光度が上昇し、複合体が形成されていることが確認された。
▲4▼阻害機構の解析
調製したFITC−LPS/CD14複合体をチップ上に結合し、次にHBS−EP緩衝液で130μg/mLに希釈したF1024−1−3抗体をインジェクとし固定化したCD14に抗体を結合した。次にTLR4−COS細胞、コントロールとしてCOS細胞を添加し、TLR4−COS細胞、COS細胞の結合量を測定した。図10に結果を示したが、棒グラフの高さはセル上に結合した量を示している。すなわち、セルにLPS/CD14複合体が結合することによりレスポンスの上昇が観察された。次にCOS細胞ではレスポンスが観察されなかったことから結合が認められなかった。一方、TOLL4−COS細胞ではレスポンスの上昇(200RU)が観察され、結合が確認された。LPS/CD14に抗体を反応させると同様にレスポンスの上昇が観察され、結合が確認された。さらにCOS細胞、TOLL4−COS細胞を反応させると、それぞれにレスポンスの上昇(TOLL4−COS細胞で136RU、COS細胞で115RU)が観察された。COS細胞のレスポンスの上昇は細胞と抗体の非特異的な結合に由来するため、以下の式を用いて阻害率を算出したところ、阻害率は90%であった。このことはF1024−1−3抗体がCD14に結合することにより、TLR4とCD14の結合が阻害されたことを示しており、F1024−1−3抗体の抑制機構がTLR4のCD14への結合阻害によることが明らかとなった。阻害率の算出は(F1024−1−3抗体なしでのTLR4−COS(TOLL4−COS)細胞のレスポンス)−{(F1024−1−3抗体結合時のTOLL4−COS細胞のレスポンス)−(F1024−1−3抗体結合時のCOS細胞のレスポンス)}/(F1024−1−3抗体なしでのTOLL4−COS細胞のレスポンス)×100(%)により算出した。
実施例10 ヒトTLR4発現形質転換株におけるサイトカイン産生阻害試験
実施例2(1)で得たHEKT4−14を24well−plateへ0.8×105cells/wellで植え込み、実施例2(2)と同様にF1024−1−3あるいは後述する実施例11で作成したsCD14(1−307)S286Cの存在下もしくは非存在下でLPS/sCD14で刺激した。20時間後に培養上清を回収し、上清中のIL−8産生量をEIAによって確認した。その結果、F1024−1−3、sCD14(1−307)S286C共に、添加濃度依存的に抑制活性を示した。(図11)
(実施例11)
F1024−1−3抗体の認識領域の解析
F1024−1−3抗体が認識する領域を明らかにするため、ペプチドによる阻害実験、CD14C欠失改変体による結合実験、CD14アミノ酸置換改変体による結合実験を行なった。
(1)[CD14ペプチドの調製]
配列番号1に記載のCD14アミノ酸配列に基づき、ペプチドA(配列番号12)、ペプチドB(配列番号13)、ペプチドC(配列番号14)及びペプチドD(配列番号15)の4種類のペプチド及びコントロールとしてペプチドE(配列番号16)を合成した。すなわち、ペプチド合成機(432A、アプライドバイオシステムズ)を用いて、使用法に従いペプチドを合成し、定法に従って脱保護、切り出しを行い、C18カラム(CAPCELL−PAK、資生堂)を用いてHPLCにより精製した。精製分画を回収し、凍結乾燥後、重量を測定し、蒸留水で10mg/mlに溶解した。
(2)ヒトCD14のアミノ酸を欠失したCD14改変体(ヒト可溶型CD14欠失改変体)の調製
▲1▼[全長型sCD14発現プラスミド(pM1656)の構築]
まず、mCD14を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドpM1650を構築した。WO98/39438に記載のプラスミドpUCH14P−4より、XbaI及びHindIIIによりヒトCD14 cDNAを含む約1.4kbのDNA断片を切り出し、哺乳動物細胞発現ベクターであるpcDNA3.1(−)(Invitrogen社)のXbaI/HindIIIサイトに挿入した。その後、E.coli Competent Cells(JM109細胞、TaKaRa社)を添付のプロトコールに従い形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のmCD14を発現するプラスミド(pM1650)を得た。
次にヒトCD14を可溶型タンパクとして発現させるため、GPIアンカーリングに必要なサイトであるN末端から326番目のAsnと328番目のGly(配列番号1参照)をそれぞれGln、Valに置換した組換え体発現プラスミドpM1656の構築を行った。すなわち、センスプライマー3(配列番号17)とアンチセンスプライマー3(配列番号18)を用い、上記pM1650を鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(TaKaRa社)により94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。増幅したDNA断片をXhoIとApaLIによりdouble digestionし、pM1650のXhoI/ApaLIサイトに挿入した。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のsCD14を発現するプラスミド(pM1656)を得た。
▲2▼[ヒト可溶型CD14C末端欠失改変体ポリペプチド発現プラスミド(pM1658〜pM1662およびpM1674〜pM1676)の構築]
ヒトCD14のC末端よりそれぞれ49、56、61、66、71、110、173、204アミノ酸を欠失させた組換え体(以下sCD14(1−307)、sCD14(1−300)、sCD14(1−295)、sCD14(1−290)、sCD14(1−285)、sCD14(1−246)、sCD14(1−183)、sCD14(1−152))を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドpM1658、pM1674、pM1675、pM1676、pM1659、pM1660、pM1662及びpM1661は以下の方法で構築した。
まず、センスプライマー3とアンチセンスプライマー4、5、6、7、8、9、10及び11(配列番号19、20、21、22、23、24、25及び26)を用い、(1)で作製したプラスミドpM1656を鋳型とし、Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。
次に増幅したDNA断片をXhoIとHindIIIによりdouble digestionし、1%アガロースゲル電気泳動により分離精製した。またpM1656を同様にXhoIとHindIIIで消化、精製し、得られた約5.8kbのDNA断片と上記PCR断片をligationした。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のCD14改変体ポリペプチドを発現するプラスミド(pM1658、pM1674、pM1675、pM1676、pM1659、pM1660、pM1662及びpM1661)を得た。
▲3▼[COS−1細胞での発現]
(1)及び(2)で作製したプラスミドpM1656、pM1658〜pM1662及びpM1674〜pM1676をCOS−1細胞に下記の方法で導入し、sCD14(1−356)、sCD14(1−307)、sCD14(1−300)、sCD14(1−295)、sCD14(1−290)、sCD14(1−285)、sCD14(1−246)、sCD14(1−183)及びsCD14(1−152)を発現させた。すなわちFuGENE6(ロシュ・ダイアグノスティックス社)50μlを上記プラスミドDNA各12.5μgと添付プロトコールに従い混合し、150cm2フラスコにセミコンフルエントに増殖したCOS−1細胞に添加した。5%CO2、37℃の条件下で72時間培養した後に、培養上清を回収し目的のCD14改変体ポリペプチドを得た。
CD14改変体ポリペプチドの発現量を、抗ヒトCD14抗体を用いたEIAにて測定した。すなわち、pH8.3の10mM NaHCO3緩衝液にて200倍希釈した抗CD14抗体MEM−18(MONOSAN社)を96ウェルプレート(Maxisorp,Nunc社)に50μl/well添加し、4℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、0.5%BSAを含むPBS−にてブロッキングを行った(室温で60分間静置)。
次にwell中の液を除去し、トランスフェクションしたCOS−1の培養上清を50μl/well添加し、25℃で60分間インキュベーションした後に、0.1%Tween20を含むPBS−で3回洗浄後、1.0μg/mlのHRP−conjugated 3C10抗体50μl/wellを添加し、25℃で60分間インキュベーションを行った。0.1%Tween20を含むPBS−で5回洗浄後、発色基質(TMB)を100μl/well添加し室温で30分反応させた後に、停止液(1N塩酸)100μl/wellを加え反応を停止した。
450nmの波長の吸光度を測定し、サンプルのCD14改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
▲4▼[sCD14(1−307)アミノ酸欠失体の調製]
また、sCD14(1−307)のアミノ酸配列より一部のアミノ酸を欠失させた各種ヒト可溶型CD14欠失改変体(以下、欠失部分をΔで示す)Δ7−11、Δ57−64、Δ180−234、Δ235−282、Δ180−282を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドは▲1▼及び▲2▼と同様に行った。但し、使用したプライマーは、Δ7−11についてはセンスプライマー4(配列番号27)とアンチセンスプライマー12(配列番号28)及びセンスプライマー5(配列番号29)とアンチセンスプライマー12(配列番号30)を、Δ57−64についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー14(配列番号31)及びセンスプライマー6(配列番号32)とアンチセンスプライマー13を、Δ180−234についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー15(配列番号33)及びセンスプライマー7(配列番号34)とアンチセンスプライマー13を、Δ235−282についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー16(配列番号35)及びセンスプライマー8(配列番号36)とアンチセンスプライマー13を、Δ180−282についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー17(配列番号37)及びセンスプライマー9(配列番号38)とアンチセンスプライマー13をそれぞれ用いた。次に得られたプラスミドを▲3▼に従い、COS−1細胞に導入し、ヒト可溶型CD14欠失改変体を得た。
CD14改変体の発現量を、抗ヒトCD14抗体を用いたEIAにて測定した。すなわち、pH8.3の10mM NaHCO3緩衝液にて200倍希釈した抗CD14抗体MEM−18(MONOSAN 社)を96ウェルプレート(Maxisorp,Nunc社)に50μl/Well添加し、4℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、0.5%BSAを含むPBS−にてブロッキングを行った(室温で60分間静置)。
次にウェル中の液を除去し、トランスフェクションしたCOS−1の培養上清を50μl/Well添加し、25℃で60分間インキュベーションした後に、0.1% Tween20を含むPBS−で3回洗浄後、1.0μg/mlのHRP−conjugated 3C10抗体50μl/Wellを添加し、25℃で60分間インキュベーションを行った。0.1% Tween20を含むPBS−で5回洗浄後、発色基質(TMB)を50μl/Well添加し室温で30分反応させた後に、停止液(1N硫酸)50μl/Wellを加え反応を停止した。
450nmの波長の吸光度を測定し、サンプルのCD14改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
次に、ヒト可溶型CD14C末端欠失改変体が目的の長さであるかを確認するため、CD14改変体の分子量を抗ヒトCD14抗体(3C10およびMEM−18)を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち各CD14改変体30ng/レーンをSDS−polyacrylamide gradient gel(5−20% ATTO社)で電気泳動し、PVDF膜(日本ミリポア社)にタンパクを転写した後、0.5% スキムミルクを含むPBS 30mlにて室温で1時間ブロッキング反応を行い、10μg/mlの3C10および100倍希釈のMEM−18を添加して室温で1時間反応させた。さらにHRP−conjugated抗マウスIg抗体と室温で30分間反応させた後、ECLキット(Amersham Pharmacia Biotech社)を用い、検出した。その結果、各CD14改変体ポリペプチドの計算上の大きさにバンドが検出された。
▲5▼[ヒトCD14アミノ酸置換改変体の調製]
本明細書中においてsCD14(1−307)のN末端から283番目のアミノ酸LeuをAlaに置換したヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドを「sCD14(1−307)L283A」と記載し、他のヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドも同様に記載した。
ヒトCD14(1−307)の種々の場所に1あるいは2アミノ酸変異を導入したヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドを作製するために、以下の方法で哺乳動物細胞発現プラスミドを作製した。
sCD14(1−307)K279Aを発現するプラスミドpM1673は、センスプライマー4とアンチセンスプライマー18(配列番号38)あるいはセンスプライマー10(配列番号39)とアンチセンスプライマー13を用い、▲2▼で作製したプラスミドpM1658を鋳型とし、Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。
アンチセンスプライマー18とセンスプライマー10にはLysをコードする配列の代わりにAlaをコードする配列GCT(アンチセンスプライマーはAGC)を用いた。これらのPCRによって増幅されたDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動によって分離回収し、Klenow Fragment(TaKaRa社)を用いてDNA断片の末端を平滑化した。
次にこれらの断片のmixtureを鋳型に、センスプライマー5とアンチセンスプライマー6を用い、上記と同様の条件で再度PCR反応を行った。2度目のPCRで増幅されたDNA断片をXhoIとHindIIIによりdouble digestionし、pM1656をXhoIとHindIIIで消化することにより得られる約5.8kbのDNA断片とligationした。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のCD14改変体ポリペプチドを発現するプラスミド(pM1673)を得た。
また同様に、N末端から282番目のVal、283番目のLeu、284番目のAsp、285番目のLeu、286番目のSer、287番目のCys、289番目のArg、294番目のPro、296番目のPro、294番目及び296番目のProあるいは300番目のProをそれぞれAlaへ置換したsCD14(1−307)V282A、sCD14(1−307)L283A、sCD14(1−307)D284A、sCD14(1−307)L285A、sCD14(1−307)S286A、sCD14(1−307)C287A、sCD14(1−307)R289A、sCD14(1−307)P294A、sCD14(1−307)P296A、sCD14(1−307)P294/296AあるいはsCD14(1−307)P300Aを発現するプラスミド(pM1663、pM1677、pM1664、pM1678、pM1665、pM1666、pM1667、pM1669、pM1670、pM1671あるいはpM1672)は、それぞれ置換を導入するアミノ酸のコドン配列をAlaのコドン配列GCTあるいはGCG(アンチセンスプライマーはAGCあるいはCGC配列)に変えたアンチセンスプライマー19、20、21、22、23、24、25、26、27、28及び29(配列番号41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及び51)とセンスプライマー11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び21(配列番号52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62)を用い、pM1673と同様の方法で作製した。
さらにsCD14(1−307)R289Dを発現させるプラスミド(pM1668)も同様に構築した。この際、Aspへの置換のためArgのコドン配列(AGA)をAspのコドン配列GAT(アンチセンスプライマーはATC)に変えたセンスプライマー22(配列番号63)及びアンチセンスプライマー30(配列番号64)を用いた。
さらに、286番目のSerをCys、Gly、Thr、Leuにそれぞれ置換した改変体を発現するプラスミドを作製した。構築方法はsCD14(1−307)S286A発現プラスミドの構築と同様で、Cys置換の場合はセンスプライマー23(配列番号65)及びアンチセンスプライマー31(配列番号66)を用いた。Gly置換の場合はセンスプライマー24(配列番号67)及びアンチセンスプライマー32(配列番号68)を、Thr置換の場合はセンスプライマー25(配列番号69)及びアンチセンスプライマー33(配列番号70)を、Leu置換の場合はセンスプライマー26(配列番号71)及びアンチセンスプライマー35(配列番号72)を用いて構築を行った。
次に得られたプラスミドを▲3▼に従い、COS−1細胞に導入し、ヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体を得た。
得られたCD14改変体を含む培養上清は、必要に応じて精製した。すなわち、抗ヒトCD14抗体(3C10)を結合したアフィニティー精製用カラム(HiTrapカラム(Amersham Pharmacia Biotech社))に供して選択的に吸着させ、pH勾配にて溶出した。得られた溶出画分はただちにpH8.0の1M HEPES緩衝液にて中和し、pHを中性とした。各画分はHRP−conjugated 3C10を用いたEIA法により検定し、CD14改変体ポリペプチドの含まれる画分を選択した。
(4)[ペプチドによる阻害実験]
精製sCD14(1−356)1μg/mlを炭酸緩衝液(pH9.5)に希釈し、プレート(Maxisorp、Nunc)に37℃、1時間で固相化した後、プレートを洗浄し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。ブロッキング液を除去し、(1)で調製した各ペプチドをPBSで10μg/mlに希釈し、添加した。続けて、中根ら(J.Histochem.Cytochem.22:1084,1974)の方法によりペルオキシダーゼで標識したF1024−1−3抗体を1μg/mLで添加し、37℃で1時間反応させた。
0.9%NaCl/0.5% Tween20で5回洗浄し、H2O2/TMB溶液を用いて発色させた後0.5M硫酸で反応を停止し、結合したF1024−1−3抗体の量を測定した。
その結果、図12に示すように、F1024−1−3抗体はペプチドA、Bでは弱いながら阻止されたが、ペプチドC、D及びコントロールに用いた無関係なペプチドEでは阻止されず、F1024−1−3抗体の認識する領域は283番目のアミノ酸より318番目のアミノ酸の間にあることが推定された。
(5)[CD14欠失改変体による抗体との結合実験]
プレート(Maxisorp、Nunc)に、10μg/mlで3C10抗体または100倍希釈したMEM−18抗体を固相化し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。次に、ブロッキング液を除去し、濃度を測定した各CD14欠失改変体を添加して室温で1時間反応した。洗浄後、10%RS/0.1% Tween−20/PBSに1μg/mlの濃度で希釈したペルオキシダーゼ標識F1024−1−3抗体またはペルオキシダーゼ標識3C10抗体を添加し、同様に室温で1時間半反応させた。洗浄後、H2O2/TMB溶液を用いて発色させた後0.5M硫酸で反応を停止し、吸光度を450nmの波長によりNJ−2100(日本インターメッド)プレート吸光度計で測定した。
固相に使用した3C10及びMEM−18抗体はそれぞれの結合サイトが7−11番目のアミノ酸、57−64番目のアミノ酸であることが明らかであるため、今回用いたCD14欠失体のうちCD14(Δ7−11)は3C10と結合せず、またCD14(Δ57−64)はMEM−18と結合しないが、他のCD14欠失体とは結合する。したがって、3C10/F1024−1−3系、MEM−18/F1024−1−3系、MEM−18/3C10系の3種類のサンドイッチELISA系の結果を解析することにより、それぞれの抗体の結合活性を解析できる。
得られた結果を解析したところ、図13に示すように、F1024−1−3抗体はsCD14(1−356)からsCD14(1−307)までは結合活性が認められ、また、3C10の結合サイトを欠失したCD14(Δ7−11)、MEM−18の結合サイトを欠失したCD14(Δ57−64)とも結合し、さらにsCD14(1−307)の180番目のアミノ酸より282番目のアミノ酸を欠失したCD14(Δ180−282)とも結合活性が認められた。このことから、F1024−1−3抗体は3C10、MEM−18抗体とは異なる抗体であり、また、結合領域は285番目よりC末端側であることが明らかになった。なお、sCD14(1−307)結合活性は他のCD14欠失体に比較して弱いため、表示を(+)で示した。
(6)[CD14アミノ酸置換改変体による結合実験]
上記と同様な測定系を用いてCD14アミノ酸置換改変体の結合活性を測定した。その結果、図14に示すように294番目のアミノ酸をProからAlaに置換することによりF1024−1−3抗体の結合活性が失われ、このような現象は3C10、MEM−18抗体には認められなかった。F1024−1−3抗体がCD14の294番目のプロリンをポイントミューテーションすることにより結合しなくなることは、CD14の立体構造が変化したことが原因である。したがってF1024−1−3抗体は294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。
(7)[ペプチドマッピングによる結合実験]
F1024−1−3抗体が認識するエピトープをさらに詳細に解析する目的で、SPOTs(GENOSYS)を用いて配列番号1に記載のCD14のアミノ酸番号246番目から345番目までの間のアミノ酸配列に基づき、2アミノ酸ずつC末側に配列をずらした10アミノ酸残基のペプチド46種類をメンブレン上に合成した。次にプロトコールに基づき、メンブレンをブロッキングし、一次抗体としてF1024−1−3抗体を反応させ、洗浄後二次抗体としてβガラクトシダーゼ標識抗ラットIgG F(ab’)2抗体(American Qualex Antibodies)と反応させた。洗浄後、発色液を添加し青色のスポットが出現するのを確認したところ、F1024−1−3抗体由来のスポットは検出されず、ペプチドマッピングにより抗体のエピトープを決定することができなかった。このことはF1024−1−3抗体が10アミノ酸により構成されるリニアーなペプチドをエピトープとはせず、立体的な構造に起因するエピトープを認識することを示唆している。
これらのことから、F1024−1−3抗体の結合領域は配列番号1のCD14の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在し、294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。すなわち、該抗体はCD14の294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識することが明らかとなった。
実施例12 抗CD14抗体のエピトープの範囲の解析
抗CD14抗体がF1024−1−3抗体と同じ機能を有するために必要な、抗CD14抗体のCD14上の認識部位の範囲を、実施例11で解析したF1024−1−3抗体のエピトープの周辺を中心に解析した。
モチーフを揃えるように多重整列した上で、あらためてその周囲の残基を含めて類似性スコアを計算し、挿入、欠失なく保存度の高い領域のみを抽出したデータベースであるBLOCKSデータベースを、ヒトCD14を対象として、プロファイル検索した。さらに、各種二次構造予測法(Lev, GOR IV, PREDATOR)により解析した。
その結果、BLOCKSデータベースのプロファイル検索より、IL−1(Accession NO. BL005253C)とその受容体の結合領域と類似性がある領域を、269番目から307番までの39アミノ酸残基と特定した。保存度が高いと推測されたアミノ酸残基(残基番号)は、Q(271)V(272)P(273)L(276)K(279)L(283)L(285)S(286)C(287)P(294)E(298)L(299)P(300)E(301)N(304)L(305)T(306)であった。
さらに、この領域の287番からC末端側の配列は、LRR(PDB−ID:1A4Y:A)との相同性が高くなかった。
また各種二次構造予測法(Lev, GOR IV, PREDATOR)からは、α−ヘリックス構造及びβ−シート構造ともに一致した予測結果が得られないこと、一般的にプロリンが多く存在する場合ヘリックス構造やシート構造をとりにくいこと、304番アスパラギンはモチーフデータベースの糖鎖結合モチーフと一致し、糖鎖結合可能部位であることから、この領域は蛋白質の表面に露出していることがわかった。
これらの解析より、該領域は、生理学的条件下では、ループが形成可能な領域であり、他の蛋白質と相互作用可能な部位であった。
すなわち、実施例11のF1024−1−3抗体のエピトープ及び、上記解析より、ヒトCD14とTLRとの結合を阻害することができる抗CD14抗体のエピトープの範囲は、ヒトCD14の269番から315番までの領域であった。
実施例13 ラットF1024−1−3抗体可変領域の配列決定
ラットF1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を以下に示す方法により解析し、相補性決定領域(CDR:complementary determinant region)のアミノ酸配列を決定した。
(1)精製F1024−1−3抗体のアミノ酸配列の解析
まず、実施例2に記載の方法により精製したF1024−1−3抗体をピリジルエチル化(以下PE化と略す)し、RP−HPLCにより脱塩精製した。PE化軽鎖はProcise494cLC(Applied Biosystems Inc.)により直接アミノ酸配列分析を行った。重鎖のアミノ末端のペプチド配列はアミノ末端がブロキングされていたことより、決定することが出来なかった。そこで、PE化重鎖はCNBr分解後、RP−HPLCによりペプチド゛断片を分離精製し、ペプチドシークエンサーProcise494cLC(Applied Biosystems Inc.)によりアミノ酸配列分析を行った。同様にPE化軽鎖についてもペプチド断片のアミノ酸配列分析を行った。得られた配列をEMBLデーターベース記載のラットIgG配列の重鎖及び軽鎖の配列と比較することにより配列上のペプチド断片の位置を決定した。重鎖のアミノ末端の配列は決定できなかったため、Cohen,H(C.R.Acad.Sci.Vie 317(4),293−298,1994)、William J.(Protein Engineering 9(7),623−628,1996)及びLutz Riechmann(Nature 332,323−327,1988)等の報告に基づき推定し、アミノ末端の配列を決定した。
