JP2023523919A - ヒト化抗ヒトｃｄ８９抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃａＲＩ）に結合することができ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止する、ヒト化抗体を説明する。本開示はまた、特定の疾患との闘いにおけるかかる抗体の使用を説明する。【選択図】なし
Description
本発明は、抗体の分野及びかかる抗体の使用に関する。本抗体は、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止するのに特に有用である。本抗体は、ヒトエフェクター細胞を標的とするのに特に有用である。
免疫グロブリンのＦｃ部分（ＦｃＲ）の受容体は、様々な型の免疫細胞上に存在し、免疫系の体液性枝と細胞性枝との間の連結を提供する。抗体とＦｃＲとの間の相互作用は、抗原特異的認識特性でＦｃＲを発現する細胞を提供する。相互作用は、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、トランスサイトーシス、エキソサイトーシス、スーパーオキシド生成、抗体依存性細胞傷害性、及びサイトカイン炎症性媒介因子の放出のうちの様々な応答を開始することができる。免疫グロブリンの受容体及び免疫応答におけるそれらの役割は、広範囲にわたって調査されている。
現在、抗体定常領域の５つのクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭが認識されている。ＩｇＡは、先天性免疫系において役割を果たす。それは、微生物及び外来タンパク質が粘膜表面に侵入するのを防ぐことに関与する。ＩｇＡはまた、毒素及び感染性生物を中和することもできる。更に、ＩｇＡは抗炎症特性を有し、ＩｇＧ誘発性サイトカイン放出及びファゴサイトーシスなどの機能を阻害することができる。
抗体定常領域の異なるクラスは、異なるＦｃ受容体と相互作用することができる。ＩｇＡと結合することができるＦｃ受容体は、ＣＤ８９である。ヒトＣＤ８９は、ヒトＩｇＡ１及びヒトＩｇＡ２の重鎖定常領域に結合することができる。ＣＤ８９は、グリコシル化膜貫通受容体であり、ＦｃαＲＩとしても既知である。ＣＤ８９は、２つの細胞外ドメイン、ＥＣ１及びＥＣ２、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有する。ＩｇＡとＣＤ８９との相互作用は、ＥＣ１細胞外ドメインによって媒介される。参照配列については、ＮＰ＿００１９９１．１（免疫グロブリンαＦｃ受容体アイソフォーム前駆体）を参照する。参照は、ヒトＣＤ８９遺伝子／タンパク質を同定するためだけに行われる。本明細書に記載のヒトＣＤ８９をデータベースエントリの特定の配列に限定することを意図するものではない。ヒトＣＤ８９の天然バリアントは、本発明の範囲内である。組換えヒトＣＤ８９はまた、ＩｇＡに結合することができ、かつ本明細書に記載される抗体に結合することができる場合、本発明の範囲内でもある。ＣＤ８９は、好中球、好酸球、並びにほとんどの単球及びマクロファージを含む骨髄系細胞の細胞表面上に存在する。しかしながら、受容体は、肥満細胞及び腸マクロファージ上には現れない。ＣＤ８９の発現は、構成的であり、ＩｇＡリガンドの存在に依存しないことが見出されている。
ＣＤ８９は、単量体ＩｇＡ、重合体ＩｇＡ及びＩｇＡ複合体と相互作用することができる。単量体ＩｇＡはＣＤ８９に一過性に結合するが、一方で重合体ＩｇＡ及びＩｇＡ複合体はＣＤ８９に貪欲に結合すると考えられている。ＣＤ８９は、炎症促進応答及び抗炎症応答の両方において役割を果たすことができる。ＩｇＡ結合に応答するために、受容体は、大部分がＦｃＲγ鎖の二量体形態である別の因子と会合する必要がある。リガンドのＣＤ８９への結合は、様々な生物学的プロセスを開始することができる。ＣＤ８９へのリガンドの結合によって促進される細胞機能はまた、関連するＦｃＲγ鎖にも依存する。
細胞上のＣＤ８９受容体の架橋は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ免疫複合体、又は抗ＣＤ８９抗体の結合によって達成され得る。架橋は、状況に応じて、特に結合に応じて、正及び負の効果を有し得る免疫応答を引き起こす。ＣＤ８９特異的抗体は、免疫応答を調節するためのツール／薬剤として使用され得る。例えば、慢性炎症性疾患に罹患している個体は、免疫応答を阻害する方法から利益を得ることができる。ＣＤ８９受容体は、好中球、好酸球、単球及びマクロファージを含む様々な細胞型上で発現する。特に、ＣＤ８９発現細胞に関連する疾患及び／又はＩｇＡ関連疾患に罹患している個体は、ＣＤ８９抗体での治療から利益を得ることができる。現在、好中球に関与する疾患に対する既知の治療はない。
一態様では、本開示は、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができるヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体であって、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＸ１ＶＸ２ＴＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
を含む、重鎖可変領域であって、式中、
Ｘ１が、Ｌ又はＷであり
Ｘ２が、Ａ又はＳであり
Ｘ３が、Ｎ、Ｓであり
Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
当該重鎖可変領域が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、重鎖可変領域と、
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＩ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＺ１Ｚ２ＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＺ ３ＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＺ４ＣＱＱ ＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＬＥＩＫ
を含む、軽鎖可変領域であって、式中、
Ｚ１が、Ａ又はＴであり
Ｚ２が、Ｖ又はＰであり
Ｚ３が、Ｙ又はＦであり
Ｚ４が、Ｙ又はＦであり、
当該軽鎖可変領域が、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体を提供する。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＸ１ＶＸ２ＴＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
を含む、重鎖可変領域であって、式中、
Ｘ１が、Ｌ又はＷであり
Ｘ２が、Ａ又はＳであり
Ｘ３が、Ｎ、Ｓであり
Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
当該重鎖可変領域が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、重鎖可変領域と、
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＩ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＺ１Ｚ２ＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＺ ３ＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＺ４ＣＱＱ ＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＬＥＩＫ
を含む、軽鎖可変領域であって、式中、
Ｚ１が、Ａ又はＴであり
Ｚ２が、Ｖ又はＰであり
Ｚ３が、Ｙ又はＦであり
Ｚ４が、Ｙ又はＦであり、
当該軽鎖可変領域が、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体を提供する。
好ましい実施形態では、Ｘ１は、Ｌであり、Ｘ２は、Ａであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｔであり、Ｚ１は、Ａであり、Ｚ２は、Ｖであり、Ｚ３は、Ｙであり、Ｚ４はＹである。
別の好ましい実施形態では、Ｘ１は、Ｌであり、Ｘ２は、Ａであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｚ１は、Ａであり、Ｚ２は、Ｖであり、Ｚ３は、Ｙであり、Ｚ４はＹである。
一態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１３８又は１３９のアミノ酸配列を有する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体を提供する。
本明細書に記載の抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができる。
更なる態様では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる。ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のブダペスト条約寄託は、寄託者がＬｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙでの２９３Ｆ ＣＧ８９クローン２を参照の下、Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒ Ｓｗｉｓｓ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ、Ｗａｌｄｍａｎｎｓｔｒ．８，８００１ Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって寄託され、アクセッション番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１を有する。
一態様では、本開示は、本明細書で開示の抗体又は本明細書で開示の抗原結合断片をコードする核酸分子（複数可）を提供する。本明細書で開示の可変領域、好ましくは、本明細書に記載のヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする核酸も提供される。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。一態様では、本明細書で開示の抗体、核酸分子（複数可）、及び／又はベクターを含む細胞（宿主細胞）を提供する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞又は酵母細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６（商標）細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）９６０２２９４０、ＷＯ１９９７／０００３２６、Ｐａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７１６－２７２１）である。
一態様では、本開示は、本明細書で開示の抗体の産生方法を提供する。本方法は、好ましくは、抗体の採取を含む。好ましくは、抗体は、細胞を使用して産生され、当該細胞から採取される。好ましくは、当該細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６（商標）細胞である。別の好ましい実施形態では、抗体は、合成的に産生される。
本開示の一態様は、開示の抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、及び／又は細胞を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、本明細書で開示の組成物又は抗体若しくはその抗原結合断片は、薬剤の製造において使用するためのものである。好ましくは、薬剤は、慢性炎症性疾患の治療又は予防のためのものである。
一態様では、本開示は、慢性炎症性疾患の治療を必要とする対象に、治療有効量の本明細書で開示の抗体若しくはその抗原結合断片、核酸分子又はベクター又は医薬組成物を投与することを含む、対象における慢性炎症性疾患の治療のための方法を提供する。
一態様では、本開示は、慢性炎症性疾患の治療における使用のための抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得るか又は結合し、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得るか、又は防止し、かつ、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない。本明細書で好ましく言及される、３７℃での一晩のインキュベーション後の生存性又は発現の変化は、好ましくは、同じ条件だが当該抗体を含まない条件下でインキュベーションされた場合の対照値に対する変化を指す。当該生存性実験は、好ましくは、無血清培地などの好適な培地中で実施される。
更なる態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、同じ条件だが当該抗体を含まない条件下でインキュベーションされた同じ細胞と比較して、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体がＮａＮ３の非存在下、３７℃で当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ＮａＮ３の存在下、４℃で当該細胞に結合されるとき、単量体ヒトＩｇＡ又は熱凝集ＩｇＡを置換し得ない。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸２２～４６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸２２～４６と交換されている組換えヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸４７～７１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸４７～７１と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸７２～９６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸７２～９６と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子への結合が２０％以下に低減したものである。
一態様では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７がカニクイザルＣＤ８９のそれぞれアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２９～３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３２～３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４５～４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４８～５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６９～７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７２～７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７７～７９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号８０～８２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５３～５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５６～５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る、抗体を提供する。
一態様では、本開示は、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体を提供し、好ましくは、抗体はＣＤ８９のＥＣ１細胞外ドメインに結合し得る。
本開示は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合し得る抗体を記載する。本明細書に記載の抗体は、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止するのに有用である。ＣＤ８９受容体に結合し得るいくつかの抗体が生成されている。ＣＤ８９のＥＣ１ドメインに結合するモノクローナル抗体は、ＩｇＡ結合を遮断することができるが、ＥＣ２ドメインに結合する抗体は、ＩｇＡが受容体に結合することを防止しないと考えられる。ＣＤ８９上のＩｇＡ結合部位を特異的に干渉する抗体は当該技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９ Ｊｕｎ ７；１８９（１１）：１７１５－２２及びＳｈｅｎ Ｌ．Ａ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ａｐｒ；５１（４）：３７３－８に記載されるＭＩＰ８ａ、２Ｄ１１又はＭＹ４３。ＭＩＰ８ａは、ヒトＣＤ８９に結合し、マウスＩｇＧ１定常領域を有するマウスモノクローナル抗体である。ＣＤ８９に結合し得る抗体、例えば、ＭＩＰ８ａは、好中球死を誘発し得る（Ｗｅｈｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４ Ｄｅｃ １；１９３（１１）：５６４９－５９）。
一態様では、本発明は、新たなヒト化抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合し得、かつ、抗体が細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。
一態様では、本発明は、新たな抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合し得、かつ、抗体が細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、抗体ＭＩＰ８ａと比較してヒトＣＤ８９発現細胞への細胞死の誘発がより少ない。
「抗体」という用語は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対からなる免疫グロブリン分子を指し、各対は、１つの「重」（Ｈ）鎖、及び１つの「軽」（Ｌ）鎖を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。ＩｇＤ、ＩｇＧ、及びＩｇＡの重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなり、ＩｇＭ及びＩｇＥの重鎖定常領域は、４つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へと更に細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖及び重鎖の可変領域は、一緒に抗体結合部位を形成し、エピトープに対する特異性を定義する。抗体における領域又はドメインにアミノ酸を割り当てるための様々な方法が当該技術分野で既知である。周知の方法としては、Ｋａｂａｔ法及びＣｈｏｔｈｉａ法が挙げられる（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３４２（６２５２）：８７７－８３）。本開示の各領域又はドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う。
「抗体」という用語は、マウス抗体、ヒト化抗体、脱免疫化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体、並びに単量体抗体の二量体、三量体、又はより高次の多量体などの抗体の多量体形態である抗体を包含する。抗体はまた、単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗体、及び必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含する。また、非抗体部分に連結又は取り付けられている抗体も包含する。更に、「抗体」という用語は、抗体を産生する任意の特定の方法によって限定されない。例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、及びポリクローナル抗体を含む。本発明は、本明細書に記載の抗体を提供する。更に、本発明は、本明細書で開示の抗体の一部、誘導体、及び／又は類似体を提供する。部分、誘導体及び／又は類似体は、必ずしも量ではなく、同種のもので抗体の抗原結合特性を保持する。部分及び／又は誘導体の非限定的な例としては、抗原結合部分であり、典型的には抗体の１つ以上の可変ドメインを含有する抗体の一部が挙げられる。非限定的な例は、様々なＦａｂ断片である。部分はまた、いわゆる単一ドメイン抗体断片であり得る。単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ、開発者であるＡｂｌｙｎｘによってナノボディと呼ばれる）は、単一モノマー可変抗体ドメインを有する抗体断片である。抗体全体と同様に、特異的抗原に選択的に結合することができる。１２～１５ｋＤａの分子量しかない単一ドメイン抗体断片は、２つの重タンパク質鎖及び２つの軽鎖からなる一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）及び一本鎖可変断片（約２５ｋＤａ、１つの軽鎖及び１つの重鎖である２つの可変領域）よりも更に小さい。単一ドメイン抗体自体は、通常の抗体よりもはるかに小さくはない（典型的には９０～１００ｋＤａである）。単一ドメイン抗体断片は、主にラクダ科に見られる重鎖抗体から操作され、これらはＶＨＨ断片（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））と呼ばれる。一部の魚類はまた、重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）を有し、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体断片を得ることができる。代替アプローチは、ヒト又はマウス由来の一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）由来の二量体可変ドメインをモノマーに分割することである。単一ドメイン抗体の研究のほとんどは現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディが標的エピトープに特異的に結合することも示されている。抗体部分の非限定的な例は、抗体又はその等価物の重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを含有する。そのような部分の非限定的な例は、ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）及びユニボディである。好ましい抗体部分又は誘導体は、少なくとも本明細書に記載の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する。誘導体又は部分である非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）断片及び単鎖Ｆｖ断片である。二重特異性抗体の機能部分は、二重特異性抗体の抗原結合部分、又は結合部分の誘導体及び／若しくは類似体を含む。
「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを含む単一のポリペプチド鎖を有し、ＶＬドメイン及びＶＨドメインは、一価分子を形成するように対形成される。単鎖抗体は、当該技術分野において既知の方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。「ダイアボディ」は、２つの鎖を有し、各鎖は、短いペプチドリンカーによって接続された同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変領域に接続された重鎖可変領域を含み、同じ鎖上の２つの領域は、互いに対形成しないが、他方の鎖上の相補ドメインと対形成して二重特異性分子を形成する。ダイアボディの調製方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８、及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照されたい）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかの可変領域に対応する、抗体の小さい機能的結合単位である。ドメイン抗体は、細菌、酵母、及び哺乳動物細胞系において良好に発現される。ドメイン抗体の更なる詳細及びその産生方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第６，２９１，１５８号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号、ＷＯ０４／００３０１９及びＷＯ０３／００２６０９を参照されたい）。ナノボディは、抗体の重鎖に由来する。ナノボディは、典型的には、単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、元の抗体の抗原結合能力を保持する。ナノボディは、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号、米国特許第６，８３８，２５４号、ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を除去することによって作製され得る。ユニボディの更なる詳細及びそれらの調製方法は、ＷＯ２００７／０５９７８２に見出され得る。
抗体に対する類似体のリストは毎年増加している。可変ドメインの配列及び多くの異なる抗体の３Ｄ構造に関する現在の広範な知識により、当業者は、本発明の抗体を、１つ又は他の抗体類似体、部分又は誘導体に変換することができる。
結合分子に加えて、本発明の分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸及びデキストランなどの、分子のインビボ半減期を増加させるための部分を更に含み得る。かかる更なる部分は、当該技術分野で周知の方法を使用して結合部分とコンジュゲートされてもよく、又はそうでなければ結合部分と組み合わされてもよい。
本明細書に記載の抗体の可変ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。ＣＡＲは、新しい特異性（典型的には、抗体の抗原結合部分又はその誘導体）と、標的細胞に対する免疫細胞とを組み合わせる、操作された受容体である。受容体は、異なる供給源（１つ以上のキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたＴリンパ球（ＣＡＲ、例えば、Ｅｓｈｈａｒ、米国特許第７，７４１，４６５号、Ｅｓｈｈａｒ、米国特許出願公開第２０１２／００９３８４２号を参照されたい）由来の部分の融合であるため、キメラと呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示の抗体は、活性化合物、例えば、毒素にカップリングされ得る。更に、開示の抗体又は抗原結合断片は、標識、例えば、蛍光タンパク質、化学標識、有機色素、着色粒子又は酵素にカップリングされ得る。本明細書で開示の抗体は、薬物にカップリングされて、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成し得る。本発明は、抗体類似体、抗体部分、及び抗体誘導体の分子が他の分子にカップリング又は組み込まれる場合も、抗体類似体、抗体部分、及び抗体誘導体を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示の抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」という用語は、ヒト及びマウスなどの２つの異なる種に由来するアミノ酸配列、典型的には、マウス可変領域（重鎖及び軽鎖由来）及びヒト定常領域（重鎖及び軽鎖）の組み合わせを含む抗体を指す。かかるキメラ抗体を生成する非限定的な例は、実施例（実施例６）に記載される。このキメラ抗体において、マウスＩｇＧ１／カッパ定常領域は、ヒトＩｇＧ／カッパ定常ドメインと交換される。
好ましい実施形態では、本明細書で開示の抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト動物抗体からのＣＤＲの一部又は全てを含有し、一方で抗体のフレームワーク及び定常領域がヒト抗体配列に由来するアミノ酸残基を含有する抗体を指す。ヒト化抗体は、典型的には、マウス抗体由来のＣＤＲをヒトフレームワーク配列に移植し、続いて、供給源抗体由来の対応するマウス残基に対する特定のヒトフレームワーク残基の逆置換によって産生される。ヒト化抗体はまた、非ヒト起源の抗体のアミノ酸配列及びプロテインデザインラボ（ＰＤＬ）技術（米国特許第５６９３７６号、米国特許第５６９３６７１号、米国特許第５５８５０８９号）を使用してインシリコで生成され得る。ヒト化抗体の利点は、マウスの対応物と比較してインビボ耐容性が増加することである。
「脱免疫化抗体」という用語はまた、典型的には、１つ以上の可変領域において、免疫原性を低減させる目的で、ヒトＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープを構成する高い傾向を有する１つ以上のエピトープが除去されている非ヒト起源の抗体を指す。エピトープのアミノ酸配列は、完全に又は部分的に除去され得る。しかしながら、典型的には、アミノ酸配列は、エピトープを構成するアミノ酸のうちの１つ以上を１つ以上の他のアミノ酸に置換することによって改変され、それによってアミノ酸配列をヒトＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープを構成しない配列に変化させる。アミノ酸は、場合によっては、対応するヒト可変重鎖又は可変軽鎖における対応する位置に存在するアミノ酸によって置換される。
好ましい実施形態では、本明細書で開示の抗ＣＤ８９抗体は、ヒト化されている。
本明細書では、「脱アミド修復された」アミノ酸配列に言及する場合、脱アミド化が起こりやすいアミノ酸が、脱アミド化が起こりにくいか、又は脱アミノ化が起こりやすくないアミノ酸に置き換えられるアミノ酸配列を指すように意図される。脱アミド化は、アミノ酸のアスパラギン又はグルタミンの側鎖中のアミド官能基が除去されるか、又は別の官能基に変換される化学反応である。典型的には、アスパラギン（Ａｓｎ）は、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸に変換される。グルタミン（Ｇｌｎ）は、グルタミン酸又はピログルタミン酸に変換される可能性がある。Ａｓｎ－Ｇｌｙ部位は最も脱アミド化が起こりやすく、アスパラギンはグルタミンと比較して容易に脱アミド化される。アスパラギン及び／又はグルタミンの脱アミド化は、抗体の構造、並びにその安定性及び／又は機能を変化させ得る。抗体では、この反応は、抗体構造、安定性又は機能（すなわち、抗体－抗原結合）を変化させる可能性があり、抗体分解をもたらせる可能性があるので、望ましくない。脱アミド化が起こりやすい抗体可変領域におけるアミノ酸を予測することができる（Ｓｙｄｏｗ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１４； ９（６）：ｅ１００７３６）。したがって、脱アミド化のリスクがある残基が同定され、次いで、これらの部位は、脱アミド化が起こりやすいアミノ酸を、脱アミド化が起りにくいアミノ酸で置き換えることによって修復され得る。
好ましい実施形態では、本明細書で開示のヒト化抗ＣＤ８９抗体は、脱アミド修復されている。好ましい一実施形態では、脱アミド化が起こりやすいアスパラギンは、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、又はグルタミン（Ｑ）アミノ酸で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示の抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列のみのアミノ酸配列からなる抗体を指す。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、又はマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、マウスの炭水化物鎖を含有してもよい。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な方式で調製され得る。キメラ、ヒト化、脱免疫化、及びヒト抗体は、本発明の範囲内である。
ヒトＣＤ８９に結合し得る抗体は、通常、抗体結合に使用される条件下で受容体に結合する。抗体及びヒトＣＤ８９受容体を、抗体結合に好適な条件下で互いに接触させる場合、抗体はヒトＣＤ８９受容体に結合する。抗体は、番号ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に発現した膜結合ヒトＣＤ８９に結合するが、一方で抗体は、細胞膜上にヒトＣＤ８９を発現しないＨＥＫ２９３Ｆ細胞に顕著に結合しない。ヒトＣＤ８９発現細胞への抗体の結合は、当業者に既知の方法によって検出され得る。例えば、蛍光標識を担持する二次抗体を使用することにより、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して標識された細胞を測定する。
ＣＤ８９は、ＩｇＡに結合し得るＦｃ受容体である。その受容体は、ＦｃαＲＩとしても知られている。ヒトＣＤ８９は、ヒトＩｇＡ１及びヒトＩｇＡ２の重鎖定常領域に結合することができる。ＣＤ８９は、グリコシル化膜貫通受容体であり、２つの細胞外ドメイン、ＥＣ１及びＥＣ２、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有する。ＩｇＡとＣＤ８９との相互作用は、ＥＣ１細胞外ドメインによって媒介される。参照配列については、ＮＰ＿００１９９１．１（免疫グロブリンαＦｃ受容体アイソフォーム前駆体）を参照する。参照は、ヒトＣＤ８９遺伝子／タンパク質を同定するためだけに行われる。本明細書に記載のヒトＣＤ８９をデータベースエントリの特定の配列に限定することを意図するものではない。ＩｇＡに結合し得、本明細書に記載の抗体に結合し得るヒトＣＤ８９の天然バリアントは、本発明の範囲内である。組換えヒトＣＤ８９はまた、ＩｇＡに結合することができ、かつ本明細書に記載される抗体に結合することができる場合、本発明の範囲内でもある。
ＣＤ８９は、好中球、好酸球、並びにほとんどの単球及びマクロファージを含む骨髄系細胞の細胞表面上に存在する。受容体は、肥満細胞及び腸マクロファージ上には現れない。ＣＤ８９の発現は、構成的であり、ＩｇＡリガンドの存在に依存しないことが見出されている。「ヒトＣＤ８９発現細胞」という用語は、ヒトＣＤ８９を発現する細胞を指す。例示的な細胞は、好中球、好酸球、単球、及び／又はマクロファージである。
細胞上のＣＤ８９受容体の架橋は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ免疫複合体、又は抗ＣＤ８９抗体の結合によって達成され得る。ＩｇＡの結合は、正及び負の効果を有し得る免疫応答を引き起こし得る。
「細胞外」という用語は、文字通り、細胞の外側を意味する。「細胞外部分」という用語は、細胞膜の外側にある分子の部分を指す。分子のこの部分は、細胞の外側の他の分子との相互作用に利用可能であり得る。ヒトＣＤ８９受容体は、２つの細胞外ドメイン、すなわち、ＥＣ１及びＥＣ２を有する。これらのドメインは、細胞の外側の分子、例えば、ＩｇＡ抗体と相互作用し得る。ＩｇＡは、ヒトＣＤ８９受容体のＥＣ１ドメインに結合することが知られている。
ヒトＣＤ８９発現細胞は、ヒトＣＤ８９分子を発現する細胞である。好ましくは、分子は、細胞の細胞膜上に存在する。ヒトＣＤ８９を発現する細胞の例は、好中球、好酸球、単球、及び／又はマクロファージであるが、これらに限定されない。更に、細胞膜上にヒトＣＤ８９を発現する修飾ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株を番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託している。
「結合を防止すること」という用語は、ＩｇＡがヒトＣＤ８９受容体と相互作用するのを防止する本明細書で開示の抗体又はその抗原結合断片の能力を指す。抗ＣＤ８９抗体又はその抗体断片がヒトＣＤ８９受容体に結合している場合、ＩｇＡはもはやヒトＣＤ８９受容体に結合することができない。好ましくは、本明細書で開示の抗ＣＤ８９抗体の結合は、ヒトＣＤ８９受容体へのＩｇＡの結合の能力を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、遮断又は低減させる。ＩｇＡのＣＤ８９への結合の防止又は遮断又は低減は、好ましくは、実施例に記載の方法で測定される。好ましくは、ＣＤ８９発現細胞を使用する。好ましくは、当該細胞は、ヒトＣＤ８９を安定に発現している。目的の抗体は、ＣＤ８９発現細胞に対して滴定される。続いて、細胞をＩｇＡとともにインキュベーションする。洗浄後、細胞に結合したＩｇＡをＩｇＡに対する標識抗体、好ましくは蛍光標識抗体を使用して検出した。ヒトＣＤ８９発現細胞の膜上のＩｇＡの結合を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を使用して測定することができる。結合したＩｇＡの量は、滴定された抗体の遮断能力を示す。特定の抗体濃度でＩｇＡの結合が少ないことは、抗体の強力な遮断能力を示す。好ましい方法が、結果が図４ａ及び図４ｂに示されている実施例において記載されている。ヒトＣＤ８９コーティングウェル上又はヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上で試験抗体を滴定することが好ましい。次いで、遮断容量は、滴定曲線をＭＩＰ８ａなどの陽性対照で得られた曲線と比較することによって容易に決定される。遮断パーセンテージは、通常、その他は同一の条件下でのＭＩＰ８ａの遮断と比較した場合、パーセンテージとして与えられる。試験抗体及び対照抗体ＭＩＰ８ａの結合の割合の比較は、試験抗体がその遮断能の少なくとも９０％に調度達する抗体の濃度で行うのが好ましい。図４ｂでは、これは、おおよそ１ｕｇ／ｍｌの抗体濃度である。この実施例では、抗体８Ｆ３の遮断パーセンテージは、約（（８００－２００）／８００）×１００＝約７５％であると算出される。抗体１６Ｄ６の遮断パーセンテージは、約（（８００－４５０）／８００）×１００＝約４５％であると算出される。ＣＤ８９に結合しない対照ＩｇＧ１は、典型的には、ＩｇＡのＣＤ８９への結合を防止しない。
免疫グロブリンＡは、とりわけ血液中及び漿液粘膜分泌物中に見られる抗体アイソタイプである。ヒトＩｇＡは、２つのサブクラス、すなわち、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を有し、単量体及び二量体形態で産生され得る。二量体形態は、最も一般的な形態である。二量体ＩｇＡの分泌形態は、分泌ＩｇＡとも称される。ＩｇＡの分泌形態は、ＦｃαＲＩへの結合において部分的に立体的に妨げられる。これは、ｓＩｇＡのＦｃαＲＩ結合部位のいくつかが、腸内腔へのｓＩｇＡの分泌を補助する切断された重合体Ｉｇ受容体（切断後に分泌構成要素と呼ばれる）の切片によって不明瞭であるためである。重合体受容体に結合する前に、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）は単量体ＩｇＡとほぼ同じ親和性でＦｃαＲＩに結合する。「熱凝集ＩｇＡ」という用語は、ＩｇＡを加熱することによって形成されるＩｇＡの複合体を指す。これらの凝集体は、免疫複合体、例えば、循環免疫複合体を模倣することができる。熱凝集ＩｇＡ複合体は、当業者に既知の任意の方法によって産生され得る。
「細胞死」という用語は、生体細胞がその機能を遂行しなくなる事象を指す。細胞死は、様々な原因、例えば、アポトーシス、プログラム細胞死、有糸分裂災害、虚血性細胞死及び／又は免疫原性細胞死から生じ得る。「細胞生存性」という用語は、代謝、成長、複製、何らかの形態の応答性、及び適応性などの特定の機能を実施する細胞の能力に関する。細胞死及び細胞生存性は、当業者に既知の多数の好適なアッセイ、例えば、ＭｕｌｔｉＴｏｘ－Ｇｌｏ又はＭｕｌｔｉＴｏｘ－Ｆｌｕｏｒ多重細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、又は生死細胞アッセイ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって評価され得る。色素排除法は、死細胞を決定するための手段として頻繁に使用される。トリパンブルーなどの色素は、生細胞の膜を容易に通過しないが、細胞膜の完全性を維持することができない死細胞には入る。細胞の生存性を決定するための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。
ＣＤ８９上のＩｇＡ結合部位を特異的に干渉する抗体は当該技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９ Ｊｕｎ ７；１８９（１１）：１７１５－２２及びＳｈｅｎ Ｌ．Ａ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ａｐｒ；５１（４）：３７３－８に記載されるＭＩＰ８ａ、２Ｄ１１又はＭＹ４３。ＭＩＰ８ａは、ヒトＣＤ８９に結合し、マウスＩｇＧ１定常領域を有するマウスモノクローナル抗体である。ＭＩＰ８ａは、Ｗｅｈｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４ Ｄｅｃ １；１９３（１１）：５６４９－５９に記載されているように、好中球の死を誘発することが示されている。
一態様では、本開示は、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができるヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体であって、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＸ１ＶＸ２ＴＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
を含む、重鎖可変領域であって、式中、
Ｘ１が、Ｌ又はＷであり
Ｘ２が、Ａ又はＳであり
Ｘ３が、Ｎ、Ｓであり
Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
当該重鎖可変領域が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、重鎖可変領域と、
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＩ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＺ１Ｚ２ＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ Ｚ３ＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＺ４ＣＱＱ ＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＬＥＩＫ
を含む、軽鎖可変領域であって、式中、
Ｚ１が、Ａ又はＴであり
Ｚ２が、Ｖ又はＰであり
Ｚ３が、Ｙ又はＦであり
Ｚ４が、Ｙ又はＦであり、
当該軽鎖可変領域が、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、軽鎖可変領域と、を含む、抗体を提供する。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＸ１ＶＸ２ＴＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
を含む、重鎖可変領域であって、式中、
Ｘ１が、Ｌ又はＷであり
Ｘ２が、Ａ又はＳであり
Ｘ３が、Ｎ、Ｓであり
Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
当該重鎖可変領域が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、重鎖可変領域と、
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＩ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＺ１Ｚ２ＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ Ｚ３ＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＺ４ＣＱＱ ＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＬＥＩＫ
を含む、軽鎖可変領域であって、式中、
Ｚ１が、Ａ又はＴであり
Ｚ２が、Ｖ又はＰであり
Ｚ３が、Ｙ又はＦであり
Ｚ４が、Ｙ又はＦであり、
当該軽鎖可変領域が、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、軽鎖可変領域と、を含む、抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｓ、及びＴ、又はＬ、Ａ、Ｓ、及びＱ、又はＬ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ｓ、Ｎ、及びＮであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４は、Ａ、Ｖ、Ｙ、及びＹである。
他の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ｓ、Ｎ、及びＮであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４は、Ａ、Ｐ、Ｆ、及びＹである。
更なる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ｓ、Ｎ、及びＮであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４は、Ａ、Ｐ、Ｙ、及びＹである。
更なる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ａ、Ｎ、及びＮ、又はＷ、Ｓ、Ｎ、及びＮであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４は、Ｔ、Ｖ、Ｙ、及びＦである。
好ましい実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｓ、及びＴであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、Ａ、Ｖ、Ｙ、及びＹである。別の好ましい実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、Ｌ、Ａ、Ｓ、及びＱであり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、Ａ、Ｖ、Ｙ、及びＹである。
好ましい実施形態では、本明細書に開示の抗ヒトＣＤ８９抗体は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＬＶＡＴ ＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳであって、
当該重鎖可変領域が、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、アミノ酸配列と、
０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
当該重鎖可変領域が、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個及び好ましくは０個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、アミノ酸配列と、
０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
好ましい実施形態では、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｔである。
別の好ましい実施形態では、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｑである。
本明細書で開示の重鎖は、１０個、好ましくは９個、好ましくは８個、好ましくは７個、好ましくは６個、好ましくは５個、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む。当該０～１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加のうちの３個以下が、重鎖可変領域に存在する。本明細書で開示の重鎖可変領域は、３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む。好ましい実施形態では、当該０～３個のアミノ酸挿入、欠失、置換は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に存在し、重鎖可変領域におけるアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加は、存在する場合、フレームワーク領域にある。重鎖可変領域におけるアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加は、存在する場合、好ましくは、重鎖可変領域の５位のロイシン（Ｌ）、１９位のアルギニン（Ｒ）、４０位のアラニン（Ａ）、４２位のグリシン（Ｇ）、４４位のグリシン（Ｇ）、７５位のセリン（Ｓ）、８４位のアスパラギン（Ｎ）、８７位のアルギニン（Ｒ）、８８位のアラニン（Ａ）、９３位のバリン（Ｖ）、及び１１４位のロイシン（Ｌ）から選択されるアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加ではない。
本明細書で開示の軽鎖は、８個、好ましくは７個、好ましくは６個、好ましくは５個、好ましくは４個、好ましくは３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む。当該０～８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加のうちの５個以下が、軽鎖定常領域に存在し、３個以下が軽鎖可変領域に存在する。本明細書で開示の軽鎖可変領域は、３個、好ましくは２個、好ましくは１個、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を含む。好ましい実施形態では、当該０～３個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４以外の位置に存在し、軽鎖可変領域におけるアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加は、存在する場合、フレームワーク領域にある。軽鎖可変領域におけるアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、存在する場合、好ましくは、軽鎖可変領域の８位のプロリン（Ｐ）、１５位のバリン（Ｖ）、１８位のアルギニン（Ｒ）、２２位のトレオニン（Ｔ）、４１位のグリシン（Ｇ）、４２位のリジン（Ｋ）、７０位のアスパラギン酸（Ｄ）、７２位のトレオニン（Ｔ）、７５位のイソロイシン（Ｉ）、７７位のセリン（Ｓ）、７９位のグルタミン（Ｑ）、８０位のグルタミン（Ｑ）、８３位のトレオニン（Ｔ）、及び１００位のグルタミン（Ｑ）から選択されるアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加ではない。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１４２のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１４２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＳＴＶＬ３である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１４３のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１４３のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＳＱＶＬ３である。
