JP2023550780A - 二重特異性抗体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本願は、TIGITタンパク質に特異的に結合することができる第1の標的部分と、腫瘍関連抗原に結合することができる第2の標的部分とを含む多重特異性抗体を提供し、多重特異性抗体は腫瘍を治療することができる。また、本願は当該多重特異性抗体の医薬品としての用途を提供する。
Description
本願はバイオ医薬品分野に関し、具体的に抗PD-L1/TIGIT二重特異性抗体およびその用途に関する。
腫瘍は新生生物の細胞特性や身体への危害程度によって良性腫瘍と悪性腫瘍に分けられ、その中で悪性腫瘍は現代社会において人類の健康を脅かす主要な疾患であり、致死率は第2位と高い。固形腫瘍の従来の治療法には、手術、化学療法、放射線療法、分子標的薬療法、および免疫療法が含まれる。固形腫瘍の多くの患者は、進行した段階で発見され、外科治療の機会を失っている。それに、そのほとんどの患者は虚弱であり、放射線療法や化学療法による強い副作用に耐えられないことがよくある。バイオ系治療薬、特にPD-1などの免疫チェックポイント抗体をはじめとした癌免疫療法は、毒性が低く、有効性が高いことから、ますます広く使用されるようになり、特に転移性、再発性、難治性の癌または既存の標準的な化学療法で無効な進行性固形腫瘍患者にとって、唯一の選択肢となる可能性がある。
現在市販の免疫チェックポイント抗体医薬品の多くはモノクローナル抗体であり、それらの多くは特定の標的に向けるものである。しかし、モノクローナル抗体療法を受けている患者は、薬剤耐性または無応答を生じる可能性がある。また、多くの疾患は、シグナル伝達経路の違い、サイトカインおよび受容体の調節メカニズムの違いなど、体内の複数の要因の影響を受けているので、単一標的免疫療法は腫瘍細胞を破壊するのに不十分である。そのため、二重特異性抗体（BsAb）などの多重特異性抗体の開発は、オフターゲット毒性、低応答率、薬剤耐性などのモノクローナル抗体薬の問題を解決し、免疫療法の受益者集団を拡大する可能性がある。
二重特異性抗体が、抗体医薬品の開発において注目されている方向であるが、前臨床評価モデル、低い発現レベル、低い安定性、複雑なプロセス、大きな品質管理バラツキなど、多くの課題に直面しているので、二重特異性抗体の開発はとても困難である。したがって、この分野では、特異性が高く、治療効果が高く、調製が容易な抗腫瘍薬の開発が急務となっている。
本願は（1）高い親和性でヒトPD-L1、ヒトTIGITと特異的に結合できること、（2）同時にPD-L1タンパク質およびTIGITタンパク質に結合できること、（3）多重特異性抗体と結合標的の結合構造を変化させず、分子を安定に保つことができること、（4）初期培養条件では、多重特異性抗体の純度は90%以上であること、（5）結合標的の結合親和性を維持することができ、個々の抗PD-L1抗体（HB0023など）および抗TIGIT抗体（HB0030など）と比較して、二重標的の相乗効果を発揮することができること、および（6）固形腫瘍などの腫瘍細胞（特にPD-L1が高発現している腫瘍）を効果的に殺すことができることのいずれかまたは複数の性質をもつ多重特異性抗体を提供する。本願の多重特異性抗体の調製方法は、簡便で操作性が高く、良好な応用将来性が期待できる。
1つの態様では、本願は、TIGITタンパク質に特異的に結合することができる第1の標的部分を含み、そのうち、前記第1の標的部分は単離された抗原結合タンパク質を含み、前記単離された抗原結合タンパク質は重鎖可変領域VHを含み、前記VHはHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、前記HCDR1はSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含み、前記HCDR2はSEQ ID NO:4または42に示すアミノ酸配列を含み、前記HCDR3はSEQ ID NO:5または43に示すアミノ酸配列を含む多重特異性抗体を提供する。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体は軽鎖可変領域VLを含み、前記VLはLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、そのうち、前記LCDR1はSEQ ID NO:6または52に示すアミノ酸配列を含み、前記LCDR2はSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含み、また、前記LCDR3はSEQ ID NO:8または53に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体は重鎖可変領域VHを含み、そのうち、前記VHはSEQ ID NO:110、1、9、12、14および32のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体は軽鎖可変領域VLを含み、そのうち、前記VLはSEQ ID NO:111、2、10、11、13、33および34のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体はさらに、第2の標的部分を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体は軽鎖可変領域VLを含み、そのうち、前記VLはSEQ ID NO:111、2、10、11、13、33および34のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体はさらに、第2の標的部分を含む。
ある実施形態では、前記第2の標的部分は腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる。
ある実施形態では、前記第2の標的部分はPD-L1タンパク質に特異的に結合することができる。
ある実施形態では、前記第2の標的部分は抗体または抗原結合フラグメントを含み、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、そのうち、前記HCDR1、HCDR2およびHCDR3はそれぞれ順次SEQ ID NO:100、101および102に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、そのうち、前記LCDR1ｍLCDR2およびLCDR3はそれぞれ順次SEQ ID NO:103、104および105に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記多重特異性抗体は第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み、そのうち、前記第1のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記TIGITタンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記TIGITタンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み、また、前記第2のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含み、または、前記第1のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記PD-L1タンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記PD-L1タンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み、さらに、前記第2のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含む。