(2)F1024−1−3抗体のcDNA合成、PCR、シークエンシング
(1)で決定したアミノ酸配列データに基づき配列番号73から82までのプライマーを合成した。また、軽鎖のプライマーとして5’UTR及び3’UTR領域に由来する配列番号83及び84のプライマーを合成した。プライマーの塩基配列とそれに対応する図15(後述)上のアミノ酸配列の位置を表3に示す。
まず、F1024−1−3抗体産生ハイブリドーマF1024−1−3の凍結アンプルを1本解凍後、10%FCSを含むRPMI1640培地で培養した。次に、培養細胞を回収しPBS−(pH7.4)で細胞を洗浄後、Y.Kagawa et al.,Mutagenesis,14(2),199−205(1999)に基づいてcDNAの解析を以下のように行った。まず、ISOGENE(日本ジーン)によりtotal RNAを抽出した。次に、Superscript preamplification system for first strand cDNA synthesis(Invitrogen)のマニュアルに従ってオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型としてセンスプライマー、アンチセンスプライマーによりPCRを行った。PCRはExTaq polymerase(Takara)を用いて94℃、60秒、55℃30秒、72℃、120秒35サイクルの条件で行い、GeneAmp PCR system 2400(Perkin Elmer)を使用した。ゲルでバンドを確認後、PCR産物を切出し精製し、ABI Dye deoxy cycle sequencing kit(Applied Biosystems Inc.)のマニュアルに従いABI373A DNA sequencer(Applied Biosystems Inc.)でシークエンシングを行った。得られた重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を図15に、CDRのアミノ酸配列を図16(配列番号3〜8)に示した。また、得られた重鎖及び軽鎖の塩基配列を図17に、CDRを図18に示した。
実施例14 F1024−1−3ラット─ヒトキメラ抗体の作製
抗原結合活性を有するV領域がF1024−1−3抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、C領域をヒト由来の抗体(キメラ抗体)を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。キメラ抗体は1984年のMorrisonら(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,81:6851,1984)の報告以来多くのものが開発されている。
(1)抗体遺伝子のクローニング
F1024−1−3抗体を産生する細胞株F1024−1−3を培養し、細胞を調製する。得られた細胞をPBS−(Sigma)で洗浄後、total RNAをIsogene(日本ジーン)を用いて単離精製する。次にOligo−dTプライマーとSuperScript II system(Invitrogen)を用いてcDNAを合成する。重鎖及び軽鎖のアミノ末端のアミノ酸配列に基づきセンスプライマーを合成する。また、重鎖アンチセンスプライマーはフレームワーク4の配列に基づき、軽鎖アンチセンスプライマーはV κ配列に基づき作製する。PCR後、DNA断片をTAクローニングベクター(Invitrogen)に組み込み、シークエンスを解析する。
(2)ラット─ヒト重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトイムノグロブリンG1のCH1領域のN末端側をコードする塩基配列をセンスプライマーとして合成し、アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンG1の3’非翻訳領域の配列を含む領域を合成する。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて、HumanSpleen5’−StretchcDNALibrary(クローンテック社製)よりPCR反応によりヒトイムノグロブリンCH領域を増幅する。また、重鎖センスプライマーは実施例1−1の重鎖領域をコードする塩基配列とヒトイムノグロブリンG1のCH1領域のN末端側をコードするアミノ酸配列にEcoRIサイトをコードする配列を含むように作製する。アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンG1のCH3領域のC末端側に位置するアミノ酸配列をコードする塩基配列とBamHIサイトを含むように作製する。これらキメラのプライマーを組み合わせて、ラットVH領域にオリエンテーションが一致するようにヒトイムノグロブリンCH領域を組み込む。得られたPCR産物を制限酵素で消化し、DNA断片を発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)に組み込み、ラット─ヒト重鎖発現プラスミドを作製する。同様にヒトのCL領域とラット由来の軽鎖領域を有するキメラ抗体遺伝子を含む発現プラスミドを構築する。
(3)キメラ抗体の作製
形質転換体を作製するため、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で切断し、直線化する。次に、ジーンパルサー(BIORAD)等を用いて遺伝子をSP2/O−ag14(ATCC CRL1581)に導入し、培養後上清に産生されるラット─ヒトキメラ抗体の有無により目的の抗体を産生する細胞を選択する。具体的には直線化したDNA断片約20μgを1×107細胞に360V、25μFDのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を96穴プレートに植え込み、2日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、10%FCS、1×HT(Invitrogen)、0.2mg/mlG−418を含むD−MEM(Sigma)を添加し、更に2週間培養する。細胞がコンフルエントになった段階で無血清培地(Hybridoma−SFM、Invitrotec)で培養し、培養上清をプロテインAカラム(Prosep−A、ミリポア)で精製し、精製キメラ抗体を得る。
得られたキメラ抗体は実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認される。
実施例15 ヒト化F1024−1−3抗体の作製(1)
(1)ヒト化F1024−1−3抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、クイーンらの一般的な方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029,1989)に準じてフレームワーク残基の選択を行う。ヒト配列はKabatら(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)のカッパ軽鎖及び重鎖配列データベースに基づきラットF1024−1−3抗体に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択する。さらに、コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ酸の改変を行う。具体的にはコンピュータープログラムENCAD(レビット、J.Mol.Boil.168,595(1983)を用いてF1024−1−3抗体可変領域の分子モデルの構築を行う。抗体データーベースより得られたヒトEu抗体分子モデル(Stephensら、Immunology 85(4),668−674(1995)にF1024−1−3抗体のCDR配列をFR中に移植する。コンピューターモデル上でCDRとFRが本来のヒト抗体モデルとは異なり、有意な接触を示すFR領域で、アミノ酸置換を行うことによりCDRとFRとの接触が改善されると予想される位置についてラット抗体由来のアミノ酸への置換を行う。また、ヒト抗体のデーターベース中でその位置においてまれにしか現れないFR中のアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサンスアミノ酸に置換する。アミノ酸置換の良否は実際の活性により確認することになるため、アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作製する。
(2)ヒト化F1024−1−3抗体の構築
(1)で選択された配列を基に、シグナルペプチド、スプライス供与シグナル及び制限サイト(例えばXbaI)を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を構築する。構築した遺伝子は合成ヌクレオチド(80塩基長程度)のものを数種類オーバーラップするように調製する。すなわち、オリゴを対にしてアニールし、DNAポリメラーゼのKlenow断片で伸長し、2本鎖断片を得る。この断片を変性し1本鎖にした後、同様にアニールし、DNAポリメラーゼのKlenow断片で伸長し、全長の遺伝子をコードする2本鎖断片を得る。得られる断片をTaqポリメラーゼによるPCRで増幅し、精製後に制限酵素(例えばXbaI)で切断し精製する。精製した断片をヒトγ1遺伝子のCH1エクソンからCH3エクソンまでを含む定常領域遺伝子をXbaI−BamHI断片を有するプラスミドpVg1(Co等、J.Immunol.148:1149(1992)のXbaIサイトに挿入する。同様な操作によりγ4の定常領域遺伝子を含むプラスミドにも挿入可能である。また、置換するアミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異導入により作製し、発現プラスミドに導入することも可能である。軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能である。この場合pVkベクターにはヒトCκ領域を含むものを使用する。
抗体を産生する形質転換体を作製するため、重鎖及び軽鎖プラスミドを制限酵素(pVkプラスミドの場合はBamHI及びFspI)で切断し直線化後、マウスミエローマ細胞Sp−O−ag14(ATCC CRL1581)中へジーンパルサー(BIORAD)を用いて導入する。具体的には直線化したDNA断片約20μgを1×107細胞に360V、25μFDのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を96穴プレートに植え込み、2日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、10%FCS、1×HT(Invitrogen)、0.25mg/mlXanthine、1μg/mlMycophenolic acidを含むD−MEM(Sigma)を添加し、更に2週間培養する。培養後上清にでる抗体により目的とするヒト化F1024−1−3抗体産生株を選択する。すなわち、上清中の抗体が固相化したCD14抗原と結合し、結合する抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG1またはIgG4抗体で検出する。選択した株はコンフルエントになるまで10%FCSを含む培地で培養し、無血清培地(Hybridoma SFM、Invitrogen)に交換する。培養上清を回収し、プロテインA(Prosep−A、ミリポア)に結合させ、0.1M グリシン塩酸(pH3.0)で溶出する。精製抗体をPBS−(Sigma)で透析し、280nmの吸光度より抗体濃度を算出する(ヒト抗体1mg/mLは1.3の吸光度を示す)。
(3)ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体が元のラット抗体と同様な活性を有していることを確認するため、CD14/TLR結合抑制活性、及び結合のアフィニティーを比較する。CD14/TLR結合抑制活性は実施例2の記載にしたがって行い、F1024−1−3抗体との比較を行う。アフィニティーの測定はBIACOREシステム(BIACORE社)を用いて測定する。すなわち、BIACORE3000を使用し、マニュアルにしたがってCM5チップ(BIACORE社)に精製CD14を固定化する。次にHBS−EPバッファー(BIACORE社)で希釈した抗体希釈列を作製し、各サンプルをインジェクトし解析を行う。抗原抗体結合を100mM 塩酸溶液で解離し、次のサンプルをインジェクトする。得られたデータをBIACOREの解析プログラム(BIA Evaluation、BIACORE)により解析し、アフィニティー(Kd)を算出する。
実施例16 ヒト化F1024−1−3抗体の作製(2)
(1)ヒト化抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体において移植するCDR配列が活性を有する適切なドメイン構造を維持させるために元のFR領域の配列も合わせて移植する。CDRドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与しいているかは、FR中のアミノ酸の性質(疎水性、親水性、酸性、塩基性、分子サイズ等)から解析し、またコンピューターを用いたモデリングにより行う。すなわち、シリコーングラフィック上で起動するソフトウエアーQUANTA/CHARMmあるいはModeler(モレキュラー・シュミレーションズ)を用いてモデリングを行う。Brookhaven Protein Data Bank(PDB)に登録されているヒト抗体配列よりF1024−1−3抗体のVH及びVL領域と相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、それに基づきF1024−1−3抗体の三次元構造を推定する。推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖のCDRに水素結合しているFR領域中のアミノ酸群(第1群)を選出し、更にそれらに水素結合しているFR領域中のアミノ酸群(第2群)を選出する。同様に、CDRに静電的相互作用やファンデルワルツ力等のエネルギー結合により結合していると推定されるFR領域中のアミノ酸群(第1群)と更にそれらに結合していると推定されるFR領域中のアミノ酸群(第2群)を選択する。このようにして選択したFR領域中のアミノ酸群をCDRアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、Kabat等の分類(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)やNCBI(National Center for Biotechnology Information)等より得られるヒト抗体配列の可変領域アミノ酸には存在しないような配列が生じる場合は、そのアミノ酸は移植しない。このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列VH及びVLに移植する配列を決定し、ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット(Oligonucleotide−directed in vitro mutagenesis system version 2)とPCR法を組み合わせる方法、また数種類の長鎖合成ヌクレオチドを組み合わせて増幅する方法、キメラ抗体のVHあるいはVL遺伝子を鋳型に数種類のプライマーを用いて増幅後、さらにそれら増幅遺伝子断片を鋳型として全長遺伝子断片を得る方法により作製する。得られた増幅遺伝子断片を実施例15記載のプラスミドpVg1あるいはVκを含むプラスミドpVkの制限酵素サイトに導入することにより発現プラスミドを調製する。作製したプラスミドは実施例15記載の方法により細胞に導入し、形質転換体を得、同様に精製抗体を作製する。また、同様に抗体の評価を行う。
実施例17 CDRペプチドの調製
実施例13で決定したCDR配列に基づき、ペプチド合成機(433A、アプライドバイオシステムズ)により各ペプチドを合成する。合成ペプチドは定法により切出し後、HPLCにより精製し凍結乾燥品を得る。得られたペプチドは実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認される。
実施例18 CD14改変体ポリペプチド高発現細胞株の樹立
(1)[CD14改変体ポリペプチド発現プラスミドの構築]
実施例11で得られたsCD14(1−307)S286Cを発現させるプラスミドをXbaIとHindIIIでdouble digestionし、sCD14(1−307)S286CをコードするDNA断片を切り出し、一方で、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトEFpromoterおよびSV40 late polyA、SV40 early polyAの上流に葉酸デヒドロゲナーゼ(DHFR)遺伝子をコードした発現ベクター(pM1103)を、EFpromoter下流でSV40 late polyAの上流にあるXbaIとNotIにてdouble digestionした。pM1103のXhoI/NotIサイトに先ほど得られたsCD14(1−307)S286CをコードするDNA断片を挿入し、コンピテントセルJM109(TaKaRa社)を用い、定法に従ってTransformationしてヒトsCD14(1−307)S286Cをホニュウ細胞で発現させるプラスミド(pM1675)を得た
(2)CD14改変体ポリペプチド生産用CHO形質転換株の樹立
CD14改変体ポリペプチド生産用CHO形質転換株を樹立するために、(1)で作製した発現プラスミドpM1675をDHFR遺伝子欠失チャイニーズハムスター子宮腫細胞株CHO DxB11に下記の方法にてTransfectionした。即ち、50μlのFuGENE6(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)と12.5μgのpM1675を添付プロトコールに従って混合した後に、150cm2のルーフラスコにセミコンフルエントに増殖したCHO DxB11細胞へ添加した。翌日、細胞をトリプシン/EDTA処理を行って回収し、10cm2ディッシュに10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地にて1ディッシュあたり2×104個の細胞を播種した。以降3〜4日毎に10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地で培地交換を行い、18日間選択培養を行った結果、核酸欠失培地中で増殖する24個のクローンを得た。次に、得られたクローン24株について、培養上清中のCD14改変体ポリペプチドの産生量を実施例11と同様の方法で測定した。その結果、生産量が2μg/mLを超える9クローンを得た。このうち、TfS286C−99株は最も産生量が高く、5.7μg/mLであった。
(3)CD14改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立
CD14改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立するために、以下に示す方法による選択培養を行った。(2)にて樹立したクローンの内、最も生産量の高いクローン(TfS286C−99)を10cm2ディッシュに3000個の細胞数で終濃度150nMのメトトレキセート(MTX)、10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地中に植え込んだ。3日後、終濃度150nMのMTX、10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地にて培地交換を行い、5日間選択培養を行った。その結果、150nMのMTXを含む培地中で増殖した15クローンを得た。得られたクローン15株について、次にCD14改変体ポリペプチドの産生量を調べた。15種の各クローンの培養上清中のCD14改変体ポリペプチド濃度を、実施例11と同様の方法で測定した。その結果、それぞれ生産量が147μg/mL、144μg/mLおよび154μg/mLとなるクローンTfS286C−99−150−3、TfS286C−99−150−8、TfS286C−99−150−9を得た。
それぞれのクローンより得られたsCD14(1−307)S286Cは、実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をCDRとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはTLRとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトCD14抗体が該作用をするために必要な認識領域のCD14における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びCD14とTLRとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニングで、LPS/CD14によるToll4を介するNF−κBの活性化の抑制を示したF1024−1−3抗体の測定結果を示す図である。
図2は、F1024−1−3抗体のイヌ、アカゲサル、カニクイサル、ウサギ、ヒトの可溶型CD14との交差反応性を示す図である。
図3(a)〜(c)は、F1024−1−3抗体のウサギCD14との結合をFluorocytomtry法で検討した結果を示す図である。
図4は、F1024−1−3抗体のLPS/CD14による内皮細胞でのIL−6産生抑制効果を示す図である。conAbはコントロールのラットIgGを示す。
図5は、F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体形成後の内皮細胞におけるIL−6産生抑制効果を示す図である。
図6(a)〜(c)は、CD14発現細胞へのFITC−LPSの結合試験の結果、F1024−1−3抗体が阻害しないことを示す図である。
図7は、LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体前投与によりTNFの産生が抑制されることを示す図である。
図8は、LTA/PepG投与ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体前投与により白血球減少症が改善されることを示す図である。
図9は、LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体後投与によりALT、クレアチニンの数値が改善されることを示す図である。黒印は抗体投与群、白丸印は生食投与群を示す。
図10は、BIACORE3000を用いてLPS/CD14/TLR4−COS複合体を形成させたときの結合量、F1024−1−3抗体を結合したときのTLR4−COSの結合抑制効果を示す図である。レスポンスはビアコア社の指標であり、1000RUが1.2ngの結合量を示す。
図11は、HEKT4−14におけるIL−8の誘導産生に対するF1024−1−3及びsCD14(1−307)S286Cの抑制効果を示すグラフである。
尚、阻害活性は下記により算出した。
(抗体あるいは組換え体未添加時のIL−8産生量─抗体あるいは組換え体添加時のIL−8産生量)/抗体あるいは組換え体未添加時のIL−8産生量×100
図12は、F1024−1−3抗体のCD14(1−356)への結合を阻止する活性をもつペプチドを示す図である。
図13は、F1024−1−3抗体の各種CD14欠失改変体との結合活性を示す図である。
図14は、F1024−1−3抗体の各種CD14アミノ酸置換改変体との結合活性を示す図である。
図15は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列を示す図である。
図16は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖のCDR配列を示す図である。
図17は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列をエンコードするDNAの一例を示す図である。
図18は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖のCDR配列をエンコードするDNAの一例を示す図である。
本発明は、抗CD14抗体及びその断片、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ペプチド、抗体の作成方法、および敗血症用医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体、CD12とToll Like Receptor(TLR)との結合阻害剤である該抗体、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列をCDRとして有する抗CD14モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、該アミノ酸配列を有するペプチドおよび敗血症用医薬組成物に関する。
背景技術
CD14は、356個のアミノ酸からなる糖蛋白であり、グリコシルホスファチジルイノシトール(glycosylphosphatidylinositol:GPI)によりマクロファージ、単球、クッパー細胞、好中球および一部B細胞の膜上にアンカリングされて存在する。
ヒトCD14は、膜結合型CD14(以下mCD14ともいう)のほかに可溶型CD14(以下sCD14または可溶性CD14ともいう)がある。そして血中には分子量の異なる複数のsCD14が存在することが報告されている(Labeta MO:Eur.J.Immunol.,23:2144,1993)。
ヒトCD14は、グラム陰性桿菌内毒素のLPS受容体として知られており(Wrightら:Science,249:1431,1990)、血中のLBP(LPS binding protein)からLPSを受け取り、複合体を形成する。
mCD14を発現しているマクロファージ等は、LPSとsCD14の複合体により活性化され、炎症性サイトカインの産生を誘導する(Hailmann Eら:J.Immnol.,156:4384,1996)。
mCD14を発現していないといわれている血管内皮細胞や血管平滑筋細胞は、sCD14とLPSの複合体(以下sCD14/LPSともいう)により炎症性サイトカインの産生が誘導される(Loppnow Hら:Infection & Immunity,63:1020,1995)。
また、グラム陰性菌ばかりでなくグラム陽性菌の菌体成分やマイコバクテリアにも反応し、リポタイコ酸(LTA)、ペプチドグリカン(PepG)等の受容体として機能し、細胞の炎症性サイトカインの産生を誘導する(Cleveland MGら:Infect immunity,64:1906,1996)。
LPSまたはLTA等のCD14を介する細胞のサイトカイン産生は、生体に障害的な作用を及ぼし、敗血症を引き起こす。一般に、敗血症の初期症状には悪寒、多汗、発熱、衰弱等がみられ、引き続いてショックを起こす低血圧、好中球減少症、汎発性血管内血液凝固症候群、成人性呼吸窮迫症候群、呼吸不全、多臓器不全等、重篤な臨床症状が生じる。
ヒトCD14のLPSのシグナルを細胞に伝達する機能は、その領域が一部明らかになっている。N末端1〜152番目がCD14の機能発現に必須な領域であり(Juan TSら:J.Biol.Chem.,270:1382,1995)、また7〜14番目および57〜64番目がLPSとの結合に必須な部分である(Juan TS:J.Biol.Chem.,270,29:17237(1995)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270,10:5219(1995))。
しかし、ヒトCD14のN末端153番以降の有する機能については、まったく明らかになっていない。
また、CD14/LPSの細胞へのシグナル伝達におけるToll like receptor(TLR)の関与が近年研究されている。現在までにヒトTLR1、2、3、4及び5(Fernand R:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:588,1998)並びにTLR6(Takeuchi O:Gene,231:59,1999)がクローニングされている。