一つでは、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＶＬ３である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＶＬ４である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ１ＶＬ１である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ１ＶＬ２である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ１ＶＬ３である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ１ＶＬ４である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ２ＶＬ１である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ２ＶＬ２である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ２ＶＬ３である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ２ＶＬ４である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＶＬ１である。
一態様では、本開示は、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、又は３個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＣＤ８９に結合するヒト化抗体を提供し、抗体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖であって、重鎖の可変領域に３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加を有する配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖であって、軽鎖の可変領域に好ましくは３個以下、好ましくは２個以下、好ましくは１個以下、好ましくは０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加が存在する軽鎖と、を含む。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る当該ヒト化抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１３５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＶＬ２である。
一態様では、本明細書で開示のヒト化抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号９９のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むキメラ抗体と比較して、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に対する高い親和性を有する。
一態様では、本発明は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合し得、かつ、抗体が細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、抗体ＭＩＰ８ａと比較してヒトＣＤ８９発現細胞における細胞死の誘発がより少ない。好ましくは、本抗体は、抗体ＭＩＰ８ａと比較して細胞死の誘発が１０％少ない。より好ましくは、本抗体は、抗体ＭＩＰ８ａと比較して細胞死の誘発が２０％少ない。より好ましくは、本抗体は、抗体ＭＩＰ８ａと比較して細胞死の誘発が４０％少ない。本抗体の細胞死を誘発する特性は、好ましくは、番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託されたヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して決定される。
標的化されたエフェクター細胞は、抗ヒトＣＤ８９抗体の結合後に溶解され得る。本明細書で開示の抗体は、標的細胞の広範囲の細胞死又は溶解を引き起こすことなく、ヒトＣＤ８９を発現する標的細胞に有用である。かかる特徴は、標的細胞を生きたまま維持するのに有用である。生存細胞は、おそらく変化したシグナル伝達によって、ＣＤ８９抗体の結合に応答し得る。ＣＤ８９発現細胞を生存させると、本明細書で開示の抗体の遮断特性によるＣＤ８９へのＩｇＡ結合の欠如に応答し得る。本明細書で開示の抗体を有する細胞は、ＩｇＡに依存しない他の刺激、病原体、及び／又は免疫作用への応答に利用可能であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、当該抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない。好ましくは、当該細胞への抗体の結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞の細胞生存性を５０％超、又は４０％超、又は３０％超、又は２０％超、又は１０％超、又はそれ以下低減させない。抗体の細胞生存を保護する特性は、好ましくは、番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託されたヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して決定される。
細胞は、通常３７℃で培養される。細胞に対する刺激の効果は、直接又はインキュベーション期間後に見られる場合がある。いくつかの刺激は、効果が見える前に細胞シグナル伝達を必要とする。「３７℃での一晩のインキュベーション」という用語は、細胞が一晩刺激とともにインキュベーションされることを示す。一晩とは、例えば１２～１６時間又は８～２４時間を意味し得、その後、細胞の特徴、例えば、細胞生存性又はホスファチジルセリン発現が測定される。
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体を提供し、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、当該抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない。好ましくは、当該細胞への抗体の結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超、より好ましくは１０％超、より好ましくは５％超増加させない。ホスファチジルセリン発現に対する抗体の効果は、好ましくは、番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託されたヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して決定される。
ホスファチジルセリンは、リン脂質であり、細胞膜の構成要素である。細胞シグナル伝達において役割を果たし、細胞死及びアポトーシスと相関している。細胞膜におけるホスファチジルセリンの発現は、細胞死のマーカーとして使用され得る。細胞膜におけるホスファチジルセリンの発現は、当業者に既知の方法によって測定され得る。ホスファチジルセリンは、細胞膜の細胞質（内）側に向いて活発に保持される。しかしながら、細胞がアポトーシスを受けると、ホスファチジルセリンはもはや細胞質側に制限されなくなる。代わりに、両側の間で急速に交換されている。ホスファチジルセリン発現は、典型的には、細胞膜の外向き表面上のホスファチジルセリンを検出することによって決定される。ホスファチジルセリンのレベルは、対照細胞、例えば、未処理細胞と比較され得る。例示的な方法は、実施例のセクションに詳細に記載されている。
ホスファチジルセリンの発現は、抗ホスファチジルセリン抗体を用いて細胞をインキュベーションすることによって決定され得る。並行して、細胞は、陰性対照、例えば、抗ヒトＣＤ１９抗体とともにインキュベーションされてもよい。細胞を洗浄及び固定した後、膜ホスファチジルセリン発現を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、抗体が提供され、その抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、抗体がＮａＮ３の非存在下、３７℃で当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得、かつ、ＮａＮ３の存在下、４℃で９０％超当該細胞に結合されるとき、単量体ヒトＩｇＡ又は熱凝集ＩｇＡを置換し得ない。ＩｇＡ置換に対する抗体の効果は、好ましくは、番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託されたヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して決定される。
好ましい実施形態では、当該抗体は、ヒト化抗体である。
アジ化ナトリウムは、４℃の低温と組み合わせて、細胞の代謝活性を阻害するために使用される。アジ化ナトリウムは、ミトコンドリア呼吸の可逆的阻害剤である。細胞の代謝活性の阻害は、細胞のミトコンドリア呼吸の低下を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示の抗体は、代謝が阻害されている細胞上で、ヒトＩｇＡを９０％超置換し得ない。
一実施形態では、本開示は、組換えヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体を提供し、ヒトＣＤ８９のアミノ酸２２～４６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸２２～４６と交換されているが、抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に１０％以下で結合する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体２０Ｂ４である。このＣＤ８９分子内で置換されるアミノ酸Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６は、ＣＤ８９（配列番号２３）のＥＣ１ドメインの部分である。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、ＭＩＰ８ａと比較した場合、ヒトＣＤ８９発現細胞における細胞死の誘発がより少ない。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない。
ＩｇＡ系は、ヒト、マウス、及びウサギを含む様々な種間で異なる。例えば、ヒトＣＤ８９遺伝子の同定されたマウスホモログは存在しない。ＣＤ８９ホモログは、ラット及びウシで同定されている。本開示は、ヒトＣＤ８９を発現するヒト細胞及びキメラＣＤ８９分子を発現するヒト細胞上のＣＤ８９に結合する抗体の実施例を含む。ヒト／カニクイザルのキメラＣＤ８９分子は、ヒトＣＤ８９分子の部分及びカニクイザルＣＤ８９の部分を有する。部分は、一般的なタンパク質構造が無傷のまま維持されるように組み合わされる。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ８９遺伝子は、ヒトＣＤ８９と同様のイントロン／エクソン構造を有し、ヒト遺伝子と８６％の相同性を示す（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。カニクイザルＣＤ８９の対応するアミノ酸とのヒトＣＤ８９のアミノ酸の置換を使用して、抗体の特異性及び交差反応性を試験することができる。カニクイザルＣＤ８９での置換は、抗ヒトＣＤ８９抗体のエピトープの同定に寄与し得る。
一実施形態では、本開示は、キメラＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体を提供し、ヒトＣＤ８９のアミノ酸４７～７１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸４７～７１と交換されているが、抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に１０％以下で結合する。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に５％以下で結合する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６である。アミノ酸Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１は、ＣＤ８９（配列番号２４）のＥＣ１ドメインの部分である。ＩｇＡは、ＣＤ８９受容体のこの部分に結合し得る。したがって、ＣＤ８９受容体のこの部分に結合する抗体は、ＩｇＡとＣＤ８９との相互作用を潜在的に干渉する。
一実施形態では、本開示は、キメラＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体を提供し、ヒトＣＤ８９のアミノ酸７２～９６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸７２～９６と交換されているが、抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に１０％以下で結合する。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に５％以下で結合する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、及び１６Ｄ６である。アミノ酸Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６は、ＣＤ８９（配列番号２５）のＥＣ１ドメインの部分である。ＥＣ１ドメインのこの部分は、Ｆ－Ｇループを含むと考えられ、それは、細胞膜に近い位置にＥＣ１の底部に位置すると予測される。
一実施形態では、本開示は、キメラＣＤ８９分子への結合が２０％以下低減しない抗体を提供し、ヒトＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１と交換され、かつ、抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。好ましくは、当該組換えヒトＣＤ８９分子への抗体の結合は、１０％以下低減しない。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、３０Ｃ７、１０Ｅ７及び１６Ｄ６である。アミノ酸Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１は、ＣＤ８９（配列番号２６）のＥＣ１ドメインの部分である。例えば、ＭＩＰ８ａ抗体は、ＥＣ１ドメインのこの部分に結合し得る。
一実施形態では、本開示は、キメラＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体を提供し、ヒトＣＤ８９のアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７がカニクイザルＣＤ８９のそれぞれアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７と交換されているが、抗体は、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止し得る。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に１０％以下で結合する。好ましくは、本抗体は、当該組換えヒトＣＤ８９分子に５％以下で結合する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、及び１６Ｄ６である。アミノ酸Ｔｈｒ５８及びＧｌｎ５９は、ヒトＩｇＡ－ＣＤ８９結合に関連すると考えられている。
いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、ＭＩＰ８ａと比較した場合、ヒトＣＤ８９発現細胞における細胞死の誘発がより少ない。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない。
本明細書に記載の抗体は、ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る。膜結合ヒトＣＤ８９を発現する例示的なＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１でブダペスト条約に従って寄託されている。これらのＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、その細胞表面でヒトＣＤ８９を安定に発現している。好ましくは、これらの細胞を使用することにより、ヒトＣＤ８９を標的とする異なる抗体の効果を比較することができる。好ましくは、ＣＤ８９抗体の結合後に細胞死を受けた細胞のパーセンテージを研究することである。ヒトＣＤ８９を安定して発現する細胞株を使用することは、典型的には、細胞間の発現の差を低減し、一過性にトランスフェクションされた細胞と比較した場合、実験条件のより良い比較を可能にする。
本開示の一態様は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２９～３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３２～３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号２９～３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２～３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体８Ｆ３である。これらのＣＤＲを有する抗体は、ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおけるエピトープ、特に、配列番号２４及び配列番号２５の配列の一部分に結合し得る。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４５～４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４８～５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号４５～４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４８～５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１０Ｅ７である。これらのＣＤＲを有する抗体は、ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおけるエピトープ、特に、配列番号２５の配列の一部分に結合し得る。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６９～７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７２～７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号６９～７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２～７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体２０Ｂ４である。これらのＣＤＲを有する抗体は、ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおけるエピトープ、特に、配列番号２３及び配列番号２４の配列の一部分に結合し得る。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７７～７９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号８０～８２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号７７～７９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８０～８２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体３０Ｃ７である。これらのＣＤＲを有する抗体は、ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおけるエピトープ、特に、配列番号２４の配列の一部分に結合し得る。
一態様では、本開示は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５３～５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５６～５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号５３～５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５６～５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
更なる態様では、本開示は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。好ましくは、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合し得る抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体１６Ｄ６である。これらのＣＤＲを有する抗体は、ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおけるエピトープ、特に、配列番号２４及び配列番号２５の配列の一部分に結合し得る。
本明細書で配列によって言及される抗体の細胞への結合は、ＭＩＰ８ａと比較した場合、ヒトＣＤ８９発現細胞において、より少ない細胞死を誘発することができる。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない。いくつかの実施形態では、当該抗体の当該細胞への結合は、３７℃での一晩のインキュベーション後に、当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない。
０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３７～３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４０～４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体が提供される。
好ましい実施形態は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体９Ｈ７である。
一実施形態は、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６１～６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６４～６６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。
好ましい実施形態は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９に結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換又は付加は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域に位置する。これらの特徴を有する例示的な抗体は、抗体２６Ｄ６である。
本開示の抗ＣＤ８９抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、本明細書に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。かかる抗体は、良好な特徴を有する。もちろん、その中の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、かかる元の抗体のバリアントを生成することが可能である。かかるバリアントの多くは、当該元と比較した場合に、多かれ少なかれ同様に挙動するであろう。かかるバリアントもまた、本開示の範囲に含まれる。
バリアントは、元の抗体の配列に関してアミノ酸置換、挿入、欠失、又は付加を有し得る。アミノ酸置換は、別のアミノ酸とのアミノ酸の交換である。好ましくは、アミノ酸は、同様の化学的特性を有するアミノ酸によって予め配置されており、これは多くの場合、保存的置換と呼ばれる。アミノ酸欠失は、配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失をもたらす。アミノ酸挿入は、配列中に１つ以上の追加のアミノ酸をもたらす。アミノ酸付加は、アミノ酸配列の開始又は終了時に１つ以上のアミノ酸をもたらす。
かかる修飾の非限定的な例は、グルタメートの代わりにピログルタメートを含む抗体である。かかる修飾の他の非限定的な例は、当該元の抗体と比較した場合に１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、反転及び／又は置換である。好ましくは、アミノ酸置換、挿入、欠失、又は付加は、可変ドメインのＣＤＲの外側である。好ましくは、アミノ酸の置換、挿入、欠失、又は付加は、可変領域のフレームワーク領域内及び／又は抗体の定常領域においてである。バリアントのＣＤ８９結合は、本明細書に記載されるように試験され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体の定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体の定常領域である。定常領域は、定常領域に特異的な特性を付与するためのアミノ酸置換などの修飾を含み得る。例えば、半分子の交換に対して抗体をより安定にするためのＩｇＧ４ヒンジ領域の変異。他の修飾は、抗体の半減期に影響を及ぼし、グリコシル化部位を追加又は除去し、産生を改善し、大規模発酵槽で産生される抗体産物の均質性を改善するなどである。
本発明の抗体は、好ましくは、マウスＩｇＧ１、補体活性化若しくはＦｃ受容体相互作用を低減若しくは防止するために定常領域で変異されたヒトＩｇＧ１、又はヒトＩｇＧ４、若しくは他のＩｇＧ４分子との半分子の交換を防止するために変異されたヒトＩｇＧ４である。好ましい実施形態では、本明細書で開示の抗体は、ヒト化ＩｇＧ４、又は他のＩｇＧ４分子との半分子の交換を防止するために変異されたヒト化ＩｇＧ４、又は補体活性化若しくはＦｃ受容体相互作用を低減若しくは防止するために定常領域で変異されたヒト化ＩｇＧ１である。
本明細書で開示の抗体の定常領域におけるいくつかのバリエーションが許容される。典型的には、約０～１０個のアミノ酸置換が定常領域において許容される。多くの場合、１０個超のアミノ酸変化が許容される。本発明の抗体は、天然に生じる重鎖定常領域（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に関して、０～１５個、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、より好ましくは５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸置換を有する重鎖定常領域（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）を有し得る。かかる抗体は、天然に生じる軽鎖定常領域に対して、０～５個、好ましくは５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸置換を有する軽鎖定常領域を有し得る。
ＩｇＧ４におけるいくつかのバリエーションは、天然に生じ、及び／又は得られる抗体の免疫学的特性を変更することなく許容される。ＩｇＧ４定常領域又は変異ＩｇＧ１定常領域を有する抗体は、抗体の薬理学的特性の少なくともほとんどを有するが、補体には結合せず、したがって、その結合する細胞のインビボでの枯渇を誘発しないであろう。好ましくは、当該定常領域は、ヒト抗体の定常領域（キメラ）である。
好ましくは、当該定常領域は、補体活性化が欠損している領域であり、好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域又は変異ヒトＩｇＧ１定常領域である。好ましい実施形態では、本明細書で開示の当該ヒト化抗体は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１アイソタイプを有する。
本明細書で開示の抗体及びその抗原結合断片によるＣＤ８９結合は、当業者に既知の多数の好適なアッセイで確認され得る。かかるアッセイは、例えば、親和性アッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含む。実施例（例えば、実施例２（ａ））は、ＣＤ８９結合を測定するために使用され得る多くのアッセイのうちのいくつか、及びヒトＣＤ８９に対する抗体の相対的結合親和性を決定する方法を詳細に説明する。
「結合分子」という用語は、（１）抗体、（２）抗体の抗原結合断片、及び（３）抗体の誘導体を包含し、それぞれ本明細書で定義される。「ＣＤ８９に結合する」又は「ＣＤ８９を（に）結合し得る」又は「ＣＤ８９に結合すること」という用語は、本明細書で定義されるように、インビトロアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（表面プラズモン共鳴）又はＯｃｔｅｔ（登録商標）（生体層干渉法）におけるヒトＣＤ８９受容体への結合分子の結合を指す。結合分子は、約１×１０－６Ｍ以下、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する。当該結合は特異的であることが好ましく、ＣＤ８９又はそのエピトープが結合分子によって特異的に結合されることを意味する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度の評価基準である。特異的に結合すること、又は「特異的に認識すること」は、本明細書において、最大でも１×１０Ｅ－６Ｍ、好ましくは最大でも１×１０Ｅ－７Ｍ、１×１０Ｅ－８Ｍ、又は最も好ましくは最大でも１×１０Ｅ－９Ｍの親和性（ＫＤ）で結合するものとして定義される。
本明細書に以下に記載されるように、本明細書に記載されるヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体のＫＤは、好ましくは、１．４ｎＭ未満、１．３ｎＭ未満、１．２ｎＭ未満、１．１ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満などの１．５ｎＭ未満である。このＫＤは、約１．７ｎＭである親マウス抗体のＫＤと比較した場合、驚くほど小さい。
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指し、リガンド（抗体など）とタンパク質（ＣＤ８９など）との間の結合親和性を説明するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、リガンドはより緊密に結合するか、又はリガンドとタンパク質との間の親和性が高い。ＫＤは、表面プラズモン共鳴及び生体層干渉法に基づくアッセイによって測定され得る。「抗ＣＤ８９抗体」という用語は、本明細書で定義されるように、ＣＤ８９、好ましくはヒトＣＤ８９に結合し得る抗体を指す。
「Ｋｏｎ」及び「Ｋｏｆｆ」という用語は、それぞれ、その標的タンパク質（ＣＤ８９など）からの会合（オン速度）及び解離（オフ速度）に対するリガンド（抗体など）の速度定数を指す。「Ｋｏｎ」は、リガンド（抗体など）がその標的タンパク質（ＣＤ８９など）に結合する速度を特徴付け、「Ｋｏｆｆ」は、リガンド（抗体など）がその標的タンパク質（ＣＤ８９など）から解離する速度を特徴付ける。
本明細書で開示の抗体及びその抗原結合断片のＣＤ８９受容体とＩｇＡとの相互作用を遮断する能力は、当業者に既知の多数の好適なアッセイで確認され得る。かかるアッセイは、例えば、親和性アッセイＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを含む。提示される実施例（例えば、実施例２（ｂ））は、多くのアッセイのうちの２つ、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡを詳細に説明し、これらは、ＣＤ８９受容体へのＩｇＡの結合を遮断する抗ＣＤ８９抗体の能力を試験するために使用され得る。
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗体のＩｇＡ遮断特徴を試験するために、組換えＣＤ８９をプレート上にコーティングする。続いて、コーティングプレートは、非特異的結合を防止するために遮断緩衝液を使用して遮断される。組換えＣＤ８９を有するプレートを、目的の抗体及び／又はハイブリドーマ上清とともにインキュベーションする。続いて、ＩｇＡをＣＤ８９を有するウェルに添加する。洗浄した後、結合したＩｇＡの量をＥＬＩＳＡ技術を使用して測定する。結合ＩｇＡの量は、試験した抗体の遮断能力を示し、それによってＩｇＡの少ない結合は、抗体の強力な遮断能力を示す。また、ＣＤ８９発現細胞を使用して、ＦＡＣＳアッセイによる抗体のＩｇＡ遮断特徴を試験し得る。好ましくは、当該細胞は、ヒトＣＤ８９を安定に発現している。ＣＤ８９発現細胞を、目的の抗体又は目的のハイブリドーマ上清とともにインキュベーションする。続いて、細胞をＩｇＡとともにインキュベーションする。洗浄した後、細胞に結合したＩｇＡを、ＩｇＡに対する二次抗体、好ましくは蛍光二次抗体を使用して標識した。ヒトＣＤ８９発現細胞の膜上のＩｇＡの結合を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を使用して測定することができる。結合ＩｇＡの量は、試験した抗体の遮断能力を示し、それによってＩｇＡの少ない結合は、抗体の強力な遮断能力を示す。
本明細書で開示の精製抗ヒトＣＤ８９抗体が、先にヒトＣＤ８９に飽和したＩｇＡを置き換えることができるかどうかを分析するために、当業者は、いくつかの既知の好適なアッセイを使用することができる。好適な試験方法のうちの１つは、実施例のセクションに開示される。このアッセイでは、ＩｇＡをＣＤ８９発現細胞に結合させる。その後、抗ＣＤ８９抗体を細胞に添加する。細胞に依然として結合しているＩｇＡの量を、ＦＡＣＳ分析で測定し得る。アッセイについては、実施例２に詳細に記載されている。このアッセイ及び他のアッセイを使用して、抗ヒトＣＤ８９抗体によるヒトＩｇＡ置換を測定し得る。置換は、代謝活性細胞を使用して（例えば、３７℃で一晩インキュベーションした）、又は代謝不活性細胞を使用して（例えば、アジ化ナトリウムの存在下で４℃でインキュベーションした）、測定され得る。
更なる態様では、本開示は、本明細書で開示の抗体又は本明細書で開示の抗原結合断片をコードする核酸分子（複数可）を提供する。本明細書で開示の可変領域をコードする核酸分子もまた提供される。本開示において使用される核酸は、典型的には、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、排他的ではない。遺伝コードに基づいて、当業者は、本明細書で開示の抗体バリアントをコードする核酸配列を決定することができる。遺伝コードの縮退に基づいて、６４個のコドンを使用して、２０個のアミノ酸及び翻訳末端シグナルをコードし得る。当業者に既知であるように、異なる生物におけるコドン使用バイアスは、遺伝子発現レベルに影響を及ぼす可能性がある。所望の核酸が発現される生物に応じて、コドン使用を最適化するために、様々な計算ツールが当業者に利用可能である。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸配列分子を含むベクターを提供する。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、異種核酸配列を宿主細胞に導入することができるプラスミド、バクテリオファージ、又は動物ウイルスなどの核酸分子を指す。本発明によるベクターは、宿主細胞において異種核酸配列によってコードされる本発明の抗体の発現又は産生を可能にする。本発明によって使用されるベクターは、例えば、動物ウイルスに由来し、その例としては、ワクシニアウイルス（修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ、ＭＶＡなどの減衰誘導体を含む）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノウイルス又はレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によるベクターは、好ましくは、選択された宿主細胞における本発明による抗体の転写の開始に好適なプロモーターを含む発現カセットを含む。真核宿主細胞における本発明によるポリペプチドの発現に好適なプロモーターの例としては、βアクチンプロモーター、免疫グロビンプロモーター、５ＳＲＮＡプロモーター、又は哺乳動物宿主のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルス由来プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示の核酸分子（複数可）が細胞内で発現される場合、細胞は、本開示に従って抗体を産生し得る。したがって、一実施形態では、本開示による抗体、核酸分子（複数可）、及び／又はベクターを含む細胞が提供される。宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。当該細胞は、好ましくは動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。宿主細胞として好適な哺乳動物細胞株の例としては、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６（商標）細胞が挙げられる。本開示の目的のための好適な細胞は、当該抗体及び／又は当該核酸を含むことができ、好ましくは産生することができる任意の細胞である。本開示は、当該細胞を含む細胞培養物を更に包含する。
「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の抗ヒトＣＤ８９抗体を発現する発現ベクターが導入された細胞を指す。該用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫も包含する。環境影響又は変異のいずれかにより特定の修飾が連続した世代で生じ得るため、かかる子孫は親細胞と同一ではない場合があるが、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本明細書で開示の抗体は、当業者に既知の任意の方法によって産生され得る。好ましい実施形態において、抗体は、細胞を使用して産生され、好ましくは、細胞は、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６（商標）細胞である。特定の好ましい実施形態において、当該細胞はＣＨＯ細胞であり、好ましくは、当該細胞は無血清培地中で培養される。これは、当該抗体を当該培養物から採取することを含む。抗体は、好ましくは培地から精製され、好ましくは、当該抗体は、親和性精製される。代替的に、当該抗体は、合成的に生成され得る。
様々な機関及び企業が、例えば臨床使用のための抗体の大規模産生のための細胞株を開発してきた。これらの細胞はまた、タンパク質の産生などの他の目的にも使用される。タンパク質及び抗体の工業的規模の産生のために開発された細胞株は、本明細書では更に、工業的細胞株と称される。したがって、本開示の好ましい実施形態は、当該抗体の大規模な産生のために開発された細胞株の使用を提供する。
本発明による抗体は、治療的使用及び非治療的使用において有利に使用され得るいくつかの活性を示す。特に、本発明による抗体は、個体の治療に有用である。好ましくは、本発明の抗体は、免疫関連疾患の治療又は免疫関連疾患に対する予防に有用である。いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、好ましくは療法、好ましくはヒト療法において使用される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示の抗体は、研究目的のために使用され得る。例えば、インビトロ実験、細胞培養、有機型培養及びインビボモデルにおいて。
慢性炎症性疾患（ＣＩＤ）の治療又は予防のための方法も記載されている。ＣＩＤの例は、例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、セリアック病などの食物アレルギー、並びに線形ＩｇＡ水疱性疾患又は疱疹状皮膚炎などの皮膚疾患である。ＣＩＤにおいて観察される組織破壊に寄与する共通の特徴のうちの１つは、多形核細胞、より具体的には好中球及び／又は好酸球の局所蓄積である。多形核細胞は、その細胞質に顆粒が存在することによって特徴付けられる白血球である。
ＩｇＡのその受容体ＣＤ８９への結合は、最終的に多形核細胞の遊走、蓄積及び浸潤をもたらす免疫細胞の活性化を含む事象のカスケードを引き起こし得る。ＩｇＡ－免疫複合体によるＣＤ８９の架橋が好中球を強力に動員し活性化するため、異常なＩｇＡの存在は炎症促進性応答の悪化をもたらし、組織損傷をもたらす可能性がある。これは、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ－シェーライン（Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ）紫斑病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、アルコール性肝硬変、セリアック疾患、喘息、ＩＢＤ、関節リウマチ、線形ＩｇＡ水疱性疾患、及び疱疹状皮膚炎などの血清（自己）ＩｇＡレベルの増加によって特徴付けられる異なるＣＩＤにおいて役割を果たし得る（Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１５；２６８：１２３－１３８）。ＩｇＡとその受容体ＣＤ８９との間の結合を干渉することは、シグナル伝達カスケード及び多形核細胞の蓄積を阻害し得る。したがって、ＣＩＤは、有効量の本発明の抗体を、かかる治療を必要とする患者に投与することによって治療又は予防され得る。ＩｇＡと好中球などの多形核細胞上の受容体との間の相互作用を遮断することで、炎症反応を停止させ得る。したがって、ＣＩＤ患者は、本明細書で開示の抗体を使用する治療から利益を得ることができる。
本発明は、炎症性疾患に罹患している対象の治療のための方法であって、当該対象に、治療有効量の本明細書で開示の抗体を投与することを含む、方法を提供する。炎症性疾患に罹患している対象の治療のための薬剤の調製のための方法もまた提供される。本開示は、ＩｇＡとＣＤ８９との間の結合を遮断することによって、免疫細胞の活性化を予防する方法を記載する。
本開示は、本明細書で開示の抗体若しくはその抗原結合断片、若しくはそれらをコードする核酸を含む医薬組成物、又は本明細書で開示の抗体若しくはその抗原結合断片、若しくはそれらをコードする核酸を含む細胞を更に含む。本発明によるポリペプチド又はその薬学的に許容される塩、並びに少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／若しくは賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。かかる組成物は、薬剤としての使用に特に好適である。組成物は、液体、半固体及び固体剤形などの任意の好適な形態であり得る。選択される製剤の用量及びスケジュールは、当業者によって周知である標準的な手順によって決定され得る。かかる手順は、動物モデルを形成する投薬スケジュールを外挿及び推定すること、並びに、次いでヒト臨床用量範囲研究における最適投薬量を決定することを含む。医薬組成物における投薬量は、所望の放出及び薬理学的特徴などのいくつかの因子に応じて変化する。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒト又は動物である。対象には、ヒト、ブタ、フェレット、アザラシ、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、及びウマなどの哺乳動物、並びにニワトリ、アヒル、ガチョウ、及びシチメンチョウなどの鳥類が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、対象は、哺乳動物である。特に好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体が同じ抗原（すなわち、ヒトＣＤ８９）に結合する能力を保持する全長抗体の１つ以上の部分を指す。「抗原結合断片」という用語はまた、非共有会合若しくは共有会合によって形成されるより大きな分子の一部分である抗体の部分、又は１つ以上の追加の分子実体を有する抗体部分のものも包含する。追加の分子実体の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するために使用され得る、ストレプトアビジンコア領域などのアミノ酸、ペプチド、又はタンパク質を含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ １９９５；６（３）：９３－１０１）。例示的な抗原結合断片は、抗体のＶＨ及び／又はＶＬである。抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、及び他の抗原認識免疫グロブリン断片が含まれる。いくつかの例では、本明細書中で使用される「抗体」という用語は、その抗原結合断片も含むと理解され得る。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列のみのアミノ酸配列からなる抗体を指す。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、又はマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、マウスの炭水化物鎖を含有してもよい。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な方式で調製され得る。
「エピトープ」という用語は、抗体若しくはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるか、又はそうでなければ分子と相互作用することができる抗原の部分を指す。「エピトープ」は、当該技術分野では「抗原決定基」とも称される。エピトープは、概して、アミノ酸、炭水化物、又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなる。エピトープは、「線形」又は「非線形／立体配座」であり得る。所望のエピトープが決定されると（例えば、エピトープマッピングによって）、そのエピトープに対する抗体が生成され得る。抗体の生成及び特徴付けはまた、所望のエピトープについての情報を提供し得る。この情報から、次いで、例えば、交差競合研究を実施して、互いに競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合を競合する抗体を見出すことによって、同じエピトープに結合するものについて抗体をスクリーニングすることが可能である。
本明細書で使用される場合、「含む」及びその活用は、その非限定的な意味で使用され、単語に続く項目が含まれることを意味するが、具体的に言及されない項目は除外されない。加えて、「～からなる」という動詞は、「～から本質的になる」に置き換えられてもよい。これは、本明細書に定義される化合物又は補助化合物が、具体的に同定された構成要素以外の追加の構成要素を含み得ることを意味し、当該追加の構成要素は、本発明の固有の特徴を変更しない。
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
「およそ」又は「約」という単語は、数値と関連して使用される場合（およそ１０、約１０）、好ましくは、値が、値の１％より多い、又は少ない１０の所与の値であり得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、及び「治療すること」という用語は、本明細書に記載の疾患若しくは障害、又はそれらの１つ以上の症状の逆転、緩和、発症の遅延、又は進行の阻害を指す。いくつかの実施形態において、治療は、１つ以上の症状が発症した後に施され得る。他の実施形態では、治療は、症状の不在下で施され得る。例えば、治療は、症状の発症前に（例えば、症状の履歴に照らして、及び／又は遺伝子若しくは他の感受性因子に照らして）感染しやすい個体に施され得る。症状が解消した後も、例えば、それらの再発を予防又は遅延させるために、治療を継続することもできる。
明確さ及び簡潔な説明の目的のために、同一又は別個の実施形態の一部として特徴が本明細書に記載される。しかしながら、本発明の範囲は、記載された特徴の全て又はいくつかの組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解されるであろう。
本明細書において引用されている全ての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の実施例において更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を明確にするために役立つ。
実施例１．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の生成
（ａ）．免疫化のための表面ヒトＣＤ８９を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞の生成
ヒト全長ＣＤ８９タンパク質（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、配列番号１を参照されたい）をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（配列番号２を参照されたい）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。この全長ヒトＣＤ８９プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に一過性にトランスフェクションした。２日後、これらのＨＥＫ２９３Ｆ細胞を採取し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中
生細胞／ｍＬで等分し、－８０℃で保管して、細胞溶解物を得た。保管前に、１：２０希釈フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（クローンＭＩＰ８ａ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のヒトＣＤ８９表面発現をフローサイトメトリーで確認した。
（ａ）．免疫化のための表面ヒトＣＤ８９を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞の生成