ある実施形態では、前記第1のポリペプチド鎖における前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成し、または、前記第1のポリペプチド鎖におけるPD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成する。
ある実施形態では、前記第1のポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:78-83および85-87から選ばれるのいずれか一項に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記第2のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:84または88に示すアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本願は、前記多重特異性抗体をコードする単離された1つまたは複数の核酸分子を提供する。
別の態様では、本願は、前記核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様では、本願は、前記核酸分子を含む、または前記ベクターによる細胞を提供する。
別の態様では、本願は、前記多重特異性抗体が発現する条件下で、前記細胞を培養することを含む、前記多重特異性抗体の調製法を提供する。
別の態様では、本願は、前記多重特異性抗体、前記核酸分子、前記ベクターおよび/または前記細胞、および任意に選択された、薬学的に許容されるアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本願は、疾患または病症を予防、寛解および/または治療するための医薬品の調製における前記多重特異性抗体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および/または前記医薬組成物の用途を提供する。
当業者は、本願の他の態様及び利点について、以下の詳細な説明から容易に洞察することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が認識するであろうように、本願の内容は、当業者が、本願に係る発明の精神及び範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にするものである。したがって、本願の添付図面及び明細書の記載は単なる例示であり、限定的なものではない。
本願に係る発明の具体的な特徴は、特許請求の範囲に記載のとおりである。本願で詳細に説明される例示的な実施形態及び添付図面を参照することによって、本願に係る発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。添付図面の概略説明は以下のとおりである。
TIGITキメラ抗体のヒトTIGITを発現する細胞に対する結合活性。
TIGITヒト化抗体のヒトTIGITを発現する細胞に対する結合活性。
ヒトTIGITとそのリガンドCD155との結合に対するTIGITキメラ抗体の阻害活性。
TIGITヒト化抗体の、ヒトTIGITとそのリガンドCD155の結合に対する阻害活性。
TIGIT抗体の動物におけるin vivo有効性試験。
TIGIT抗体と対照抗体Tiragolumabの動物における有効性試験の比較。
本願に記載の多重特異性抗体の例示的な構造。
本願に記載の多重特異性抗体TIGIT-IgG-PDL1-scFvのSDS-PAGE電気泳動図結果。
本願に記載の多重特異性抗体PDL1-IgG-TIGIT-scFvのSDS-PAGE電気泳動図結果。
PDL1に対する本願に記載の多重特異性抗体PDL1-IgG-TIGIT-scFvの機能阻害効果。
TIGITに対する本願に記載の多重特異性抗体TIGIT-IgG-PDL1-scFvの機能阻害効果。
マウス腫瘍モデルに対する本願に記載の多重特異性抗体の治療効果。
以下では、特定の具体的な実施形態を用いて本願の実施形態を説明するが、この技術に精通している者は、本願で開示されることにより、本願の他の利点および効果を容易に理解され得る。
用語定義
本願では、「TIGIT」という用語は、「IgおよびITIMドメイン含有T細胞免疫受容体」を意味し、通常、PVR（ポリオウイルス受容体）ファミリーのメンバーである免疫グロブリンがPVR/CD155およびNectin-2/CD112に結合することを意味している。本願におけるTIGITは、霊長類（例えば、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザル）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物由来のTIGITタンパク質を指すことができる。この用語は、完全長TIGITまたはそのフラグメント（シグナルペプチドを欠いた成熟フラグメントなど）、未処理のTIGIT、細胞内での処理によるあらゆる形態のTIGIT、および合成TIGITを含む。また、スプライシング変異体や対立遺伝子変異体など、TIGITの変異体をも含む。いくつかの態様では、TIGITはヒトTIGITであり、ヒトTIGITのアミノ酸配列はUniProtアクセッション番号Q495A1に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、TIGITはカニクイザルTIGITであり、カニクイザルTIGITのアミノ酸配列はUniProtアクセッション番号G7NXM4に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、TIGITはマウスTIGITであり、マウスTIGITのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P86176に示すアミノ酸配列を含む。
本願では、「TIGIT」という用語は、「IgおよびITIMドメイン含有T細胞免疫受容体」を意味し、通常、PVR（ポリオウイルス受容体）ファミリーのメンバーである免疫グロブリンがPVR/CD155およびNectin-2/CD112に結合することを意味している。本願におけるTIGITは、霊長類（例えば、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザル）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物由来のTIGITタンパク質を指すことができる。この用語は、完全長TIGITまたはそのフラグメント（シグナルペプチドを欠いた成熟フラグメントなど）、未処理のTIGIT、細胞内での処理によるあらゆる形態のTIGIT、および合成TIGITを含む。また、スプライシング変異体や対立遺伝子変異体など、TIGITの変異体をも含む。いくつかの態様では、TIGITはヒトTIGITであり、ヒトTIGITのアミノ酸配列はUniProtアクセッション番号Q495A1に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、TIGITはカニクイザルTIGITであり、カニクイザルTIGITのアミノ酸配列はUniProtアクセッション番号G7NXM4に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、TIGITはマウスTIGITであり、マウスTIGITのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P86176に示すアミノ酸配列を含む。