TLR2若しくはTLR4を欠損したマウスによる研究により、TLR4がグラム陰性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を、TLR2がグラム陽性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を担っている可能性があることが報告されている(Takeuchi Oら:Immunity,11:443,1999)。またTLR2がLPSの細胞内へのシグナル伝達に関与すること、さらにTLR2が細胞表面上でLPSに直接反応すること、CD14存在下では反応が増強されることが報告されている(Ruey−Bing Y:Nature,395:284,1998)。
しかしながらCD14とTLRとの相互作用において、CD14がTLRもしくはTLRと他の機能の解明されていない低分子物質であるアクセサリー分子の複合体と直接結合するか否かは明らかになっておらず、さらにTLRとCD14の結合領域もまったく未知である。
LPSのヒトCD14を介するシグナル伝達を制御するヒト抗CD14抗体として、ヒトCD14の7〜14番目に結合する3C10抗体(Steinman:J.Exp.Med.,158:126(1983)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270:29,17237(1995))および57〜64番目に結合するMEM−18抗体(Bazil:Eur.J.Immunol.,16:1583(1986)およびJuan TS:J.Biol.Chem.,270,10,5219(1995))が知られており、敗血症治療薬への応用が開示されている。
さらに、LPSの結合を抑制し、サイトカインの放出を抑制する28C5抗体および23G4抗体、並びにLPSの結合は一部しか抑制せず、サイトカインの放出を抑制する18E12抗体(特表平8−510909号)が開示されている。
また、グラム陽性細菌及びマイコバクテリアとの作用に対する抗CD14抗体も開示されている(特表平10−505839号)。
しかし敗血症治療薬として用いる場合、LPSの結合領域を認識する抗体、またはLPSの結合を抑制する抗体は、形成したLPS/CD14のシグナル伝達を抑制する効果は期待できない。また、LPSのCD14への結合を特異的に阻害するため、グラム陽性菌の菌体成分及びマイコプラズマ等によるシグナル伝達を抑制する効果も期待できない。また、18E12抗体はCD14の認識部位が明らかになっておらず、サイトカインの放出を抑制する機序も不明である。
また上記のとおり、CD14/LPSの細胞へのシグナル伝達におけるTLRの関与が知られているが、この関与を阻害する物質が、シグナル伝達を調節することが可能か否かは定かではなく、また阻害する物質はまったく知られていない。
発明の開示
本発明は、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体、及びその生物学的に活性のある断片、特定のアミノ酸配列をCDRとして有する抗体、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ヒトCD14の特定領域のアミノ酸を含むペプチド、該ペプチドを免疫源とする抗体の作成方法、敗血症用医薬組成物を提供することを目的とする。
発明者らは、上記のような従来の問題点を克服するため鋭意検討を行い、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をCDRとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはTLRとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトCD14抗体が該作用をするために必要な認識領域のCD14における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びCD14とTLRとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
すなわち、本発明は、下記(1)〜(11)の抗CD14抗体、(12)の抗CD14ヒト化抗体の作成方法、および(13)の医薬組成物を提供する。
(1)配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体。
(2)CD14とToll Like Receptor(TLR)との結合阻害剤である上記(1)の抗体。
(3)モノクローナル抗体である上記(1)または(2)に記載の抗体。
(4)上記(3)の抗体の生物学的に活性のあるFab、Fab’、(Fab’)2である断片。
(5)ハイブリドーマF1024−1−3(受託番号FERM BP−7511)により産生されるF1024−1−3モノクローナル抗体。
(6)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)のうち少なくとも一つを有する抗CD14モノクローナル抗体。
(7)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つを有するヒト化抗体またはキメラ抗体。
(8)配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも一つを含むペプチド。
(9)上記(3)〜(5)のいずれかの抗体若しくは抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
(10)配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むペプチド。
(11)上記(10)のペプチドを免疫原として用いる、CD14とTLRの結合阻害剤である抗体の作成方法。
(12)配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗CD14ヒト化抗体の作成方法。
(13)上記(1)〜(8)に記載の抗体若しくはペプチドのいずれかを有効成分として含む敗血症用医薬組成物。
本発明は、さらに下記(14)〜(17)のモノクローナル抗体を提供する。
(14)ラットモノクロナール抗体である上記(3)のモノクロナール抗体。
(15)ヒトモノクロナール抗体である上記(3)のモノクロナール抗体。
(16)ウサギ、イヌ、サルのCD14と交差反応性を有する上記(3)、(13)または(14)のモノクロナール抗体。
(17)ヒト抗体である上記(3)、(15)または(16)のモノクロナール抗体。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体である。
配列番号1に記載のアミノ酸配列はヒトCD14のアミノ酸配列である。また配列番号1に記載される356アミノ酸からなる蛋白質はヒトCD14の全長である。
ここでエピトープとは抗原決定基であり、抗体と特異的に結合する構造部位をいう。
抗体が認識する領域は一次配列上連続したアミノ酸残基を認識するものとは限らず、蛋白質のとる立体構造を認識するエピトープを有する抗体もある(抗体の蛋白工学、1〜4頁 三木敬三郎等編 講談社サイエンティフィック1991年)。例えば、一次配列上不連続なアミノ酸残基を認識している抗体は、該不連続なアミノ酸残基が立体構造的には、抗体が認識するのに十分近い距離に存在するために、該不連続なアミノ酸残基をエピトープとする場合がある。
例えばエピトープとして、該領域の一部の連続したアミノ酸が挙げられるが、上記したように、該領域の不連続なアミノ酸も含まれる。すなわちヒトCD14の269番から315番までの領域に存在する限り、連続若しくは不連続なアミノ酸の集合または連続若しくは不連続なアミノ酸が点在した2ケ所以上のアミノ酸の集合も「ヒトCD14の269番から315番までの領域のエピトープ」に含まれる。好ましくは連続した8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体である。
また本発明の抗体は、269番から315番以外の領域を含むエピトープを認識する抗体も含まれる。例えば、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8以上のアミノ酸残基と、ヒトCD14の269番から315番まで以外の領域の数アミノ酸残基により形成されるエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトCD14と結合する。ヒトCD14とはsCD14またはmCD14を問わない。また、どちらか一方のCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。例えばsCD14は、血中に存在し、mCD14はマクロファージに存在する。
ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識するとは、例えば、後述する実施例11の方法と同様に、ヒトCD14のN末端1〜315番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド(sCD14(1−315))とは結合するがsCD14(1−268)と結合しないことにより、判断できる。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識することにより、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。
CD14は細菌菌体成分と結合し、その結合したCD14/細菌菌体成分複合体がTLRと結合し、シグナルを細胞に伝達し、細胞を活性化する。これらのシグナル伝達機構により細胞が活性化されると、細胞から炎症性サイトカインが放出され、細胞障害、敗血症等の炎症が惹起される。
本発明の抗体は、菌体成分による細胞活性化をCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有することにより抑制し、細胞障害、敗血症等の炎症を抑制する。
「CD14とTLRとの結合」を詳細に説明すると、CD14と細菌菌体成分とが結合したCD14/細菌菌体成分複合体とTLRとの結合である。細菌菌体成分には、LPS、LTA若しくはペプチドグリカン(PGN)若しくはリポアラビノマンナン等、マイコプラズマ等が挙げられる。例えばLPSとCD14が結合した複合体であるLPS/CD14はTLR、特にTLR2若しくはTLR4、と会合することにより、細胞へシグナルを伝達する。TLRにより細胞内へシグナルが伝達されると、MyD88、IRAK及びNIKを経由してNF−κBが活性化される等により、細胞の活性化が起こる。本発明の抗体はこの過程において、LPS/CD14とTLRとの結合を阻害する。
「CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する」とは、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する限り限定はされないが、例えば後述する実施例2、または4の系により測定し判断することができる。
また、本発明の抗体は、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する抗体が好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が10μg/ml以下で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化若しくはIL−8産生を30%以上抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する抗体である。さらに好ましくは50%以上抑制する抗体である。特に好ましくは70%以上抑制する抗体である。
また、本発明の抗体は、外因性のLPS/CD14による内皮細胞のサイトカインの産生を60%以下に抑制する抗体が好ましい。より具体的には、抗体の濃度が1μg/ml以上で、10ng/mlのLPS、300ng/mlの外因性のCD14存在下での内皮細胞のIL−6産生を60%以下に抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、40%以下に抑制する抗体である。
また、CD14とTLRとの結合には、直接的な結合、他の因子を介する結合または他の因子により活性化される結合が挙げられる。血中若しくはin vitroでは動物由来の血清存在下で結合する場合が挙げられる。例えば、MD2存在下で、TLR4若しくはTLR4の2量体の構造が安定した時に結合する場合が挙げられる。本発明の抗体は、いずれかの場合の結合を阻害する機能を有していればよい。例えば血中若しくはin vitroでは動物由来の血清存在下で、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗CD14抗体が挙げられる。
本発明の抗体がCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有するのは、該領域がCD14とTLRとの結合に関連がある領域であるからである。このためヒトCD14の269番から315番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識する抗体は、該領域の機能を変化させることによりCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。
また、CD14とTLRとの結合に関連がある領域として、エピトープとする領域が、ヒトCD14の269番から315番までに完全に含まれる抗体が好ましい。より好ましいエピトープとする領域は、実施例のF1024−1−3抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトCD14の285番から315番までの領域である。また好ましくは、ヒトCD14の269番から307番までの領域である。さらに好ましくは、連続したアミノ酸をエピトープとして特異的に認識する抗体が好ましい。
また、本発明の抗体は、実施例のF1024−1−3抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトCD14の285番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体が好ましい。該抗体はCD14の294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
Proは他のアミノ酸と異なりα炭素に結合したN原子が環構造に組み込まれ>NH基になっているため、ポリペプチドはPro骨格により1次構造が制限され、蛋白質の立体構造に影響を与える。すなわち、ProはNH基がないため水素結合を形成できず、α−ヘリックスを形成できない(プロテインバイオテクノロジー、F.フランク編、培風館)。該抗体がCD14の294番目のProをポイントミューテーションすることにより結合しなくなるが、これはCD14の立体構造が変化したことが原因である。すなわち、該抗体は、294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
また、本発明の抗体は抗ヒトCD14抗体であるが、該領域と同等のヒト以外の哺乳動物のCD14の領域に対する抗体であっても、後述する抗ヒトCD抗体と同等の効果を示す抗体であれば、本発明に含まれる。
配列番号2に記載のアミノ酸配列は、ヒトCD14の269番目から315番目のアミノ酸配列である。
この配列番号2に記載のアミノ酸配列の領域の一部若しくは全部からなり、連続した8以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体は、本発明の抗体に含まれる。好ましくはヒトCD14の285番目から307番目までの領域のアミノ酸配列の一部若しくは全部からなり、連続した8以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成された抗体である。またペプチドが立体構造をとることを考慮すると、好ましくは連続した10以上、より好ましくは連続した15以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体である。
本発明の抗体は、CD14と特異的に結合することにより、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。CD14とはsCD14またはmCD14を問わない。また、どちらか一方のCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体も含まれる。例えば、血中に存在するsCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体若しくはマクロファージ等に存在するmCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する抗体が挙げられる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体の有する機能を明確にするため、若しくは明確に発揮させるためには、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作成の容易さの面では、ラットが好ましい。医薬品組成物の構成物の面では、ヒト抗体が好ましい。ヒト抗体には、ヒト抗体産生マウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれる。この他にもヒト化抗体、ファージ抗体若しくはキメラ抗体等も本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体は、定常領域と、フレームワーク領域がヒト由来で、相補性決定領域が非ヒト由来である抗体である。ファージ抗体は繊維状ファージのコート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示させ、作製する抗体であり、単鎖Fv(scFv)フォームあるいはFabフォームが主に使用される。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とからなる抗体である。
本発明の抗体はその分子種は特に限定されない。いずれのクラス、サブクラス及びイソタイプに分類される抗体であってもよい。また、生物学的に活性のあるFab、Fab’、(Fab’)2等の抗体断片も、本発明に含まれる。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる。例えば、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
配列番号1に示されるアミノ酸の配列の全部の蛋白質または269番から315番までの領域の連続した8個以上からなるペプチドを免疫原として免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマの中から、後述する本発明の第五の態様のスクリーニング方法により、クローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。また、sCD14(1−315)と結合し、sCD14(1−268)とは結合しないクローンを選択しても、本発明の抗体を作成することができる。好ましくは、285番から307番までの領域の連続した8個以上からなるペプチドを免疫原とすることである。より好ましくは連続した10個以上、特に好ましくは連続した15個以上のアミノ酸からなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはP3、P3U1、SP2/O、NS−1、YB2/0及びY3−Ag1,2,3等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行なうことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行なう。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば3日後、に摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。
免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Milstein等の方法(Methods in Enzymol.,73巻3頁)等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール(PEG)を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。
免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を1/10量ないし等量を使用することが好ましい。
細胞融合をPEG(平均分子量1,000〜4,000)を使用して行なう方法ではPEG濃度は特に限定されないが50%で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド(DMSO)等の補助剤を添加してもよい。
融合は37℃に加温したPEG溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、1〜5分間反応後、培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地(HAT培地)等の選択培地で1日〜7日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。例えばELISA法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。また、ハイブリーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
また、ヒト抗体は石田らが開発した方法(PNAS,97:722,2000)を用いて作製できる。すなわち、まず、Trans−chromosome)(Tc)マウスは石田らの方法に従い、ヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)をミクロセル融合法によりマウスES細胞に導入し、Joynerらの方法(ジーン ターゲティング、実験法シリーズ、メディカル・サイエンス・インターナショナル)にしたがい、それぞれの染色体断片を有するキメラマウスを作製する。次に、作製した2種類のキメラマウスを交配することによりヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)の両者を有するキメラマウスを作製する。マウス由来の内因性のマウス抗体の産生を失わせる為、Capecchiらの方法(Mol.Cell.Biol.12:2919−2923、1992)に従い内因性のIg重鎖とκ鎖をノックアウトしたダブルKOマウスを作製し、ヒト染色体断片を導入したキメラマウスと交配させ、ヒト2番染色体断片(Ig軽鎖κ)と14番染色体断片(Ig重鎖)を含み、内因性のIg重鎖とκ鎖をノックアウトしたトランスクロモソームマウスを作製する。作製したTcマウスは血中にヒト由来の抗体を産生し、一部マウスγ鎖を有する抗体も存在するが、マウスIg(κ)は検出されない。得られたTcマウスは数代経っても染色体は維持され、その子孫を以下の抗CD14ヒトモノクローナル抗体の作製に使用できる。
Tcマウスに精製したCD14抗原50μgを、タイターマックスゴールド(Titer Max Gold, CytRx 社)と混合後、皮下に投与し、3週間後同様に追加投与を行う。抗体価の上昇は、抗原を固相化したプレートに希釈した抗血清を反応させ、続いて抗ヒトIgG抗体を用いて結合した血清中のヒト抗体を検出する。細胞融合は、抗体価の上昇したマウスの腹腔に抗原を50μg投与し、3日後に行う。具体的には、採取した脾細胞をマウスミエローマ細胞(SP2/O−Ag14)と混合後、PEG4000(Merck)により融合し、G418(1mg/mL)を含むHAT培地によりハイブリドーマを選択する。出現したハイブリドーマを抗ヒトIgGκ抗体、抗IgG抗体、抗IgG2抗体、抗IgG3抗体または抗IgG4抗体を2次抗体としてスクリーニングし、CD14と結合するヒト抗体を産生するハイブリドーマを選択する。さらに実施例2に記載のスクリーニング方法により、本発明のヒトCD14抗体を得ることができる。
また、ヒト化抗体は公知の方法(Nature,321:522,1986)を用いて、ファージ抗体は公知の方法(Annu Rev.Immunol,12:433,1994)を用いて、キメラ抗体は公知の方法(Nature,312:643,1984)を用いて作製できる。
また、ヒト化抗体及びキメラ抗体の作成方法の詳細は後述する。
本発明の抗体の断片であるFab、Fab’、(Fab’)2等も公知の方法(石川栄治、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター)で作製できる。
ポリペプチドは、ヒト血清中の可溶型CD14を公知の方法により精製して調製することができる。また、一般的に使用されるペプチド合成機(ペプチドシンセサイザー432A型、パーキンーエルマージャパン)等を用いた方法、遺伝子組換え法(東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社)等が挙げられる。
例えば、269番から315番までの領域の連続した8個以上のアミノ酸からなるペプチドは432A型ペプチド合成機を用いてFmoc法により合成でき、TFAによる脱保護、樹脂からの切断の後、C18 HPLCカラム(Capcell−pak、資生堂)を用いて精製し、目的のペプチドを調製することができる。
本発明の抗体の好適な例として、ラットにヒト血清中より精製したCD14蛋白質を抗原として免疫した免疫細胞とミエローマ細胞を細胞融合して取得したハイブリドーマF1024−1−3が産生するF1024−1−3抗体が挙げられる。ハイブリドーマF1024−1−3は平成12年9月29日付けで日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(IPOD)に寄託し(受託番号P−18061)、さらに平成13年3月16日付で原寄託から国際寄託に移管した(受託番号FERM BP−7511)。
また、F1024−1−3抗体のCDRをVL−CDR1、VL−CDR2、VL−CDR3、HL−CDR1、HL−CDR2及びHL−CDR3をそれぞれ配列番号3、4、5、6、7及び8として図16に示す。本発明のモノクローナル抗体には、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つは有する抗CD14モノクローナル抗体が含まれる。好ましくは、VL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号3〜5に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、HL−CDR1〜CD3のうちの一つ以上が対応する配列番号6〜8に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗CD14モノクローナル抗体である。さらに好ましくは、VL−CDR1〜HL−CDR3がそれぞれ配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を有する抗CD14モノクローナル抗体である。
該抗CD14モノクローナル抗体は、そのサブタイプは限定されない。F1024−1−3抗体のサブタイプのIgGだけでなく、IgA,IgD,IgE及びIgMも含まれる。これらはF1024−1−3抗体の超可変部位(CDR)の配列を維持し、抗体の重鎖をκ鎖からλ鎖へ、または軽鎖をγ鎖からα鎖、δ鎖、ε鎖若しくはμ鎖へ、置換して遺伝子工学的手法により、作成することができる。