ヒト全長ＣＤ８９タンパク質（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、配列番号１を参照されたい）をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（配列番号２を参照されたい）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。この全長ヒトＣＤ８９プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に一過性にトランスフェクションした。２日後、これらのＨＥＫ２９３Ｆ細胞を採取し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中
（ｂ）．スクリーニングのための表面ヒトＣＤ８９を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞の生成
ヒト全長ＣＤ８９タンパク質（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、配列番号１を参照されたい）をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（配列番号２を参照されたい）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。この全長ヒトＣＤ８９プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフェクションした。１２５μｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、安定してヒト全長ＣＤ８９がトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞クローン番号２を選択した。１：２０希釈ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（クローンＭＩＰ８ａ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のヒトＣＤ８９表面発現をフローサイトメトリーで確認した。
ヒト全長ＣＤ８９タンパク質（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、配列番号１を参照されたい）をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（配列番号２を参照されたい）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。この全長ヒトＣＤ８９プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフェクションした。１２５μｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、安定してヒト全長ＣＤ８９がトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞クローン番号２を選択した。１：２０希釈ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（クローンＭＩＰ８ａ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のヒトＣＤ８９表面発現をフローサイトメトリーで確認した。
（ｃ）．マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の免疫化及び生成
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６～８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、
の水中油型乳化Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＳＡＳ、Ｓｉｇｍａ）中の組換えＣ末端ポリヒスチジンタグ化ヒト細胞外ＣＤ８９ドメイン（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ ＳＥＱ ＮＰ＿００１９９１．１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ）及びヒトＣＤ８９を、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物（上記の実施例１（ａ）を参照されたい）を０日目に皮下注射し、各マウスに、２５μｇの２５０μＬのＳＡＳと混合した２５０μＬのＰＢＳ中の組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物（５ｘ１０６個の生存膜結合ＣＤ８９発現細胞から調製）を注射した。１４日目及び２８日目に、水中油型乳化ＳＡＳ中の組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９を一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物での皮下注射によって、これら４匹のマウスの抗体応答を強化し、各マウスに、２５０μＬのＳＡＳと混合した２５０μＬのＰＢＳ中の２５μｇの組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物（５×１０６個の生存膜結合ＣＤ８９発現細胞から調製された）を注射した。最後に、２匹のマウス（マウス番号３及び番号４）に、４２日目及び４３日目にアジュバントなしの組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物を腹腔内注射し、各マウスに、２００μＬのＰＢＳ中の２０μｇの組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物（４×１０６個の生存膜結合ＣＤ８９発現細胞から調製された）を注射した。加えて、２匹のマウス（マウス番号１及び番号２）に、７７日目及び７８日目にアジュバントなしの組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物を腹腔内注射し、各マウスに、２００μＬのＰＢＳ中の２０μｇの組換えヒトＣＤ８９及びヒトＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞溶解物（４×１０６個の生存膜結合ＣＤ８９発現細胞から調製された）を注射した。４６日目（融合Ｉの場合、マウス番号３及び番号４）又は８１日目（融合ＩＩの場合、マウス番号１及び番号２）に、これらの免疫化マウス由来の脾細胞を、以下に記載されるように標準的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６：４９５によって最初に記載された）を使用して、ＳＰ２／０－Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＤＳＭＺ）と融合させた。簡潔に述べると、免疫化されたマウスを屠殺した。脾臓から脾細胞を摘出し、ＧｌｕｔａＭａｘ培地（ＳＦ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む無血清ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉで洗浄した。対数増殖するＳＰ２／０－Ａｇ１４骨髄腫細胞をＳＦ培地で洗浄し、脾細胞に添加して、５：１の脾細胞対骨髄腫細胞の比を得た。次いで、細胞をペレット化し、上清を除去した。次いで、１ｍｌのポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）の３７％（ｖ／ｖ）溶液を６０秒間にわたって滴下し、その後、細胞を３７℃で更に６０秒間インキュベーションした。次いで、８ｍｌのＳＦ培地、続いて、５ｍｌのＧｌｕｔａＭａｘ／１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｂｏｄｉｎｃｏ）を含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉを穏やかに撹拌しながらゆっくりと添加した。室温（ＲＴ）で３０分後、細胞をペレット化し、ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉで洗浄して残留ポリエチレングリコールを除去し、最後にアミノプテリン選択培地、すなわち、５０×Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（商標）アミノプテリン（デノボＤＮＡ合成阻害剤、Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭａｘ／１０％ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ中、１ウェル当たり０．１×１０６細胞／２００μＬの濃度で播種した。７日目からアミノプテリン選択培地を２～３日ごとに補給し、１２～１４日目にＧｌｕｔａＭａｘ／１０％ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉに置き換えた。
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６～８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、
（ｄ）．マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の存在についてのスクリーニング
各融合後１２～１４日目から、増殖するハイブリドーマ由来の上清を、標的タンパク質として組換えＣ末端ポリヒスチジンタグ化ヒト（細胞外）ＣＤ８９（ｒｈｕＣＤ８９、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いるＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧクラスのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、「低親和性」ＩｇＭとは対照的な「高親和性」ＩｇＧ）の存在についてスクリーニングした。この目的のために、ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを５０μＬの未希釈ハイブリドーマ上清／ウェルで、室温で１時間インキュベーションした。並行して、５０μＬの培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％のＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）及び１０μｇ／ｍＬ（培地中で希釈）のマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。
各融合後１２～１４日目から、増殖するハイブリドーマ由来の上清を、標的タンパク質として組換えＣ末端ポリヒスチジンタグ化ヒト（細胞外）ＣＤ８９（ｒｈｕＣＤ８９、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いるＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧクラスのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、「低親和性」ＩｇＭとは対照的な「高親和性」ＩｇＧ）の存在についてスクリーニングした。この目的のために、ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを５０μＬの未希釈ハイブリドーマ上清／ウェルで、室温で１時間インキュベーションした。並行して、５０μＬの培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％のＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）及び１０μｇ／ｍＬ（培地中で希釈）のマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。
融合後１２～１４日目から、増殖するハイブリドーマ由来の上清もまた、標的タンパク質として膜結合ヒトＣＤ８９を用いるＦＡＣＳを使用して、ＩｇＧクラスのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、「低親和性」ＩｇＭとは対照的な「高親和性」ＩｇＧ）の産生について、スクリーニングし、確認した。この目的のために、安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％のＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を１００μＬの未希釈ハイブリドーマ上清／チューブとともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１００μＬの培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％のＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）、１０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬ、１０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）１００μＬを陽性対照として実行した。トランスフェクションされていない（すなわち、膜結合ヒトＣＤ８９発現について陰性）野生型（ＷＴ）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞も陰性対照細胞として実行して、抗体特異性を決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
二重ＣＤ８９陽性（すなわち、ＥＬＩＳＡでｒｈｕＣＤ８９＋（データは示さない）及びＦＡＣＳで膜ＣＤ８９＋ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図１））ハイブリドーマを増殖させ、凍結保存した。これらの二重ＣＤ８９陽性ハイブリドーマ由来の上清は、トランスフェクションされていない（すなわち、膜結合ヒトＣＤ８９発現について陰性）ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞との反応性を示さなかった。図１に示されるように、このアプローチにより、２１個のマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマを得た。続いて、これらのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマの上清を、その受容体ＣＤ８９上の血清ヒトＩｇＡの結合を遮断する能力について試験した（以下の実施例１（ｅ）を参照されたい）。
（ｅ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の存在についてのスクリーニング
血清ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合に対するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の効果を分析するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用することによって、血清ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げるマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を決定した。
血清ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合に対するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の効果を分析するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用することによって、血清ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げるマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を決定した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを２５μＬの未希釈ハイブリドーマ上清／ウェルで、室温で３０時間インキュベーションした。並行して、２５μＬの培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％のＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）及び２０μｇ／ｍＬ（培地中で希釈）のマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）２５μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２μｇ／ｍＬ（培養培地中で希釈）の精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２５μＬをこれらのウェルに添加し、室温で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合を、１μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片抗ヒトヤギ血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、室温で１時間測定した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、１：１０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合（光学密度）を測定した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照）を、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に１０×１０６細胞／ｍＬで置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、５０μＬの未希釈ハイブリドーマ上清／チューブとともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの培養培地（ＧｌｕｔａＭａｘ／１０％ＦＣＳを有するｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）、２０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び２０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬを陰性対照として実行し、２０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（培養培地中で希釈）の精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図２Ａに示すように、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマ（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）由来の２１個の調査された上清のうちの６個は、血清ヒトＩｇＡのｒｈｕＣＤ８９への結合の強力な／完全な遮断を示したが、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマ（すなわち、１６Ｄ６）由来の２１個の調査された上清のうちの１個は、血清ヒトＩｇＡのｒｈｕＣＤ８９への結合の中間／部分的な遮断を示した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、血清ヒトＩｇＡのｒｈｕＣＤ８９への結合の強力／完全な遮断を示した。
図２Ｂに示すように、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマ（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）由来の２１個の調査された上清のうちの６個は、血清ヒトＩｇＡの膜結合ヒトＣＤ８９への結合の強力な／完全な遮断を示したが、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマ（すなわち、１６Ｄ６）由来の２１個の調査された上清のうちの１個は、血清ヒトＩｇＡの膜結合ヒトＣＤ８９への結合の中間／部分的な遮断を示した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、血清ヒトＩｇＡの膜結合ヒトＣＤ８９への結合の強力／完全な遮断を示した。
プロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、上記のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体産生ハイブリドーマの上清からマウス抗体を精製した。ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、重鎖及び軽鎖をアイソタイプクラスについて分類し、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）がＩｇＧ１／κであることが見出された。加えて、ＬＡＬ発色エンドポイントアッセイ（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＬＰＳレベルを決定し、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、＜０．００５ＥＵ ＬＰＳ／μｇのマウスＩｇＧを含有した。続いて、実施例２及び３に記載されるように、これらの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体を、ヒトＣＤ８９に対する相対的結合親和性、ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの結合に対する遮断効果、及びヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス、及び血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走に対する遮断効果について詳細に試験した。加えて、実施例４に記載されるように、これらの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体の優れた特異性を、既知の商業用ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断及び非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体との交差競合によって、ヒトＣＤ８９／ウシＦｃγ２Ｒドメインマッピングによって、カニクイザルＣＤ８９に対する異種間結合によって、及びヒト／カニクイザルＣＤ８９エピトープマッピングによって調査した。
実施例２．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の結合特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを５０μＬの滴定された（遮断緩衝液中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／ウェルで、室温で１時間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（遮断緩衝液中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を陽性対照として実行した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図３Ａに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、ｒｈｕＣＤ８９に用量依存的に結合した。それらの結合プロファイルに基づいて、以下の相対的親和性ランキングが見出された（高い親和性から低い親和性まで）：９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ）＞１６Ｄ６。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、ｒｈｕＣＤ８９への用量依存的結合も示した。
図３Ｂに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９に用量依存的に結合した。それらの結合プロファイルに基づいて、以下の相対的親和性ランキングが見出された（高い親和性から低い親和性まで）：９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４（＝ＭＩＰ８ａ）＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６、これはＥＬＩＳＡに見出された相対的親和性ランキングと一致した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、膜ヒトＣＤ８９への用量依存的結合も示した。
（ｂ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断能力の程度
精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを２５μＬの滴定された（遮断緩衝液中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／ウェルで、室温で３０時間インキュベーションした。並行して、２５μＬの滴定された（遮断緩衝液中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２μｇ／ｍＬ（遮断緩衝液中で希釈）の精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２５μＬをこれらのウェルに添加し、室温で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合を、１μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片抗ヒトヤギ血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、室温で１時間測定した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、１：１０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合（光学密度）を測定した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図４Ａに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、ｒｈｕＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの結合を用量依存的に防止した。それらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度から弱いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ）＞１６Ｄ６。興味深いことに、これらの調査した精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ｒｈｕＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡ結合を立体的に遮断する程度（本実施例）と、ｒｈｕＣＤ８９に対するそれらのそれぞれの相対的結合親和性（上記実施例２（ａ）を参照されたい）との間には、強い正の関係があるようであった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、血清ヒトＩｇＡのｒｈｕＣＤ８９への結合の用量依存的遮断も示した。
図４Ｂに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの結合を用量依存的に防止した。それらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度から低いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４（＝ＭＩＰ８ａ）＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６、これはＥＬＩＳＡに見出されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度と一致した。興味深いことに、これらの調査した精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、膜ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡ結合を立体的に遮断する程度（本実施例）と、膜ヒトＣＤ８９に対するそれらのそれぞれの相対的結合親和性（上記実施例２（ａ）を参照されたい）との間には、強い正の関係があるようであった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の用量依存的遮断も示した。
精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、分泌ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力をＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照）を、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に１０×１０６細胞／ｍＬで置いた。次いで１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、０．１６μＭ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製されたヒト（初乳由来）ＩｇＡ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する分泌ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の４％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する分泌ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図４Ｃに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９への分泌ヒトＩｇＡの結合を用量依存的に防止した。それらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度から低いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４（＝ＭＩＰ８ａ）＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６、これはＦＡＣＳに見出された血清ヒトＩｇＡを使用したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度と一致した（４Ｂ）。興味深いことに、これらの調査した精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、膜ヒトＣＤ８９への分泌ヒトＩｇＡ結合を立体的に遮断する程度（本実施例）と、膜ヒトＣＤ８９に対するそれらのそれぞれの相対的結合親和性（上記実施例２（ａ）を参照されたい）との間には、強い正の関係があるようであった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、分泌ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の用量依存的遮断も示した。
ヒトＣＤ８９は、単量体ヒトＩｇＡに対する低／中程度の親和性
を有する受容体であることが記載されているが、ヒトＩｇＡ免疫複合体は、ヒトＣＤ８９に貪欲に結合する（Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１１；４：６１２－６２４）。ヒトＩｇＡ免疫複合体を模倣するために、ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を６３℃で３０分間加熱し、室温まで冷却し、続いて４℃、１２０００×ｇで２分間遠心分離して、任意の不溶性タンパク質沈殿を除去した。この熱凝集（血清由来）ヒトＩｇＡを、サイズ排除クロマトグラフィー分析を使用して非凝集（血清由来）ヒトＩｇＡと比較し、熱凝集ヒトＩｇＡが、
の単量体、
二量体、及び
の四量体以上の多量体ヒトＩｇＡからなるが、非凝集ヒトＩｇＡは、
の単量体、
の二量体、及び
の三量体ヒトＩｇＡからなることを実証した。次いで、この熱凝集血清ヒトＩｇＡ対非凝集血清ヒトＩｇＡと膜結合ヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した（以下を参照されたい）。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体５０μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。更に、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、追加の陰性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図５Ａに示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、非凝集血清ヒトＩｇＡで見出されるのと同様の程度に、熱凝集血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合を防止した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、非凝集血清ヒトＩｇＡで見出されるのと同様の程度に、熱凝集血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の遮断も示した。驚くべきことに、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、非凝集血清ヒトＩｇＡで見出されるのと同様の程度で、熱凝集血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の部分的
遮断を示した。
まとめると、これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、膜ヒトＣＤ８９への単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集及び熱凝集ＩｇＡ）及び二量体分泌ヒトＩｇＡの結合を防止したことが実証された。要約については、表１Ａ（すなわち、血清ヒトＩｇＡ遮断）を参照されたい。
（ｃ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体による血清ヒトＩｇＡの置換
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体が、ヒトＣＤ８９へ先に飽和した血清ヒトＩｇＡを置換することができたかどうかを分析するために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体が、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上の膜結合ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの置換に対する効果を、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体が、ヒトＣＤ８９へ先に飽和した血清ヒトＩｇＡを置換することができたかどうかを分析するために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体が、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上の膜結合ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの置換に対する効果を、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬとともに、４℃で３０分間インキュベーションした。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。並行して、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。更に、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、追加の陰性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図５Ｂに示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを様々な程度に置換した。それらの血清ヒトＩｇＡ置換の程度に基づいて、以下のランキングが見出された（強いヒトＩｇＡ置換の程度から弱いヒトＩｇＡ置換の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞２０Ｂ４＞３０Ｃ７＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＞１６Ｄ６。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えた。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えなかった。
図５Ｂに示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）はまた、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の熱凝集血清ヒトＩｇＡを、様々な程度に、及び非凝集血清ヒトＩｇＡで見出されるのとわずかに小さい程度に置き換えた。それらの血清ヒトＩｇＡ置換の程度に基づいて、以下のランキングが見出された（強いヒトＩｇＡ置換の程度から弱いヒトＩｇＡ置換の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞２０Ｂ４＞３０Ｃ７＞８Ｆ３＝１０Ｅ７。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、非凝集血清ヒトＩｇＡで見られるのとわずかに少ない程度ではあるが、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えた。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の熱凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えなかった。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、（１６Ｄ６）、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の単量体、二量体及び三量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集ＩｇＡ）の置換、並びに、少し低い程度で、四量体又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、熱凝集ＩｇＡ）の置換を示したことが実証された。要約については、表１Ａを参照されたい。
全ての上記の実験（上記の実施例２（ｂ）及び実施例２（ｃ）を参照されたい）は、（フローサイトメトリー）代謝不活性条件下（すなわち、寒冷な周囲温度（４℃）で、及び抗体が受容体に結合した後の抗体－抗原複合体のキャッピング、脱落、及び内在化を防止するミトコンドリア呼吸の可逆的阻害剤である、ＮａＮ３の存在によって）で実施されたため、以下のとおり、代謝（活性）条件下で、膜結合ヒトＣＤ８９との非凝集及び熱凝集ヒト血清ＩｇＡの相互作用を立体的に妨げる発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を調査した。
ヒトＩｇＡ遮断設定：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、１２５μｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、１．７０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で置いた。次いで、４００μＬ／チューブ（すなわち０．７×１０６細胞）のこれらの細胞を、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体５０μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ及び１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。更に、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び１００μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、追加の陰性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬを、これらの細胞に添加し、３７℃で更に２４時間、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
ヒトＩｇＡ置換設定：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、１２５μｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、１．７０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で置いた。次いで、４００μＬ／チューブ（すなわち０．７×１０６細胞）のこれらの細胞を、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬとともに、４℃で３０分間インキュベーションした。この後（すなわち、洗浄せずに）、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体５０μＬをこれらの細胞に添加し、３７℃で更に２４時間、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。並行して、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ及び１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。更に、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び１００μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、追加の陰性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図５Ｃに示すように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｂ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、代謝活性条件下で、膜ヒトＣＤ８９への非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡ結合を強力に阻害した。精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６は、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集血清ヒトＩｇＡの結合の部分的遮断を示したが、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６は、代謝活性条件下で膜ヒトＣＤ８９へ結合する熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を遮断することができなかった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、代謝活性条件下で、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合の強力な遮断も示した。驚くべきことに、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集血清ヒトＩｇＡの結合の部分的遮断を示したが、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、代謝活性条件下で膜ヒトＣＤ８９へ結合する熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を遮断することができなかった。
図５Ｄに示すように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｂ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、代謝活性条件下で、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡを強力に置き換えた。精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６は、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを部分的に置き換えることができたが、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６は、代謝活性条件下で、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の熱凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えることができなかった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、代謝活性条件下で、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡ結合を強力に置き換えた。驚くべきことに、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の非凝集血清ヒトＩｇＡを部分的に置き換えることができたが、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、代謝活性条件下で、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の熱凝集血清ヒトＩｇＡを置き換えることができなかった。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、代謝活性条件下での膜ヒトＣＤ８９に対する単量体、二量体及び三量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集ＩｇＡ）、並びに、四量体又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、熱凝集ＩｇＡ）の結合を阻害することが実証された。加えて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７はまた、代謝活性条件下で、先に飽和した膜ヒトＣＤ８９上の単量体、二量体及び三量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集ＩｇＡ）、並びに四量体又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、熱凝集ＩｇＡ）を置き換えた。要約については、表１Ｂを参照されたい。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ＣＤ８９発現ヒト好中性顆粒球においてヒト細胞死を誘発すると記載されている（Ｗｅｈｒｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４，１９３：５６４９－５６５９）。炎症性微小環境に応じて、カスパーゼ依存性（典型的にはアポトーシス中に観察される）又はカスパーゼ非依存性（非アポトーシス）細胞死は、二価マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａへの曝露によって、これらのヒト好中性顆粒球において誘発された。したがって、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７のヒトＣＤ８９媒介性細胞死に対する効果を、標的細胞として安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して調査した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、１２５μｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、１．２５×１０６細胞／ｍＬで、４℃で置いた。次いで、４００μＬ／チューブ（すなわち０．５×１０６細胞）のこれらの細胞を、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体５０μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ及び１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、それぞれ陰性及び陽性細胞死誘発対照として実行した。更に、１００μｇ／ｍＬ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び１００μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、追加の対照として実行した。続いて（すなわち、洗浄せずに）、５０μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培養培地をこれらの細胞に添加し、更に２４時間、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃でインキュベーションした。この２４時間のインキュベーション後、細胞を０．０２％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色して、生細胞と死細胞を区別した。この場合、生細胞のパーセンテージを、Ｂｕｒｋｅｒ血球計を使用してカウントした。加えて、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、アポトーシス又は細胞死のマーカーとして知られている細胞膜におけるリン脂質ホスファチジルセリンの発現を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートマウス抗ホスファチジルセリン抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、３０分間４℃で決定した。並行して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を陰性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、３０分間、４℃で固定した。膜ホスファチジルセリン発現（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図５Ｅに示すように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６は、ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において細胞死を引き起こし、それはマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体の両方での処理後、細胞生存性の減少（トリパンブルー排除アッセイによって測定される）及びホスファチジルセリン発現レベルの増加によって例証された。予想どおり、商業用ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、これらのヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞においても細胞死を誘発し、この細胞死誘発は、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６で見出されたものと同等であった。驚くべきことに、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、これらのヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において顕著な細胞死を誘発せず、商業用ＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３も誘発しなかった。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６は、膜ヒトＣＤ８９発現細胞において細胞死を誘発したが、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、膜ヒトＣＤ８９発現細胞において細胞死を誘発しなかったことが実証された。