本願では、「PD-L1」という用語は、一般にプログラム細胞死1リガンド1を指し、B7ホモログ1、B7-H1、分化クラスター274、（3）274またはCD274とも呼ばれ、PD-1に結合した後に、T細胞活性化とサイトカイン分泌をダウンレギュレートする。「PD-L1」は霊長類（例えば、ヒトおよびカニクイザル）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物起源の任意の天然PD-L1を含む。前記用語は、「完全長」の未処理のPD-L1および細胞の処理によって生成された任意の形態のPD-L1を含む。PD-L1は膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。「PD-L1」は無傷のPD-L1およびそのフラグメント、さらに機能的変異体、アイソフォーム、種の同族体、誘導体、類似体、および少なくとも1つのPD-L1との共有エピトープを有する類似体を含む。PD-L1の基本的な構造は、細胞外Ig様V型ドメインとIg様C2型ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの4つのドメインを含む。例示的なヒトPD-L1アミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001254653またはUniProtアクセッション番号Q9NZQ7から見出すことができる。
本願では、「抗原結合タンパク質」という用語は、一般に、抗原と結合する部分と任意に、抗原結合タンパク質と抗原との結合を促進するコンフォメーションを採用することを可能にする足場または骨格部分とを指す。抗原結合タンパク質の例としては、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体、抗原結合フラグメント（Fab、Fab'、F（ab）2、Fvフラグメント、F（ab'）2、scFv、ジscFvおよび/またはdAb）、免疫複合体、多重特異性抗体（例えば二特異性抗体）、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体アナログまたは融合タンパク質があるが、これらに限定されない。
本願では、「Fab」という用語は、一般に、重鎖可変構造ドメインおよび軽鎖可変構造ドメインを含み、さらに軽鎖の定常構造ドメインおよび重鎖の第1の定常構造ドメイン（CH1）を含むフラグメントを指し、用語「Fab'」は、一般に、重鎖CH1構造ドメインのカルボキシル末端に少数の残基（抗体のヒンジ領域からの1以上のシステインを含む）を付加することによってFabと異なるフラグメントを指す。「F（ab'）2」という用語は、一般に、Fabのダイマー、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結した2つのFabフラグメントを含む抗体フラグメントを指す。「Fv」という用語は、一般に、完全な抗原認識、結合部位を含む最小の抗体フラグメントを指す。いくつかの態様では、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が強固に非共有結合した二量体からなることもある。「dsFv」という用語は、一般に、単一軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との結合がジスルフィド結合であるジスルフィド安定化Fvフラグメントを指す。「dAbフラグメント」という用語は、一般に、VH構造ドメインからなる抗体フラグメントを指す。本願では、「scFv」という用語は、一般に、柔軟なペプチドリンカーを介した抗体の重鎖可変構造ドメインと軽鎖可変構造ドメインとの共有結合によって形成される一価分子を指す。ここで、scFv分子は、一般構造：NH2-VL-リンカー-VH-COOHまたはNH2-VH-リンカー-VL-COOHを有し得る。
本願では、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（2本の軽鎖と2本の重鎖からなる完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびカメリア化モノ構造ドメイン抗体は対象となるが、それらに限定されるものではない。「抗体」という用語は、一般に、少なくとも2本の重鎖（HC）と2本の軽鎖（LC）がジスルフィド結合で連結されたタンパク質、またはその抗原結合性フラグメントを含み得る。各重鎖には、重鎖可変領域（VH）と重鎖定常領域がある。自然に存在するIgG、IgDおよびIgA抗体の一部では、重鎖定常領域に3つの構造ドメイン、CH1、CH2およびCH3が存在する。自然に存在するいくつかの抗体では、各軽鎖は軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域には、構造ドメインであるCLが存在する。VHおよびVL領域は、さらに補完決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域に細分化され、フレーム領域（FR）と呼ばれるより保守的な領域と交互に配置されている。各VHおよびVL3つのCDRと4つのフレーム領域（FR）を持ち、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順で配列されている。自然重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域（H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4）を含み得、大部分はβ-フォールディング構造をとり、3つのCDRによってループ結合を形成し、場合によってはβ-フォールディング構造の一部を形成する。各鎖のCDRはFR領域を介して互いに近接して保持され、もう一方の鎖のCDRとともに、抗体の抗原結合部位を形成する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織や因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。
本願では、「可変」という用語は、一般に、抗体の可変構造ドメインの配列の一部が強く可変であることを指し、これにより、様々な特異的抗体のその特定の抗原に対する結合性や特異性が形成される。しかし、変動性は抗体の可変領域全体に均一に分布しているわけではない。補完決定領域（CDR）または高可変性領域（HVR）として知られる、軽鎖および重鎖可変領域の3つのセグメントに集中して存在する。可変領域のより保存性の高い部分をフレーム（FR）と呼ぶ。当技術分野では、抗体のCDRは、様々な方法、例えば、配列変動に基づくKabat定義ルール（Kabatら、Protein Sequences in Immunology、第5版、National Institutes of Health, Bethesda, Maryland（1991）を参照）、構造ループ領域の位置に基づくChothia定義ルール（A1-Lazikani et al., JMol Biol 273:927-48,1997を参照）およびIMGTオントロジー（IMGT-ONTOLOGY）の概念に基づくIMGT科学チャートルールとIMGT定義ルールなどが挙げられる。