本発明には、配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つは有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体が含まれる。好ましくは、VL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号3〜5に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、HL−CDR1〜CDR3のうちの一つ以上が対応する配列番号6〜8に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体である。さらに好ましくは、VL−CDR1〜HL−CDR3がそれぞれ配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を有する抗CD14キメラ抗体または抗CD14ヒト化抗体である。
また、配列番号3〜8に記載のアミノ酸配列を少なくとも一つ含むペプチドも本発明に含まれる。好ましくは、配列番号3〜8にいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。またN末端からC末端に向かって配列番号3から順に配列番号8までのアミノ酸配列を含むペプチドも好ましい。また6つのアミノ酸配列の間に適当なリンカーが入っても良い。
上記のモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体はペプチドのCD14/TLR結合阻害作用は、後述する実施例2のスクリーニングにより判定できる。
具体的なキメラ抗体、ヒト化抗体の作成法を説明する。ヒト定常領域および再編成した可変領域DNAは、公知の操作法に従って種々のヒト細胞、好ましくは不死化B細胞から単離しうる。同様な方法により非ヒト材料から非ヒト抗体配列を単離することができる。DNA配列のための材料の細胞ならびに発現および分泌のための宿主細胞は、種々の材料、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(セルライン及びハイブリドーマのカタログ、第5版(1985)、ロックビル、MD、本引例をもって本明細書の一部と成す)から得ることができる。
これらの「天然に存在する形態」の抗体鎖に加えて、他の「実質的に同一な」修飾された抗体重鎖および軽鎖が当業者に周知の種々の組み換えDNA技術を利用して容易にデザインされそして製造されうる。例えば、鎖は、いくつかのアミノ酸の置換、末端及び中間での付加や欠失等によって、その1次構造レベルにて天然の配列から変化することができる。或いは、1又はそれ以上の抗体活性(例えば、結合活性)を有するような、一次の抗体構造の部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができよう。特に、多くの遺伝子と同様に、抗体遺伝子も分離した機能的領域を含有し、各領域は異なる生物活性を有することが注目される。一般に、所望のエピトープ結合成分をコードする遺伝子の修飾は、種々の良く知られた技術、例えば、特定部位の突然変異誘発(ギルマンアンドスミス、Gene8:81−97(1979)及びロバーツら、ネーチャー328:731−734(1987)、本引例を持って本明細書の一部と成す、参照)によって、容易に達成できる。
より好ましい本発明の態様において、エピトープ結合成分は、「キメラ」または「ヒト化」された抗体遺伝子によってコードされる(CoおよびQueenNature、351巻、501頁、1991年)。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する抗体遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変(V)セグメントは、ヒト定常(C)セグメント、例えば、γ1及びγ4と連結されうる。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からのV又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体からのC又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
「フレームワーク領域」とは、Kabat等による定義(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)の如く、単一種中の種々の抗体の内で、比較的保存されている(即ち、CDR以外の)抗体軽鎖及び重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク 領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一(約85%又はそれ以上)であるところのフレームワーク領域である。
「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのCDRを含む抗体を云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である、即ち少なくとも約85〜90%、好ましくは少なくとも95%同一である。従って、恐らくCDRを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、1以上の天然のヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化抗体は、キメラマウス可変領域/ヒト定常領域抗体を含まない。
これらの抗体は、より特異的には、本発明は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体(アクセプター)抗体からのフレームワーク領域(FR)の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て(4つ)、より好ましくはすべて(各鎖について4つ)を含有し、そして、F1024−1−3抗体からの1以上、好ましくはすべて(各鎖について3つ)の相補性決定領域(CDR)を含有するヒト化抗体である。該抗体は、軽鎖/重鎖複合体の2つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、1以上、好ましくは全て(3つ)の供与体(ラット)抗体の相補性決定領域を含む。例えば、供与体(ラット)相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体(ラット)アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入する。さらに明確な例としては、本発明のヒト化抗体は、各々、配列表の配列番号3、4、5、6、7または8のいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるCDRの少なくとも一つ、好ましくはすべて(各鎖3つ)を含有するものである。ヒト化抗体における各CDRおよびフレームワークの位置は元の供与体抗体における位置と対応していることが望ましい。
一般に、本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖可変領域フレームワーク及び供与体抗体重鎖可変領域フレームワーク間において、65%以上95%以下、好ましくは70%以上90%以下の相同性(即ち、配列同一のパーセント)が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖及び軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、2つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる2以上のヒト抗体から由来してもよい。
ヒトフレームワーク領域に関しては、CDRを得る非ヒト抗体のフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト抗体配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は60%以上、より好ましくは65%以上である。また、好ましくは、受容体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト抗体重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の5つ、より好ましくは3つの中にある。ヒト化抗体の設計は、以下のように行うことができる。
1)アミノ酸が以下の(a)〜(c)のカテゴリーに該当する場合は、用いられるヒト抗体(受容体抗体)のフレームワークアミノ酸はCDRを供与する非ヒト抗体(供与体抗体)由来のアミノ酸で置換される。
(a)受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト抗体のその位置に稀であり、そして供与体抗体中の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に典型的である;
(b)該アミノ酸がCDRの1つに一次配列上近接もしくは隣接している;または、(c)該アミノ酸が供与体もしくはヒト化抗体の三次元モデルにおいてCDRの約5、好ましくは4、より好ましくは3オングストローム以内に原子を有する(Co等Proc,Natl.Acad.Sci.USA,88、2869、1991)。
2)受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体抗体の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。
ヒト化抗体の製造の詳細な説明については、Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029(1989)、WO90/07861およびWO92/11018、Co等Proc,Natl.Acad.Sci.USA,88,2869(1991)、CoおよびQueenNature、351巻、501頁、1991年、ならびに、Coら、J.Immunol.148:1149(1992)(これらの引例をもって本明細書の一部と成す)が参照される。
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては曖昧であることもあり、そして、代わりの様々な抗体が製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。このため、コンピューターモデリングによるCDRとFRの最適化を行えばよい。
相同性の高いヒト抗体V領域が見出された後、そのフレームワーク部分にF1024−1−3抗体のCDR配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシミュレーションする。このときに使用するプログラムとしてはABMODやENCAD(Biochemistry,29:10032、1990)が用いられる。この立体構造のシミュレーションにより、CDR領域のアミノ酸の配置がCD14との結合活性を最適に有するように、CDR近傍のFRのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、最適化が行える。
また、CDRとFRの最適化には、F1024−1−3抗体のFRの一部のアミノ酸配列をそのまま用いて、ヒト抗体V領域に移植する方法も可能である。F1024−1−3抗体のFR領域は図15に示す。ヒト抗体V領域にF1024−1−3抗体のCDRとFRの一部の配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシュミレーションする。このときに使用するプログラムとしては、ModelerおよびQUANTA/CHARMm(Molecular Sumilations社)が用いられる。軽鎖では3〜4箇所を、重鎖では7〜8箇所をラット由来のアミノ酸に変更することによりFRがラット抗体の構造に近くなり、CDR領域のアミノ酸の配置がCD14との結合活性を最適にすることが容易になる場合がある。
また、抗CD14抗体としての結合活性が維持されていれば、CDR領域のアミノ酸の1または2以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加をしてもよい。この場合、例えばGlyとAla、Val、LeuとIle、AsnとGln、CysとMetまたはLysとArg等、同族に分類されるアミノ酸同士の置換は、抗CD14抗体としての結合活性が維持されていやすいと理解される。また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の26から30の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており(チョチアおよびレスク、J.Mol.Biol.、196:901−917(1987))、その意味ではCDRと同様に移植することも可能である。
得られたアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗体を作成する。例えば、上記より決定したアミノ酸配列より、ヒト化抗体遺伝子配列を決定し、ヒト化モノクローナル抗体をコードする遺伝子を作製する。具体的にはヒトV領域の遺伝子よりCDRをエンコードするDNAを削除し、変わりにラット由来のCDRをエンコードするDNAを挿入する。さらに、分子モデリングにより変更するアミノ酸に応じて、対応するDNA配列をPCRを用いた部位特異的突然変異導入法等により改変し、組み替えヒトV領域遺伝子を作製する。これをヒト抗体の重鎖、軽鎖のC領域を含むベクターにクローニングし発現ベクターを得る。このとき使用するヒト由来の配列を変更することにより、ヒトIgG1、IgG3等の抗体のサブクラスを得ることができる。発現ベクターはマウスミエローマ細胞Sp2−O−ag14(ATCC CRL1581)やハムスター卵巣細胞CHOに遺伝子導入し、発現を行う。
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、ラット抗体に比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも3つの潜在的な利点を有する。
1)エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる(例えば、補体依存性細胞障害(CDC)又は抗体依存性細胞障害(ADCC)による、より効率的な標的細胞の破壊)。
2)ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はC領域を異物として認識せず、従って、このような注入された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
3)注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている(ショー、D.ら、J.Immunol.138:4534−4538(1987))。注入されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与量を与えることができる。
本発明の抗体は、ヒトCD14と特異的に結合し、CD14とTLRとの結合を阻害すること、すなわちCD14とTLRとの結合阻害剤であることにより、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に用いることができる。例えば、敗血症などの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のTNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用であり、より具体的には発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。また、本発明の抗体が抑制する細胞活性化の原因物質はLPSのみとは限定されない。例えば、LTA、PGN若しくはマイコプラズマ等と複合体を形成したCD14の細胞活性化を抑制する。すなわち、これらを原因とする疾患においても、上記に記載のとおり、治療または予防に有用である。
本発明の抗体は、ヒトCD14の269番から315番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識するという機能を有するので、ヒトCD14の定性若しくは定量するツールとして有用である。例えば、検体と本発明の抗体を接触させ、抗原抗体複合体を形成させた後、該複合体を検出または定量する測定方法である。検体は血清、尿、体液または培養上清等が例示される。抗原抗体複合体の検出または定量法はELISA法またはRIA法等が例示される。
本発明の第二の態様は、本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明のハイブリドーマの好ましい例は、本発明の抗体の好ましい例であるF1024−1−3抗体を産生するハイブリドーマF1024−1−3(FERM BP−7511)である。
本発明の第三の態様は、配列番号1に記載のCD14の269番から315番までの領域のアミノ酸を連続8個以上含むペプチドである。好ましくは285番から307番までの領域のアミノ酸を連続8個以上含むペプチドである。また、好ましくは連続10個以上、特に好ましくは連続15個以上のアミノ酸からなるペプチドである。
本発明のペプチドは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明の第四の態様は、本発明の第三の態様のペプチドを免疫原として用いることを特徴とするCD14とTLRとの結合阻害剤である抗体の作成方法である。免疫原として用いるペプチドの好ましい例は、本発明の第三の態様の好ましいペプチドの例である。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
作成された抗体がCD14とTLRとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例2に記載した方法で行うことができる。
本発明の第五の態様は、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗CD14ヒト化抗体の作成方法である。本発明の抗CD14ヒト化抗体の作成方法は、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることである。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
さらに本発明の方法を実施するために、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化し、コンピュータ上でCDRとフレームワーク領域(FR)の立体構造をシミュレーションしてCDRとフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を最適化して、抗CD14ヒト化抗体のアミノ酸配列を決定することが好ましい。このようにして決定した抗CD14ヒト化抗体のアミノ酸配列の少なくとも重鎖または軽鎖の定常領域をエンコードするヒト抗体の遺伝子を含むベクターに、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDR及び最適化して変化させたFR若しくはFRの一部をエンコードするDNAを組み込めばよい。FRの一部とは、FRの一部の連続したアミノ酸配列のみならず、最適化するために置換する不連続のアミノ酸配列をも含む。このようにアミノ酸配列を最適化して抗CD14ヒト化抗体を作成する方法も、配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化して最適化する限り、本発明に含まれる。
好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化することである。
なお、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号3、4、5、6、7及び8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列の一例は図18に示した。FRを含む重鎖及び軽鎖をエンコードする塩基配列の一例は図17に示されている。
作成されたヒト化抗体がCD14とTLRとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例2に記載した方法で行うことができる。
本発明の第六の態様は、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程を含む敗血症用治療薬のスクリーニング方法である。敗血症用治療薬のスクリーニング方法とは、被検物質が敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質であるか否かを検討する方法である。また、複数の被検物質から敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質を選択する方法である。
本発明のスクリーニング方法は、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程を含む。
本発明のスクリーニング方法のCD14原としては、細胞に発現しているCD14、血中等に存在するsCD14、または遺伝子組換え法により作成されるsCD14が挙げられる。細胞に発現しているCD14は、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またsCD14は、少なくともヒトCD14の269番から315番を含むsCD14であれば、改変体であってもよい。CD14の立体構造の維持の点で、好ましくはCD14全長である。
TLR原としては、TLRを発現する細胞、遺伝子組換え法により作成されるTLR等が挙げられる。細胞に発現しているTLRは、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またCD14原とTLR原は同一の細胞であってもよい。
また、CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程において、同時にCD14活性化物質も接触させることが好ましい。CD14活性化物質により、活性化されたCD14がTLRに結合しやすいからである。
CD14活性化物質は、CD14と結合することにより、複合体を形成し、CD14を活性化する機能を有する物質であれば特に限定されない。例えばLPS若しくはLTA等の菌体成分、マイコプラズマ等が挙げられる。
CD14、TLRおよび被検物質を接触させる工程は、これらが接触される工程であれば特に限定されない。例えば溶液中において直接接触させる、CD14若しくはTLRをプレート等に固定して、他を溶液中に混合しプレートに添加する、またはCD14若しくはTLRを発現する細胞の培養液中に他を添加する等が挙げられる。
CD14、TLRおよび被検物質、並びにCD14活性化物質を接触させる順番も特に限定されない。例えばこれらを同時に接触させる、CD14活性化物質およびCD14を先に接触させる、CD14活性化物質およびCD14をTLRと接触させる前に、CD14活性化物質およびCD14と被検物質を接触させる等の順番が挙げられる。
被検物質が敗血症用治療薬であるか否かの判定は、特に限定されない。例えば、CD14とTLRとの結合を直接観察し、被検物質が結合を阻害していれば、若しくはその結合阻害の程度に応じて、敗血症用治療薬であると判定若しくは選択する、またはCD14若しくはTLRを発現する細胞の活性化を測定することにより判定若しくは選択する等が挙げられる。
被検物質は特に限定されない。例えば、抗CD14抗体等の抗体、CD14改変ポリペプチド等のポリペプチド、低分子化合物等が例示される。
本発明のスクリーニング方法により、簡便に敗血症用治療薬が選択できる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、簡便に、敗血症用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法として有用である。
本発明の第七の態様は、CD14とTLRとの結合阻害剤を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤は、CD14が直接TLRに結合することを阻害する剤、若しくはCD14が第三物質を介してTLRに結合し複合体等を形成すること等を阻害する剤であれば特に限定されない。また、その阻害機構も限定されない。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤はその阻害する能力として、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する阻害剤が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が3μg/ml以上で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化を30%以上抑制する阻害剤が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する阻害剤である。
好ましくは、CD14とTLRとの結合阻害剤として本発明の抗体若しくは抗体の断片を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるCD14とTLRとの結合阻害剤若しくは本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、その力価として、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制する力価が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化を30%以上抑制する力価が好ましい。より好ましくは、40%以上抑制する力価である。
ヒトCD14を介した細胞活性化による敗血症の経路において、CD14とTLRとの結合阻害剤はCD14とTLRとの結合を阻害することにより、CD14からTLRへのシグナル伝達が阻害されるため、TLR以降のシグナル伝達が遮断され、細胞活性化を抑制し、敗血症の治療効果を示す。
すなわち、本発明の医薬組成物は、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に有用である。例えば、敗血症、関節リウマチ、AIDS、自己免疫疾患、溶血性貧血、腫瘍、アトピー性疾患、アレルギー疾患、サルコイドーシス、マラリア、乾癬、発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などに有用である。特に、これらの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のTNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用である。これらの疾患の中でも、LPSが関与するグラム陰性細菌感染、LTA若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、またはマイコプラズマに伴う敗血症の治療または予防に有用である。すなわち、これらの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、血中にLPS、LTA若しくはマイコプラズマ等が高値である患者またはそのような状況に置かれることが予想される細菌感染者に予防効果が期待できる。
また、CD14とTLRとの結合阻害剤を有効成分として含んでいれば、製剤学的に許容される各種添加物を含んでいてもよい。例えば、担体、賦形剤、安定剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、干渉剤、保存剤、懸濁化剤、乳化剤、一般的に用いられる適当な溶媒の類(滅菌水や植物油等)、さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含んでいてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、抗生物質、ステロイド、各種サイトカイン抗体若しくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。これらは、有効成分である本発明の抗体と相加効果若しくは相乗効果を示し、より有効な医薬組成物と成ることができる。