（ｄ）．商業用プロトタイプマウス抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断能力の程度
ヒトＣＤ８９は、短い細胞質尾部、膜貫通領域、及び２つの細胞外（ＥＣ）Ｉｇ様ドメインからなる。短いドメイン間ヒンジ領域によって、これらの２つのＩｇ様ＥＣドメインは、互いに約９０°の角度で折り畳まれる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：２７９６６－２７９７０）。ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡの結合部位は、膜遠位Ｉｇ様ＥＣ１ドメインにあり、膜近位Ｉｇ様ＥＣ２ドメインにはない（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１６２：２１４６－２１５３、Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）。したがって、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができるが、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができないことが、概して、認められている（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ ２００１；４９：２１７－２２９、Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１１；４：６１２－６２４）。より具体的には、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識し（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びＡ３は、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）、及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープをそれぞれ認識する（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）。
ヒトＣＤ８９は、短い細胞質尾部、膜貫通領域、及び２つの細胞外（ＥＣ）Ｉｇ様ドメインからなる。短いドメイン間ヒンジ領域によって、これらの２つのＩｇ様ＥＣドメインは、互いに約９０°の角度で折り畳まれる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：２７９６６－２７９７０）。ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡの結合部位は、膜遠位Ｉｇ様ＥＣ１ドメインにあり、膜近位Ｉｇ様ＥＣ２ドメインにはない（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１６２：２１４６－２１５３、Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）。したがって、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができるが、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができないことが、概して、認められている（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ ２００１；４９：２１７－２２９、Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１１；４：６１２－６２４）。より具体的には、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識し（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びＡ３は、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）、及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープをそれぞれ認識する（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）。
驚くべきことに、精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断薬（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３（１０μｇ／ｍＬで調査した場合）は、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの両方の結合の部分的だが顕著な
遮断を示した（上の実施例２（ｂ）を参照されたい）。したがって、ＦＡＣＳ分析を使用することによって、血清ヒトＩｇＡと膜結合ヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げためにマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３をより詳細に調査した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び５０μＬの精製された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図６Ａ及び６Ｂに示されるように、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローン５９及びＡ３の両方は、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を部分的に用量依存的に阻害し（すなわち、最大
６０％の阻害）、一方でそれらの対応するマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照は、膜ヒトＣＤ８９へ結合する非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合に対するいかなる効果も欠いており、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローン５９及びＡ３のＣＤ８９／ＩｇＡ相互作用に対する阻害効果が特異的であったことを実証した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の用量依存的で完全な防止を示した。
これらの結果により、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内のエピトープを認識するプロトタイプ抗体（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）、及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープを認識するプロトタイプ抗体（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）である、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローン５９及びＡ３が、それぞれ、膜ヒトＣＤ８９への単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集及び熱凝集ＩｇＡ）の結合を特異的で部分的に阻害することができることが実証された。おそらく、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローン５９及びＡ３は、ＥＣ２ドメイン又はＥＣ１－ＥＣ２境界に結合した後、（ヒトＣＤ８９上のＩｇＡ結合部位（すなわち、ＥＣ１ドメイン）を認識する抗ヒトＣＤ８９抗体による立体障害とは対照的に）ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡの結合が「有利」又は最適でなくなるような様式で、膜ヒトＣＤ８９の折り畳みを変化させる可能性がある。
実施例３．エクスビボヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球を使用したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の生物学的特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。比較のために、安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）、及びヒトＣＤ８９発現単球性Ｕ９３７細胞株（ＲＴ Ｕｒｂａｎｕｓ博士、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ Ｕｔｒｅｃｈｔ，ＮＬからの寛大な贈り物）を並行して調査した。ＰＢＳで洗浄した後、顆粒球を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した０．１％のＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ／ＢＳＡ）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体１００μＬとともに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）のクローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）のクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬを陽性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（シアン、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。
図７Ａに示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１０μｇ／ｍＬで）は、複数のドナー（ｎ＝５）から単離されたエクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に結合した。好中性顆粒球に対するそれらの結合プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（高い結合強度から低い結合強度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞１０Ｅ７＝３０Ｃ７＝２０Ｂ４（＝Ａ５９＝Ａ３）＞８Ｆ３＝１６Ｄ６、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来の膜全長ヒトＣＤ８９に対するこれらの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１０μｇ／ｍＬで）で見出された結合ランキング（図７Ｂを参照されたい）、すなわち８Ｆ３＝９Ｈ７＝１０Ｅ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ＝Ａ５９＝Ａ３）＞１６Ｄ６とは予想外に顕著に異なっていた。加えて、単球Ｕ９３７細胞由来の膜ヒトＣＤ８９に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１０μｇ／ｍＬで）で見出された結合ランキング（図７Ｃを参照されたい）、すなわち９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞１０Ｅ７＝３０Ｃ７（＝Ａ５９＝Ａ３）＞８Ｆ３＝１６Ｄ６＝２０Ｂ４は、エクスビボ好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９への精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１０μｇ／ｍＬで）で見出される前述の結合ランキングと類似しているように思われる（２０Ｂ４を除く）。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来の膜ヒト全長ＣＤ８９、及び単球Ｕ９３７細胞由来の膜ヒトＣＤ８９上のエピトープを認識したことが実証された。しかしながら、これらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体で見出される結合ランキングは、エクスビボヒトＣＤ８９発現ヒト好中性顆粒球（高い結合強度から低い結合強度へ、９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞１０Ｅ７＝３０Ｃ７＝２０Ｂ４（＝Ａ５９＝Ａ３）＞８Ｆ３＝１６Ｄ６）対ヒト全長ＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（高い結合強度から低い結合強度へ、８Ｆ３＝９Ｈ７＝１０Ｅ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ＝Ａ５９＝Ａ３）＞１６Ｄ６）をこの比較研究における標的細胞とし使用した場合、顕著に異なり、これは、これらの細胞上で複数の膜ヒトＣＤ８９アイソフォームを認識（を欠如）する可能性があることを示唆した。実際、初代ヒト好中性顆粒球及び単球は、全長ＣＤ８９（ＦｃαＲＩａ．１とも呼ばれる）とは別に、ヒトＣＤ８９の２つの代替的なスプライシングバリアント転写産物を発現することが知られており（Ｐａｔｒｙ ａｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６；１５６：４４４２－４４４８、Ｐｌｅａｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９６；３１８：７７１－７７７、Ｔｏｇｏ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００３；５３５：２０－２０９）、（１）ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン（Ｇｌｙ１９５～Ｔｈｒ２１６、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．２）の一部（ＦｃαＲＩａ．２又はΔ６６ＥＣ２と呼ばれる）、又は（２）ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン全体（Ｇｌｙ１２１～Ｔｈｒ２１６、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．３）（ＦｃαＲＩａ．３又はΔＥＣ２と呼ばれる）を欠いている。１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、同様の程度に（低親和性抗体１６Ｄ６を除く、上記の実施例２（ａ）も参照されたい）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（全長ヒトＣＤ８９バージョンのみを発現する）に結合したが、初代ヒト好中性顆粒球（全長ヒトＣＤ８９、ΔＥＣ２、及び少ない程度ではΔ６６ＥＣ２バージョンを発現する）への１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７の結合（ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープをそれぞれ認識するヒトＩｇＡ非遮断剤クローンＡ５９及びＡ３のように（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２））は、１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｄ６（ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識するヒトＩｇＡ遮断剤ＭＩＰ８ａのように（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６））よりも顕著に低かったため、（１）マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン若しくはＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のいずれかのエピトープを認識するか（ＥＣ２ドメインの欠如により代替的スプライシングバリアントＦｃαＲＩａ．３に結合できないヒトＩｇＡ非遮断剤クローンＡ５９及びＡ３のように）、又は（完全長ヒトＣＤ８９／ＦｃαＲＩａ．１の「正常な」タンパク質折り畳みとは対照的に）これらの代替的スプライシングバリアントの「異常な」タンパク質折り畳みによりヒトＣＤ８９の代替的スプライシングバリアント（すなわち、ＦｃαＲＩａ．２及び／又はＦｃαＲＩａ．３）ではアクセスできないＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識すること、並びに（２）マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｄ６は、（ヒトＩｇＡ遮断剤ＭＩＰ８ａのように）ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識することを示唆している。興味深いことに、代替的スプライシングバリアントＦｃαＲＩａ．３（又はΔＥＣ２）は、血清由来ヒトＩｇＡへの結合を欠くが、このスプライシングバリアントには、ＥＣ１ドメイン全体（すなわち、ヒトＣＤ８９上のＩｇＡ結合部位）が存在し、これは、この代替的スプライシングバリアントＦｃαＲＩａ．３の「異常な」タンパク質折り畳み（全長ヒトＣＤ８９／ＦｃαＲＩａ．１の「正常な」タンパク質折り畳みとは対照的である）を示す。更に、全長ヒトＣＤ８９は、インサイドアウトシグナル伝達のために、２つの異なる立体配座、すなわち、ヒトＣＤ８９の不活性状態対活性状態を形成する可能性が高い（Ｂｒａｎｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１５，２６８：７４－８７）。その結果、不活性ヒトＣＤ８９は、ヒトＩｇＡに対する低親和性結合を示すが、活性ヒトＣＤ８９は、ヒトＩｇＡに対する高親和性結合を示す（Ｂｒａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００１；９７：３４７８－３４８３）。したがって、全長ヒトＣＤ８９の立体配座変化／状態（インサイドアウトシグナル伝達時）は、エクスビボヒト好中性顆粒球上の全長ヒトＣＤ８９に対する、発明者らが生成したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体の差次的結合をもたらす可能性がある。
一致して、完全長のヒトＣＤ８９、ΔＥＣ２及びΔ６６ＥＣ２バージョンを発現することも知られている単球Ｕ９３７細胞に対して、１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７の結合（ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープをそれぞれ認識する非遮断剤クローンＡ５９及びＡ３のように（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２））は、１０μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｄ６の結合（ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識する遮断剤ＭＩＰ８ａのように（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６））よりも顕著に低かった（Ｐａｔｒｙ ａｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６；１５６：４４４２－４４４８、Ｔｏｇｏ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００３；５３５：２０－２０９）。
これらの結果により、また、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、エこれらの抗体が全ての５人の調査されたドナーから単離されたヒト好中性顆粒球に明確に結合しているため、クスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９上の非多形エピトープを認識したことを実証した。
（ｂ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスの遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで顆粒球を再懸濁した。次いで、１００μＬ／ウェル（すなわち、９６ウェルの平底プレート中に０．２×１０６細胞、Ｇｒｅｉｎｅｒ）のこれらの細胞を、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体とともに４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陰性対照として実行し、滴定された（ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳ中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、１．２μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティング蛍光ラテックスビーズ（１μｍサイズ及びカルボキシレート修飾ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１：６０の細胞対ビーズ比でこれらの細胞に添加し（調製物ＩｇＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）、３７℃で更に３０分間インキュベーションした。並行して、１：６０の細胞対ビーズ比でＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティング蛍光ラテックスビーズを陰性対照として実行した（調製物ＢＳＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で再懸濁した後、フローサイトメーター（シアン、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、エクスビボヒト好中性顆粒球上の膜ヒトＣＤ８９によって、蛍光ラテックスビーズの血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス（Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３に従って食細胞指数を計算するために使用される幾何平均蛍光強度）を測定した。
図８に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球における血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを用量依存的に阻害した。それらの血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度に基づいて、以下のランキングが見出された（強いＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度から低いＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度へ）：８Ｆ３＝９Ｈ７＝１０Ｅ７＝２６Ｄ６＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ）＞２０Ｂ４＞１６Ｄ１６。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球における血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスの用量依存的阻害を示した。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球において、血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスの阻害を全く示さないか、ほとんど示さないか、又は弱く示した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球のヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを阻害したことが実証された。要約については、表２を参照されたい。
（ｃ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び血清ヒトＩｇＡ媒介性ロイコトリエンＢ４産生の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの（１）血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、（２）血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び（３）血清ヒトＩｇＡ媒介性好中球－化学誘引物質ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの（１）血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、（２）血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び（３）血清ヒトＩｇＡ媒介性好中球－化学誘引物質ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生を阻害する能力を決定した。
二次元（２－Ｄ）遊走アッセイ：初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて１００μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、９６ウェルの平底プレート中に０．２５×１０６細胞／ウェル、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を２０μｇ／ｍＬ（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体とともに４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、２０μｇ／ｍＬ（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陰性対照として実行し、２０μｇ／ｍＬ（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を対照として実行した。その後、１ウェル当たり１５０μＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加し、細胞を１０分間放置して再び単層とした。この後（すなわち、洗浄せずに）、１０μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティングセファロース４Ｂビーズ（９０μｍサイズ及びシアノゲンブロミド活性化、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、これらの細胞の単層（調製物３μｇ／ｍＬのＩｇＡビーズ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｒｏｌ ２００９；１３７：２０１８－２０２９を参照されたい）に穏やかに添加し、３７℃で更に４０分間インキュベーションした。並行して、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティングセファロース４Ｂビーズを陰性対照として実行した（調製物３μｇ／ｍＬのＢＳＡビーズ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｒｏｌ ２００９；１３７：２０１８－２０２９を参照されたい）。次いで、上清を収集し、走化性アッセイ及びＬＢＴ４ ＥＬＩＳＡに使用し（以下を参照）、セファロースビーズを洗浄して、非結合／非遊走カルセインＡＭ標識顆粒球を除去した。続いて、顆粒球を０．２％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液中で、室温で３０分間溶解し、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で放出されたカルセインＡＭ（ＩｇＡ結合／遊走顆粒球の数を反映する）を測定した。ＩｇＡ結合／遊走エクスビボヒト好中性顆粒球の数を、溶解カルセインＡＭ標識顆粒球の既知の数（すなわち、０～０．３×１０６細胞／ウェル）での標準曲線を使用して定量化した。
走化性アッセイ：初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。走化性を測定するために、ボイデンチャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）の下部区画のウェルに、ＩｇＡでコーティングセファロースビーズ刺激初代ヒト好中性顆粒球（すなわち、別の健常なドナー由来、上記を参照されたい）由来の２９μＬの上清を充填した。並行して、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地のみ及び精製された１又は１０ｎＭのＬＴＢ４（ＲＰＭＩ中、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれ陰性及び陽性対照として実行した。その後、下部区画を３μｍの孔径のポリビニルピロリドンコーティングポリカーボネートフィルター（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）で覆い、続いて上部区画をＢｏｙｄｅｎチャンバの下部区画に組み立てた。この後、５０μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、０．０５×１０６細胞／ウェル）を上部区画のウェルに添加した。３７℃で４０分間インキュベーションした後、上部区画から下部区画のウェルに向かうエクスビボヒト好中性顆粒球の走化性を決定した。この場合、下部区画の顆粒球を、０．１％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液中で、室温で３０分間溶解し、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で放出されたカルセインＡＭ（走化性顆粒球の数を反映する）を測定した。ＩｇＡコーティングセファロースビーズ誘発性走化性エクスビボヒト好中性顆粒球の数を、溶解カルセインＡＭ標識顆粒球の既知の数（すなわち、０～０．０５×１０６細胞／ウェル）での標準曲線を使用して定量化した。
ＬＴＢ４ ＥＬＩＳＡ：ＩｇＡでコーティングセファロースビーズ刺激エクスビボヒト好中性顆粒球由来の上清中のＬＴＢ４レベルを測定した（上記参照）。この目的のために、商業用ＬＴＢ４競合ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従って使用した。
図９Ａに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性遊走を阻害した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性遊走の阻害を示した。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性遊走の高度に変動した（すなわち、なし、弱い、又は中間）阻害を示した。
図９Ｂに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性走化性を阻害した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性走化性の阻害を示した。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性走化性の高度に変動した（すなわち、なし、中間、又は強い）阻害を示した。
図９Ｃに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性化学誘引性ＬＴＢ４産生を阻害した。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性化学誘引性ＬＴＢ４産生の阻害を示した。驚くべきことに、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３はまた、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性化学誘引性ＬＴＢ４産生の阻害を示した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、走化性、及び化学誘引性ＬＴＢ４放出を阻害したことが実証された。要約については、表３及び４を参照されたい。
（ｄ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する血清ヒトＩｇＡ結合及び血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、（１）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球と血清ヒトＩｇＡとの相互作用を立体的に妨げる能力、及び（２）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介ラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、（１）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球と血清ヒトＩｇＡとの相互作用を立体的に妨げる能力、及び（２）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介ラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて１００μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体とともに４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陰性対照として実行し、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、１００μＬのこれらの細胞（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）に添加した。このプレートは、１０μｇ／ｍＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を１００μＬ／ウェル、又は１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（陰性対照として使用される、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μＬ／ウェルのいずれかで、前もってコーティングされた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、上清（１８０μＬ／ウェル）を採取して、非結合顆粒球を除去し、これらの上清を（いくつかの遠心クリアランスステップ後に）使用して、ラクトフェリン産生レベルを測定した（脱顆粒マーカーとして使用、以下を参照されたい）。プレートを洗浄した後、顆粒球を０．２％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液中で、室温で３０分間溶解し、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で放出されたカルセインＡＭ（ＩｇＡ結合顆粒球の数を反映する）を測定した。ＩｇＡ結合エクスビボヒト好中性顆粒球の数を、溶解カルセインＡＭ標識顆粒球の既知の数（すなわち、０～０．３×１０６細胞／ウェル）での標準曲線を使用して定量化した。
プレート結合血清ヒトＩｇＡで刺激した初代ヒト好中性顆粒球の上清中のラクトフェリン産生（脱顆粒の程度を表す）を測定した（上記参照）。このため、９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、１００μＬ／ウェルのウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体（１：５０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１６～２４時間、４～８℃でコーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、室温で１時間遮断した。次いで、プレートを１００μＬ／ウェルの上清とともに、１；２の希釈（遮断緩衝液中）で、１時間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ヒトラクトフェリン検出抗体（１：２５００、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｐ－ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭＡｒｋ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、４０５ｎｍの波長で光学密度を測定した。精製されたヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準物質として使用して、血清ヒトＩｇＡ刺激エクスビボヒト好中性顆粒球によって放出されるラクトフェリンの量を計算した。
図１０Ａに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡへの結合を用量依存的に阻害した。それらの阻害の程度基づいて、以下のランキングが見出された（強い阻害度から低い阻害度へ）：９Ｈ７＝１０Ｅ７＝２６Ｄ６＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ）＞ ８Ｆ３＞２０Ｂ４。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡへの結合に対する用量依存的阻害を示した。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡへの結合に対して阻害を示さなかった。
図１０Ｂに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を用量依存的に阻害した。それらの阻害の程度基づいて、以下のランキングが見出された（強い阻害度から低い阻害度へ）：９Ｈ７＝１０Ｅ７＝２６Ｄ６＝３０Ｃ７（＝ＭＩＰ８ａ）＞８Ｆ３＞２０Ｂ４。興味深いことに、これらの調査した精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を阻害する程度は、ヒトＣＤ８９発現ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡへの結合に対するそれぞれの阻害の程度を反映した（図１０Ｂを図１０Ａと比較する）。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生の用量依存的阻害を示した。対照的に、両方とも周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）である、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、３人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生の阻害を示さなかった。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡへの結合、及びそれらの対応するＩｇＡ媒介ラクトフェリン産生（脱顆粒マーカー）を阻害したことが実証された。要約については、表５を参照されたい。
（ｅ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性好中性細胞外トラップ（ＮＥＴ）の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介ＮＥＴの放出を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介ＮＥＴの放出を阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、複数の健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に０．５×１０６細胞／ｍＬで顆粒球を再懸濁した。次いで、１．０×１０５細胞／２００μＬ／ウェル（９６ウェルＵ底プレート中（Ｇｒｅｉｎｅｒ））を２０μｇ／ｍＬの精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体とともに４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陰性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、３．０μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティング非蛍光ラテックスビーズ（０．９μｍサイズ及びカルボキシレート修飾ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１：３００の細胞対ビーズ比でこれらの細胞に添加し（調製物ＩｇＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）、３７℃で更に３０分間インキュベーションした。並行して、１：３００の細胞対ビーズ比でＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティング非蛍光ラテックスビーズを陰性対照として実行した（調製物ＢＳＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）。この後、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で細胞を２回洗浄し、続いてこれらの細胞を１．０×１０５細胞／２００μＬ／ウェルで９６ウェルの平底黒色プレート（ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）２００、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、３７℃で更に３時間インキュベーションした。示される場合、１００μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅＩを添加した。次いで、２．５μｇ／ｍＬのＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって細胞外ＤＮＡの放出を調査した。蛍光強度を、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。
図２３に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、８人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性ＮＥＴの放出を阻害した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球からのヒトＩｇＡ媒介性ＮＥＴ放出を阻害したことが実証された。
（ｆ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球における細胞死の誘発
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ＣＤ８９発現ヒト好中性顆粒球においてヒト細胞死を誘発すると記載されている（Ｗｅｈｒｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４，１９３：５６４９－５６５９）。炎症性微小環境に応じて、カスパーゼ依存性（典型的にはアポトーシス中に観察される）又はカスパーゼ非依存性（非アポトーシス）細胞死は、二価マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａへの曝露によって、これらのヒト好中性顆粒球において誘発された。したがって、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７のヒトＣＤ８９媒介性細胞死に対する効果を、標的細胞として非プライミング（非炎症性状態を模倣する）及びＬＰＳプライミング（炎症性状態を模倣する）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球を使用して調査した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ＣＤ８９発現ヒト好中性顆粒球においてヒト細胞死を誘発すると記載されている（Ｗｅｈｒｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４，１９３：５６４９－５６５９）。炎症性微小環境に応じて、カスパーゼ依存性（典型的にはアポトーシス中に観察される）又はカスパーゼ非依存性（非アポトーシス）細胞死は、二価マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａへの曝露によって、これらのヒト好中性顆粒球において誘発された。したがって、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７のヒトＣＤ８９媒介性細胞死に対する効果を、標的細胞として非プライミング（非炎症性状態を模倣する）及びＬＰＳプライミング（炎症性状態を模倣する）ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球を使用して調査した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、複数の健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで顆粒球を再懸濁した。次いで、これらの細胞を、プライミングしないか、又は５分間３７℃でＬＰＳプライミングした（１００ｎｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４由来のＵｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＰＳ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。洗浄後、これらの顆粒球を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて２５０μＬの顆粒球（すなわち、９６ウェルの平底プレート中に０．５×１０６細胞／ウェル、Ｆａｌｃｏｎ）を、１０μｇ／ｍＬの精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体と１０μｇ／ｍＬの架橋ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを組み合わせて、３７℃で５時間インキュベーションした。並行して、精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として実行した。０．１％ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ／ＢＳＡ）で十分に洗浄した後、顆粒球を、３μＭの赤色蛍光ＤＮＡ対比染色ヨウ化プロピジウムで、３０～６０分間４℃で染色した。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ中の２％ホルムアルデヒド中で３０分間４℃で固定した。エクスビボヒト好中性顆粒球における細胞死のパーセンテージ（プロピジウムヨウ化物染色に基づく）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して決定した。
図２４に示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体及び商業用ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、３人の健常な個体から単離した非プライミングヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球において細胞死を引き起こさなかった。対照的に、商業用ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、ＬＰＳプライミングされたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球において顕著な細胞死を誘発したが、発明者らの全ての精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウスＣＤ８９特異的抗体は、ＬＰＳプライミングされたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球において細胞死を引き起こさなかった。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、非炎症性（すなわち、非プライミング後）条件及び炎症性（すなわち、ＬＰＳプライミング後）条件下で、ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球における細胞死を誘発しなかったことが実証された。
（ｇ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７を使用して、実験的に誘発されたヒトＩｇＡ媒介性自己免疫性皮膚障害線形ＩｇＡ水疱性疾患の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の、実験的に誘発されたヒトＩｇＡ媒介性自己免疫性皮膚障害線形ＩｇＡ水疱性疾患（ＬＡＢＤ）を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の、実験的に誘発されたヒトＩｇＡ媒介性自己免疫性皮膚障害線形ＩｇＡ水疱性疾患（ＬＡＢＤ）を阻害する能力を決定した。