本願では、「可変」という用語は、一般に、抗体の可変構造ドメインの配列の一部が強く可変であることを指し、これにより、様々な特異的抗体のその特定の抗原に対する結合性や特異性が形成される。しかし、変動性は抗体の可変領域全体に均一に分布しているわけではない。補完決定領域（CDR）または高可変性領域（HVR）として知られる、軽鎖および重鎖可変領域の3つのセグメントに集中して存在する。可変領域のより保存性の高い部分をフレーム（FR）と呼ぶ。当技術分野では、抗体のCDRは、様々な方法、例えば、配列変動に基づくKabat定義ルール（Kabatら、Protein Sequences in Immunology、第5版、National Institutes of Health, Bethesda, Maryland（1991）を参照）、構造ループ領域の位置に基づくChothia定義ルール（A1-Lazikani et al., JMol Biol 273:927-48,1997を参照）およびIMGTオントロジー（IMGT-ONTOLOGY）の概念に基づくIMGT科学チャートルールとIMGT定義ルールなどが挙げられる。
IMGTは国際ImMunoGeneTics情報システムを指し、免疫遺伝学と免疫情報学の世界的な参照データベース(http：//www.imgt.org)である。IMGTは、ヒトやその他の脊椎動物の免疫グロブリン（IG）や抗体、T細胞受容体（TR）、主要組織適合性（MH）、および脊椎動物や非脊椎動物の免疫グロブリンスーパーファミリー（Igsf）、MHスーパーファミリー（MhSf）、免疫系関連タンパク質（RPI）を専門としている。
本願では、「kabatの抗体ナンバリング規則」という用語は、一般に、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域またはその抗原結合部分におけるアミノ酸残基のナンバリングシステムを指す（Kabatら(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391およびKabat、E.A.ら(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国健康福祉省、NIH公告第91-3242号）。重鎖可変領域にとって、CDR1は重鎖可変領域の31-35番目のアミノ酸、CDR2は重鎖可変領域の50-65番目のアミノ酸、CDR3は重鎖可変領域の95-102番目のアミノ酸である。軽鎖可変領域によって、CDR1は軽鎖可変領域の24-34番目のアミノ酸、CDR21は軽鎖可変領域の50-56番目のアミノ酸およびCDR3の89-97番目のアミノ酸である。
本願では、「単離された」抗原結合タンパク質という用語は、一般に、それが生成された環境の構成要素（例えば、天然または組換え）から同定、単離および／または回収された抗原結合タンパク質を指す。それらが発生する環境の汚染成分は、通常、研究、診断または治療の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、その他のタンパク質または非タンパク質の溶質が含まれることがある。単離抗原結合タンパク質または抗体は、通常、少なくとも1回の精製工程を経て調製される。
本願では、「多重特異性抗体」という用語は、一般に、1つまたは複数の抗原における1つ以上のエピトープの可変領域を認識する抗体を指す。多重特異性抗体には、完全長抗体、2つまたはこれ以上のVLおよびVHドメインを有する抗体、Fab、Fv、dsFv、scFvなどの抗体フラグメント、二重抗体、二重特異性抗体および三重抗体、共有結合または非共有結合の抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は同一または異なる抗原における2つの異なるエピトープを認識する「二重特異性抗体」であってもよい。
本願では、「モノクローナル抗体」という用語は、一般に、実質的に均質な抗体群から得られた抗体、すなわち、存在し得る少数の自然変異を除いて、クラスター内の個々の抗体は同一であることを指す。モノクローナル抗体は、通常、単一の抗原部位に対して高度に特異的である。さらに、従来のポリクローナル抗体製剤は、通常、異なる決定基に対して異なる抗体を持つが、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基クラスターに対して指向性を持つ。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、ハイブリドーマ培養により合成することができ、他の免疫グロブリンに汚染されないという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体の特性を示すものであり、特定の抗体製造方法を必要とするものではないと解釈される。例えば、本願で使用するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞で調製してもよいし、組換えDNA法により調製してもよい。
本願では、「キメラ抗体」という用語は、一般に、可変領域がある種に由来し、定常領域が他の種に由来する抗体を指す。一般に、可変領域はげっ歯類などの実験動物の抗体（「親抗体」）に由来し、定常領域はヒトの抗体に由来するため、得られるキメラ抗体は親（例えばマウス由来）抗体よりもヒト個体に有害な免疫反応を引き起こす可能性が低くなる。
本願では、「ヒト化抗体」という用語は、一般に、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のCDRドメイン外のアミノ酸の一部または全部がヒト免疫グロブリンからの対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。また、CDR領域におけるアミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾も、抗体が特定の抗原と結合する能力を依然として保持している限り、許容される場合がある。ヒト化抗体は、任意に、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。「ヒト化抗体」は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持している。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンの配列に由来するキメラ抗体から最小限の構成とすることができる。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）のCDRドメインの残基を、所望の特性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）のCDRドメインの残基と置換されてもよい。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリンのFRドメインの残基は、対応する非ヒト残基と置換されてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体やドナー抗体には存在しないアミノ酸修飾を含んでいてもよい。これらの修飾は、結合親和性などの抗体の性能をさらに改善するために行われることができる。