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、特に限定されないが、例えば、本発明の抗体を有効成分とするときには、0.1mg/kg以上が好ましい。より好ましくは1〜10mg/kgの投与量である。本発明の医薬組成物を薬剤として用いるときの剤形は、坐剤、吸入剤、特に注射剤等が好適である。また種々の投与経路が可能であるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射が一般的であり、その他に直腸内投与、経皮吸収、経粘膜吸収等が挙げられる。また、投与時期若しくは回数は、患者の状態にも依存するが、予防投与、単回投与若しくは連続投与等が例示される。
また本発明は、CD14とTLRとの結合を阻害する機能を有し、以下▲1▼または▲2▼のいずれかであるCD14改変体ポリペプチドを開示する。
▲1▼配列番号1に記載のアミノ酸配列のN末端が1〜6番目のいずれかであり、C末端が246〜306番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
▲2▼配列番号1に記載のアミノ酸配列のN末端が1〜6番目のいずれかであり、C末端が269〜356番目のいずれかであり、かつ269〜307番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
以下には、ヒトCD14ポリペプチドのアミノ酸配列を主として説明し、ヒトCD14のアミノ酸配列を単にCD14のアミノ酸配列と称することもあるが、ヒト以外の哺乳動物のCD14であってヒトCD14の269番目から307番目のアミノ酸に相当する機能を有する部位が同様に改変され、本発明の改変体と同等の効果を示す範囲であれば、CD14はヒト以外の種のCD14ポリペプチドであってもよい。
「CD14改変体ポリペプチド」とは、CD14ポリペプチドの一部が欠失したポリペプチド、CD14ポリペプチドのアミノ酸の一部が置換したポリペプチド及びCD14ポリペプチドにアミノ酸を付加したポリペプチドが含まれる。また、これらの改変が組み合わさった改変体ポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドはCD14とTLRとの結合を阻害する機能を有する。CD14とTLRとの結合を阻害する機能についての詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
また、本発明のポリペプチドは、TLR発現細胞の細胞活性化を30%以上抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が10μg/ml以下で、1μg/mlのLPS、0.5μg/mlの外因性のCD14存在下でのTLR発現細胞のNF−κBの活性化若しくはIL−8産生を30%以上抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、40%以上抑制するポリペプチドである。さらに好ましくは50%以上抑制するポリペプチドである。特に好ましくは70%以上抑制するポリペプチドである。
また、本発明のCD14改変体ポリペプチドは、該ポリペプチド自身ではLPS存在下で内皮細胞のサイトカインを誘導しないポリペプチドが好ましい。より具体的なアッセイ系においては、このポリペプチドの濃度が300ng/ml以下で、10ng/mlのLPS存在下での内皮細胞のIL−6産生を誘導しないポリペプチドが好ましい。
「誘導しない」とは、そのアッセイ系において、測定されるIL−6が検出限界以下であることである。たとえば、IL−6産生の測定において、human IL−6 EIA kit(PE Biosystems社)を使用する場合は、検出限界以下とは50pg/ml以下である。
また、本発明のCD14改変体ポリペプチドは、外因性のLPS/CD14による内皮細胞のサイトカインの産生を60%以下に抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が300ng/ml以上で、10ng/mlのLPS、300ng/mlの外因性のCD14存在下での内皮細胞のIL−6産生を60%以下に抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、40%以下に抑制するポリペプチドである。
「LPS/CD14」とは、LPSとCD14とが結合した複合体である。
この活性の点においては、前記▲1▼のポリペプチドのうちでも、C末端が246番目〜285番目のいずれかであるCD14改変体ポリペプチドが好ましい。さらに好ましくは、C末端が246番目または285番目であるポリペプチドである。
またこの活性の点においては、前記▲2▼のポリペプチドのうちでも、C末端が269〜356番目のいずれかであり、かつ269〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドが好ましい。より好ましくは、C末端が284〜356番目のいずれかであり、かつ284〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドである。さらにはC末端が307番であり、かつ284〜286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上がLeu、Ala、CysまたはGlyに置換されたCD14改変体ポリペプチドが好ましい。
また、細菌菌体成分をポリペプチド自身が除去するという面で、本発明のポリペプチドは細菌菌体成分と結合することが好ましい。例えば、LPSのCD14の結合部位は7〜14番目及び57〜64番目であり、その部位の配列はは本発明のポリペプチドは維持されている。
本発明のポリペプチドは機能を維持していれば、N末端のアミノ酸1〜6個が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。例えばN末端にさらにMetが付加されたポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。また、途中のアミノ酸配列は、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。
本発明のポリペプチドは、その特徴を失わない限り、いかなる修飾を受けてもよい。修飾としては、その蛋白質が動物細胞または酵母等の真核細胞の培養により産生される過程で受ける可能性のあるポリペプチドの翻訳過程または翻訳後の修飾及び化学的修飾等がある。
本発明のポリペプチドの製造方法を開示する。
形質転換体を作成し、培養し、必要に応じて遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次いで培養混合物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせて、本発明のポリペプチドの精製を行う「培養混合物」とは、形質転換体、形質転換体を含む培地、もしくは培養上清または細胞のライセートを意味する。本発明の製造方法において、産生された本発明のポリペプチドが細胞培養上清中に分泌される場合は、培養上清から該ポリペプチドを精製できる。一方、該ポリペプチドが形質転換体内に蓄積される場合には、リゾチーム処理、界面活性剤処理、凍結融解、加圧、超音波処理その他の方法から宿主細胞に適したものを適宜選択して細胞を溶解または破砕した後、遠心分離、濾過等の方法により可溶性画分または不溶性画分として該ポリペプチドを回収し、精製する。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を配列番号9〜11に示す。組換えベクターは、該DNAを任意の塩基配列を有する他のDNA断片とライゲーションする方法、または任意のベクターに導入する方法(Sambrook J.等、Molecular Cloning,a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York、1989参照)等で得ることができる。具体的には、DNAとベクターとをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、得られた各断片をDNAリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよく、市販品を利用してもよい。ベクターの代表的なものとしては、pUC118、pBR322、pSV2−dhfr、pBluescriptII、PHIL−S1、λZapII、λgt10、pAc700、YRP17、pEF−BOS、pEFN−II等が挙げられる。
形質転換体は、上記組換えベクターを、宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。
本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれを形質転換したものであってもよい。原核細胞としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。真核細胞としてはCOS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、Namalwa細胞等の哺乳動物細胞の他、Sf細胞等の昆虫細胞や酵母を挙げることができる。このうち、大腸菌、哺乳動物細胞、酵母を形質転換して得られた形質転換体は扱いやすく、高発現量が期待できるので好ましい。
哺乳動物細胞の中では、遺伝子のコピー数を増加させることができるため、CHO細胞のdhfr欠損株を宿主とすることが好ましい。また、酵母の中では、外来タンパク質の分泌生産量が多いために、ピキア(Pichia)属の酵母や付加糖鎖が哺乳類と類似しているSchizosaccharomyces pombeを宿主とすることが好ましい。
形質転換体の培養は、各種の成書を参考にして、一般的な手法で行うことができる(例えば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、1992、参照)。
遺伝子の発現誘導を行う場合には、組み込まれたプロモーターによって適当な薬剤を選択して使用する。例えば、trpプロモーターが組み込まれている場合には3β−インドールアクリル酸を用い、MMTVプロモーターの場合にはデキサメタゾンを、またAOX1プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使用するとよい。
遺伝子の増幅方法の代表的な例としては、dhfr欠損CHO細胞を宿主とし、dhfrを有するベクターを使用した際にメトトレキセートを用いる方法等が挙げられる。
当該製造方法で使用する形質転換体は、本発明の形質転換体であれば、限定されないが、好ましくは、COS細胞および、CHO細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
EF1αのプロモーターを有する組換えベクターでCHO細胞等の哺乳動物細胞を形質転換して得られた形質転換体は、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地で培養する。細胞は、約1〜10×104細胞/mlの濃度で植え込み、37℃、5%炭酸ガス/95%空気の条件で培養を行う。通常、2〜3日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で培地を、血清不含のD−MEMに交換する。さらに引き続き、2〜3日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。前述したようにメトトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることが好ましい。さらに好ましくはdhfr欠損CHO細胞を宿主とし、dhfrを有するベクターを使用することである。
上述の培養混合物から本発明のポリペプチドを精製する方法としては、通常ポリペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な方法を適宜選択して行う。
(実施例)
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
実施例1 抗ヒトCD14の作製
[投与抗原の調製]
精製抗ヒトCD14モノクローナル抗体3C10(ATCCより購入し、通常の方法により調製し、精製したもの)5mgを、ハイトラップNHS活性化樹脂(Hitrap NHS−activated)(アマシャム−ファルマシア)のマニュアルにしたがい樹脂に結合し、3C10結合アフニティーカラムを調製した。
可溶型CD14は、ヒト血清(日本バイオテストより購入)100mLを調製したカラムに添加し、続けてリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、PBSと記載する)にて洗浄した。
波長280nmの吸光度が低下したのを確認した後、0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)を用いてカラムから溶出し、ダイアフロー(グレースジャパン)を用いて濃縮した。
PBSで透析後、タンパク濃度を波長280nmの吸光度(係数1O.D.=1mg/ml)より算出した。その結果、精製可溶型CD14約200μgを得、SDS−PAGE分析により約55kDのバンドを確認した。
[抗CD14モノクローナル抗体の調製]
Wistarラット(SLCより購入)メス8週令のフットパッドに100μgの精製可溶型CD14とフロインド完全アジュバント(Difco)とを1対1で混合したものを投与し、3週間後腸骨リンパ節を摘出し、無菌的にリンパ球を採取した。
得られたリンパ球をマウスミエローマ細胞SP2/O−Ag14(ATCC CRL1581)と5対1で混合しポリエチレングリコール1500(Sigma)を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む10%胎児血清/RPMI1640に懸濁し、96穴プレート(Nunc)に播種した。
5%CO2、37℃の条件下で培養し、増殖してくるハイブリドーマが確認できた段階でアミノプテリンを除いた培地に交換した。
細胞融合から1週間後に培養上清をサンプリングし、精製可溶型CD14を固相化したプレートでCD14に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、精製可溶型CD14を1μg/mLでプレート(Maxisorp、Nunc)に固相化し、0.1%ウシアルブミンを含むPBSでブロッキングした。次に培養上清を添加し、37℃で1時間反応させた後、0.05%Tween−20を含む0.9%生理食塩水で洗浄した。
各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体(DAKO)を添加し、37℃で1時間反応させ、洗浄後0.02%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、10分間反応後0.5M硫酸で反応を停止した。
プレートの吸光度を450nmの波長で測定し、吸光度が0.2以上のウエルを抗CD14抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
選択したハイブリドーマは限界希釈法(単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈/著、講談社)によりクローニングし、10日後に同様にスクリーニングを行い、抗CD14抗体産生ハイブリドーマを17クローン得た。
次にハイブリドーマを10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640で培養した後、細胞を回収しHybridoma−SFM(Gibco)で抗体産生を行い、モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。培養上清からろ紙で細胞を除いた後、プロテインGカラム(Prosep−G、ミリポア)で精製し、17種類の精製ヒトCD14抗体を得た。
実施例2 ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング
1)[スクリーニング系の作成」
▲1▼ヒトTLR4発現プラスミドの構築
ヒトTLR4 cDNAは翻訳領域が約2.5kbよりなるため(Genbank accession NO.AF17765)、TLR4 cDNAのクローニングは5’端側1.1kbおよび3’端側2.3kbを別々に行った。
5’端側のクローニングにはセンスプライマー1(tcgaggaagagaagacacca)、アンチセンスプライマー1(ccatccgaaattataagaaaagtc)を設計し、ヒト肺(human lung)cDNA(CLONTECH社)を鋳型とし、PyrobestDNAポリメラーゼ(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返し、PCRを行った。3’端側のクローニングにはセンスプライマー2(cccatccagagtttagccct)、アンチセンスプライマー2(cccaagctttggaattactcacccttagc)を設計し、ヒト脾(human spleen)cDNA(CLONTECH社)を鋳型に同様にPCRを行った。増幅したDNA断片をpBluescript IISK(+)(STRATAGENE社)のEcoRVサイトに挿入して、得られたTLR4 cDNAの塩基配列を確認した。
次に、これらプラスミドを用いて、翻訳開始コドンの856bp下流にあるEcoRIサイトにてTLR4 cDNAの5’端側及び3’端側を結合し、ホニュウ細胞発現ベクターpcDNA3.1(−)(Invitrogen社)に組み込み、ヒトTLR4発現プラスミドpcDNAT4を作製した。
▲2▼ヒトTLR4発現形質転換株の樹立
▲1▼で作製したプラスミドpcDNAT4を、ヒト胎児腎臓由来細胞株であるHEK293細胞(ATCC)に下記の方法で導入した。すなわちFuGENE6(ロシュ・ダイアグノスティックス社)25μlを6.3(gのpcDNAT4と添付プロトコールに従い混合し、75cm2フラスコにセミコンフルエントに増殖したHEK293細胞に添加した。5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した後に細胞を剥離し、1.2mgのG418(GIBCO−BRL社)及び10%非働化FBSを含むDMEM培地に再懸濁した。その後、週に2回培地交換を行い、20日間培養を続け、G418耐性株T4−14を得た。
2)[ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング]
T4−14細胞を10%非働化FBSを含むDMEM培地に懸濁し、1×105細胞/ウェル(well)で24ウェル−プレートに播き込み、5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した。その後、FuGENE6を用いて、リポータージーンpNFκB−Luc(CLONTECH社)を100ng/ウェル導入し、さらに24時間培養を続けた。終濃度1μg/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)、終濃度0.5μg/mlのsCD14(1−356)さらに抗CD14抗体3C10あるいは実施例1で得られた抗CD14抗体を終濃度1〜10μg/ml添加し、6時間培養を続けた後に、細胞をPassive Lysis Buffer(Promega社)で溶解し、ルチフェラーゼ(Luciferase)活性をLuciferase Assay System(Promega)を用いて添付のプロトコールにしたがって測定した。その結果、活性を有する抗体として、図1に示すように、10μg/mlの抗体添加系で、NF−κBの活性化を約50%阻止したF1024−1−3抗体を得た。
またF1024−1−3抗体のアイソタイプをRat MonoAB ID/SPキット(ZYMED)を用いてタイピングしたところ、IgG1/κであった。
実施例3 F1024−1−3抗体の交差反応性の確認
敗血症動物モデルにおけるF1024−1−3抗体の有用性を明らかにする目的でF1024−1−3抗体の各種動物由来CD14との交差反応性を検討した。まず、ヒトCD14(1−356)を50ng/ウェルでプレート(Maxisorp、Nunc)に固相化し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。
イヌ(ビーグル)、サル(カニクイ、アカゲ)、ウサギ(ニュージランド白色種)、ヒト(ポジティブコントロール)及びラット(ネガティブコントロール)の各血清をPBSで希釈したものを、ペルオキシダーゼ標識F1024−1−3抗体1μg/mLと混合し、ブロッキング液を除去したプレートに添加した。プレートを37℃で1時間反応し、洗浄液で5回洗浄後、0.02%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、10分間反応後0.5M硫酸で反応を停止した。プレートの吸光度を450nmの波長で測定した。4倍希釈血清の結果を図2に示す。
その結果、F1024−1−3抗体のヒトCD14への結合はウサギで52%、イヌで30%、アカゲで44%、カニクイで57%、ヒトで83%阻害され、F1024−1−3抗体はウサギ、イヌ、サルのCD14と交差反応性を示すことが示された。
次に、ウサギのCD14との結合をフローサイトメトリー法を用いて検討した。
ウサギ(ニュージランド白色種、北山ラベス)オス、2.2kgの耳動脈よりウサギ全血1mLをヘパリンで濡らしたシリンジで採血した。100μLに10mLのTris/NH4Cl溶液を加え、溶血させ、残った細胞分画を遠心して回収した。集めた細胞を5%牛血清/0.1%EDTA/PBS−でブロッキングし、再度遠心し、細胞を回収した。
次に細胞を1mLの5%牛血清/0.1%EDTA/PBS−に懸濁しF1024−1−3抗体、ヒトCD14(1−356)275ngでプレインキュベーションしたF1024−1−3抗体、ラットIgGをそれぞれ最終濃度1μg/mLとなるように添加し、4℃で1時間反応した。細胞懸濁液を0.25%牛血清/PBS−で3回洗浄後、1000倍に希釈したFITC標識抗ラット抗体(DAKO)に再懸濁し、4℃で30分間反応した。再度、細胞を洗浄し、FACS解析をFACSCalibur(BD社)で行い、蛍光強度を測定した。
図3に示すように、ウサギ単球はF1024−1−3抗体で染色され、ヒトCD14で前処理することにより、染色が阻害された。また、コントロール抗体(ラットIgG)では染色されなかった。したがって、F1024−1−3抗体は単球上のウサギCD14と結合することが確認された。
実施例4 F1024−1−3抗体のIL−6産生阻害活性
ヒト血管内皮細胞HUVEC(三光純薬社)を0.05% トリプシン0.53mM EDTAを含むPBS−で剥離後、健常人ヒト血清より抗CD14抗体を用いて可溶型CD14を除去した血清を2%含むRPMI1640培地(旭テクノガラス社)(以下2%CD14w/oHS/RPMIと表記)にて懸濁し、5×104細胞/ウェル(50μl/ウェル)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。
可溶型CD14を除去したヒト血清を14%含むRPMI1640培地を10μl、120ng/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)10μl、3.6μg/mlの血清由来可溶型CD14を10μl、及び900ng/mlのF1024−1−3抗体または3C10抗体40μlを加えて細胞に添加した。この混合液を20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をヒトIL−6 EIAキット(PE Biosystems社)で測定した。
IL−6の測定はヒトIL−6 EIAキット添付のプロトコールに従い、行った。即ち、培養上清100μlをIL−6抗体固相化プレートに移し、37℃で60分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し400μl/ウェルのWash Buffer 2で4回洗浄し、100μl/ウェルで抗ヒトIL−6抗体を添加し37℃、30分間インキュベーションを行った。反応液を除去、400μl/ウェルのWash Buffer 2で4回洗浄した後にペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を100μl/ウェル加え、さらに37℃、30分間インキュベーションを行った。
洗浄後発色基質(TMB)を100μl/ウェル添加し室温で15分間反応させた後に、停止液100μl/ウェルを加え反応を停止した。450nmの波長の吸光度を測定し、サンプル中のIL−6の産生量を算出した。なお、コントロール抗体のラットIgGおよび3C10抗体は精製標品を使用した。
その結果を図4に示す。抗体を加えないときのIL−6産生量を100%とした。F1024−1−3抗体及び3C10抗体にIL−6産生阻害活性が認められたが、F1024−1−3抗体は0.3μg/mLで60%以上産生を阻害した。3C10抗体はF1024−1−3抗体より、阻害が弱かった。F1024−1−3抗体は内皮細胞の炎症性サイトカイン産生阻害効果が3C10抗体よりも優れていることが明らかとなった。
また、実施例1のスクリーニングで選択された物質が、実際に細胞のサイトカインを抑制することが明らかとなった。
実施例5 F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体系形成後のIL−6産生抑制測定
実施例4と同様にヒト血管内皮細胞HUVEC(三光純薬社)を懸濁し、5×104細胞/ウェル(50μl/ウェル)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。可溶型CD14を除去したヒト血清を14%含むRPMI1640培地を10μl、120ng/mlのLPS(E.coli 055:B5、Difco社)10μl、3.6μg/mlの血清由来可溶型CD14を10μl混合し、37℃下1時間インキュベーションしてLPS/CD14複合体を形成させた。その後LPS/CD14混合液に900ng/mlのF1024−1−3抗体または3C10抗体40μlを加えて細胞に添加した。さらに20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をヒトIL−6EIAキット(PE Biosystems社)で測定した。
IL−6の測定はヒトIL−6 EIAキット添付のプロトコールに従い、行った。なお、コントロール抗体のラットIgGおよび3C10抗体は精製標品を使用した。
その結果を図5に示す。抗体を加えないときのIL−6産生量を100%とした。F1024−1−3抗体はIL−6産生阻害活性が認められたが、3C10抗体はコントロール抗体と同程度であり、LPS/CD14複合体形成後ではIL−6の産生抑制効果が認められなかった。以上の点より、F1024−1−3抗体は内皮細胞のLPS/CD14複合体形成後でも炎症性サイトカイン産生阻害効果があり、したがってすでにLPSが体内に進入した後の患者、すなわち敗血症と判断された後の患者でも症状の改善効果が期待できることが明らかとなった。
実施例6 F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体への結合試験
細胞膜上のCD14とLPSの結合に対する抗CD14抗体の影響について、フローサイトメトリー(Flow cytometry)法により解析を行った。ヒト単球系細胞株THP−1を40ng/mlの1α,25−ジヒドロキシビタミン(dihydroxyvitamin)D3(フナコシ社)で48時間培養し、分化誘導させた後に、10μg/mlの抗CD14抗体(3C10あるいはF1024−1−3抗体)を含むかまたは含まない培地(10%FBSを含むRPMI1640)中にて37℃、30分間インキュベーションした。その後に、FITC標識LPS(Sigma社)を終濃度1ng/mlで添加し、37℃でさらに15分間インキュベーションした。その後、直ちに等容量の氷冷したRPMI1640培地を添加し、FACSCalibur(BD社)を用い蛍光強度を測定した。
結果を図6に示す。図6に示すように、LPSのCD14結合によって観察される特異的蛍光が、3C10抗体により完全に抑制されたが、F1024−1−3では部分的にしか抑制されず、F1024−1−3抗体はLPSのCD14への結合を抑制していないことが示された。