ＬＡＢＤは、ＩｇＡ自己抗体と関連する慢性皮膚疾患であり、これは、ＣＤ８９発現好中性顆粒球が優勢な、高密度の炎症性浸潤を伴う亜表皮水疱によって特徴付けられる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１８９：１５９４－１６０１）。ＬＡＢＤ患者において、線形ＩｇＡ沈着は、典型的には、真皮－表皮接合部に見られ、これらのＩｇＡ自己抗体は、主に、ヒトＣＤ８９の架橋を介して持続的な好中性顆粒球動員を誘発する膜貫通ヘミデスモソーム抗原ＢＰ１８０／コラーゲンＸＶＩＩに対して向けられる（Ｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１４；１４：６９－９５）。結果として、ＣＤ８９発現好中性顆粒球の一定の活性化（すなわち、活性酸素種及び炎症促進性サイトカイン産生による）及び浸潤（すなわち、局所化学誘引物質ＬＴＢ４放出による）は、ＬＡＢＤ患者において、重度の組織損傷及び症状の悪化を引き起こす。
インビボＬＡＢＤマウスモデル：マウスＣＤ８９ホモログを欠く二重トランスジェニックヒトＣＤ８９／ヒトＩｇＡ（Ｔｇ ｈｕＣＤ８９／ｈｕＩｇＡ）マウスにおいて、ヒトＣＤ８９の発現、調節、ヒトＩｇＡとの相互作用、及び機能は、ヒト状況を模倣する（Ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３：４３８７－４３９４）。これらのＴｇ ｈｕＣＤ８９／ｈｕＩｇＡ（均等に分布した雌及び雄）マウスは、循環マウス好中性顆粒球上に膜ヒトＣＤ８９を発現させており（Ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３；４３８７－４３９４）、そのマウスに、０、２、４、６、８、１０、及び１２日目に、７ｍｇ／ｍＬ（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｍ．ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ，Ｄｅｐｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＶＵｍｃ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ）の抗マウスコラーゲンＸＶＩＩヒトＩｇＡ（自己）抗体１０μＬを右耳に、又はＰＢＳ１０μＬを左耳に、皮下注射した。精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７処置を伴った、又は伴わない注射部位でのヒトＣＤ８９発現マウス好中性顆粒球の流入を、監視した。この目的のために、１．５ｍｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７ １００μＬを、７日目及び１１日目に腹腔内に注射した（処置レジメンについては、図３１Ａを参照されたい）。並行して、１．５ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１００μＬを陰性対照として実行した。１４日目に、マウスを屠殺し、耳を切除し、続いて、液体窒素中でスナップ凍結した。これらの耳組織標本を凍結切片化し（６μｍ）、アセトン中で１０分間室温で固定した。次いで、これらの空気乾燥した凍結切片を、１：４００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートラット抗マウスＬｙ－６Ｇ（ＧＲ－１染色、好中性顆粒球マーカー、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、５分間、室温で核を対比染色した。耳全体の画像を取得するためのタイルスキャンは、以下の設定でＶｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ顕微鏡を使用して実施された。ＤＡＰＩ ＭＳＩ ０．４３ｍｓ、ＦＩＴＣ ８１．７０ｍｓ、及び２０倍の倍率。凍結切片のＧＲ－１染色をＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して分析した。マウスの耳の総面積（μｍ２）及び特異的ＧＲ－１染色の面積（μｍ２）を測定した。定量は、ＧＲ－１面積（μｍ２）を総面積（μｍ２）で割ったものとして算出した。以下の式を使用して、ＧＲ－１／総面積比を決定した。
図３１Ｂに示されるように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７は、注射部位で抗マウスコラーゲンＸＶＩＩヒトＩｇＡ抗体誘発性ヒトＣＤ８９発現マウス好中性顆粒球流入を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７が、Ｔｇ ｈｕＣＤ８９／ｈｕＩｇＡマウスにおける実験的に誘発されたインビボヒトＩｇＡ媒介性ヒトＣＤ８９発現マウス好中性顆粒球流入を阻害したことが実証された。
実施例４．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体によって認識されるヒトＣＤ８９エピトープ及びＣＤ８９ドメインの特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対する、ＰＥコンジュゲート商業用マウス抗ＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤）、クローンＡ５９（ＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤）、及びクローンＡ３（ＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤）との非標識ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の交差競合
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体よって認識される位置を、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、及び既知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）とのクロス競合によって決定した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対する、ＰＥコンジュゲート商業用マウス抗ＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤）、クローンＡ５９（ＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤）、及びクローンＡ３（ＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤）との非標識ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の交差競合
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体よって認識される位置を、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、及び既知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤である精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）とのクロス競合によって決定した。
ヒトＣＤ８９は、短い細胞質尾部、膜貫通領域、及び２つの細胞外（ＥＣ）Ｉｇ様ドメインからなる。短いドメイン間ヒンジ領域によって、これらの２つのＩｇ様ＥＣドメインは、互いに約９０°の角度で折り畳まれる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：２７９６６－２７９７０）。ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡの結合部位は、膜遠位Ｉｇ様ＥＣ１ドメインにあり、膜近位Ｉｇ様ＥＣ２ドメインにはない（Ｗｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１６２：２１４６－２１５３、Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）。したがって、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができるが、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメインに結合するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体は、ヒトＣＤ８９上のヒトＩｇＡ結合を遮断することができないことが、概して、認められている（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ ２００１；４９：２１７－２２９、Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１１；４：６１２－６２４）。より具体的には、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識し（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）、プロトタイプＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びＡ３は、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）、及びヒトＣＤ８９のＥＣ１－ＥＣ２ドメインの境界内のエピトープをそれぞれ認識する（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）。生成された精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、膜ヒトＣＤ８９に対する周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断及び非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９、及びクローンＡ３）と競合する能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）のクローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）のクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬを陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、５μＬの未希釈ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びクローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対するＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９、及びクローンＡ３の結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１１Ａに示すように、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７、２６Ｄ６、及び３０Ｃ７でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａの後続結合を完全に（＞９０％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、及び２０Ｂ４でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａの後続結合を遮断しなかった（＜２５％）。参照目的のために、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａでのプレインキュベーションもまた、膜ヒトＣＤ８９に対するそのＰＥコンジュゲート抗体対応物の後続結合を完全に（＞９０％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製された周知のマウス非遮断ＣＤ８９／ＩｇＡ抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びＡ３でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａの後続結合を遮断しなかった（＜２５％）。
図１１Ｂに示すように、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９の後続結合を部分的に（
５５～６５％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、及び３０Ｃ７でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９の後続結合を遮断しなかった（＜２５％）。参考のために、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対するそのＰＥコンジュゲート抗体対応物の後続結合を完全に（＞９０％）遮断した。更に、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３でのプレインキュベーションも、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９の後続結合を完全に（＞９０％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体ＭＩＰ８ａでのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９の後続結合を部分的に遮断した（
５０％）。
図１１Ｃに示すように、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３の後続結合を部分的に（
５５～６５％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、及び３０Ｃ７でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３の後続結合を遮断しなかった（＜２５％）。参考のために、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３でのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対するそのＰＥコンジュゲート抗体対応物の後続結合を完全に（＞９０％）遮断した。更に、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９でのプレインキュベーションも、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３の後続結合を完全に（＞９０％）遮断したが、１０μｇ／ｍＬの非標識の精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体ＭＩＰ８ａでのプレインキュベーションは、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３の後続結合を部分的に遮断した（
５５％）。
上記の交差競合の程度を分析するために、（１０μｇ／ｍＬのみを使用するのとは対照的に）滴定された交差競合する非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体でのプレインキュベーションも実施し、続いて、安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を使用して、ＰＥコンジュゲートされたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９、及びクローンＡ３でのインキュベーションを実施した。
図１２Ａに示すように、全ての「ＭＩＰ８ａ」交差競合する非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、９Ｈ７、２６Ｄ６、及び３０Ｃ７）は、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａの結合を用量依存的に遮断した。それらの「ＭＩＰ８ａ」交差競合プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強力な「ＭＩＰ８ａ－ＰＥ」遮断の程度から低い「ＭＩＰ８ａ－ＰＥ」遮断の程度へ）：９Ｈ７＝２６Ｄ６（＝ＭＩＰ８ａ）＞３０Ｃ７。要約については、表６を参照されたい。
図１２Ｂに示すように、全ての「Ａ５９」交差競合する非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、９Ｈ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４）は、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９の結合を用量依存的に遮断した。それらの「Ａ５９」交差競合プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強力な「Ａ５９－ＰＥ」遮断の程度から低い「Ａ５９－ＰＥ」遮断の程度へ）：（Ａ５９＝Ａ３）＞９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４（＝ＭＩＰ８ａ）。要約については、表６を参照されたい。
図１２Ｃに示すように、全ての「Ａ３」交差競合する非標識の精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、９Ｈ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４）は、膜ヒトＣＤ８９に対する商業用ＰＥコンジュゲートＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３の結合を用量依存的に遮断した。それらの「Ａ３」交差競合プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強力な「Ａ３－ＰＥ」遮断の程度から低い「Ａ３－ＰＥ」遮断の程度へ）：（Ａ５９＝Ａ３）＞９Ｈ７＝２６Ｄ６＝２０Ｂ４（＝ＭＩＰ８ａ）。要約については、表６を参照されたい。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、それらの交差競合プロファイルが、これらの商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体で得られた交差競合プロファイルと顕著に異なるため、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９、又はクローンＡ３によって認識されるヒトＣＤ８９エピトープとは異なるヒトＣＤ８９エピトープに結合したことが実証された。更に、これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、及び１６Ｄ６（同一の交差競合プロファイルを持つ３つの抗体）対群としてのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６（同一の交差競合プロファイルを持つ両方の抗体）対ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４対ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７は、それらの交差競合プロファイルが顕著に異なっていたため、同一ではないＣＤ８９エピトープに結合したことが実証された。加えて、これらの結果により、群としてのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６（両方とも同一のクロスコンペイトプロファイルを有する抗体）対商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａは、それらの交差競合プロファイルが同一であるため、類似のＣＤ８９エピトープに結合するようであったことが実証された。これらの結果により、また、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、及び１６Ｄ６は、それらの交差競合プロファイルが同一であるため、類似のＣＤ８９エピトープに結合するようであったことが実証された。最後に、これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７及び２６Ｂ６は、それらの交差競合プロファイルが同一であるため、類似のＣＤ８９エピトープに結合するようであったことが実証された。
（ｂ）．膜全長ヒトＣＤ８９及び様々な膜キメラヒトＣＤ８９／ウシＦｃγ２Ｒ構築物へのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合（ヒトＣＤ８９のＥＣ１対ＥＣ２ドメインマッピング）
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体によって認識されるエピトープの位置をドメインマッピングによって決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上で発現された、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン又はＥＣ２ドメインに結合するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体によって認識されるエピトープの位置をドメインマッピングによって決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上で発現された、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン又はＥＣ２ドメインに結合するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
構造的に、ヒトＣＤ８９及びウシＦｃγ２Ｒは、非常に相同であり、互いに密接に関連している（Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１；９：４５７－４９２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５；１５５：１５３４－１５４１）。したがって、キメラヒト／ウシ受容体は、これらの２つの受容体タンパク質間でＩｇ様ＥＣ１及びＥＣ２ドメインを交換することによって設計された（図１３Ａも参照されたい）。機能的には、ヒトＣＤ８９及びウシＦｃγ２Ｒは、ヒトＣＤ８９がヒトＩｇＡに結合するがウシＩｇＧ２に結合しないのに対して、ウシＦｃγ２ＲはウシＩｇＧ２に結合し、ヒトＩｇＡに結合しないという点で完全に異なる。以下のヒトＣＤ８９構築物を生成し、一過性に発現させた。（１）ヒトＣＤ８９のＩｇ様ＥＣ１及びＩｇ様ＥＣ２ドメインの両方を含有した（配列番号１を参照されたい）膜全長ヒトＣＤ８９構築物、したがって「ヒトＥＣ１－ＥＣ２－ＣＤ８９」と表記され、（２）ウシＦｃγ２Ｒ構築物のＩｇ様ＥＣ２ドメインと組み合わせたヒトＣＤ８９の膜キメラＩｇ様ＥＣ１ドメイン（配列番号３及び配列番号４を参照されたい、すなわち、ウシ膜貫通細胞内領域、又はヒト膜貫通細胞内領域とそれぞれ組み合わせた）、したがって「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記され、及び（３）ヒトＣＤ８９のＩｇ様ＥＣ２ドメインと組み合わせたウシＦｃγ２Ｒの膜キメラＩｇ様ＥＣ１ドメイン構築物（配列番号７を参照されたい）、したがって「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」と表記される。更に、膜全長ウシＦｃγ２Ｒ構築物も生成し、これは、ウシＦｃγ２ＲのＩｇ様ＥＣ１及びＩｇ様ＥＣ２ドメインの両方を含有し（配列番号９を参照されたい）、したがって、「ウシＦｃγ２Ｒ」として表記される。上述の「ヒトＥＣ１－ＥＣ２－Ｄ８９」、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」、及び「ウシＦｃγ２Ｒ」構築物をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（それぞれ、配列番号２、５、６、８、及び１０を参照されたい）。これらのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、「ヒトＣＤ８９」、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」、及び「ウシＦｃγ２Ｒ」構築物を一過性にトランスフェクションした。４８時間及び／又は７２時間後、トランスフェクションされた細胞上の前述のキメラヒト／ウシ受容体へのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合をＦＡＣＳ分析によって分析した。この目的のために、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、クローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬを陽性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。抗体の結合をフローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
上記のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体のキメラヒト／ウシ受容体への結合以外に、これらのキメラヒト／ウシ受容体の（１）膜表面発現レベル及び（２）適切な折り畳みも、これらの一過性トランスフェクション細胞上で調査した。この場合、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、（１）２．５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、及び（２）１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来、上記実施例２（ｂ）を参照されたい）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、それぞれ５μｇ／ｍＬの１：２００の希釈ＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ重鎖／軽鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、３０分間４℃で測定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜キメラヒト／ウシ受容体に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、フローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１３Ｂに示すように、全てのキメラヒトＣＤ８９／ウシＦｃγ２Ｒ受容体（すなわち、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」の２つのバージョン）及び全長ヒトＣＤ８９は、ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体がこれらの細胞上に結合することによって証明されるように、一過性にトランスフェクションされた細胞の膜表面上に発現された。更に、これらの膜発現ヒトキメラＣＤ８９／ウシＦｃγ２Ｒ受容体（すなわち、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」の２つのバージョン）及び全長ヒトＣＤ８９は、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの両方の結合によって証明されるように、適切なタンパク質折り畳みを示すようであった。予想どおり、ＥＣ１ドメイン（すなわち、ヒトＣＤ８９上のＩｇＡ結合部位）を欠く、キメラヒトＣＤ８９／ウシＦｃγ２Ｒ受容体「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」は、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡに結合しなかった。予想どおり、ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡは、モックをトランスフェクションされた細胞にも、全長ウシＦｃγ２Ｒをトランスフェクションされた細胞にも結合しなかった。
図１３Ｃに示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞において、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」の両方のバージョンへの結合を示し、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」への結合は示さなかった。更に、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、全長ヒトＣＤ８９「ヒトＥＣ１－ＥＣ２－ＣＤ８９）をトランスフェクションされた細胞への結合を示したが、モックをトランスフェクションされた細胞又は全長ウシＦｃγ２Ｒをトランスフェクションされた細胞への結合は示さなかった。予想どおり、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープを認識する精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６）は、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」の両方のバージョンに結合し、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」に結合しないことを示したが、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内のエピトープを認識する精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）は、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」に結合し、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」に結合しないことを示した。驚くべきことに、ヒトＣＤ８９のＥＣ１及びＥＣ２ドメインの両方の部分に依存するエピトープを認識する、精製された周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１８９：１７１５－１７２２）は、「ヒトＥＣ２－ＣＤ８９」に結合し、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」には結合しなかった。最後に、これら全ての調査した商業用マウス抗ヒトＣＤ８９スペックフィック抗体は、全長ヒトＣＤ８９「ヒトＥＣ１－ＥＣ２－ＣＤ８９）をトランスフェクションされた細胞への結合を示したが、モックをトランスフェクションされた細胞又は全長ウシＦｃγ２Ｒをトランスフェクションされた細胞への結合は示さなかった。
これらの結果により、発明者らの全てのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、ヒト全長ＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内の線形及び／又は非線形／立体配座エピトープ（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ｇｌｙ１２１、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１）を認識するようであったことが実証された。
（ｃ）．膜カニクイザル全長ＣＤ８９へのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合
発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の多種交差反応性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上に発現された全長カニクイザルＣＤ８９に結合する能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の多種交差反応性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上に発現された全長カニクイザルＣＤ８９に結合する能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
カニクイザルＣＤ８９タンパク質（配列番号１１、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５９０３９８．１を参照されたい）をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって合成した（配列番号１２を参照されたい）。このｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカニクイザル全長ＣＤ８９を一過性にトランスフェクションした。４８時間及び／又は７２時間後、トランスフェクションされた細胞上の表面カニクイザルＣＤ８９へのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の交差反応をＦＡＣＳ分析によって分析した。この目的のために、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、クローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬを陽性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。抗体の結合をフローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
上記のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体のカニクイザル全長ＣＤ８９への結合以外に、カニクイザル全長ＣＤ８９の（１）膜表面発現レベル及び（２）適切な折り畳みも、これらの一過性トランスフェクション細胞上で調査した。このため、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、（１）２．５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、及び（２）１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来、上記実施例２（ｂ）を参照されたい）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜カニクイザルＣＤ８９に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、それぞれ５μｇ／ｍＬの１：２００の希釈ＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ重鎖／軽鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、３０分間４℃で測定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜カニクイザルＣＤ８９に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、フローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１４Ａに示すように、全長カニクイザルＣＤ８９は、これらの細胞に対する交差反応ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体の結合によって証明されるように、一過性にトランスフェクションされた細胞の膜表面上で発現された。更に、この膜発現全長カニクイザルＣＤ８９は、交差反応性非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの両方の結合によって証明されるように、適切なタンパク質折り畳みを示しているようであった。
図１４Ｂに示すように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６及び３０Ｃ７は、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞上のカニクイザル全長ＣＤ８９に対する中間／弱い交差反応性を示した。精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４は、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞上のカニクイザル全長ＣＤ８９を認識しなかった。商業用の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞上のカニクイザル全長ＣＤ８９に対して強力な交差反応性を示したが、商業用の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローンＭＩＰ８ａは、カニクイザル全長ＣＤ８９に対して少しの結合も示さなかった。
これらの結果により、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６及び３０Ｃ７が、おそらくカニクイザル全長ＣＤ８９のＥＣ１ドメインにおける、線形及び／又は非線形／立体配座エピトープを認識するようであったことが実証された。
全長カニクイザルＣＤ８９タンパク質の予測アミノ酸配列（Ｍｅｔ１～Ｌｙｓ２８７、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１）は、全長ヒトＣＤ８９タンパク質のアミノ酸配列（Ｍｅｔ１～Ｌｙｓ２８７、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１）と８６％の相同性を示し、カニクイザルＣＤ８９の細胞外領域の予測アミノ酸配列（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ａｓｎ２２７、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１）は、細胞外領域ヒトＣＤ８９タンパク質のアミノ酸配列（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ａｓｎ２２７、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１）と８３％の相同性を示す。より詳細には、カニクイザルＣＤ８９タンパク質のＥＣ１ドメイン（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ｇｌｙ１２１、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１）、短いヒンジ領域（すなわち、Ｌｅｕ１２２～Ｌｙｓ１２５）、ＥＣ２ドメイン（すなわち、Ｐｒｏ１２６～Ａｓｎ２２０）、及び膜近位「リンカー」領域（すなわち、Ａｒｇ２２１～Ａｓｎ２２７）の予測アミノ酸配列は、それぞれ、ヒトＣＤ８９タンパク質の対応するアミノ酸配列と７２％、１００％、９３％、及び８５％の相同性を示す。
発明者らの生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、ヒト全長ＣＤ８９のＥＣ１ドメイン（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ｇｌｙ１２１、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１）内の線形及び／又は非線形／立体配座エピトープを認識するようであることを考慮すると（上記実施例４（ｂ）を参照されたい）、発明者らのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の大部分（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４）が、トランスフェクション２９３Ｆ細胞上の全長カニクイザルＣＤ８９の低相同（すなわち、７２％のアミノ酸配列）のＥＣ１ドメイン（すなわち、Ｇｌｎ２２～Ｇｌｙ１２１、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１）と交差反応しない。
（ｄ）．様々な膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物へのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合（ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープマッピング）
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体によって認識されるエピトープをエピトープマッピングによって決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上で発現された、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープに結合するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の良好な特異性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体によって認識されるエピトープをエピトープマッピングによって決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上で発現された、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のエピトープに結合するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
構造的に、全長ヒトＣＤ８９及び全長カニクイザルＣＤ８９は、高度に相同であり（すなわち、アミノ酸配列、上記実施例４（ｃ）も参照されたい）、互いに密接に関連している（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４、１１３：１７８－１８６）。しかしながら、全てがヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメインを有するエピトープを認識した（上記実施例４（ｂ）を参照されたい）、発明者らの生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウスＣＤ８９抗体は、カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメインと異種間反応性がない（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４）か、弱い異種間反応性（すなわち、３０Ｃ７）か、又は中間の異種間反応性（すなわち、１６Ｄ６）のいずれかを示した（上記実施例４（ｃ）を参照されたい）。したがって、キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９受容体を、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の部分（すなわち、２５アミノ酸長のペプチド）を、カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメインからの相互の対応物と交換することによって設計し（図１５Ａも参照されたい）、発明者らの生成したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体によって認識される、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内の重要な領域を決定した。機能的には、ヒトＣＤ８９及びカニクイザルＣＤ８９は、ヒトＣＤ８９及びカニクイザルＣＤ８９の両方がヒト血清ＩｇＡに結合する点で類似している（上記実施例４（ｃ）を参照されたい）。以下のヒトＣＤ８９構築物を生成し、一過性に発現させた。（１）ヒトＣＤ８９の全長ＥＣ１ドメインを含有する膜全長ヒトＣＤ８９構築物（配列番号１を参照されたい）、したがって「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記され、（２）カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互Ｇｌｎ２２～Ａｒｇ４６と交換されたヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来のＧｌｎ２２～Ｌｙｓ４６からなる膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物（Ｉ）（配列番号１３を参照されたい）、したがって「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記され、（３）カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互Ｉｌｅ４７～Ａｒｇ７１と交換されたヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来のＩｌｅ４７～Ｉｌｅ７１からなる膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物（ＩＩ）（配列番号１５を参照されたい）、したがって、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記され、（４）カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互Ａｓｐ７２～Ｇｌｙ９６と交換されたヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来のＧｌｙ７２～Ｇｌｙ９６からなる膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物（ＩＩＩ）（配列番号１７を参照されたい）、したがって、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記され、及び（５）カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１と交換されたヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来のＡｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１からなる膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物（ＩＶ）（配列番号１９を参照されたい）、したがって、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」と表記される。また、膜全長カニクイザルＣＤ８９構築物は、ヒトカニクイザルＣＤ８９の全長ＥＣ１ドメインを含有し（配列番号１１参照）、したがって「カニクイザルＥＣ１－ＣＤ８９」と表記される。
長さが２５アミノ酸の連続したペプチド（すなわち、構築物Ｉ～ＩＶ、上記を参照）のＥＣ１ドメイン部分を交換することに加えて、ヒトＣＤ８９上でアミノ酸残基（ホットスポット）に接触するヒトＩｇＡ（Ｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２００３；４２３：６１４－６２０、Ｂａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１１；４：６１２－６２４、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１４；２３：３７８－３８６に従って）もまた、カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互アミノ酸と交換した（図１５Ａも参照されたい）。この目的のために、以下のキメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物を生成し、一過性に発現させた。カニクイザルＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来の相互Ｉｌｅ５８、Ｔｒｐ５９、Ｇｌｕ７３、Ｌｙｓ７４、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ１０６、及びＳｅｒ１０７と交換したヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン由来のＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６、Ｈｉｓ１０６、及びＴｙｒ１０７からなる膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物（配列番号２１を参照されたい）、したがって、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）と表記される。
上述の「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）、及び「カニクイザルＥＣ１－ＣＤ８９」構築物をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙにより合成した（それぞれ、配列番号２、１４、１６、１８、２０、２２、及び１２を参照されたい）。これらのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１由来の発現プラスミド中でサブクローニングした。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、「ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）、及び「カニクイザルＥＣ１－ＣＤ８９」構築物を一過性にトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションされた細胞上の前述のキメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の結合をＦＡＣＳ分析によって分析した。この目的のために、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを陰性対照として実行し、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）、クローンＡ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、クローンＡ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬを陽性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。抗体の結合をフローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