本願では、「完全ヒト抗体」とは、一般に、抗体をコードする遺伝子をヒトから遺伝子操作により抗体遺伝子欠損動物に導入することにより、動物で発現させた抗体を指すものとする。抗体のすべての部分（抗体の可変領域と定常領域を含む）は、ヒト由来の遺伝子によってコード化されている。免疫上の副作用を大幅に軽減することができる。本分野で完全ヒト抗体を取得する方法としては、ファージディスプレイディープLs法、トランスジェニックマウス法、リボソームディスプレイディープLs法、RNA-ポリペプチド法などが考えられる。
本願では、「結合」、「特異的結合」または「～に特異的」という用語は、一般に、測定可能で再現可能な相互作用を指し、例えば、 抗原と抗体の結合など、異種分子（生体分子を含む）の存在下で標的の存在を判定することができる。例えば、抗体は抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するが、その結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間に何らかの相補性が必要である。例えば、標的（エピトープであってもよい）と特異的に結合する抗体とは、他の標的と結合するよりも高い親和性、親和性、より容易に、および／またはより長い期間、この標的と結合するものである。抗体が抗原と「特異的に結合する」と言われるのは、その抗原結合ドメインを介して、ランダムに結合する無関係なエピトープよりも容易にエピトープと結合する場合である。「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質（抗体など）と結合する抗原上の特定の原子団（糖側鎖、リン酸基、スルホニル基など）またはアミノ酸のことである。
本願では、「KD」および「KD」という用語は、互換的に用いられ、一般に、平衡解離定数を指し、「KD」は、解離速度定数（kdis、「解離速度（off-rate）（koff）」または「kd」としても知られる）と結合速度定数（kon、「結合速度（kon）」または「ka」としても知られる）の比を指す。抗原結合タンパク質（抗体など）の抗原に対する結合親和性は、結合速度定数（kon）、解離速度定数（kdis）、平衡解離定数（KD）を用いて表すことができる。結合・解離速度定数を決定する方法は当該分野でよく知られており、バイオフィルム干渉法（Bliophilm Interferometry：BLI）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、平衡透析、表面プラズモン共鳴（SPR）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、共免疫沈降（Co-IP）、タンパク質チップ技術などがあるが、それだけにとどまらない。異なる条件下(例えば、塩分濃度、pH)で測定した場合、測定したある特定のタンパク質-タンパク質相互作用の親和性は異なる可能性がある。
本願では、「参照抗体」という用語は、一般に、本願に記載の抗原結合タンパク質が抗原TIGITとの結合を競合する抗体を指す。
本願では、「ADCC」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」という用語は、一般に、多数の分泌型免疫グロブリンが特定の細胞傷害性エフェクター細胞（例えば、NK細胞、好中球およびマクロファージ）上のFc受容体（FcR）と結合し、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞と特異的に結合し、続いて標的細胞を細胞傷害性薬剤で殺傷できる細胞傷害の一形態を指す。ADCCを媒介する主細胞（例えば、NK細胞）はFcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFeγRIIIを発現する（Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991) 464ページ表3を参照）。標的分子のADCC活性を評価するために、in vitroおよび／またはin vivo細胞毒性測定を行うことができ、例えば、in vitro ADCCアッセイは、米国特許第5500362号または第5821337号または米国特許第6737056号（Presta）に記載されているように実施することができる。このようなアッセイに使用できるエフェクター細胞には、PBMCやNK細胞などがある。代替的／付加的に、標的分子のADCC活性は、例えば、Clynesら、PNAS（USA）95：652-656（1998）に開示すような動物モデルにおいて、in vivoで評価され得る。例えば、Fc受容体（FcR）結合アッセイを実施して、抗体がFcγR結合を欠き（したがって潜在的にADCC活性を欠く）、FcRn結合能を保持していることを確認することができる。
ADCC活性は、Fc領域を修飾することで低下させることができる。いくつかの態様では、Fcレセプターとの結合に影響を与える部位を、例えば、救済的なレセプター結合部位でない部位を除去することができる。いくつかの態様では、Fc領域は、ADCC部位を除去するように修飾されてもよい。ADCC部位は当技術分野で知られており、IgG1のADCC部位については、例えば、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9を参照できる。
本願では、「......の間」とは、一般に、アミノ酸フラグメントのC末端が第1のアミノ酸フラグメントのN末端と直接的または間接的に結合しており、そのN末端が第2のアミノ酸フラグメントのC末端と直接的または間接的に結合していることを指す。軽鎖においては、例えば、前記L-FR2のN末端が前記LCDR1のC末端に直接または間接的に連結され、前記L-FR2のC末端が前記LCDR2のN末端に直接または間接的に連結されている。例えば、L-FR3の前記N-末端は前記LCDR2のC-末端に直接または間接的に連結され、L-FR3の前記C-末端は前記LCDR3のN-末端に直接または間接的に連結されている。重鎖では、例えば、前記H-FR2のN末端が前記HCDR1のC末端に直接または間接的に連結され、前記H-FR2のC末端が前記HCDR2のN末端に直接または間接的に連結されている。例えば、前記H-FR3のN末端は、前記HCDR2のC末端に直接または間接的に連結され、前記H-FR3のC末端は、前記HCDR3のN末端に直接または間接的に連結されている。本願では、「第1のアミノ酸フラグメント」および「第2のアミノ酸フラグメント」は、同一または異なるアミノ酸フラグメントの何れであってもよい。
本願では、「単離された」抗原結合タンパク質という用語は、一般に、それが生成された環境の構成要素（例えば、天然または組換え）から同定、単離および／または回収された抗原結合タンパク質を指す。それらが発生する環境の汚染成分は、通常、研究、診断または治療の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、その他のタンパク質または非タンパク質の溶質が含まれることがある。単離抗原結合タンパク質または抗体は、通常、少なくとも1回の精製工程を経て調製される。本願に記載の単離抗原結合タンパク質は、一般に、TIGIT抗原でない抗原とは結合しない。
本願では、「単離された核酸分子」または「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、mRNA、cDNAまたは合成由来のDNAまたはRNA、あるいはそれらの何らかの組み合わせであって、自然界に存在するポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結されていないものを指す。