実施例7 グラム陽性菌菌体成分に誘導されるIL−6産生阻害活性
ヒト腎由来細胞株U−373MG(ATCC)を0.05% Trypsin,0.53mM EDTAを含むPBS−で剥離後、RPMI1640培地(旭テクノガラス社)にて懸濁し、3×104cells/well(100μl/well)で96ウェルプレートに植え込み37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。RPMI1640培地を70μl、1μg/ml(w/v)のStaphylococcus aureus cell suspendion(Sigma社)10μl、5μg/mlのsCD14(1−356)を10μl及び10μg/mlのF1024−1−3抗体10μlをウェルに添加し、さらに20時間培養を行った後、培養上清中のIL−6をhuman IL−6 EIA kit(IL−6 Eli−pair:GIBCO BRL社)で測定した。コントロールとして、CD14改変体ポリペプチド、F1024−1−3抗体の代わりにsCD14(1−356)を添加した。
IL−6の測定はhuman IL−6 EIA kit添付のプロトコールに従い、行った。すなわち、1%(w/v)BSA/PBS(−)にて4倍希釈した培養上清50μlをIL−6抗体固相化プレートに移し、ビオチン化抗ヒトIL−6抗体50μlを加え37℃で60分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し400μl/wellの0.05%(v/v)Tween−20/PBS(−)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を100μl/well加え、さらに37℃、20分間インキュベーションを行った。洗浄後発色基質(TMB)を100μl/wellを添加し室温で15分間反応させた後に、停止液(1M HCl)100μl/wellを加え反応を停止した。450nmの波長の吸光度を測定し、サンプル中のIL−6の産生量を算出した。F1024−1−3抗体のIL−6産生阻害活性は55.2%であった。
この結果より,F1024−1−3がグラム陽性菌菌体成分に誘導されるサイトカイン産生を抑制することが示された。
実施例8 LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体の有効性
敗血症モデルにおけるF104−1−3抗体の有効性を確認する目的で、LPS負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、F1024−1−3抗体の有効性を抗体前投与及び後投与の2種類のプロトコールにより検討した。
[F1024−1−3抗体の前投与効果]
(1)LPS前投与
LPS負荷ウサギ敗血症モデルは、Schimkeらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13875,1998)に準じ、LPS(Salmonella minnesota Re595、Sigma社)をニュージランド白色種(2.1−2.4kg、北山ラベス)に0、5、24時間毎に5μg/kgを耳静脈より投与することにより作製した。前投与群のプロトコールはF1024−1−3抗体を−1、4、23時間毎に2.5mg/kgを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。まず、体重により群れ分けを行い、各群5羽を選択し、−1時間に前採血を行なった。次に、1、3、5、7、23、25、28、48時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清GPT値、血清クレアチニン値、血清TNFα値を測定した。なお、白血球数はSysmex F−280(東亜医用電子)により、血清GPT値、血清クレアチニン値はDRI−CHEM5000(FUJI FILM)により測定した。
また、TNFαはDavidらの方法(Journal of Immunological Methods,68:167,1984)に準じて、L929細胞(ATCC)を0.25%トリプシン/PBS−で剥離後、5.5×105細胞/mLに再懸濁し、5.5×104細胞/ウェルでプレートに播種した。37℃、5%CO2下で一晩培養後、上清を除きTNF標準品(ヒトTNF、持田)または希釈した検体100μLを添加し、続けて最終濃度5μg/mLとなるようにアクチノマイシンD(Sigma)を添加して、37℃、5%CO2下で20時間培養した。
TNF量はプレートの培養上清を100μL除いた後、WST−1溶液(同仁化学)を10μL添加して、37℃で40〜90分間インキュベーション後、450nmの吸光度を測定し、産生された血清中のTNF量を吸光度の相対値として表示した。さらに、48時間後の生存率をもって、F1024−1−3抗体の有効性を判定した。
まとめを、表1に示す。その結果、F14024−1−3抗体投与群では48時間後の生存率は100%(5/5)であったのに対して、生食投与群では40%(2/5)であり、F1024−1−3抗体投与により生存率は有意に改善された。また、28時間後の各パラメータの値もF1024−1−3抗体投与群で生食投与群に比較して前値に近い値を示した。
さらに、図7に示すように血清中のTNFの産生量はF1024−1−3抗体投与により抑制され、in vivoにおいてもin vitro同様、炎症性サイトカインの産生をF1024−1−3抗体が抑制することが明らかとなった。
表1はF1024−1−3抗体のLPS負荷ウサギ敗血症モデルにおける前投与での死亡率の改善、各種パラメータの改善を示している。
さらに、グラム陽性菌に対する効果を確認する目的で、LPSの変わりにLTA/PepGを投与し、F1024−1−3抗体の白血球減少症の改善効果を検討した。すなわち、F1024−1−3抗体(2.5mg/kg)または生食をニュージランド白色種(2.1−2.4kg、北山ラベス)に投与し、1時間後LTA(Sigma)及びPepG(Fluka)160μg/mLを耳静脈より投与した。
LTA/PepG投与直前を0時間として、毎時間採血し白血球数を測定したところ、図8に示すように、生食投与群では白血球数の減少が観察されたのに対して、F1024−1−3抗体投与群では白血球数の減少が観察されず、F1024−1−3抗体がLTA/PepGに由来する白血球減少症に対しても効果を示し、グラム陽性菌に由来する敗血症に対しても有効性が確認された。
(2)[F1024−1−3抗体の後投与効果]
(1)の方法にしたがって、LPS負荷ウサギ敗血症モデルを作製した。後投与群のプロトコールはF1024−1−3抗体を4、23時間毎に2.5mg/kgを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。
まず、同様に群れ分けを行なったウサギ、各群5羽をより、−1時間に前採血を行なった。次に、プロトコールにしたがってLPSを投与し、さらに1、3、5、7、24、26、28、48時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清GPT値、血清クレアチニン値を同様に測定した。
まとめを、表2に示した。その結果、F14024−1−3抗体投与群では48時間後の生存率は100%(5/5)であったのに対して、生食投与群では80%(4/5)と有意な差が認めれなかったが、28時間後の各種パラメータではF1024−1−3抗体投与群は正常値に近い値であり、一方、生食投与群は細胞が傷害されたことを示す異常値であった。また、図9に示すように血清中のクレアチニン値は経過観察中に大きな変動は認められず、F1024−1−3抗体にLPS負荷により惹起される組織傷害を抑制する効果があることが確認された。
表2はF1024−1−3抗体のLPS負荷ウサギ敗血症モデルにおける後投与での各種パラメータの改善を示している。
実施例9 蛋白質相互作用解析装置を用いた阻害機構の解析
(1)[49kDa高分子量のCD14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製]
▲1▼49kDa高分子量のCD14蛋白質に特異的なペプチドの作製
配列番号1に記載の316番目から328番目の配列を、免疫に使用する49kDa高分子量のCD14特異的なペプチド(以下、ペプチド13と記載)として選択した。
なお、選択したペプチドをC末端でSH基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、C末端にシステインを挿入した。ペプチドの合成はABI432Aペプチド合成機(アプライド)を用いて行った。定法により樹脂よりペプチドを切り出し、C18逆相HPLC(CAPCELL−PAK、資生堂)を用いてペプチドを精製した。
▲2▼合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の作製
▲1▼で作製したペプチドを蒸留水で10mg/mLに溶解し、10mg/mLのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、PIERCE)と等量混合した。室温で2時間反応後、NAP−10カラム(ファルマシア)で脱塩しペプチド13キャリア抗原(以下、ペプチド13−KLHと記載)を得た。蛋白質濃度は使用したKLH量を液量で割ったものを用いた。
▲3▼49kDa高分子量のCD14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製
ペプチド13−KLH100μgを免疫源とし、実施例1(1)に記載の方法と同様に細胞融合を行った。HAT培地(GIBCO)によりハイブリドーマを選択し、1週間後、組換えヒトCD14蛋白質と反応する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。
まず0.01M炭酸緩衝液(pH9.5)により精製した組換えヒトCD14蛋白質を1μg/mLに希釈し、イムノプレート(Maxisorb、NUNC)の各ウエルに50μL添加した。37℃で1時間反応後、イオン交換水で5回洗浄し、0.5%BSAを含むPBSを各ウエルに100μL添加しブロッキングを行った。次に選択したハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し37℃で1時間反応させた後、0.05%Tween20を含む生理食塩水で3回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体(DAKO)を10%ウサギ血清を含むPBSで1000倍に希釈し各ウエルに50μL添加した。37℃で1時間反応後、同様に5回洗浄し0.01%過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で10分間反応後、0.5M硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計(NJ−2100、日本インターメッド)で450nmの吸光度を測定した。その結果、高分子量のCD14蛋白質と反応したハイブリドーマを含むウエル(F1025−4−1)を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。
選択したハイブリドーマを10%FCS/RPMI−1640培地(GIBCO)で培養後、Hybridoma−SFM培地(GIBCO)で培養し抗体を産生させ、Prosep−Gカラム(Bioprossesing)を用いて抗体を精製した。精製したF1025−4−1抗体のサブタイプはラットIgG1/κであった。
▲4▼HRP標識抗体の作製
0.5mgのペルオキシダーゼ(東洋紡)を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した100mMの過ヨウ素酸を添加し25℃で20分間反応した。反応終了後1.5%エチレングリコールを添加し25℃で10分間反応後1mM酢酸緩衝液(pH4.4)に対して透析した。精製F1025−4−1抗体を10mM炭酸緩衝液(pH9.5)で透析し、0.5mgに対して1M炭酸緩衝液(pH9.5)を添加して活性化した0.5mgのペルオキシダーゼをそれぞれの抗体と等量に混合し25℃で2時間反応した。4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに2時間4℃で反応した。反応液をPBSに透析しペルオキシダーゼ標識抗体を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
(2)[F1024−1−3抗体の阻害機構の解析]
▲1▼組み換えTLR4の発現
COS−1細胞(ATCC:CRL1150)を3×105cells/75cm2のフラスコに接種し、37℃5%CO2下で一昼夜培養した。翌日、実施例2(1)記載のプラスミドpCDNAT4を用いてFuGENE6(Roche)記載のプロトコールにしたがって6.25μg DNA:25μl FuGENE6の比率で混合し、1%FBS/DMEM(Sigma、高グルコース)を15mL添加したフラスコに加え、37℃5%CO2下で48時間培養した。また、プラスミドを含まないで同様に操作したCOS−1細胞をネガティブコントロールとした。TLR4分子を細胞膜上に発現したCOS−1細胞(以下、TLR4−COSと記載する)、及び発現していないCOS−1細胞の上清を廃棄し、PBS−(Sigma)で2回細胞を洗浄した。次に1%EDTA/PBS−溶液を5ml添加し、軽く攪拌後、セルスクレイパー(COSTAR)を用いて細胞を培養フラスコより剥がし、50mLの遠沈管に回収した。フラスコをさらに5mLのPBS−で洗浄し、50mL遠沈管に加え、1000rpmで10分間遠心し、細胞を沈殿させた後上清を廃棄し、さらに2回PBS−で細胞を洗浄した。次に洗浄した細胞を40μmのセルストレイナー(FALCON)でろ過し、細胞数をカウントした。一度遠心し、5×105cells/mLとなるようにPBS−で希釈し4℃で保存した。
▲2▼抗FITC抗体固定化チップの調製
BIACORE3000(BIACORE社)の解析に使用するチップ上のセルに抗FITCモノクローナル抗体(OEMconcept社)を固定化するため、ビアコア社マニュアルに従い、NHS/EDC溶液(BIACORE社)によりセルを7分間活性化後、pH6.0の酢酸緩衝液で50μg/mLに希釈した抗体をマニュアルインジェクション法により添加し抗体を固定化後、エタナールアミンによりブロッキングを行った。リファレンスは未処理セルを使用した。▲3▼FITC−LPS/CD14複合体の調製
PBS−(pH7.4)で6μg/mLに希釈したFITC−LPS(Sigma、Serotype0111:B4)と上記で調製した組み換えsCD14(1−356)300μg/mLを1:1混合し、37℃で30分間静置することにより複合体を形成した。複合体の形成は抗FITC抗体固相化プレートと(1)で調製したペルオキシダーゼ標識抗CD14抗体(F1025−4−1)を用いたELISA系で確認した。すなわち、抗FITC抗体を10μg/mLでプレートに固相化し、0.5%牛血清アルブミン/PBS−でブロッキングした。次に調製したFITC−LPS/CD14複合体、FITC−LPS、sCD14の3種類のサンプルを抗体固相化ウエルに添加し、37℃で1時間反応した。各ウエルを洗浄後、1μg/mLに希釈したペルオキシダーゼ標識坑CD14抗体と反応させ、洗浄後TMB発色基質溶液(BioFix、フナコシ)により反応させ、適度な発色が得られた段階で、硫酸で反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。その結果、FITC−LPS、sCD14単独では吸光度の上昇が見られないのに対してFITC−LPS/CD14複合体でのみ吸光度が上昇し、複合体が形成されていることが確認された。
▲4▼阻害機構の解析
調製したFITC−LPS/CD14複合体をチップ上に結合し、次にHBS−EP緩衝液で130μg/mLに希釈したF1024−1−3抗体をインジェクとし固定化したCD14に抗体を結合した。次にTLR4−COS細胞、コントロールとしてCOS細胞を添加し、TLR4−COS細胞、COS細胞の結合量を測定した。図10に結果を示したが、棒グラフの高さはセル上に結合した量を示している。すなわち、セルにLPS/CD14複合体が結合することによりレスポンスの上昇が観察された。次にCOS細胞ではレスポンスが観察されなかったことから結合が認められなかった。一方、TOLL4−COS細胞ではレスポンスの上昇(200RU)が観察され、結合が確認された。LPS/CD14に抗体を反応させると同様にレスポンスの上昇が観察され、結合が確認された。さらにCOS細胞、TOLL4−COS細胞を反応させると、それぞれにレスポンスの上昇(TOLL4−COS細胞で136RU、COS細胞で115RU)が観察された。COS細胞のレスポンスの上昇は細胞と抗体の非特異的な結合に由来するため、以下の式を用いて阻害率を算出したところ、阻害率は90%であった。このことはF1024−1−3抗体がCD14に結合することにより、TLR4とCD14の結合が阻害されたことを示しており、F1024−1−3抗体の抑制機構がTLR4のCD14への結合阻害によることが明らかとなった。阻害率の算出は(F1024−1−3抗体なしでのTLR4−COS(TOLL4−COS)細胞のレスポンス)−{(F1024−1−3抗体結合時のTOLL4−COS細胞のレスポンス)−(F1024−1−3抗体結合時のCOS細胞のレスポンス)}/(F1024−1−3抗体なしでのTOLL4−COS細胞のレスポンス)×100(%)により算出した。
実施例10 ヒトTLR4発現形質転換株におけるサイトカイン産生阻害試験
実施例2(1)で得たHEKT4−14を24well−plateへ0.8×105cells/wellで植え込み、実施例2(2)と同様にF1024−1−3あるいは後述する実施例11で作成したsCD14(1−307)S286Cの存在下もしくは非存在下でLPS/sCD14で刺激した。20時間後に培養上清を回収し、上清中のIL−8産生量をEIAによって確認した。その結果、F1024−1−3、sCD14(1−307)S286C共に、添加濃度依存的に抑制活性を示した。(図11)
(実施例11)
F1024−1−3抗体の認識領域の解析
F1024−1−3抗体が認識する領域を明らかにするため、ペプチドによる阻害実験、CD14C欠失改変体による結合実験、CD14アミノ酸置換改変体による結合実験を行なった。
(1)[CD14ペプチドの調製]
配列番号1に記載のCD14アミノ酸配列に基づき、ペプチドA(配列番号12)、ペプチドB(配列番号13)、ペプチドC(配列番号14)及びペプチドD(配列番号15)の4種類のペプチド及びコントロールとしてペプチドE(配列番号16)を合成した。すなわち、ペプチド合成機(432A、アプライドバイオシステムズ)を用いて、使用法に従いペプチドを合成し、定法に従って脱保護、切り出しを行い、C18カラム(CAPCELL−PAK、資生堂)を用いてHPLCにより精製した。精製分画を回収し、凍結乾燥後、重量を測定し、蒸留水で10mg/mlに溶解した。
(2)ヒトCD14のアミノ酸を欠失したCD14改変体(ヒト可溶型CD14欠失改変体)の調製
▲1▼[全長型sCD14発現プラスミド(pM1656)の構築]
まず、mCD14を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドpM1650を構築した。WO98/39438に記載のプラスミドpUCH14P−4より、XbaI及びHindIIIによりヒトCD14 cDNAを含む約1.4kbのDNA断片を切り出し、哺乳動物細胞発現ベクターであるpcDNA3.1(−)(Invitrogen社)のXbaI/HindIIIサイトに挿入した。その後、E.coli Competent Cells(JM109細胞、TaKaRa社)を添付のプロトコールに従い形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のmCD14を発現するプラスミド(pM1650)を得た。
次にヒトCD14を可溶型タンパクとして発現させるため、GPIアンカーリングに必要なサイトであるN末端から326番目のAsnと328番目のGly(配列番号1参照)をそれぞれGln、Valに置換した組換え体発現プラスミドpM1656の構築を行った。すなわち、センスプライマー3(配列番号17)とアンチセンスプライマー3(配列番号18)を用い、上記pM1650を鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(TaKaRa社)により94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。増幅したDNA断片をXhoIとApaLIによりdouble digestionし、pM1650のXhoI/ApaLIサイトに挿入した。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のsCD14を発現するプラスミド(pM1656)を得た。
▲2▼[ヒト可溶型CD14C末端欠失改変体ポリペプチド発現プラスミド(pM1658〜pM1662およびpM1674〜pM1676)の構築]
ヒトCD14のC末端よりそれぞれ49、56、61、66、71、110、173、204アミノ酸を欠失させた組換え体(以下sCD14(1−307)、sCD14(1−300)、sCD14(1−295)、sCD14(1−290)、sCD14(1−285)、sCD14(1−246)、sCD14(1−183)、sCD14(1−152))を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドpM1658、pM1674、pM1675、pM1676、pM1659、pM1660、pM1662及びpM1661は以下の方法で構築した。
まず、センスプライマー3とアンチセンスプライマー4、5、6、7、8、9、10及び11(配列番号19、20、21、22、23、24、25及び26)を用い、(1)で作製したプラスミドpM1656を鋳型とし、Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。
次に増幅したDNA断片をXhoIとHindIIIによりdouble digestionし、1%アガロースゲル電気泳動により分離精製した。またpM1656を同様にXhoIとHindIIIで消化、精製し、得られた約5.8kbのDNA断片と上記PCR断片をligationした。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のCD14改変体ポリペプチドを発現するプラスミド(pM1658、pM1674、pM1675、pM1676、pM1659、pM1660、pM1662及びpM1661)を得た。
▲3▼[COS−1細胞での発現]
(1)及び(2)で作製したプラスミドpM1656、pM1658〜pM1662及びpM1674〜pM1676をCOS−1細胞に下記の方法で導入し、sCD14(1−356)、sCD14(1−307)、sCD14(1−300)、sCD14(1−295)、sCD14(1−290)、sCD14(1−285)、sCD14(1−246)、sCD14(1−183)及びsCD14(1−152)を発現させた。すなわちFuGENE6(ロシュ・ダイアグノスティックス社)50μlを上記プラスミドDNA各12.5μgと添付プロトコールに従い混合し、150cm2フラスコにセミコンフルエントに増殖したCOS−1細胞に添加した。5%CO2、37℃の条件下で72時間培養した後に、培養上清を回収し目的のCD14改変体ポリペプチドを得た。
CD14改変体ポリペプチドの発現量を、抗ヒトCD14抗体を用いたEIAにて測定した。すなわち、pH8.3の10mM NaHCO3緩衝液にて200倍希釈した抗CD14抗体MEM−18(MONOSAN社)を96ウェルプレート(Maxisorp,Nunc社)に50μl/well添加し、4℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、0.5%BSAを含むPBS−にてブロッキングを行った(室温で60分間静置)。
次にwell中の液を除去し、トランスフェクションしたCOS−1の培養上清を50μl/well添加し、25℃で60分間インキュベーションした後に、0.1%Tween20を含むPBS−で3回洗浄後、1.0μg/mlのHRP−conjugated 3C10抗体50μl/wellを添加し、25℃で60分間インキュベーションを行った。0.1%Tween20を含むPBS−で5回洗浄後、発色基質(TMB)を100μl/well添加し室温で30分反応させた後に、停止液(1N塩酸)100μl/wellを加え反応を停止した。
450nmの波長の吸光度を測定し、サンプルのCD14改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
▲4▼[sCD14(1−307)アミノ酸欠失体の調製]
また、sCD14(1−307)のアミノ酸配列より一部のアミノ酸を欠失させた各種ヒト可溶型CD14欠失改変体(以下、欠失部分をΔで示す)Δ7−11、Δ57−64、Δ180−234、Δ235−282、Δ180−282を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドは▲1▼及び▲2▼と同様に行った。但し、使用したプライマーは、Δ7−11についてはセンスプライマー4(配列番号27)とアンチセンスプライマー12(配列番号28)及びセンスプライマー5(配列番号29)とアンチセンスプライマー12(配列番号30)を、Δ57−64についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー14(配列番号31)及びセンスプライマー6(配列番号32)とアンチセンスプライマー13を、Δ180−234についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー15(配列番号33)及びセンスプライマー7(配列番号34)とアンチセンスプライマー13を、Δ235−282についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー16(配列番号35)及びセンスプライマー8(配列番号36)とアンチセンスプライマー13を、Δ180−282についてはセンスプライマー4とアンチセンスプライマー17(配列番号37)及びセンスプライマー9(配列番号38)とアンチセンスプライマー13をそれぞれ用いた。次に得られたプラスミドを▲3▼に従い、COS−1細胞に導入し、ヒト可溶型CD14欠失改変体を得た。
CD14改変体の発現量を、抗ヒトCD14抗体を用いたEIAにて測定した。すなわち、pH8.3の10mM NaHCO3緩衝液にて200倍希釈した抗CD14抗体MEM−18(MONOSAN 社)を96ウェルプレート(Maxisorp,Nunc社)に50μl/Well添加し、4℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、0.5%BSAを含むPBS−にてブロッキングを行った(室温で60分間静置)。
次にウェル中の液を除去し、トランスフェクションしたCOS−1の培養上清を50μl/Well添加し、25℃で60分間インキュベーションした後に、0.1% Tween20を含むPBS−で3回洗浄後、1.0μg/mlのHRP−conjugated 3C10抗体50μl/Wellを添加し、25℃で60分間インキュベーションを行った。0.1% Tween20を含むPBS−で5回洗浄後、発色基質(TMB)を50μl/Well添加し室温で30分反応させた後に、停止液(1N硫酸)50μl/Wellを加え反応を停止した。
450nmの波長の吸光度を測定し、サンプルのCD14改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
次に、ヒト可溶型CD14C末端欠失改変体が目的の長さであるかを確認するため、CD14改変体の分子量を抗ヒトCD14抗体(3C10およびMEM−18)を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち各CD14改変体30ng/レーンをSDS−polyacrylamide gradient gel(5−20% ATTO社)で電気泳動し、PVDF膜(日本ミリポア社)にタンパクを転写した後、0.5% スキムミルクを含むPBS 30mlにて室温で1時間ブロッキング反応を行い、10μg/mlの3C10および100倍希釈のMEM−18を添加して室温で1時間反応させた。さらにHRP−conjugated抗マウスIg抗体と室温で30分間反応させた後、ECLキット(Amersham Pharmacia Biotech社)を用い、検出した。その結果、各CD14改変体ポリペプチドの計算上の大きさにバンドが検出された。