上記のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体のキメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物への結合以外に、これらのキメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物の（１）膜表面発現レベル及び（２）適切な折り畳みも、これらの一過性トランスフェクション細胞上で調査した。この場合、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで、４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、（１）２．５μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、及び（２）１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集ヒト（血清由来、上記実施例２（ｂ）を参照されたい）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、それぞれ５μｇ／ｍＬの１：２００の希釈ＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ重鎖／軽鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、３０分間４℃で測定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物に対する（１）ウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体、及び（２）非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合を、フローサイトメーター（モデルＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１５Ｂに示すように、全てのキメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９カンストラクト（すなわち、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット））並びに全長ヒトＣＤ８９及び全長カニクイザルＣＤ８９は、これらの細胞上のウサギ抗ヒトＣＤ８９ポリクローナル抗体の結合によって証明されるように、一過的にトランスフェクションされた細胞の膜表面上に発現された。更に、膜発現キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」並びに全長ヒトＣＤ８９及び全長カニクイザルＣＤ８９は、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡの両方に結合した。対照的に、膜発現キメラヒトＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）は、非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡへの結合を示さなかった。
これらの結果により、血清ヒトＩｇＡはヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１（すなわち、ＩＱＣＱＡＩＲＥＡＹＬＴＱＬＭＩＩＫＮＳＴＹＲＥＩ、配列番号２４を参照されたい）に結合し、及びこのＩｌｅ４７～Ｉｌｅ７１アミノ酸配列内のアミノ酸残基Ｔｈｒ５８及びＧｌｎ５９は、血清ヒトＩｇＡが「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への結合を示さなかったため、この血清ヒトＩｇＡ／ヒトＣＤ８９相互作用にとって重要なようであったことが実証された。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、かつ予想されるように（上記実施例４（ｃ）を参照されたい）、発明者らの全ての精製ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、全長ヒトＣＤ８９への強力な結合を示したが、全長カニクイザルＣＤ８９への結合を示さないか（すなわち、８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、２６Ｄ６、及び２０Ｂ４）、弱い結合（すなわち、３０Ｃ７）、又は中間の結合（すなわち、１６Ｄ６）を示した。予想されるように（上記実施例４（ｃ）を参照されたい）、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａもまた、全長ヒトＣＤ８９に強い結合を示したが、全長カニクイザルＣＤ８９には結合しなかった。予想されるように（上記実施例４（ｃ）を参照されたい）、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３は、全長ヒトＣＤ８９及び全長カニクイザルＣＤ８９の両方に強力な結合を示した。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、それぞれ、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への中間の結合を示すか又は結合を示さなかった。これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１及びＧｌｙ７２～Ｇｌｙ９６における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した（すなわち、それぞれ、ＩＱＣＱＡＩＲＥＡＹＬＴＱＬＭＩＩＫＮＳＴＹＲＥＩ及びＧＲＲＬＫＦＷＮＥＴＤＰＥＦＶＩＤＨＭＤＡＮＫＡＧ、配列番号２４及び２５を参照されたい）。これらのアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１及びＧｌｙ７２～Ｇｌｙ９６内のアミノ酸残基Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、及びＬｙｓ７６は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への結合を示さなかったため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への弱い結合を示し、これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体９Ｈ７が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１（すなわち、ＲＹＱＣＱＹＲＩＧＨＹＲＦＲＹＳＤＴＬＥＬＶＶＴＧ、配列番号２６を参照されたい）における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した。このアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１内のアミノ酸残基Ｈｉｓ１０６及びＴｙｒ１０７は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体９Ｈ７が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への弱い結合を示したため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体９Ｈ７のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への弱い結合を示し、これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６（すなわち、ＧＲＲＬＫＦＷＮＥＴＤＰＥＦＶＩＤＨＭＤＡＮＫＡＧ、配列番号２５を参照されたい）における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した。このアミノ酸配列Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６内のアミノ酸残基Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、及びＬｙｓ７６は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への結合を示さなかったため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、それぞれ、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への中間又は弱い結合を示した。これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１及びＧｌｙ７２～Ｇｌｙ９６における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した（すなわち、それぞれ、ＩＱＣＱＡＩＲＥＡＹＬＴＱＬＭＩＩＫＮＳＴＹＲＥＩ及びＧＲＲＬＫＦＷＮＥＴＤＰＥＦＶＩＤＨＭＤＡＮＫＡＧ、配列番号２４及び２５を参照されたい）。これらのアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１及びＧｌｙ７２～Ｇｌｙ９６内のアミノ酸残基Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、及びＬｙｓ７６は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への結合を示さなかったため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への弱い結合を示し、これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２６Ｄ６が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１（すなわち、ＲＹＱＣＱＹＲＩＧＨＹＲＦＲＹＳＤＴＬＥＬＶＶＴＧ、配列番号２６を参照されたい）における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した。このアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１内のアミノ酸残基Ｈｉｓ１０６及びＴｙｒ１０７は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２６Ｄ６が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への中間の結合を示したため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２６Ｄ６のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４は、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、それぞれ、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」及び「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への中間の結合を示すか又は結合を示さなかった。これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６及びＩｌｅ４７～Ｉｌｅ７１における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した（すなわち、それぞれ、ＱＥＧＤＦＰＭＰＦＩＳＡＫＳＳＰＶＩＰＬＤＧＳＶＫ及びＩＱＣＱＡＩＲＥＡＹＬＴＱＬＭＩＩＫＮＳＴＹＲＥＩ、配列番号２３及び２４を参照されたい）。このアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１内のアミノ酸残基Ｔｈｒ５８及びＧｌｎ５９は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への強い結合を示したため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、発明者らの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７は、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への結合を示さなかった。これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体３０Ｃ７が、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１（すなわち、それぞれ、ＩＱＣＱＡＩＲＥＡＹＬＴＱＬＭＩＩＫＮＳＴＹＲＥＩ、配列番号２５を参照されたい）における線形又は非線形／立体配座エピトープを認識したことを示した。このアミノ酸配列Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１内のアミノ酸残基Ｔｈｒ５８及びＧｌｎ５９は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体３０Ｃ７が、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への中間の結合を示したため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体３０Ｃ７のヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示すように、精製された周知のマウス抗ヒトＣＤ８９／ＩｇＡ遮断抗体クローンＭＩＰ８ａは、「ΔＧｌｎ２２－Ｌｙｓ４６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、「ΔＩｌｅ４７－Ｉｌｅ７１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」、及び「ΔＧｌｙ７２－Ｇｌｙ９６ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への強力な結合を示したが、「ΔＡｒｇ９７－Ｇｌｙ１２１ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」構築物への結合を示さなかった。これは、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａが、ヒトＣＤ８９のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１（すなわち、ＲＹＱＣＱＹＲＩＧＨＹＲＦＲＹＳＤＴＬＥＬＶＶＴＧ、配列番号２６を参照されたい）における直線的又は非直線的／立体構造的エピトープを認識したことを示した。このアミノ酸配列Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１内のアミノ酸残基Ｈｉｓ１０６及びＴｙｒ１０７は、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａが、「ΔＴｈｒ５８、Ｇｌｎ５９；ΔＡｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６；ΔＨｉｓ１０６、Ｔｙｒ１０７ヒトＥＣ１－ＣＤ８９」（ホットスポット）構築物への中間の結合を示したため、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａのヒトＣＤ８９への結合に重要であるようであった。要約については、表７を参照されたい。
図１５Ｃに示されるように、かつ予想されるように、ヒトＣＤ８９のＥＣ２ドメイン内のエピトープを認識する、精製された既知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９及びクローンＡ３（上記実施例４（ｂ）を参照されたい）は、ヒトＥＣ２ドメインがこれらの構築物のいずれにおいても変化しなかったため、全ての調査されたヒトキメラＣＤ８９／カニクイザルＣＤ８９構築物に強力な結合を示した。要約については、表７を参照されたい。
実施例５．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の分子遺伝学的特徴付け
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７を産生するハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、５×１０６細胞を含有するマイクロバイアルに等分し、－８０℃でペレットとして保管した。これらの細胞ペレットを使用して、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによってＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度を決定し（Ａ２６０ｎｍ）、ＲＮＡを－８０℃で保管した。逆転写酵素によって、ｃＤＮＡを、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して２μｇのＲＮＡから合成し、－８０℃で保管した。アイソタイプマウスＩｇＧ１／カッパに基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７の可変（Ｖ）領域を増幅するために、表８に示すプライマーを設計した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７を産生するハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、５×１０６細胞を含有するマイクロバイアルに等分し、－８０℃でペレットとして保管した。これらの細胞ペレットを使用して、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによってＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度を決定し（Ａ２６０ｎｍ）、ＲＮＡを－８０℃で保管した。逆転写酵素によって、ｃＤＮＡを、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して２μｇのＲＮＡから合成し、－８０℃で保管した。アイソタイプマウスＩｇＧ１／カッパに基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、９Ｈ７、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７の可変（Ｖ）領域を増幅するために、表８に示すプライマーを設計した。
プライマー３８５、３８６、３８７、３８９、及び３９１は、マウス抗体の軽鎖のシグナルペプチドとアニーリングするように設計されたセンスプライマーであり、プライマー３９４及び６０５は、マウスκ軽鎖の定常領域とアニーリングするアンチセンスプライマーである。プライマー６０９は、マウスＶＬ領域のマウスフレームワーク１（ＦＲ１）とアニーリングする退縮プライマーである。プライマー４０５、４０７、４０９、４１０、及び４１２は、マウス抗体の重鎖のシグナルペプチドとアニーリングするセンスプライマーであり、プライマー４１６は、重鎖マウスＩｇＧ１の定常領域とアニーリングするように設計されたアンチセンスプライマーである。表８に示すプライマーの組み合わせを使用して、様々なＰＣＲを実行した。生成されたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（商標）－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にサブクローニングした。続いて、クローニングされた挿入物を配列決定した。
重鎖及び軽鎖配列反応からそれぞれ合計４及び５のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号２７及び２８に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２９～３１及び３２～３４に記載されている。
重鎖及び軽鎖の両方の配列反応から、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の合計４個の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体９Ｈ７のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号３５及び３６に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体９Ｈ７のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３７～３９及び４０～４２に記載されている。
重鎖及び軽鎖の両方の配列反応から、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の合計４個の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号４３及び４４に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４５～４７及び４８～５０に記載されている。
重鎖及び軽鎖の両方の配列反応から、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の合計４個の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号５１及び５２に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１６Ｄ６のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５３～５５及び５６～５８に記載されている。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６から重鎖及び軽鎖の両方の配列反応の合計４個の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２６Ｄ６のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号５９及び６０に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２６Ｄ６のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６１～６３及び６４～６６に記載されている。
重鎖及び軽鎖配列反応からそれぞれ合計４及び６のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号６７及び６８に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６９～７１及び７２～７４に記載されている。
重鎖及び軽鎖の両方の配列反応から、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の合計４個の有益な配列を得た。この情報に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体３０Ｃ７のＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスアミノ酸配列を決定し、それぞれ、配列番号７５及び７６に記載されている。マウス抗ヒトＣＤ８９抗体３０Ｃ７のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７７～７９及び８０～８２に記載されている。
実施例６．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒトＩｇＧ４／カッパ（すなわち、マウス定常ＩｇＧ１／カッパドメインを定常ヒトＩｇＧ４／カッパドメインと交換する）抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の生成
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の決定されたマウスＶ領域（上記実施例５を参照されたい）に基づいて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体バージョンを生成するように設計が作成された。この目的のために、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓに最適化されたｃＤＮＡ配列、配列番号８３（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖８Ｆ３をコードする）、配列番号８４（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７をコードする）、配列番号８５（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１６Ｄ６をコードする）、配列番号８６（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖２０Ｂ４をコードする）、及び配列番号８７（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖３０Ｃ７をコードする）、並びに配列番号８８（キメラマウス／ヒト軽κ鎖８Ｆ３をコードする）、配列番号８９（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１０Ｅ７をコードする）、配列番号９０（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１６Ｄ６をコードする）、及び配列番号９１（キメラマウス／ヒト軽κ鎖２０Ｂ４をコードする）、及び配列番号９２（キメラマウス／ヒト軽κ鎖３０Ｃ７をコードする）をＧＥＮＥＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文し、これはヒトシグナルペプチド、それに続くヒト安定化ＩｇＧ４定常領域に連結されたマウスＶＨ鎖（すなわち、Ｓ２３９Ｐ、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０５－１０８，１９９３による）、又はそれに続くヒトカッパ定常領域に連結されたマウスＶＬ鎖のいずれかをコードした。好適な制限酵素を使用して、生成されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１由来発現プラスミド中にサブクローニングした。続いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、キメラ抗体を２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一過性に発現させた。発現されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体を、従来の親和性クロマトグラフィープロテインＡカラムを使用して、上清から精製した。その後、ＬＡＬ発色エンドポイントアッセイ（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＬＰＳレベルを決定し、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、＜０．００１ＥＵ ＬＰＳ／μｇのキメラＩｇＧを含有した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体の決定されたマウスＶ領域（上記実施例５を参照されたい）に基づいて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体バージョンを生成するように設計が作成された。この目的のために、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓに最適化されたｃＤＮＡ配列、配列番号８３（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖８Ｆ３をコードする）、配列番号８４（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７をコードする）、配列番号８５（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１６Ｄ６をコードする）、配列番号８６（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖２０Ｂ４をコードする）、及び配列番号８７（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖３０Ｃ７をコードする）、並びに配列番号８８（キメラマウス／ヒト軽κ鎖８Ｆ３をコードする）、配列番号８９（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１０Ｅ７をコードする）、配列番号９０（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１６Ｄ６をコードする）、及び配列番号９１（キメラマウス／ヒト軽κ鎖２０Ｂ４をコードする）、及び配列番号９２（キメラマウス／ヒト軽κ鎖３０Ｃ７をコードする）をＧＥＮＥＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文し、これはヒトシグナルペプチド、それに続くヒト安定化ＩｇＧ４定常領域に連結されたマウスＶＨ鎖（すなわち、Ｓ２３９Ｐ、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０５－１０８，１９９３による）、又はそれに続くヒトカッパ定常領域に連結されたマウスＶＬ鎖のいずれかをコードした。好適な制限酵素を使用して、生成されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１由来発現プラスミド中にサブクローニングした。続いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、キメラ抗体を２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一過性に発現させた。発現されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体を、従来の親和性クロマトグラフィープロテインＡカラムを使用して、上清から精製した。その後、ＬＡＬ発色エンドポイントアッセイ（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＬＰＳレベルを決定し、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）は、＜０．００１ＥＵ ＬＰＳ／μｇのキメラＩｇＧを含有した。
キメラアミノ酸配列については、配列番号９３（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖８Ｆ３）、配列番号９４（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７）、配列番号９５（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖１６Ｄ６）、配列番号９６（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖２０Ｂ４）、及び配列番号９７（キメラマウス／ヒト重ＩｇＧ４鎖３０Ｃ７）、並びに配列番号９８（キメラマウス／ヒト軽κ鎖８Ｆ３）、配列番号９９（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１０Ｅ７）、配列番号１００（キメラマウス／ヒト軽κ鎖１６Ｄ６）、配列番号１０１（キメラマウス／ヒト軽κ鎖２０Ｂ４）、及び配列番号１０２（キメラマウス／ヒト軽κ鎖３０Ｃ７）を参照されたい。
実施例７．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の結合特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／５０μＬ／ウェル）で、半区域９６ウェルＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを、５０μＬの（遮断緩衝液中の）精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体／ウェルとともに、及びそれを含まずに、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨ２ＳＯ４を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。比較のために、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体対応物を並行して実行し、それらの結合を実施例２（ａ）に記載のとおりに監視した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）１００μＬを、陰性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。比較のために、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体対応物を並行して実行し、それらの結合を実施例２（ａ）に記載のとおりに監視した。
図１６Ａに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、ｒｈｕＣＤ８９に用量依存的に結合した。それらの結合プロファイルに基づいて、以下の相対的親和性ランキングが見出された（高い親和性から低い親和性まで）：２０Ｂ４＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６。比較及び一致のために、それらのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体対応物は、同様の相対的親和性ランキング、すなわち、２０Ｂ４＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６を示した。より具体的には、キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、１０Ｅ７、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６は、それぞれ以下、９、３１、１６、２２、及び１０８ｎｇ／ｍＬの相対的親和性（すなわち、最大半量結合ＥＣ５０）をもたらし、一方、対応するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、１０Ｅ７、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６は、それぞれ１３、５２、２０、２９、及び１１９ｎｇ／ｍＬの相対的親和性をもたらし、これは、キメラ化プロセス中に、ｒｈｕＣＤ８９に対するキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、１０Ｅ７、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６の結合親和性が変化しないままであるようであることを示した。
図１６Ｂに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９に用量依存的に結合した。それらの結合プロファイルに基づいて、以下の相対的親和性ランキングが見出された（高い親和性から低い親和性まで）：２０Ｂ４＞３０Ｃ７＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＞１６Ｄ６。比較のために、それらのマウス抗ヒトＣＤ８９抗体対応物は、わずかに異なる相対的親和性ランキング、すなわち、２０Ｂ４＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞１６Ｄ６を示した。より具体的には、キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、１０Ｅ７、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６は、それぞれ以下、２９６、１３２１、１２５１、６１５、及び１７８９ｎｇ／ｍＬの相対的親和性（すなわち、最大半量結合ＥＣ５０）をもたらし、一方、対応するマウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、８Ｆ３、１０Ｅ７、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６は、それぞれ２６０、７１４、６３７、４８４、及び１６２２ｎｇ／ｍＬの相対的親和性をもたらし、これは、（１）膜結合型ＣＤ８９に対するキメラマウス／ヒトマウス抗ヒトＣＤ８９抗体２０Ｂ４、３０Ｃ７、及び１６Ｄ６の結合親和性は、キメラ化プロセス中に変化しないままのようであったこと、並びに（２）膜結合ＣＤ８９に対するキメラマウス／ヒトマウス抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３及び１０Ｅ７の結合親和性は、キメラ化プロセス中にわずかに減少するようであったことを示した。
（ｂ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断能力の程度
精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、血清ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、血清ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）、ＢｉｏＲａｄ）を、陽性対照として実行した。更に、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ５９（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬ、及び２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）の精製マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＡ３（周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４８：１７６４－１７７０）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μＬを、陰性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、２０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された非凝集又は熱凝集（上記実施例２（ｂ）を参照されたい）ヒト（血清由来）ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する非凝集又は熱凝集血清ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１７Ａ及び１７Ｂに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９への非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡ結合を用量依存的に防止した。それらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度から低いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度へ）：２０Ｂ４＞３０Ｃ７＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＞１６Ｄ６。興味深いことに、これらの調査したキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、膜ヒトＣＤ８９への血清ヒトＩｇＡ結合を立体的に遮断する程度（本実施例）と、膜ヒトＣＤ８９に対するそれらのそれぞれの相対的結合親和性（上記実施例７（ａ）を参照されたい）との間には、強い正の関係があるようであった。参照目的のために、マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、血清ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の用量依存的遮断も示した。加えて、マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体クローン５９及びＡ３は、膜ヒトＣＤ８９への非凝集及び熱凝集血清ヒトＩｇＡ結合を、用量依存的に部分的に阻害し（すなわち、最大
の阻害）、これらの２つの周知のＣＤ８９／ＩｇＡ非遮断剤を使用して、発明者らの先の結果を確認した（上記の実施例２（ｄ）を参照されたい）。
精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、分泌ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の能力を、ＦＡＣＳ分析を使用して決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照）を、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に１０×１０６細胞／ｍＬで置いた。次いで１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体／チューブとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ（ＢｉｏＲａｄ）を陽性対照として実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、０．２０μＭ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製されたヒト（初乳由来）ＩｇＡ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬをこれらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する分泌ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の４％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する分泌ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図１７Ｃに示すように、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、膜ヒトＣＤ８９への分泌ヒトＩｇＡの結合を用量依存的に防止した。それらのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（強いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度から低いＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度へ）：２０Ｂ４＞３０Ｃ７＞８Ｆ３＝１０Ｅ７＞１６Ｄ６、これはＦＡＣＳに見出された血清ヒトＩｇＡを使用したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度と一致した（図１７Ａ及び１７Ｂを参照されたい）。興味深いことに、これらの調査した精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体の、膜ヒトＣＤ８９への分泌ヒトＩｇＡ結合を立体的に遮断する程度（本実施例）と、膜ヒトＣＤ８９に対するそれらのそれぞれの相対的結合親和性（上記実施例７（ａ）を参照されたい）との間には、強い正の関係があるようであった。参照目的のために、精製されたマウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、既知のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断剤（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１２１：１０６－１１１）を並行して実行し、また、分泌ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合の用量依存的遮断も示した。
まとめると、これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７が、膜ヒトＣＤ８９への単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次の多量体血清ヒトＩｇＡ（すなわち、非凝集及び熱凝集ＩｇＡ）及び二量体分泌ヒトＩｇＡの結合を防止したことが実証された。
実施例８．エクスビボヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球を使用したＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体の生物学的特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、顆粒球を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した０．１％ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ／ＢＳＡ）中に１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）のキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）１００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）１００μＬを、陰性対照として実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、続いて、細胞を１：１００に希釈したフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ４特異的抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（シアン、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。
図１８に示すように、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体（１０μｇ／ｍＬで）は、複数のドナーから単離されたエクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に結合した（ｎ＝３）。好中性顆粒球に対するそれらの結合プロファイルに基づいて、以下のランキングが見出された（高い結合強度から低い結合強度へ）：８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＝２０Ｂ４＞１６Ｄ６。
これらの結果により、また、発明者らのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、これらの抗体が全ての３人の調査されたドナーから単離されたヒト好中性顆粒球に明確に結合しているため、エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９上の非多形エピトープを認識したことが実証された。
（ｂ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスの遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで顆粒球を再懸濁した。次いで、１００μＬ／ウェル（すなわち、９６ウェルの平底プレート中に０．２×１０６細胞、 Ｇｒｅｉｎｅｒ）のこれらの細胞を、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）とともに４℃で２０分間インキュベーションした。この後（すなわち、洗浄せずに）、１．２μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティング蛍光ラテックスビーズ（１μｍサイズ及びカルボキシレート修飾ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１：６０の細胞対ビーズ比でこれらの細胞に添加し（調製物ＩｇＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）、３７℃で更に３０分間インキュベーションした。並行して、１：６０の細胞対ビーズ比でＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティング蛍光ラテックスビーズを陰性対照として実行した（調製物ＢＳＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で再懸濁した後、フローサイトメーター（シアン、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、エクスビボヒト好中性顆粒球上の膜ヒトＣＤ８９によって、蛍光ラテックスビーズの血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス（Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３に従って食細胞指数を計算するために使用される幾何平均蛍光強度）を測定した。比較のために、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９及びクローンＡ３を、実施例３（ｂ）に記載されるように並行して実行した。
図１９に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球における血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを用量依存的に阻害した。それらの血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度に基づいて、以下のランキングが見出された（強いＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度から低いＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス阻害の程度へ）：８Ｆ３＝１０Ｅ７＝３０Ｃ７＞２０Ｂ４＞１６Ｄ１６。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球のヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを阻害したことが実証された。
（ｃ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び血清ヒトＩｇＡ媒介性ロイコトリエンＢ４産生の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの（１）血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、（２）血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び（３）血清ヒトＩｇＡ媒介性好中球－化学誘引物質ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの（１）血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、（２）血清ヒトＩｇＡ媒介性走化性、及び（３）血清ヒトＩｇＡ媒介性好中球－化学誘引物質ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生を阻害する能力を決定した。