本願では、「ベクター」という用語は、一般に、適切な宿主細胞内で自己複製することができる核酸分子であって、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間に移すものを指す。前記ベクターは主にDNAまたはRNAを細胞に挿入するために使用されるベクター、主にDNAまたはRNAを複製するために使用されるベクター、および主にDNAまたはRNAの転写および／または翻訳の発現に使用されるベクターが含まれていてもよい。前記ベクターはまた、前記の様々な機能を有するベクターを含む。前記ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチドに転写または翻訳されるポリヌクレオチドである場合もある。通常、前記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、前記ベクターは、所望の発現産物を産生することができる。
本願では、「細胞」という用語は、一般に、本願に記載される核酸分子からなるプラスミドまたはベクターを含むことができるかまたは含んでいた、あるいは本願に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントを発現することができる個々の細胞、細胞株または細胞培養物を指す。前記細胞は、単一の宿主細胞の子孫で構成されていてもよい。自然変異、偶発的変異または故意の変異により、娘細胞は必ずしも元の親細胞と形態的またはゲノム的に同一でなくてもよいが、本願に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現できるものであれば十分と考える。前記細胞は、本願に記載のベクターを用いてin vitroで細胞をトランスフェクトすることによって得られる。前記細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば酵母細胞、例えばCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞またはミエローマ細胞）であってもよい。いくつかの態様では、前記細胞は、哺乳類細胞であってもよい。例えば、前記哺乳類細胞は、CHO-K1細胞であってもよい。本願では、「組換え細胞」という用語は、一般に、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。前記組換え宿主細胞には、特定の細胞だけでなく、これらの細胞の子孫も含まれる。
本願では、「薬学的に許容されるアジュバント」という用語は、一般に、使用される用量および濃度において曝露された細胞または哺乳動物に対して無毒である薬学的に許容されるベクター、賦形剤または安定化剤を含む。通常、生理学的に許容されるベクターは、pH緩衝化された水溶液である。生理学的に許容されるベクターの例としては、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸； グルコース、マンノース、デキストリンなどの単糖類、二糖類などの糖質；EDTAなどのキレート剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはTWEENTM（登録商標）、ポリエチレングリコール（PEG）やPLURONICSTM（登録商標）などの非イオン系界面活性剤などが挙げられる。
本明細書では、「投与」および「治療」という用語は、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官または生体液への外来性薬物、治療剤、診断剤または組成物の適用を意味する。「投与」および「処理」という用語は、治療法、薬物動態法、診断法、研究法および実験法を指す場合がある。細胞の処理には、試薬と細胞との接触、試薬と液体との接触、液体と細胞との接触が含まれる。「投与」および「処理」という用語は、試薬、診断薬、組成物結合によって、または他のin vitroおよび離体での細胞の処理によってという意味もある。「治療」とは、ヒト、動物または研究対象に適用される場合、治療処置、予防処置、研究および診断を意味し、TIGITコンジュゲートのヒトまたは動物、対象、細胞、組織、生理学的区画または生理学的液体への接触を含む。
本明細書では、「治療」という用語は、本願のTIGIT抗原結合タンパク質およびその組成物のいずれかを含む治療剤を、当該治療剤が治療効果を有することが知られている疾患の1つまたは複数の症状を有する患者に、内服または外用として投与することを指す。患者には、通常、疾患の1つ以上の症状を寛解するのに有効な量（治療有効量）の治療薬が投与される。治療効果としては、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または軽減、寛解または予後の改善などが望まれる。例えば、癌に関連する症状の1つ以上が減少または除去された場合、個体は正常に「治療」される。これには、癌細胞の増殖の減少（または破壊）、疾患に由来する症状の減少、疾患を有する個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬物の投与量の減少、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存の延長が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本願では、「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、すべての冗長（腫瘍性）細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がんおよびがん性の細胞および組織を指す。
本明細書では、「任意に」または「任意的に」という用語は、その後に説明する事象または状況が発生してもよいが、必ず発生するものではないことを指す。
本願では、「含む」という用語は、一般に、含む、包含する、含有する、対象とすることを指す。場合によっては、「～のための」、「～からなる」という意味もある。
本願では、「約」という用語は、通常、指定値以上0.5%～10%の範囲での変動を意味し、例えば、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、又は10%の範囲での変動を指す。
TIGIT抗原結合タンパク質
1つの態様では、本願は、重鎖可変領域VHに少なくとも1つのCDRを含み得る単離抗原結合タンパク質を提供し、前記VHは、SEQ ID NO：55のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得る。
1つの態様では、本願は、重鎖可変領域VHに少なくとも1つのCDRを含み得る単離抗原結合タンパク質を提供し、前記VHは、SEQ ID NO：55のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得る。