▲5▼[ヒトCD14アミノ酸置換改変体の調製]
本明細書中においてsCD14(1−307)のN末端から283番目のアミノ酸LeuをAlaに置換したヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドを「sCD14(1−307)L283A」と記載し、他のヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドも同様に記載した。
ヒトCD14(1−307)の種々の場所に1あるいは2アミノ酸変異を導入したヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドを作製するために、以下の方法で哺乳動物細胞発現プラスミドを作製した。
sCD14(1−307)K279Aを発現するプラスミドpM1673は、センスプライマー4とアンチセンスプライマー18(配列番号38)あるいはセンスプライマー10(配列番号39)とアンチセンスプライマー13を用い、▲2▼で作製したプラスミドpM1658を鋳型とし、Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa社)により98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを30回繰り返しPCR反応を行った。
アンチセンスプライマー18とセンスプライマー10にはLysをコードする配列の代わりにAlaをコードする配列GCT(アンチセンスプライマーはAGC)を用いた。これらのPCRによって増幅されたDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動によって分離回収し、Klenow Fragment(TaKaRa社)を用いてDNA断片の末端を平滑化した。
次にこれらの断片のmixtureを鋳型に、センスプライマー5とアンチセンスプライマー6を用い、上記と同様の条件で再度PCR反応を行った。2度目のPCRで増幅されたDNA断片をXhoIとHindIIIによりdouble digestionし、pM1656をXhoIとHindIIIで消化することにより得られる約5.8kbのDNA断片とligationした。JM109細胞を形質転換した後、生じたコロニーをPCRにより確認し、目的のCD14改変体ポリペプチドを発現するプラスミド(pM1673)を得た。
また同様に、N末端から282番目のVal、283番目のLeu、284番目のAsp、285番目のLeu、286番目のSer、287番目のCys、289番目のArg、294番目のPro、296番目のPro、294番目及び296番目のProあるいは300番目のProをそれぞれAlaへ置換したsCD14(1−307)V282A、sCD14(1−307)L283A、sCD14(1−307)D284A、sCD14(1−307)L285A、sCD14(1−307)S286A、sCD14(1−307)C287A、sCD14(1−307)R289A、sCD14(1−307)P294A、sCD14(1−307)P296A、sCD14(1−307)P294/296AあるいはsCD14(1−307)P300Aを発現するプラスミド(pM1663、pM1677、pM1664、pM1678、pM1665、pM1666、pM1667、pM1669、pM1670、pM1671あるいはpM1672)は、それぞれ置換を導入するアミノ酸のコドン配列をAlaのコドン配列GCTあるいはGCG(アンチセンスプライマーはAGCあるいはCGC配列)に変えたアンチセンスプライマー19、20、21、22、23、24、25、26、27、28及び29(配列番号41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及び51)とセンスプライマー11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び21(配列番号52、53、54、55、56、57、58、59、60、61及び62)を用い、pM1673と同様の方法で作製した。
さらにsCD14(1−307)R289Dを発現させるプラスミド(pM1668)も同様に構築した。この際、Aspへの置換のためArgのコドン配列(AGA)をAspのコドン配列GAT(アンチセンスプライマーはATC)に変えたセンスプライマー22(配列番号63)及びアンチセンスプライマー30(配列番号64)を用いた。
さらに、286番目のSerをCys、Gly、Thr、Leuにそれぞれ置換した改変体を発現するプラスミドを作製した。構築方法はsCD14(1−307)S286A発現プラスミドの構築と同様で、Cys置換の場合はセンスプライマー23(配列番号65)及びアンチセンスプライマー31(配列番号66)を用いた。Gly置換の場合はセンスプライマー24(配列番号67)及びアンチセンスプライマー32(配列番号68)を、Thr置換の場合はセンスプライマー25(配列番号69)及びアンチセンスプライマー33(配列番号70)を、Leu置換の場合はセンスプライマー26(配列番号71)及びアンチセンスプライマー35(配列番号72)を用いて構築を行った。
次に得られたプラスミドを▲3▼に従い、COS−1細胞に導入し、ヒトsCD14(1−307)アミノ酸置換改変体を得た。
得られたCD14改変体を含む培養上清は、必要に応じて精製した。すなわち、抗ヒトCD14抗体(3C10)を結合したアフィニティー精製用カラム(HiTrapカラム(Amersham Pharmacia Biotech社))に供して選択的に吸着させ、pH勾配にて溶出した。得られた溶出画分はただちにpH8.0の1M HEPES緩衝液にて中和し、pHを中性とした。各画分はHRP−conjugated 3C10を用いたEIA法により検定し、CD14改変体ポリペプチドの含まれる画分を選択した。
(4)[ペプチドによる阻害実験]
精製sCD14(1−356)1μg/mlを炭酸緩衝液(pH9.5)に希釈し、プレート(Maxisorp、Nunc)に37℃、1時間で固相化した後、プレートを洗浄し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。ブロッキング液を除去し、(1)で調製した各ペプチドをPBSで10μg/mlに希釈し、添加した。続けて、中根ら(J.Histochem.Cytochem.22:1084,1974)の方法によりペルオキシダーゼで標識したF1024−1−3抗体を1μg/mLで添加し、37℃で1時間反応させた。
0.9%NaCl/0.5% Tween20で5回洗浄し、H2O2/TMB溶液を用いて発色させた後0.5M硫酸で反応を停止し、結合したF1024−1−3抗体の量を測定した。
その結果、図12に示すように、F1024−1−3抗体はペプチドA、Bでは弱いながら阻止されたが、ペプチドC、D及びコントロールに用いた無関係なペプチドEでは阻止されず、F1024−1−3抗体の認識する領域は283番目のアミノ酸より318番目のアミノ酸の間にあることが推定された。
(5)[CD14欠失改変体による抗体との結合実験]
プレート(Maxisorp、Nunc)に、10μg/mlで3C10抗体または100倍希釈したMEM−18抗体を固相化し、0.5%BSA/PBSでブロッキングした。次に、ブロッキング液を除去し、濃度を測定した各CD14欠失改変体を添加して室温で1時間反応した。洗浄後、10%RS/0.1% Tween−20/PBSに1μg/mlの濃度で希釈したペルオキシダーゼ標識F1024−1−3抗体またはペルオキシダーゼ標識3C10抗体を添加し、同様に室温で1時間半反応させた。洗浄後、H2O2/TMB溶液を用いて発色させた後0.5M硫酸で反応を停止し、吸光度を450nmの波長によりNJ−2100(日本インターメッド)プレート吸光度計で測定した。
固相に使用した3C10及びMEM−18抗体はそれぞれの結合サイトが7−11番目のアミノ酸、57−64番目のアミノ酸であることが明らかであるため、今回用いたCD14欠失体のうちCD14(Δ7−11)は3C10と結合せず、またCD14(Δ57−64)はMEM−18と結合しないが、他のCD14欠失体とは結合する。したがって、3C10/F1024−1−3系、MEM−18/F1024−1−3系、MEM−18/3C10系の3種類のサンドイッチELISA系の結果を解析することにより、それぞれの抗体の結合活性を解析できる。
得られた結果を解析したところ、図13に示すように、F1024−1−3抗体はsCD14(1−356)からsCD14(1−307)までは結合活性が認められ、また、3C10の結合サイトを欠失したCD14(Δ7−11)、MEM−18の結合サイトを欠失したCD14(Δ57−64)とも結合し、さらにsCD14(1−307)の180番目のアミノ酸より282番目のアミノ酸を欠失したCD14(Δ180−282)とも結合活性が認められた。このことから、F1024−1−3抗体は3C10、MEM−18抗体とは異なる抗体であり、また、結合領域は285番目よりC末端側であることが明らかになった。なお、sCD14(1−307)結合活性は他のCD14欠失体に比較して弱いため、表示を(+)で示した。
(6)[CD14アミノ酸置換改変体による結合実験]
上記と同様な測定系を用いてCD14アミノ酸置換改変体の結合活性を測定した。その結果、図14に示すように294番目のアミノ酸をProからAlaに置換することによりF1024−1−3抗体の結合活性が失われ、このような現象は3C10、MEM−18抗体には認められなかった。F1024−1−3抗体がCD14の294番目のプロリンをポイントミューテーションすることにより結合しなくなることは、CD14の立体構造が変化したことが原因である。したがってF1024−1−3抗体は294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。
(7)[ペプチドマッピングによる結合実験]
F1024−1−3抗体が認識するエピトープをさらに詳細に解析する目的で、SPOTs(GENOSYS)を用いて配列番号1に記載のCD14のアミノ酸番号246番目から345番目までの間のアミノ酸配列に基づき、2アミノ酸ずつC末側に配列をずらした10アミノ酸残基のペプチド46種類をメンブレン上に合成した。次にプロトコールに基づき、メンブレンをブロッキングし、一次抗体としてF1024−1−3抗体を反応させ、洗浄後二次抗体としてβガラクトシダーゼ標識抗ラットIgG F(ab’)2抗体(American Qualex Antibodies)と反応させた。洗浄後、発色液を添加し青色のスポットが出現するのを確認したところ、F1024−1−3抗体由来のスポットは検出されず、ペプチドマッピングにより抗体のエピトープを決定することができなかった。このことはF1024−1−3抗体が10アミノ酸により構成されるリニアーなペプチドをエピトープとはせず、立体的な構造に起因するエピトープを認識することを示唆している。
これらのことから、F1024−1−3抗体の結合領域は配列番号1のCD14の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在し、294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。すなわち、該抗体はCD14の294番目のアミノ酸がProであることによって生じ得る立体構造の285番目のアミノ酸より315番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識することが明らかとなった。
実施例12 抗CD14抗体のエピトープの範囲の解析
抗CD14抗体がF1024−1−3抗体と同じ機能を有するために必要な、抗CD14抗体のCD14上の認識部位の範囲を、実施例11で解析したF1024−1−3抗体のエピトープの周辺を中心に解析した。
モチーフを揃えるように多重整列した上で、あらためてその周囲の残基を含めて類似性スコアを計算し、挿入、欠失なく保存度の高い領域のみを抽出したデータベースであるBLOCKSデータベースを、ヒトCD14を対象として、プロファイル検索した。さらに、各種二次構造予測法(Lev, GOR IV, PREDATOR)により解析した。
その結果、BLOCKSデータベースのプロファイル検索より、IL−1(Accession NO. BL005253C)とその受容体の結合領域と類似性がある領域を、269番目から307番までの39アミノ酸残基と特定した。保存度が高いと推測されたアミノ酸残基(残基番号)は、Q(271)V(272)P(273)L(276)K(279)L(283)L(285)S(286)C(287)P(294)E(298)L(299)P(300)E(301)N(304)L(305)T(306)であった。
さらに、この領域の287番からC末端側の配列は、LRR(PDB−ID:1A4Y:A)との相同性が高くなかった。
また各種二次構造予測法(Lev, GOR IV, PREDATOR)からは、α−ヘリックス構造及びβ−シート構造ともに一致した予測結果が得られないこと、一般的にプロリンが多く存在する場合ヘリックス構造やシート構造をとりにくいこと、304番アスパラギンはモチーフデータベースの糖鎖結合モチーフと一致し、糖鎖結合可能部位であることから、この領域は蛋白質の表面に露出していることがわかった。
これらの解析より、該領域は、生理学的条件下では、ループが形成可能な領域であり、他の蛋白質と相互作用可能な部位であった。
すなわち、実施例11のF1024−1−3抗体のエピトープ及び、上記解析より、ヒトCD14とTLRとの結合を阻害することができる抗CD14抗体のエピトープの範囲は、ヒトCD14の269番から315番までの領域であった。
実施例13 ラットF1024−1−3抗体可変領域の配列決定
ラットF1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を以下に示す方法により解析し、相補性決定領域(CDR:complementary determinant region)のアミノ酸配列を決定した。
(1)精製F1024−1−3抗体のアミノ酸配列の解析
まず、実施例2に記載の方法により精製したF1024−1−3抗体をピリジルエチル化(以下PE化と略す)し、RP−HPLCにより脱塩精製した。PE化軽鎖はProcise494cLC(Applied Biosystems Inc.)により直接アミノ酸配列分析を行った。重鎖のアミノ末端のペプチド配列はアミノ末端がブロキングされていたことより、決定することが出来なかった。そこで、PE化重鎖はCNBr分解後、RP−HPLCによりペプチド゛断片を分離精製し、ペプチドシークエンサーProcise494cLC(Applied Biosystems Inc.)によりアミノ酸配列分析を行った。同様にPE化軽鎖についてもペプチド断片のアミノ酸配列分析を行った。得られた配列をEMBLデーターベース記載のラットIgG配列の重鎖及び軽鎖の配列と比較することにより配列上のペプチド断片の位置を決定した。重鎖のアミノ末端の配列は決定できなかったため、Cohen,H(C.R.Acad.Sci.Vie 317(4),293−298,1994)、William J.(Protein Engineering 9(7),623−628,1996)及びLutz Riechmann(Nature 332,323−327,1988)等の報告に基づき推定し、アミノ末端の配列を決定した。
(2)F1024−1−3抗体のcDNA合成、PCR、シークエンシング
(1)で決定したアミノ酸配列データに基づき配列番号73から82までのプライマーを合成した。また、軽鎖のプライマーとして5’UTR及び3’UTR領域に由来する配列番号83及び84のプライマーを合成した。プライマーの塩基配列とそれに対応する図15(後述)上のアミノ酸配列の位置を表3に示す。
まず、F1024−1−3抗体産生ハイブリドーマF1024−1−3の凍結アンプルを1本解凍後、10%FCSを含むRPMI1640培地で培養した。次に、培養細胞を回収しPBS−(pH7.4)で細胞を洗浄後、Y.Kagawa et al.,Mutagenesis,14(2),199−205(1999)に基づいてcDNAの解析を以下のように行った。まず、ISOGENE(日本ジーン)によりtotal RNAを抽出した。次に、Superscript preamplification system for first strand cDNA synthesis(Invitrogen)のマニュアルに従ってオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型としてセンスプライマー、アンチセンスプライマーによりPCRを行った。PCRはExTaq polymerase(Takara)を用いて94℃、60秒、55℃30秒、72℃、120秒35サイクルの条件で行い、GeneAmp PCR system 2400(Perkin Elmer)を使用した。ゲルでバンドを確認後、PCR産物を切出し精製し、ABI Dye deoxy cycle sequencing kit(Applied Biosystems Inc.)のマニュアルに従いABI373A DNA sequencer(Applied Biosystems Inc.)でシークエンシングを行った。得られた重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を図15に、CDRのアミノ酸配列を図16(配列番号3〜8)に示した。また、得られた重鎖及び軽鎖の塩基配列を図17に、CDRを図18に示した。
実施例14 F1024−1−3ラット─ヒトキメラ抗体の作製
抗原結合活性を有するV領域がF1024−1−3抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、C領域をヒト由来の抗体(キメラ抗体)を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。キメラ抗体は1984年のMorrisonら(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,81:6851,1984)の報告以来多くのものが開発されている。
(1)抗体遺伝子のクローニング
F1024−1−3抗体を産生する細胞株F1024−1−3を培養し、細胞を調製する。得られた細胞をPBS−(Sigma)で洗浄後、total RNAをIsogene(日本ジーン)を用いて単離精製する。次にOligo−dTプライマーとSuperScript II system(Invitrogen)を用いてcDNAを合成する。重鎖及び軽鎖のアミノ末端のアミノ酸配列に基づきセンスプライマーを合成する。また、重鎖アンチセンスプライマーはフレームワーク4の配列に基づき、軽鎖アンチセンスプライマーはV κ配列に基づき作製する。PCR後、DNA断片をTAクローニングベクター(Invitrogen)に組み込み、シークエンスを解析する。
(2)ラット─ヒト重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトイムノグロブリンG1のCH1領域のN末端側をコードする塩基配列をセンスプライマーとして合成し、アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンG1の3’非翻訳領域の配列を含む領域を合成する。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて、HumanSpleen5’−StretchcDNALibrary(クローンテック社製)よりPCR反応によりヒトイムノグロブリンCH領域を増幅する。また、重鎖センスプライマーは実施例1−1の重鎖領域をコードする塩基配列とヒトイムノグロブリンG1のCH1領域のN末端側をコードするアミノ酸配列にEcoRIサイトをコードする配列を含むように作製する。アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンG1のCH3領域のC末端側に位置するアミノ酸配列をコードする塩基配列とBamHIサイトを含むように作製する。これらキメラのプライマーを組み合わせて、ラットVH領域にオリエンテーションが一致するようにヒトイムノグロブリンCH領域を組み込む。得られたPCR産物を制限酵素で消化し、DNA断片を発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)に組み込み、ラット─ヒト重鎖発現プラスミドを作製する。同様にヒトのCL領域とラット由来の軽鎖領域を有するキメラ抗体遺伝子を含む発現プラスミドを構築する。
(3)キメラ抗体の作製
形質転換体を作製するため、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で切断し、直線化する。次に、ジーンパルサー(BIORAD)等を用いて遺伝子をSP2/O−ag14(ATCC CRL1581)に導入し、培養後上清に産生されるラット─ヒトキメラ抗体の有無により目的の抗体を産生する細胞を選択する。具体的には直線化したDNA断片約20μgを1×107細胞に360V、25μFDのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を96穴プレートに植え込み、2日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、10%FCS、1×HT(Invitrogen)、0.2mg/mlG−418を含むD−MEM(Sigma)を添加し、更に2週間培養する。細胞がコンフルエントになった段階で無血清培地(Hybridoma−SFM、Invitrotec)で培養し、培養上清をプロテインAカラム(Prosep−A、ミリポア)で精製し、精製キメラ抗体を得る。
得られたキメラ抗体は実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認される。
実施例15 ヒト化F1024−1−3抗体の作製(1)
(1)ヒト化F1024−1−3抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、クイーンらの一般的な方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029,1989)に準じてフレームワーク残基の選択を行う。ヒト配列はKabatら(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)のカッパ軽鎖及び重鎖配列データベースに基づきラットF1024−1−3抗体に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択する。さらに、コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ酸の改変を行う。具体的にはコンピュータープログラムENCAD(レビット、J.Mol.Boil.168,595(1983)を用いてF1024−1−3抗体可変領域の分子モデルの構築を行う。抗体データーベースより得られたヒトEu抗体分子モデル(Stephensら、Immunology 85(4),668−674(1995)にF1024−1−3抗体のCDR配列をFR中に移植する。コンピューターモデル上でCDRとFRが本来のヒト抗体モデルとは異なり、有意な接触を示すFR領域で、アミノ酸置換を行うことによりCDRとFRとの接触が改善されると予想される位置についてラット抗体由来のアミノ酸への置換を行う。また、ヒト抗体のデーターベース中でその位置においてまれにしか現れないFR中のアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサンスアミノ酸に置換する。アミノ酸置換の良否は実際の活性により確認することになるため、アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作製する。
(2)ヒト化F1024−1−3抗体の構築
(1)で選択された配列を基に、シグナルペプチド、スプライス供与シグナル及び制限サイト(例えばXbaI)を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を構築する。構築した遺伝子は合成ヌクレオチド(80塩基長程度)のものを数種類オーバーラップするように調製する。すなわち、オリゴを対にしてアニールし、DNAポリメラーゼのKlenow断片で伸長し、2本鎖断片を得る。この断片を変性し1本鎖にした後、同様にアニールし、DNAポリメラーゼのKlenow断片で伸長し、全長の遺伝子をコードする2本鎖断片を得る。得られる断片をTaqポリメラーゼによるPCRで増幅し、精製後に制限酵素(例えばXbaI)で切断し精製する。精製した断片をヒトγ1遺伝子のCH1エクソンからCH3エクソンまでを含む定常領域遺伝子をXbaI−BamHI断片を有するプラスミドpVg1(Co等、J.Immunol.148:1149(1992)のXbaIサイトに挿入する。同様な操作によりγ4の定常領域遺伝子を含むプラスミドにも挿入可能である。また、置換するアミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異導入により作製し、発現プラスミドに導入することも可能である。軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能である。この場合pVkベクターにはヒトCκ領域を含むものを使用する。
抗体を産生する形質転換体を作製するため、重鎖及び軽鎖プラスミドを制限酵素(pVkプラスミドの場合はBamHI及びFspI)で切断し直線化後、マウスミエローマ細胞Sp−O−ag14(ATCC CRL1581)中へジーンパルサー(BIORAD)を用いて導入する。具体的には直線化したDNA断片約20μgを1×107細胞に360V、25μFDのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を96穴プレートに植え込み、2日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、10%FCS、1×HT(Invitrogen)、0.25mg/mlXanthine、1μg/mlMycophenolic acidを含むD−MEM(Sigma)を添加し、更に2週間培養する。培養後上清にでる抗体により目的とするヒト化F1024−1−3抗体産生株を選択する。すなわち、上清中の抗体が固相化したCD14抗原と結合し、結合する抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG1またはIgG4抗体で検出する。選択した株はコンフルエントになるまで10%FCSを含む培地で培養し、無血清培地(Hybridoma SFM、Invitrogen)に交換する。培養上清を回収し、プロテインA(Prosep−A、ミリポア)に結合させ、0.1M グリシン塩酸(pH3.0)で溶出する。精製抗体をPBS−(Sigma)で透析し、280nmの吸光度より抗体濃度を算出する(ヒト抗体1mg/mLは1.3の吸光度を示す)。
(3)ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体が元のラット抗体と同様な活性を有していることを確認するため、CD14/TLR結合抑制活性、及び結合のアフィニティーを比較する。CD14/TLR結合抑制活性は実施例2の記載にしたがって行い、F1024−1−3抗体との比較を行う。アフィニティーの測定はBIACOREシステム(BIACORE社)を用いて測定する。すなわち、BIACORE3000を使用し、マニュアルにしたがってCM5チップ(BIACORE社)に精製CD14を固定化する。次にHBS−EPバッファー(BIACORE社)で希釈した抗体希釈列を作製し、各サンプルをインジェクトし解析を行う。抗原抗体結合を100mM 塩酸溶液で解離し、次のサンプルをインジェクトする。得られたデータをBIACOREの解析プログラム(BIA Evaluation、BIACORE)により解析し、アフィニティー(Kd)を算出する。
実施例16 ヒト化F1024−1−3抗体の作製(2)