二次元（２－Ｄ）遊走アッセイ：初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて、１００μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、９６ウェルの平底プレート中で０．２５×１０６細胞／ウェル、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を２０μｇ／ｍＬ（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）の精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）とともに４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、２０μｇ／ｍＬ（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）の精製されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を陰性対照として実行した。その後、１ウェル当たり１５０μＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加し、細胞を１０分間放置して再び単層とした。この後（すなわち、洗浄せずに）、１０μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティングセファロース４Ｂビーズ（９０μｍサイズ及びシアノゲンブロミド活性化、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、これらの細胞の単層（調製物３μｇ／ｍＬのＩｇＡビーズ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｒｏｌ ２００９；１３７：２０１８－２０２９を参照されたい）に穏やかに添加し、３７℃で更に４０分間インキュベーションした。並行して、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティングセファロース４Ｂビーズを陰性対照として実行した（調製物３μｇ／ｍＬのＢＳＡビーズ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｒｏｌ ２００９；１３７：２０１８－２０２９を参照されたい）。次いで、上清を収集し、走化性アッセイ及びＬＢＴ４ ＥＬＩＳＡに使用し（以下を参照）、セファロースビーズを洗浄して、非結合／非遊走カルセインＡＭ標識顆粒球を除去した。続いて、顆粒球を０．２％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液中で、室温で３０分間溶解し、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で放出されたカルセインＡＭ（ＩｇＡ結合／遊走顆粒球の数を反映する）を測定した。ＩｇＡ結合／遊走エクスビボヒト好中性顆粒球の数を、溶解カルセインＡＭ標識顆粒球の既知の数（すなわち、０～０．３×１０６細胞／ウェル）での標準曲線を使用して定量化した。比較のために、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９及びクローンＡ３を、実施例３（ｃ）に記載されるように並行して実行した。
走化性アッセイ：初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。走化性を測定するために、ボイデンチャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）の下部区画のウェルに、ＩｇＡでコーティングセファロースビーズ刺激初代ヒト好中性顆粒球（すなわち、別の健常なドナー由来、上記を参照されたい）由来の２９μＬの上清を充填した。並行して、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地のみ及び精製された１又は１０ｎＭのＬＴＢ４（ＲＰＭＩ中、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれ陰性及び陽性対照として実行した。その後、下部区画を３μｍの孔径のポリビニルピロリドンコーティングポリカーボネートフィルター（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）で覆い、続いて上部区画をＢｏｙｄｅｎチャンバの下部区画に組み立てた。この後、５０μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、０．０５×１０６細胞／ウェル）を上部区画のウェルに添加した。３７℃で４０分間インキュベーションした後、上部区画から下部区画のウェルに向かうエクスビボヒト好中性顆粒球の走化性を決定した。この場合、下部区画の顆粒球を、０．１％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）緩衝液中で、室温で３０分間溶解し、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ／ＰＯＬＡＲｓｔａｒ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で放出されたカルセインＡＭ（走化性顆粒球の数を反映する）を測定した。ＩｇＡコーティングセファロースビーズ誘発性走化性エクスビボヒト好中性顆粒球の数を、溶解カルセインＡＭ標識顆粒球の既知の数（すなわち、０～０．０５×１０６細胞／ウェル）での標準曲線を使用して定量化した。
ＬＴＢ４ ＥＬＩＳＡ：ＩｇＡでコーティングセファロースビーズ刺激エクスビボヒト好中性顆粒球由来の上清中のＬＴＢ４レベルを測定した（上記参照）。この目的のために、商業用ＬＴＢ４競合ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従って使用した。
図２０Ａに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性遊走を阻害した。
図２０Ｂに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、２人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性走化性を阻害した。
図２０Ｃに示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての２０μｇ／ｍＬの精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングセファロースビーズ媒介性化学誘引性ＬＴＢ４産生を阻害した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球の血清ヒトＩｇＡ媒介性遊走、走化性、及び化学誘引性ＬＴＢ４放出を阻害したことが実証された。
（ｄ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体を使用した、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生の遮断
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、これらの初代ヒト好中性顆粒球を１μＭの蛍光カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で３０分間標識した。洗浄後、これらのカルセインＡＭ標識顆粒球を、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて１００μＬのカルセインＡＭ標識顆粒球（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたキメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体（すなわち、８Ｆ３、１０Ｅ７、１６Ｄ６、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７）とともに４℃で２０分間インキュベーションした。この後（すなわち、洗浄せずに）、１００μＬのこれらの細胞（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）に添加した。このプレートは、１０μｇ／ｍＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を１００μＬ／ウェル、又は１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（陰性対照として使用される、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μＬ／ウェルのいずれかで、前もってコーティングされた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、上清（１８０μＬ／ウェル）を採取して、非結合顆粒球を除去し、これらの上清を（いくつかの遠心クリアランスステップ後に）使用して、ラクトフェリン産生レベルを測定した（脱顆粒マーカーとして使用、以下を参照されたい）。比較のために、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａ、クローンＡ５９及びクローンＡ３を、実施例３（ｄ）に記載されるように並行して実行した。
プレート結合血清ヒトＩｇＡで刺激した初代ヒト好中性顆粒球の上清中のラクトフェリン産生（脱顆粒の程度を表す）を測定した（上記参照）。このため、９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、１００μＬ／ウェルのウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体（１：５０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１６～２４時間、４～８℃でコーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、室温で１時間遮断した。次いで、プレートを１００μＬ／ウェルの上清とともに、１；２の希釈（遮断緩衝液中）で、１時間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ヒトラクトフェリン検出抗体（１：２５００、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｐ－ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭＡｒｋ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、４０５ｎｍの波長で光学密度を測定した。精製されたヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準物質として使用して、血清ヒトＩｇＡ刺激エクスビボヒト好中性顆粒球によって放出されるラクトフェリンの量を計算した。
図２１に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、発明者らの全ての精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体（１６Ｄ６を除く）は、２人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中球顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を用量依存的に阻害した
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３、１０Ｅ７、２０Ｂ４、及び３０Ｃ７は、ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生（脱顆粒マーカー）を阻害したことが実証された。
実施例９．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７の生成
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の決定されたマウスＶ領域（上記実施例５を参照されたい）に基づいて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンを生成した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の決定されたマウスＶ領域（上記実施例５を参照されたい）に基づいて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンを生成した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のインシリコヒト化可変重鎖配列（３）及びヒト化可変軽鎖配列（４）を、ＰＤＬ技術を使用して得た（Ｐａｎｏｒａｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡにより実施）。ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化可変重鎖及び可変軽鎖アミノ酸配列については、配列番号１１７（ＶＨ１）、１１８（ＶＨ２）、１１９（ＶＨ３）、１２０（ＶＬ１）、１２１（ＶＬ２）、１２２（ＶＬ３）、及び１２３（ＶＬ４）を参照されたい。
この設計の後、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ最適化ｃＤＮＡ配列、配列番号１２４、１２５、１２６（全長ヒト化重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３をコード）及び配列番号１２７、１２８、１２９、１３０（全長ヒト化軽κ鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４をコード）を、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文し、これは、ヒトシグナルペプチド、それに続くヒト安定化ＩｇＧ４定常領域に連結されたヒト化可変重鎖（すなわち、Ｓ２３９Ｐ、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０５－１０８，１９９３による）、又はそれに続くヒトカッパ定常領域に連結されたヒト化可変軽鎖のいずれかをコードした。好適な制限酵素を使用して、生成されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１由来発現プラスミド中にサブクローニングした。続いて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一過性に発現させた。これらの発現されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンを含有する上清を、従来のＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーを使用して、それぞれ、ｒｈｕＣＤ８９及び膜結合ヒトＣＤ８９に対する結合について調べた（実施例１０、以下を参照されたい）。
このようにして、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の１２個のヒト化バージョン、すなわち、ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３、ＶＨ１ＶＬ４、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ２、ＶＨ２ＶＬ３、ＶＨ２ＶＬ４、ＶＨ３ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ２、ＶＨ３ＶＬ３、及びＶＨ３ＶＬ４が生成された。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化アミノ酸配列については、配列番号１３１、１３２、１３３（全長ヒト化重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３をコード）、及び配列番号１３４、１３５、１３６、１３７（全長ヒト化軽κ鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４をコード）を参照されたい。
実施例１０．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７の結合特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンの相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンの相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンの相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンの相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（５０ｎｇ／１００μＬ／ウェル）で、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを１００μＬで滴定された（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地中（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及び滴定されずにインキュベーションした。上清中の抗体濃度（実施例９を参照）を、プロテインＡバイオセンサーチップと組み合わせた生体層干渉法Ｏｃｔｅｔ（登録商標）装置を使用することによって、内部ヒトＩｇＧ４κ標準物質に対して、室温で１時間、ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７／ウェルで予め決定した。キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的のために並行して実行した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨＣＬを添加した後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１００μＬの滴定された（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、上清中の抗体濃度（実施例９を参照されたい）は、プロテインＡバイオセンサーチップと組み合わせて生体層干渉法Ｏｃｔｅｔ（登録商標）装置を使用することにより、内部ヒトＩｇＧ４κ標準に対して事前に決定された）ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７／チューブとともに、及びそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照のために並行して実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の４％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図２５Ａに示すように、全てのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョン（すなわち、ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３、ＶＨ１ＶＬ４、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ２、ＶＨ２ＶＬ３、ＶＨ２ＶＬ４、ＶＨ３ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ２、ＶＨ３ＶＬ３、及びＶＨ３ＶＬ４）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７は、ｒｈｕＣＤ８９に用量依存的に結合した。ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（すなわち、参照）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＶＬ３及びＶＨ３ＶＬ４は、類似したＳ字形滴定曲線を示し、これは、ｒｈｕＣＤ８９に対するそれらの結合親和性が類似していることを示したが（最大半量結合
）、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３、ＶＨ１ＶＬ４、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ２、ＶＨ２ＶＬ３、ＶＨ２ＶＬ４、ＶＨ３ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ２は、顕著に低い結合親和性を示し、これは、より低い最大光学密度シグナル又は類似していない結合親和曲線によって例証された。
図２５Ｂに示すように、全てのＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョン（すなわち、ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３、ＶＨ１ＶＬ４、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ２、ＶＨ２ＶＬ３、ＶＨ２ＶＬ４、ＶＨ３ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ２、ＶＨ３ＶＬ３、及びＶＨ３ＶＬ４）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７は、膜ヒトＣＤ８９に用量依存的に結合した。ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（すなわち、参照）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＶＬ３及びＶＨ３ＶＬ４は、類似したＳ字形滴定曲線を示し、これは、膜ヒトＣＤ８９に対するそれらの結合親和性が類似していることを示したが（最大半量結合
）、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３、ＶＨ１ＶＬ４、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ２、ＶＨ２ＶＬ３、ＶＨ２ＶＬ４、ＶＨ３ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ２は、顕著に低い結合親和性を示し、これは、より低い最大蛍光シグナル又は類似していない結合親和曲線によって例証された。
この上清スクリーニング後、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７ ＶＨ３ＶＬ３を選択した。しかしながら、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７の可変重鎖におけるＣＤＲ２（配列番号４６を参照）は、脱アミド化が起こりやすい２つの脱アミド化「アスパラギン－グリシン」（「Ａｓｎ－Ｇｌｙ」）モチーフを含む（Ｓｙｄｏｗ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１４；９（６）：ｅ１００７３６）。脱アミド化は、アミノ酸アスパラギンの側鎖中のアミド官能基が別の官能基に変換される化学反応である。典型的には、アスパラギンは、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸に変換される。抗体では、この反応は、抗体構造、安定性又は機能（すなわち、抗体－抗原結合）を変化させる可能性があり、抗体分解をもたらせる可能性があるため、深刻な危険因子を形成し得る。したがって、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のインシリコ「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化可変重鎖配列を、Ｆｖ構造モデルを使用して取得した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって実施された）。この詳細な評価に基づいて、ＶＨ：Ａｓｎ５２及びＶＨ：Ａｓｎ５４は、（１）（ＶＨ３ＳＱ）それぞれ、ＶＨ：Ｓｅｒ５２及びＶＨ：Ｇｌｎ５４の組み合わせ、及び（２）（ＶＨ３ＳＴ）それぞれ、ＶＨ：Ｓｅｒ５２及びＶＨ：Ｔｈｒ５４の組み合わせで置換された。ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化可変重鎖アミノ酸配列については、配列番号１３８（ＶＨ３ＳＱ）及び１３９（ＶＨ３ＳＴ）を参照されたい。
この設計の後、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ最適化ｃＤＮＡ配列、配列番号１４０、１４１（完全長「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＨ３ＳＱ、ＶＨ３ＳＴをコード）及び配列番号１２９（完全長ヒト化軽κ鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、ＶＬ３をコード）を、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文し、これは、ヒトシグナルペプチド、それに続くヒト安定化ＩｇＧ４定常領域に連結された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化可変重鎖（すなわち、Ｓ２３９Ｐ、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０５－１０８，１９９３による）、又はそれに続くヒトカッパ定常領域に連結されたヒト化可変軽鎖のいずれかをコードした。好適な制限酵素を使用して、生成されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１由来発現プラスミド中にサブクローニングした。続いて、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一過性に発現させた。上清を採取した後、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３を、従来の親和性クロマトグラフィープロテインＡカラムを使用して精製し、続いて、従来のＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーを使用して、ｒｈｕＣＤ８９及び膜結合ヒトＣＤ８９に対する結合を調査した（以下の実施例１０（ｂ）を参照されたい）。加えて、ＬＡＬ発色エンドポイントアッセイ（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＬＰＳレベルを決定し、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、＜０．００２ＥＵ ＬＰＳ／μｇのヒト化ＩｇＧを含有した。
このようにして、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の２つの「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化バージョン、すなわち、ＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３を生成した。
ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化アミノ酸配列については、配列番号１４２、１４３（完全長「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化重ＩｇＧ４鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、それぞれ、ＶＨ３ＳＱ、ＶＨ３ＳＴをコード）、及び配列番号１３６（完全長ヒト化軽κ鎖１０Ｅ７バージョン、すなわち、ＶＬ３についてコード）を参照されたい。
（ｂ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の相対的結合親和性
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の相対的結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を使用した。
ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＣＤ８９（１０４１４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ）を、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（５０ｎｇ／１００μＬ／ウェル）で、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）を使用して、４～８℃で１６～２４時間の間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で、室温で１時間遮断した。続いて、プレートを、１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７／ウェルとともに、及びそれを含まずに１時間、室温でインキュベーションした。キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的のために並行して実行した。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合を、室温で１時間、１：５，０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、続いて比色検出のためのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のすぐに使用可能な溶液を用いて決定した。１ＭのＨＣＬを添加した後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、４５０ｎｍの波長（６５５ｎｍの参照波長）でｒｈｕＣＤ８９に対する抗体の結合（光学密度）を測定した。
ＦＡＣＳ：安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照されたい）を、５０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（可能なＦｃγ受容体を遮断する、Ｓｉｇｍａ）を補充した０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に、１０×１０６細胞／ｍＬで４℃で１０分間置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１００μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製された「ＣＤＲ２脱アミド化修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７／チューブとともに、及びそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。キメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的のために並行して実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、続いて細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の４％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図２６Ａに示すように、「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方、並びにキメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７が、ｒｈｕＣＤ８９へ用量依存的に結合した。ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（すなわち、参照）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、同様のＳ字形滴定曲線を示し、これは、プレートに結合したｒｈｕＣＤ８９に対するそれらの結合親和性が類似していることを示した（最大半量結合
）。
図２６Ｂに示すように、「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方、及びキメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７が、膜ヒトＣＤ８９へ用量依存的に結合した。驚くべきことに、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（すなわち、参照）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、異なるＳ字形滴定曲線を示し、これは、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３のヒト膜ＣＤ８９に対する結合親和性が、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体
（最大半量結合
）よりも高かったこと（最大半量結合ＥＣ５０ ６００ｎｇ／ｍＬ）を示した。要約すると、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、「ＣＤＲ２脱アミド修復」プロセス中に膜結合ヒトＣＤ８９に対する結合親和性を増加させるようであった。
（ｃ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断能力の程度
精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の、血清又は分泌ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる能力を、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した。
精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３のＣＤ８９／ＩｇＡ遮断の程度を分析するために、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の、血清又は分泌ヒトＩｇＡとヒトＣＤ８９との相互作用を立体的に妨げる能力を、ＦＡＣＳ分析を用いて決定した。
安定したヒト全長ＣＤ８９をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（クローン番号２、上記実施例１（ｂ）を参照）を、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．０５％ＮａＮ３を含有する氷冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３）中に１０×１０６細胞／ｍＬで置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３／チューブとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、５０μＬの滴定された（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中）精製されたキメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的で実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、０．２０μＭ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製されたヒト血清由来ＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は０．１６μＭ（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中で希釈）の精製された初乳由来ＩｇＡ（ＢｉｏＲａｄ）５０μＬを、これらの細胞に添加し、４℃で更に３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡ又は分泌ヒトＩｇＡの結合を、３０分間４℃で、５μｇ／ｍＬのビオチンコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト血清ＩｇＡα鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、決定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３で十分に洗浄した後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３中の４％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。膜ヒトＣＤ８９に対する血清ヒトＩｇＡ又は分泌ヒトＩｇＡの結合（幾何平均蛍光強度）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
図２７Ａ及び２７Ｂに示すように、「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方、並びにＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７は、用量依存的に、膜ヒトＣＤ８９への血清及び分泌ヒトＩｇＡの結合を防止した。驚くべきことに、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（すなわち、参照）、及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、異なる阻害滴定曲線を示し、これは、「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方によるＣＤ８９／ＩｇＡ阻害（血清ヒトＩｇＡ及び分泌ヒトＩｇＡについて、それぞれ最大半量阻害
）が、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７（血清ヒトＩｇＡ及び分泌ヒトＩｇＡについて、それぞれ最大半量阻害
）よりも強かったことを示した。要約すると、「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、「ＣＤＲ２脱アミド修復」プロセス中にＣＤ８９／ＩｇＡ遮断能の程度を増加させるようであり、これは、膜結合ヒトＣＤ８９に対する結合親和性の増加と一致した（上記実施例１０（ｂ）を参照されたい）。
まとめると、これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、単量体血清ヒトＩｇＡ及び二量体分泌ヒトＩｇＡの膜ヒトＣＤ８９への結合を防止したことが実証された。
（ｄ）．ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の平衡解離定数（ＫＤ）
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の平衡解離定数（ＫＤ）を決定するために、ＢＬＩ／Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ベースの分析を使用した。
ヒトＣＤ８９に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の平衡解離定数（ＫＤ）を決定するために、ＢＬＩ／Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ベースの分析を使用した。
ビオチン化した（ＰｉｅｒｃｅのＮ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンを使用して）精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３を、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）中に２．５μｇ／ｍＬで、３０℃で５分間、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に充填した。続いて、０ｎＭ（ベースラインのドリフトを監視するための参照試料）及び０．３１～２０ｎＭ（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０中、２倍希釈ステップ）の単量体組換えＣ末端ポリヒスチジンタグ化ヒト（細胞外）ＣＤ８９分析物（ｒｈｕＣＤ８９（１０４１４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ）の会合を、３０℃で５分間測定し、続いて、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、３０℃で２０分間の解離相を測定した。ビオチン化した（ＰｉｅｒｃｅからのＮ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンを使用して）精製されたマウス及びキメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の対応物（それぞれ、実施例２及び実施例６を参照されたい）を比較目的で試験した。平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）における１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して決定された。
「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方、キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７、並びにマウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７は、可溶性単量体ｒｈｕＣＤ８９に対する高い親和性結合を示した。驚くべきことに、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７の結合親和性（すなわち、１．２８ｎＭのＫＤ値）及びＣＤ８９／ＩｇＡ遮断マウス抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７の結合親和性（すなわち、１．６７ｎＭのＫＤ値）よりも、可溶性単量体ｒｈｕＣＤ８９へのより高い結合親和性（すなわち、それぞれ０．８２ｎＭ及び０．９２ｎＭのＫＤ値）を示した。
まとめると、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、「ＣＤＲ２脱アミド修復」プロセス中に可溶性単量体ｒｈｕＣＤ８９に対する結合親和性を増加させるようであった。要約については、表９を参照されたい。
実施例１１．エクスビボヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球を使用した、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の生物学的特徴付け
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
（ａ）．ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対するＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の結合
ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球に対する精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析を使用した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、顆粒球を、０．１％ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；ＰＢＳ／ＢＳＡ）中の１０ｘ１０６細胞／ｍＬに置いた。次いで、１０μＬ／チューブ（すなわち、０．１×１０６細胞）のこれらの細胞を、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７ １００μＬとともに、又はそれを含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。並行して、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＬを陰性対照として実行した。更に、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたキメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）１００μＬを、参照目的のために実行した。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、続いて、細胞を１：２００に希釈したビオチンコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ４特異的抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、細胞を１：２００に希釈したＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／ＢＳＡで十分に洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の２％ホルムアルデヒド中で、４℃で３０分間固定した。エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に対する抗体の結合（幾何平均蛍光強度）をフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。
図２８に示すように、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３（１０μｇ／ｍＬで）の両方は、複数のドナーから単離されたエクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９に結合した（ｎ＝３）。
これらの結果により、またＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、これらの抗体が全ての３人の調査されたドナーから単離されたヒト好中性顆粒球に明確に結合しているため、エクスビボヒト好中性顆粒球由来の膜ヒトＣＤ８９上の非多形エピトープを認識したことが実証された。
（ｂ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３を使用して、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを遮断する
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンのＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡコーティングラテックスビーズのファゴサイトーシスを阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に２．０×１０６細胞／ｍＬで顆粒球を再懸濁した。次いで、１００μＬ／ウェル（すなわち、９６ウェルの平底プレート中に０．２×１０６細胞、Ｇｒｅｉｎｅｒ）のこれらの細胞を、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製された「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７とともに、４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、精製されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を陰性対照として実行した。加えて、１０μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の精製されたキメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的のために実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、１．２μＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）コーティング蛍光ラテックスビーズ（１μｍサイズ及びカルボキシレート修飾ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１：６０の細胞対ビーズ比でこれらの細胞に添加し（調製物ＩｇＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）、３７℃で更に３０分間インキュベーションした。並行して、１：６０の細胞対ビーズ比でＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）コーティング蛍光ラテックスビーズを陰性対照として実行した（調製物ＢＳＡビーズ、Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３を参照されたい）。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で再懸濁した後、フローサイトメーター（Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、エクスビボヒト好中性顆粒球上の膜ヒトＣＤ８９によって、蛍光ラテックスビーズの血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシス（Ａｌｅｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２：２３７４－２３８３に従って食細胞指数を計算するために使用される幾何平均蛍光強度）を測定した。
図２９に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、３人の健常な個体から単離された膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球における血清ヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを用量依存的に阻害した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、膜ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球のヒトＩｇＡ媒介性ファゴサイトーシスを阻害したことが実証された。
（ｃ）．ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３を使用して、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からの血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を遮断する
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からのラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の生物学的活性を分析するために、生成されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断キメラマウス／ヒト抗ヒトＣＤ８９抗体の、ヒトＣＤ８９発現初代ヒト好中性顆粒球からのラクトフェリン産生を阻害する能力を決定した。