1つの態様では、本願は、重鎖可変領域VHに少なくとも1つのCDRを含み得る単離抗原結合タンパク質を提供し、前記VHは、SEQ ID NO：54のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質の前記VHは、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、HCDR1を含んでいてもよく、前記HCDR1は、SEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列： GYSITSDYAを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質はHCDR2を含んでいてもよく、前記HCDR2はSEQ ID NO:56に示すアミノ酸配列：IX2X3SGX6X7を含み得る。ここで、X2はSまたはT、X3はSまたはY、X6はAまたはS、X7はPまたはTであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記HCDR2は、SEQ ID NO：4および42のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、HCDR2を含んでいてもよく、前記HCDR2は、SEQ ID NO：4に示すアミノ酸配列： ITSSGSTを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよいもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、HCDR3を含んでいてもよく、ここで、前記HCDR3は、SEQ ID NO：57に示すアミノ酸配列：AX2LX4X5X6X7YX9X10AMDYを含み得る。ここで、X2はRまたはS、X4はDまたはG、X5はFまたはT、X6はDまたはG、X7はNまたはY、X9はGまたは非存在、X10はGまたは非存在であってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記HCDR3はSEQ ID NO：5および43のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、HCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR3は、SEQ ID NO：5に示すアミノ酸配列：ARLDFGNYGGAMDYを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR1、H-FR2、H-FR3およびH-FR4を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR1を含んでいてもよく、前記H-FR1は、SEQ ID NO：58に示すアミノ酸配列：X1VQLQESGPGLVKPSX16X17LSLTCTVX25を含み得る。ここで、X1はDまたはQ、X16はEまたはQ、X17はSまたはT、およびX25はSまたはTであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
例えば、前記H-FR1は、SEQ ID NO： 23および35のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR1を含んでいてもよく、前記H-FR1は、SEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR1を含んでいてもよく、前記H-FR1は、SEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR2を含んでいてもよく、前記H-FR2は、SEQ ID NO：60に示すアミノ酸配列： WX2WIRQX7PGX10X11X12EWX15GYを含み得る。ここで、 X2はIまたはN、X7はFまたはP、X10はKまたはN、X11はG、RまたはK、X12はLまたはV、X15はIまたはMであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記H-FR2はSEQ ID NO： 24-26および36-37のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR2を含んでいてもよく、前記H-FR2は、SEQ ID NO：59に示すアミノ酸配列：WIWIRQPPGX10X11LEWIGYを含み得る。ここで、X10はKまたはN、X11はGまたはKであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記H-FR2はSEQ ID NO： 24-26のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR3を含んでいてもよく、前記H-FR3は、SEQ ID NO：61に示すアミノ酸配列：X1YNPSLKSRX10X11X12X13X14DTSKNQFX22LX24LX26X27VTX30X31DTATYYCを含み得る。ここで、X1はR、SまたはY、X10はIまたはV、X11はSまたはT、X12はFまたはI、X13はSまたはT、X14はRまたはV、X22はFまたはS、X24はKまたはQ、X26はSまたはT、X27はFまたはS、X30はAまたはT、X31はAまたはEであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記H-FR3はSEQ ID NO：27、38および39のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR3を含んでいてもよく、前記H-FR3は、SEQ ID NO：27に示すアミノ酸配列： YNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR4を含んでいてもよく、前記H-FR4は、SEQ ID NO：62に示すアミノ酸配列： WGQGTX6VX8VSSを含み得る。ここで、X6はLまたはS、X8はIまたはTであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記H-FR4はSEQ ID NO：28、40および41のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域H-FR4を含んでいてもよく、前記H-FR4は、SEQ ID NO：28に示すアミノ酸配列： WGQGTLVTVSSを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO:55に示すアミノ酸配列：X1VQLQESGPGLVKPSX16X17LSLTCTVX25GYSITSDYAWX36WIRQX41PGX44X45X46EWX49GYIX53X54SGX57X58X59YNPSLKSRX68X69X70X71X72DTSKNQFX80LX82LX84X85VTX88X89DTATYYCAX98LX100X101X102X103YX105X106AMDYWGQGTX116VX118VSSを含み得る。