(1)ヒト化抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体において移植するCDR配列が活性を有する適切なドメイン構造を維持させるために元のFR領域の配列も合わせて移植する。CDRドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与しいているかは、FR中のアミノ酸の性質(疎水性、親水性、酸性、塩基性、分子サイズ等)から解析し、またコンピューターを用いたモデリングにより行う。すなわち、シリコーングラフィック上で起動するソフトウエアーQUANTA/CHARMmあるいはModeler(モレキュラー・シュミレーションズ)を用いてモデリングを行う。Brookhaven Protein Data Bank(PDB)に登録されているヒト抗体配列よりF1024−1−3抗体のVH及びVL領域と相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、それに基づきF1024−1−3抗体の三次元構造を推定する。推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖のCDRに水素結合しているFR領域中のアミノ酸群(第1群)を選出し、更にそれらに水素結合しているFR領域中のアミノ酸群(第2群)を選出する。同様に、CDRに静電的相互作用やファンデルワルツ力等のエネルギー結合により結合していると推定されるFR領域中のアミノ酸群(第1群)と更にそれらに結合していると推定されるFR領域中のアミノ酸群(第2群)を選択する。このようにして選択したFR領域中のアミノ酸群をCDRアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、Kabat等の分類(Sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,1991)やNCBI(National Center for Biotechnology Information)等より得られるヒト抗体配列の可変領域アミノ酸には存在しないような配列が生じる場合は、そのアミノ酸は移植しない。このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列VH及びVLに移植する配列を決定し、ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット(Oligonucleotide−directed in vitro mutagenesis system version 2)とPCR法を組み合わせる方法、また数種類の長鎖合成ヌクレオチドを組み合わせて増幅する方法、キメラ抗体のVHあるいはVL遺伝子を鋳型に数種類のプライマーを用いて増幅後、さらにそれら増幅遺伝子断片を鋳型として全長遺伝子断片を得る方法により作製する。得られた増幅遺伝子断片を実施例15記載のプラスミドpVg1あるいはVκを含むプラスミドpVkの制限酵素サイトに導入することにより発現プラスミドを調製する。作製したプラスミドは実施例15記載の方法により細胞に導入し、形質転換体を得、同様に精製抗体を作製する。また、同様に抗体の評価を行う。
実施例17 CDRペプチドの調製
実施例13で決定したCDR配列に基づき、ペプチド合成機(433A、アプライドバイオシステムズ)により各ペプチドを合成する。合成ペプチドは定法により切出し後、HPLCにより精製し凍結乾燥品を得る。得られたペプチドは実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認される。
実施例18 CD14改変体ポリペプチド高発現細胞株の樹立
(1)[CD14改変体ポリペプチド発現プラスミドの構築]
実施例11で得られたsCD14(1−307)S286Cを発現させるプラスミドをXbaIとHindIIIでdouble digestionし、sCD14(1−307)S286CをコードするDNA断片を切り出し、一方で、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトEFpromoterおよびSV40 late polyA、SV40 early polyAの上流に葉酸デヒドロゲナーゼ(DHFR)遺伝子をコードした発現ベクター(pM1103)を、EFpromoter下流でSV40 late polyAの上流にあるXbaIとNotIにてdouble digestionした。pM1103のXhoI/NotIサイトに先ほど得られたsCD14(1−307)S286CをコードするDNA断片を挿入し、コンピテントセルJM109(TaKaRa社)を用い、定法に従ってTransformationしてヒトsCD14(1−307)S286Cをホニュウ細胞で発現させるプラスミド(pM1675)を得た
(2)CD14改変体ポリペプチド生産用CHO形質転換株の樹立
CD14改変体ポリペプチド生産用CHO形質転換株を樹立するために、(1)で作製した発現プラスミドpM1675をDHFR遺伝子欠失チャイニーズハムスター子宮腫細胞株CHO DxB11に下記の方法にてTransfectionした。即ち、50μlのFuGENE6(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)と12.5μgのpM1675を添付プロトコールに従って混合した後に、150cm2のルーフラスコにセミコンフルエントに増殖したCHO DxB11細胞へ添加した。翌日、細胞をトリプシン/EDTA処理を行って回収し、10cm2ディッシュに10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地にて1ディッシュあたり2×104個の細胞を播種した。以降3〜4日毎に10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地で培地交換を行い、18日間選択培養を行った結果、核酸欠失培地中で増殖する24個のクローンを得た。次に、得られたクローン24株について、培養上清中のCD14改変体ポリペプチドの産生量を実施例11と同様の方法で測定した。その結果、生産量が2μg/mLを超える9クローンを得た。このうち、TfS286C−99株は最も産生量が高く、5.7μg/mLであった。
(3)CD14改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立
CD14改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立するために、以下に示す方法による選択培養を行った。(2)にて樹立したクローンの内、最も生産量の高いクローン(TfS286C−99)を10cm2ディッシュに3000個の細胞数で終濃度150nMのメトトレキセート(MTX)、10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地中に植え込んだ。3日後、終濃度150nMのMTX、10%非働化透析FBSおよび2mM L−グルタミンを含むMEMαmodification核酸欠失培地にて培地交換を行い、5日間選択培養を行った。その結果、150nMのMTXを含む培地中で増殖した15クローンを得た。得られたクローン15株について、次にCD14改変体ポリペプチドの産生量を調べた。15種の各クローンの培養上清中のCD14改変体ポリペプチド濃度を、実施例11と同様の方法で測定した。その結果、それぞれ生産量が147μg/mL、144μg/mLおよび154μg/mLとなるクローンTfS286C−99−150−3、TfS286C−99−150−8、TfS286C−99−150−9を得た。
それぞれのクローンより得られたsCD14(1−307)S286Cは、実施例2の方法により、CD14/TLR結合阻害活性が確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトCD14を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたCD14/LPSであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗CD14抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をCDRとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはTLRとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトCD14抗体が該作用をするために必要な認識領域のCD14における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びCD14とTLRとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒトCD14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニングで、LPS/CD14によるToll4を介するNF−κBの活性化の抑制を示したF1024−1−3抗体の測定結果を示す図である。
図2は、F1024−1−3抗体のイヌ、アカゲサル、カニクイサル、ウサギ、ヒトの可溶型CD14との交差反応性を示す図である。
図3(a)〜(c)は、F1024−1−3抗体のウサギCD14との結合をFluorocytomtry法で検討した結果を示す図である。
図4は、F1024−1−3抗体のLPS/CD14による内皮細胞でのIL−6産生抑制効果を示す図である。conAbはコントロールのラットIgGを示す。
図5は、F1024−1−3抗体のLPS/CD14複合体形成後の内皮細胞におけるIL−6産生抑制効果を示す図である。
図6(a)〜(c)は、CD14発現細胞へのFITC−LPSの結合試験の結果、F1024−1−3抗体が阻害しないことを示す図である。
図7は、LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体前投与によりTNFの産生が抑制されることを示す図である。
図8は、LTA/PepG投与ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体前投与により白血球減少症が改善されることを示す図である。
図9は、LPS負荷ウサギ敗血症モデルにおけるF1024−1−3抗体後投与によりALT、クレアチニンの数値が改善されることを示す図である。黒印は抗体投与群、白丸印は生食投与群を示す。
図10は、BIACORE3000を用いてLPS/CD14/TLR4−COS複合体を形成させたときの結合量、F1024−1−3抗体を結合したときのTLR4−COSの結合抑制効果を示す図である。レスポンスはビアコア社の指標であり、1000RUが1.2ngの結合量を示す。
図11は、HEKT4−14におけるIL−8の誘導産生に対するF1024−1−3及びsCD14(1−307)S286Cの抑制効果を示すグラフである。
尚、阻害活性は下記により算出した。
(抗体あるいは組換え体未添加時のIL−8産生量─抗体あるいは組換え体添加時のIL−8産生量)/抗体あるいは組換え体未添加時のIL−8産生量×100
図12は、F1024−1−3抗体のCD14(1−356)への結合を阻止する活性をもつペプチドを示す図である。
図13は、F1024−1−3抗体の各種CD14欠失改変体との結合活性を示す図である。
図14は、F1024−1−3抗体の各種CD14アミノ酸置換改変体との結合活性を示す図である。
図15は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列を示す図である。
図16は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖のCDR配列を示す図である。
図17は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列をエンコードするDNAの一例を示す図である。
図18は、F1024−1−3抗体の重鎖及び軽鎖のCDR配列をエンコードするDNAの一例を示す図である。
Claims (13)
- 配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗CD14抗体。
- CD14とToll Like Receptor(TLR)との結合阻害剤である請求の範囲1に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である請求の範囲1または2に記載の抗体。
- 請求の範囲3に記載の抗体の生物学的に活性のあるFab、Fab’、(Fab’)2である断片。
- ハイブリドーマF1024−1−3(受託番号FERM BP−7511)により産生されるF1024−1−3モノクローナル抗体。
- 配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)のうち少なくとも一つを有する抗CD14モノクローナル抗体。
- 配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRのうち少なくとも一つを有するヒト化抗体またはキメラ抗体。
- 配列番号3、4、5、6、7、または8に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも一つを有するペプチド。
- 請求の範囲3〜5のいずれかに1つに記載の抗体若しくは抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
- 配列番号1に記載のヒトCD14の269番から315番までの領域の8個以上のアミノ酸を含むペプチド。
- 請求の範囲7に記載のペプチドを免疫原として用いる、CD14とTLRの結合阻害剤である抗体の作成方法。
- 配列番号3、4、5、6、7または8に記載のアミノ酸配列を有するCDRをエンコードする塩基配列を含むDNAを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗CD14ヒト化抗体の遺伝子を産生させることを特徴とする抗CD14ヒト化抗体の作成方法。
- 請求の範囲1〜8のいずれか1つに記載の抗体若しくはペプチドを有効成分として含む敗血症用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000356719 | 2000-11-22 | ||
JP2000356719 | 2000-11-22 | ||
PCT/JP2001/008563 WO2002042333A1 (fr) | 2000-11-22 | 2001-09-28 | Anticorps monoclonal anti-cd14 exerçant un effet d'inhibition de la fixation cd14/tlr |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002042333A1 true JPWO2002042333A1 (ja) | 2004-03-25 |
Family
ID=18828903
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002544466A Pending JPWO2002042333A1 (ja) | 2000-11-22 | 2001-09-28 | Cd14/tlr結合阻害作用を有する抗cd14モノクローナル抗体 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7264967B2 (ja) |
EP (1) | EP1336620A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2002042333A1 (ja) |
AU (1) | AU2001290315A1 (ja) |
CA (1) | CA2429467A1 (ja) |
WO (1) | WO2002042333A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1252333A4 (en) * | 2000-01-25 | 2005-01-05 | Nuvelo Inc | Methods and materials related to CD84-like polypeptides and polynucleotides |
US20040092712A1 (en) * | 2000-03-31 | 2004-05-13 | Shoji Furusako | Tlr/cd14 binding inhibitor |
US7608684B2 (en) | 2002-11-12 | 2009-10-27 | Mochida Pharmaceuticals Co., Ltd. | Soluble CD14 antigen |
ATE460430T1 (de) * | 2002-11-12 | 2010-03-15 | Mochida Pharm Co Ltd | Kit zur untersuchung von menschlichem niedermolekulargewicht cd14 und antikörper |
AU2004241069B2 (en) * | 2003-05-15 | 2010-09-09 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis |
DK1830881T3 (da) * | 2004-12-10 | 2010-09-20 | Novimmune Sa | Kombinationsterapier, som er målrettet mod multiple toll-like-receptorer og anvendelse deraf |
CN101189334B (zh) * | 2005-06-03 | 2013-11-06 | 持田制药株式会社 | 抗cd14抗体融合蛋白质 |
WO2008027739A2 (en) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Nuvelo, Inc. | Antibodies to ntb-a |
CN102898527B (zh) | 2011-07-25 | 2016-12-21 | 三星电子株式会社 | 融合蛋白、药物组合物及预防或治疗癌症的方法 |
CN102940538B (zh) * | 2012-12-06 | 2014-10-15 | 吉林大学 | 可调节周期性下颌前伸牵引装置 |
WO2017160599A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of cd300b antagonists to treat sepsis and septic shock |
WO2018106959A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-14 | Progenity Inc. | Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems |
EP4108183A1 (en) | 2017-03-30 | 2022-12-28 | Biora Therapeutics, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device |
JP7371019B2 (ja) | 2018-05-10 | 2023-10-30 | ザ・メソジスト・ホスピタル | 疾病の予後と管理のための方法 |
WO2019246312A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator |
WO2019246317A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm |
WO2020106757A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Progenity, Inc. | Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract |
CN115232211A (zh) * | 2019-11-19 | 2022-10-25 | 武汉全景生物技术有限公司 | 新的抗可溶性cd14亚型抗体及其应用 |
US11707610B2 (en) | 2019-12-13 | 2023-07-25 | Biora Therapeutics, Inc. | Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract |
WO2021253335A1 (zh) * | 2020-06-18 | 2021-12-23 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 抗可溶性cd14亚型抗体、试剂盒及其应用 |
WO2022073072A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Implicit Bioscience Limited | Methods and agents for the treatment of ocular disease |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2744130B2 (ja) * | 1989-08-01 | 1998-04-28 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | 敗血症治療用組成物 |
EP0751962B1 (en) | 1993-05-28 | 2006-08-02 | The Scripps Research Institute | Methods for inhibiting cd14 mediated cell activation |
EP0759999A1 (en) * | 1994-05-12 | 1997-03-05 | Quest International B.V. | Process for inhibiting the growth of a culture of lactic acid bacteria, and optionally lysing the bacterial cells, and uses of the resulting lysed culture |
ATE308994T1 (de) | 1994-09-16 | 2005-11-15 | Scripps Research Inst | Gebrauch von antikörpern zur verhinderung von auswirkungen hervorgerufen durch grampositive- und myko-bakterien |
WO1996020957A1 (en) * | 1994-12-30 | 1996-07-11 | Amgen Inc. | Anti-inflammatory cd14 polypeptides |
KR20000065204A (ko) | 1997-03-07 | 2000-11-06 | 모치다 에이 | Cd14에 대한 안티센스 화합물 |
US20040092712A1 (en) * | 2000-03-31 | 2004-05-13 | Shoji Furusako | Tlr/cd14 binding inhibitor |
-
2001
- 2001-09-28 JP JP2002544466A patent/JPWO2002042333A1/ja active Pending
- 2001-09-28 US US10/432,236 patent/US7264967B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-09-28 AU AU2001290315A patent/AU2001290315A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-28 WO PCT/JP2001/008563 patent/WO2002042333A1/ja active Application Filing
- 2001-09-28 EP EP01970291A patent/EP1336620A4/en not_active Withdrawn
- 2001-09-28 CA CA002429467A patent/CA2429467A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002042333A1 (fr) | 2002-05-30 |
US7264967B2 (en) | 2007-09-04 |
AU2001290315A1 (en) | 2002-06-03 |
EP1336620A1 (en) | 2003-08-20 |
EP1336620A4 (en) | 2004-11-17 |
CA2429467A1 (en) | 2002-05-30 |
US20040091478A1 (en) | 2004-05-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPWO2002042333A1 (ja) | Cd14/tlr結合阻害作用を有する抗cd14モノクローナル抗体 | |
JP3926153B2 (ja) | 遺伝子組換え抗体およびその抗体断片 | |
JP4052515B2 (ja) | ヒト型cdr移植抗体およびその抗体断片 | |
JP3925663B2 (ja) | 抗Fasリガンド抗体および該抗体を用いた測定法 | |
KR101695056B1 (ko) | 카드헤린-11의 ec1 도메인을 표적으로 하는 인간화 항체 및 관련 조성물 및 방법 | |
US20160176985A1 (en) | Humanized monoclonal antibodies and methods of use | |
CN106794129B (zh) | 对il-21具有特异性的结合分子及其用途 | |
US20050154192A1 (en) | Anti-il13 receptor alpha1 neutralizing antibody | |
JP6363623B2 (ja) | 免疫グロブリンaのレベルを増大するための方法 | |
KR100496335B1 (ko) | 항-Fas 리간드항체 및 이 항체를 이용한 측정법 | |
KR20230009441A (ko) | 항-tigit 항체, 이의 제조 방법 및 용도 | |
EP1275713A1 (en) | Tlr/cd14 binding inhibitor | |
EA037397B1 (ru) | Гуманизированные антитела к рецептору ccr7 | |
US20040092712A1 (en) | Tlr/cd14 binding inhibitor | |
JP6872756B2 (ja) | 抗Myl9抗体 | |
JP6555687B2 (ja) | 免疫制御剤 | |
CN115515625A (zh) | 与人类ceacam1/3/5特异性结合的新抗体及其用途 | |
WO2003072134A1 (fr) | Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle | |
KR20230158526A (ko) | Ccr9에 결합하는 치료용 결합 분자 | |
RU2804456C1 (ru) | Связывающие молекулы, специфичные к ил-21, и области их применения | |
JP2023523919A (ja) | ヒト化抗ヒトcd89抗体及びその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080926 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080926 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110621 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111101 |