初代ヒト好中性顆粒球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）勾配遠心分離、続くＮＨ４Ｃｌ溶解緩衝液中での赤血球の溶解を使用して、健常なドナー（インフォームドコンセント後）の末梢血から単離した。次いで、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中に、これらの初代ヒト好中性顆粒球を２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、続いて１００μＬの顆粒球（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３とともに、４℃で２０分間インキュベーションした。並行して、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を陰性対照として実行した。更に、滴定された（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中）精製されたキメラ抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７（実施例６を参照されたい）を、参照目的のために実行した。この後（すなわち、洗浄せずに）、１００μＬのこれらの細胞（すなわち、０．２×１０６細胞／ウェル）を９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）に添加した。このプレートは、１０μｇ／ｍＬの精製されたヒト（血清由来）ＩｇＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を１００μＬ／ウェル、又は１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（陰性対照として使用される、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μＬ／ウェルのいずれかで、前もってコーティングした。３７℃で３０分間インキュベーションした後、上清（１８０μＬ／ウェル）を採取して、非結合顆粒球を除去し、これらの上清を（いくつかの遠心クリアランスステップ後に）使用して、ラクトフェリン産生レベルを測定した（脱顆粒マーカーとして使用、以下を参照されたい）。比較のために、商業用マウス抗ヒトＣＤ８９抗体クローンＭＩＰ８ａを、実施例３（ｄ）に記載されるように並行して実行した。
プレート結合血清ヒトＩｇＡで刺激した初代ヒト好中性顆粒球の上清中のラクトフェリン産生（脱顆粒の程度を表す）を測定した（上記参照）。このため、９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、１００μＬ／ウェルのウサギ抗ヒトラクトフェリン抗体（１：５０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１６～２４時間、４～８℃でコーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、室温で１時間遮断した。次いで、プレートを１００μＬ／ウェルの上清とともに、１；２の希釈（遮断緩衝液中）で、１時間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ヒトラクトフェリン検出抗体（１：２５００、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｐ－ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した後、マイクロプレートリーダー（ｉＭＡｒｋ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、４０５ｎｍの波長で光学密度を測定した。精製されたヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準物質として使用して、血清ヒトＩｇＡ刺激エクスビボヒト好中性顆粒球によって放出されるラクトフェリンの量を計算した。
図３０に示すように、いくつかのドナーごとのバリエーションが観察されたが、精製されたＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３の両方は、５人の健常な個体から単離されたヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球による血清ヒトＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生を用量依存的に阻害した。
これらの結果により、ＣＤ８９／ＩｇＡ遮断「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４／カッパ抗ヒトＣＤ８９モノクローナル抗体１０Ｅ７バージョンＶＨ３ＳＱＶＬ３及びＶＨ３ＳＴＶＬ３は、ヒトＣＤ８９発現エクスビボ初代ヒト好中性顆粒球によるＩｇＡ媒介性ラクトフェリン産生（脱顆粒マーカー）を阻害したことが実証された。
本発明の特定の態様
態様１．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、抗体ＭＩＰ８ａと比較した場合、当該ヒトＣＤ８９発現細胞における細胞死の誘発がより少ない、抗体。
態様１．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分（ヒトＦｃαＲＩ）に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、抗体ＭＩＰ８ａと比較した場合、当該ヒトＣＤ８９発現細胞における細胞死の誘発がより少ない、抗体。
態様２．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞の細胞生存性を６０％超低減させない、抗体。
態様３．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、３７℃での一晩のインキュベーション後に当該細胞のホスファチジルセリン発現を２０％超増加させない、抗体。
態様４．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、当該抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸２２～４６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸２２～４６と交換されている組換えヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体。
態様５．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸４７～７１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸４７～７１と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体。
態様６．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸７２～９６がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸７２～９６と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体。
態様７．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、当該抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１がカニクイザルＣＤ８９のアミノ酸９７～１２１と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子への結合が２０％以下に低減したものである、抗体。
態様８．抗体であって、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、当該抗体が当該細胞に結合されるとき、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができ、かつ、ヒトＣＤ８９のアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７がカニクイザルＣＤ８９のそれぞれアミノ酸５８、５９、７３、７４、７６、１０６、及び１０７と交換されているキメラヒトＣＤ８９分子に２０％以下で結合する、抗体。
態様９．細胞が、ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（番号ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託）である、態様１～８のいずれか１つに記載の抗体。
態様１０．抗体であって、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２９～３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号３２～３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１１．抗体であって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１２．抗体であって、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４５～４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４８～５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１３．抗体であって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１４．抗体であって、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６９～７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７２～７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１５．抗体であって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１６．抗体であって、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７７～７９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号８０～８２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１７．抗体であって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１８．抗体であって、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５３～５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、０、１、又は２個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５６～５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
態様１９．抗体であって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができる、抗体。
配列の説明
配列番号１：
全長ヒトＣＤ８９のアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、ａａ２８７）
配列番号１：
全長ヒトＣＤ８９のアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｐ２４０７１．１、ａａ２８７）
配列番号２：
完全長ヒトＣＤ８９タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
完全長ヒトＣＤ８９タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号３：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２（ウシＴＭ及びウシＩＣ）を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２（ウシＴＭ及びウシＩＣ）を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
配列番号４：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２（ヒトＴＭ及びヒトＩＣ）を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２（ヒトＴＭ及びヒトＩＣ）を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
配列番号５：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（ウシＴＭ及びウシＩＣ、哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（ウシＴＭ及びウシＩＣ、哺乳動物発現のために最適化）
配列番号６：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（ヒトＴＭ及びヒトＩＣ、哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１及びウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（ヒトＴＭ及びヒトＩＣ、哺乳動物発現のために最適化）
配列番号７：
ウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ１、及びヒトＣＤ８９（ヒトＴＭ＆ヒトＩＣ）由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
ウシＦｃγ２Ｒ由来のＥＣ１、及びヒトＣＤ８９（ヒトＴＭ＆ヒトＩＣ）由来のＥＣ２を含むキメラＦｃＲのアミノ酸配列
配列番号８
ウシＦｃγ２ＲのＥＣ１及びヒトＣＤ８９のＥＣ２を含む、キメラＦｃＲキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
ウシＦｃγ２ＲのＥＣ１及びヒトＣＤ８９のＥＣ２を含む、キメラＦｃＲキメラＦｃＲをコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号９：
全長ウシＦｃγ２Ｒのアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｑ２８１０９、ａａ２６４）
全長ウシＦｃγ２Ｒのアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号Ｑ２８１０９、ａａ２６４）
配列番号１０：
全長ウシＦｃγ２Ｒタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
全長ウシＦｃγ２Ｒタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号１１：
全長カニクイザルＣＤ８９のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１、ａａ２８７）
全長カニクイザルＣＤ８９のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５９０３９８．１、ａａ２８７）
配列番号１２：
全長カニクイザルＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
全長カニクイザルＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号１３：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ａｒｇ４６）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ａｒｇ４６）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
配列番号１４：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ａｒｇ４６）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｎ２２～Ａｒｇ４６）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号１５：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ａｒｇ７１）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ａｒｇ７１）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
配列番号１６：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ａｒｇ７１）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｉｌｅ４７～Ａｒｇ７１）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号１７：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｓｐ７２～Ｇｌｙ９６）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｓｐ７２～Ｇｌｙ９６）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
配列番号１８：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｓｐ７２～Ｇｌｙ９６）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｓｐ７２～Ｇｌｙ９６）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号１９：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
配列番号２０：ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号２１：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分内のＩｇＡと接触するアミノ酸残基（Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６、Ｈｉｓ１０６、及びＴｙｒ１０７）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分由来の相互アミノ酸（Ｉｌｅ５８、Ｔｒｐ５９、Ｇｌｕ７３、Ｌｙｓ７４、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ１０６、及びＳｅｒ１０７）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分内のＩｇＡと接触するアミノ酸残基（Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６、Ｈｉｓ１０６、及びＴｙｒ１０７）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分由来の相互アミノ酸（Ｉｌｅ５８、Ｔｒｐ５９、Ｇｌｕ７３、Ｌｙｓ７４、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ１０６、及びＳｅｒ１０７）と交換することによる、キメラＣＤ８９のアミノ酸配列
配列番号２２：
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分内のＩｇＡと接触するアミノ酸残基（Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６、Ｈｉｓ１０６、及びＴｙｒ１０７）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分由来の相互アミノ酸（Ｉｌｅ５８、Ｔｒｐ５９、Ｇｌｕ７３、Ｌｙｓ７４、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ１０６、及びＳｅｒ１０７）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
ヒトＣＤ８９由来のＥＣ１部分内のＩｇＡと接触するアミノ酸残基（Ｔｈｒ５８、Ｇｌｎ５９、Ａｒｇ７３、Ａｒｇ７４、Ｌｙｓ７６、Ｈｉｓ１０６、及びＴｙｒ１０７）を、カニクイザルＣＤ８９由来のＥＣ１部分由来の相互アミノ酸（Ｉｌｅ５８、Ｔｒｐ５９、Ｇｌｕ７３、Ｌｙｓ７４、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ１０６、及びＳｅｒ１０７）と交換することによる、キメラＣＤ８９をコードするｃＤＮＡ配列（哺乳動物発現のために最適化）
配列番号２３：
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列Ｉ（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列Ｉ（Ｇｌｎ２２～Ｌｙｓ４６）
配列番号２４：
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＩ（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＩ（Ｉｌｅ４７～Ｉｌｅ７１）
配列番号２５：
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＩＩ（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＩＩ（Ｇｌｙ７２～Ｇｌｙ９６）
配列番号２６：
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＶ（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）
ヒトＣＤ８９のＥＣ１部分内のアミノ酸配列ＩＶ（Ａｒｇ９７～Ｇｌｙ１２１）
配列番号２７：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号２８：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体８Ｆ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号２９～３４
配列番号２９：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ１
配列番号２９：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ１
配列番号３０：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ２
配列番号３１：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ８Ｆ３の重鎖ＣＤＲ３
配列番号３２：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３３：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３４：
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ８Ｆ３の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３５：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号３６：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体９Ｈ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号３７～４２
配列番号３７：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号３７：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号３８：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ２
配列番号３９：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ９Ｈ７の重鎖ＣＤＲ３
配列番号４０：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４１：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４２：
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ９Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号４３：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号４４：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１０Ｅ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号４５～５０
配列番号４５：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号４５：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号４６：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ２
配列番号４７：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 １０Ｅ７の重鎖ＣＤＲ３
配列番号４８：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４９：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号５０：
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 １０Ｅ７の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５１：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号５２：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体１６Ｄ６の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号５３～５８
配列番号５３：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ１
配列番号５３：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ１
配列番号５４：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ２
配列番号５５：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 １６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ３
配列番号５６：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号５７：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号５８：
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 １６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５９：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号６０：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２６Ｄ６の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号６１～６６
配列番号６１：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ１
配列番号６１：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ１
配列番号６２：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ２
配列番号６３：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の重鎖ＣＤＲ３
配列番号６４：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号６５：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号６６：
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ２６Ｄ６の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６７：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号６８：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体２０Ｂ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号６９～７４
配列番号６９：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ１
配列番号６９：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ１
配列番号７０：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ２
配列番号７１：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の重鎖ＣＤＲ３
配列番号７２：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号７３：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号７４：
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ２０Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号７５：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の重鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
配列番号７６：
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の軽鎖可変領域のコンセンサスアミノ酸配列
マウス抗ヒトＣＤ８９特異的抗体３０Ｃ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）：配列番号７７～８２
配列番号７７：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号７７：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号７８：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ２
配列番号７９：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の重鎖ＣＤＲ３
配列番号８０：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ１
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号８１：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ２
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号８２：
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ３
アミノ酸配列 ３０Ｃ７の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号８３：
キメラマウスＶＨ ８Ｆ３ヒト重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＨ ８Ｆ３ヒト重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８４：
キメラマウスＶＨ １０Ｅ７及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＨ １０Ｅ７及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８５：
キメラマウスＶＨ １６Ｄ６及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＨ １６Ｄ６及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８６：
キメラマウスＶＨ ２０Ｂ４及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＨ ２０Ｂ４及びヒト定常重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８７：
キメラマウスＶＨ ３０Ｃ７ヒト重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＨ ３０Ｃ７ヒト重ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８８：
キメラマウスＶＬ ８Ｆ３ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＬ ８Ｆ３ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号８９：
キメラマウスＶＬ １０Ｅ７ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＬ １０Ｅ７ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号９０：
キメラマウスＶＬ １６Ｄ６ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＬ １６Ｄ６ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号９１：
キメラマウスＶＬ ２０Ｂ４ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＬ ２０Ｂ４ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号９２：
キメラマウスＶＬ ３０Ｃ７ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
キメラマウスＶＬ ３０Ｃ７ ヒト軽カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号９３：
キメラマウスＶＨ ８Ｆ３ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＨ ８Ｆ３ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
配列番号９４：
キメラマウスＶＨ １０Ｅ７ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＨ １０Ｅ７ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
配列番号９５：
キメラマウスＶＨ １６Ｄ６ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＨ １６Ｄ６ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
配列番号９６：
キメラマウスＶＨ ２０Ｂ４ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＨ ２０Ｂ４ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
配列番号９７：
キメラマウスＶＨ ３０Ｃ７ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＨ ３０Ｃ７ ヒト重ＩｇＧ４鎖のアミノ酸配列
配列番号９８：
キメラマウスＶＬ ８Ｆ３ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＬ ８Ｆ３ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
配列番号９９：
キメラマウスＶＬ １０Ｅ７ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＬ １０Ｅ７ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
配列番号１００：
キメラマウスＶＬ １６Ｄ６ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＬ １６Ｄ６ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０１：
キメラマウスＶＬ ２０Ｂ４ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＬ ２０Ｂ４ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０２：
キメラマウスＶＬ ３０Ｃ７ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
キメラマウスＶＬ ３０Ｃ７ ヒト軽カッパ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０３：ＰＣＲプライマー
配列番号１０４：ＰＣＲプライマー
配列番号１０５：ＰＣＲプライマー
配列番号１０６：ＰＣＲプライマー
配列番号１０７：ＰＣＲプライマー
配列番号１０８：ＰＣＲプライマー
配列番号１０９：ＰＣＲプライマー
配列番号１１０：ＰＣＲプライマー
配列番号１１１：ＰＣＲプライマー
配列番号１１２：ＰＣＲプライマー
配列番号１１３：ＰＣＲプライマー
配列番号１１４：ＰＣＲプライマー
配列番号１１５：ＰＣＲプライマー
配列番号１１６：ＰＣＲプライマー
配列番号１１７：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ１のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ１のアミノ酸配列
配列番号１１８：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ２のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ２のアミノ酸配列
配列番号１１９：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３のアミノ酸配列
配列番号１２０：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ１のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ１のアミノ酸配列
配列番号１２１：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ２のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ２のアミノ酸配列
配列番号１２２：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ３のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ３のアミノ酸配列
配列番号１２３：
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ４のアミノ酸配列
ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７軽鎖可変領域ＶＬ４のアミノ酸配列
配列番号１２４：
ヒト化ＶＨ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＨ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２５：
ヒト化ＶＨ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＨ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２６：
ヒト化ＶＨ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＨ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２７：
ヒト化ＶＬ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＬ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２８：
ヒト化ＶＬ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＬ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２９：
ヒト化ＶＬ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＬ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１３０：
ヒト化ＶＬ４をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＬ４をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１３１：
ヒト化ＶＨ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＨ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３２：
ヒト化ＶＨ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＨ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３３：
ヒト化ＶＨ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＨ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３４：
ヒト化ＶＬ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＬ１をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３５：
ヒト化ＶＬ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＬ２をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３６：
ヒト化ＶＬ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＬ３をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３７：
ヒト化ＶＬ４をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＬ４をカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７のヒト化カッパ鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１３８：
「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３ＳＱのアミノ酸配列
「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３ＳＱのアミノ酸配列
配列番号１３９：
「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３ＳＴのアミノ酸配列
「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７重鎖可変領域ＶＨ３ＳＴのアミノ酸配列
配列番号１４０：
ヒト化ＶＨ３ＳＱをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＨ３ＳＱをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１４１：
ヒト化ＶＨ３ＳＴをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
ヒト化ＶＨ３ＳＴをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１４２：
ヒト化ＶＨ３ＳＱをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＨ３ＳＱをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
配列番号１４３：
ヒト化ＶＨ３ＳＴをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
ヒト化ＶＨ３ＳＴをカバーする抗ヒトＣＤ８９抗体１０Ｅ７の「ＣＤＲ２脱アミド修復」ヒト化ＩｇＧ４鎖をコードするアミノ酸配列
Claims (16)
- ヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができるヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体であって、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＸ１ＶＸ２Ｔ ＩＸ３ＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
を含む、重鎖可変領域であって、式中、
Ｘ１が、Ｌ又はＷであり
Ｘ２が、Ａ又はＳであり
Ｘ３が、Ｎ、Ｓであり
Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
前記重鎖可変領域が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、重鎖可変領域と、
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＩ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＺ１Ｚ２ＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ Ｚ３ＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＺ４ＣＱＱ ＧＫＴＬＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＬＥＩＫ
を含む、軽鎖可変領域であって、式中、
Ｚ１が、Ａ又はＴであり
Ｚ２が、Ｖ又はＰであり
Ｚ３が、Ｙ又はＦであり
Ｚ４が、Ｙ又はＦであり、
前記軽鎖可変領域が、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４以外の位置に、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体。 - 前記重鎖可変領域が、脱アミド修復されている、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体。
- 前記重鎖可変領域が、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＬＶＡＴ ＩＳＧＸ４ＧＤＩＴＹＹ ＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹ ＤＹＤＹＡＭＤＹＷＧ ＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含み、式中、Ｘ４が、Ｑ、Ｔ、又はＮであり、
軽鎖可変領域が、指示されたアミノ酸配列に関して、０、１、２、又は３個のアミノ酸バリエーション、挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体。 - 前記抗体が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１４２又は１４３のアミノ酸配列を有する重鎖と、０、１、２、３、４、５、６、７、８個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗ヒトＣＤ８９抗体。
- 前記抗体が、配列番号９４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、キメラ抗体と比較して、前記ヒトＣＤ８９の細胞外部分に対するより高い親和性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が前記細胞に結合されるとき、前記抗体が、ヒトＣＤ８９発現細胞上のヒトＣＤ８９の細胞外部分に結合することができ、かつ、ヒトＩｇＡのヒトＣＤ８９への結合を防止することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記細胞が、ヒトＣＤ８９発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（番号ＤＳＭ ＡＣＣ３３４１で寄託）である、請求項７に記載の抗体。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原（ヒトＣＤ８９）結合断片をコードする、核酸分子。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体の可変領域をコードする、核酸分子。
- 請求項９又は１０に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項１～８に記載の抗体、請求項９及び１０のいずれか一項に記載の核酸分子、並びに／又は請求項１１に記載のベクターを含む、細胞であって、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞、又は酵母細胞、より好ましくは、ヒト細胞である、細胞。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記方法が、前記抗体の採取を含み、前記抗体が、好ましくは、細胞を使用して産生され、かつ細胞から採取され、前記細胞が、好ましくは、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６（商標）細胞である、方法。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはそれらの抗原結合断片、請求項９及び１０のいずれか一項に記載の核酸分子、並びに／又は請求項１１に記載のベクターを含む、医薬組成物。
- 慢性炎症性疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１～８に記載の抗体若しくはそれらの抗原結合断片、請求項９及び１０のいずれか一項に記載の核酸分子、並びに／又は請求項１１に記載のベクター。
- 対象における慢性炎症性疾患の治療のための方法であって、慢性炎症性疾患の治療を必要とする前記対象に、治療有効量の、請求項１～８に記載の抗体若しくはそれらの抗原結合断片、請求項９及び１０のいずれか一項に記載の核酸分子、並びに／又は請求項１１に記載のベクターを投与することを含む、方法。
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