ここで、X1はDまたはQ、X16はEまたはQ、X17はSまたはT、X25はSまたはT、X36はIまたはN、X41はFまたはP、X44はNまたはK、X45はG、KまたはR、X46はLまたはV、X49はIまたはM、X53はSまたはT、X54はSまたはY、X57はAまたはS、X58はPまたはT、X59はR、SまたはY、X68はIまたはV、X69はSまたはT、X70はFまたはI、X71はSまたはT、X72はRまたはV、X80はFまたはS、X82はKまたはQ、X84はSまたはT、X85はFまたはS、X88はAまたはT、X89はAまたはE、X98はRまたはS、X100はDまたはG、X101はFまたはT、X102はDまたはG、X103はNまたはY、X105はGまたは不存在、X106はGまたは不存在、X116はLまたはS、X118はIまたはTであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO：1、9、12、14および32のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は重鎖可変領域VHを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO:54に示すアミノ酸配列：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGX44X45LEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSSを含み得る。ここで、X44はKまたはN、X45はGまたはKであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO：9、12および14のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域を含んでいてもよく、当該重鎖定常領域は、ヒトIgG、例えば、ヒトIgG1由来であってもよい。いくつかの態様では、ヒトIgG1のFcドメインを修飾して、所望の特性（例えば、ADCC KO）を達成することができる。前記修飾は、アミノ酸の変異であってもよい。いくつかの態様では、IgG 1の修飾がL234A/L235Aとなることがある。すなわち、EU番号に従って, 234番および235番のアミノ酸がそれぞれロイシン (L) からアラニン (A) に変異する。いくつかの態様では、本願に記載の抗原結合タンパク質の重鎖定常領域は、野生型ヒトIgG1由来であってもよい。例えば、本願に記載の抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO：35-36のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質、軽鎖可変領域VLに少なくとも1つのCDRを含んでいてもよく、前記VLは、SEQ ID NO：64に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質、軽鎖可変領域VLに少なくとも1つのCDRを含んでいてもよく、前記VLは、SEQ ID NO：63に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記抗原結合タンパク質のVLは、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質はLCDR1を含んでいてもよく、前記LCDR1はSEQ ID NO:65に示すアミノ酸配列：QHVSX5Aを含み得る。ここで、X5はNまたはTであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記LCDR1は、SEQ ID NO：6および52のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、LCDR1を含んでいてもよく、前記LCDR1は、SEQ ID NO：6に示すアミノ酸配列： QHVSTAを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、LCDR2を含んでいてもよく、前記LCDR2は、SEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列： SASを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質はLCDR3を含んでいてもよく、前記LCDR3はSEQ ID NO:66に示すアミノ酸配列：QQX3YX5X6PX8Tを含み得る。ここでX3はHまたはY、X5はIまたはS、X6はLまたはT、且X8はWまたはYであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記LCDR3はSEQ ID NO：8および53のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、LCDR3を含んでいてもよく、前記LCDR3は、SEQ ID NO：8に示すアミノ酸配列： QQHYITPYTを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR1、L-FR2、L-FR3およびL-FR4を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR1を含んでいてもよく、ここで、前記L-FR1は、SEQ ID NO：68に示すアミノ酸配列： DIX3MTQSX8X9X10X11X12X13SX15GDRVX20ITCX24ASを含み得る。ここで、X3はQまたはV、X8はHまたはP、X9はKまたはS、X10はFまたはS、X11はLまたはM、X12はFまたはS、X13はAまたはT、X15はIまたはV、X20はSまたはT、X24はKまたはRであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
例えば、前記L-FR1はSEQ ID NO：15、16、 44および45のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記L-FR1はSEQ ID NO：15、16、 44および45のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR1を含んでいてもよく、前記L-FR1は、SEQ ID NO：67に示すアミノ酸配列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX24ASを含み得る。ここで、X24はKまたはRであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR1はSEQ ID NO：15および16のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR2を含んでいてもよく、前記L-FR2は、SEQ ID NO：70に示すアミノ酸配列： X1X2WYQQKPGX10X11PKLIX17を含み得る。ここで、X1はLまたはV、X2はAまたはN、X10はKまたはQ、X11はAまたはS、および、X17は、HまたはYであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR2はSEQ ID NO：17、18、46および47のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR2を含んでいてもよく、前記L-FR2は、SEQ ID NO：69に示すアミノ酸配列： X1X2WYQKPGKAPKLLIYを含み得る。ここで、X1はLまたはV、X2はAまたはNであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR2はSEQ ID NO：17および18のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR3を含んでいてもよく、前記L-FR3は、SEQ ID NO：72に示すアミノ酸配列： YX2X3X4GVPX8RFX11GX13X14SGTDFTX21TIX24SX26QX28EDX31AX33YYCを含み得る。ここで、X2はLまたはR、X3はQまたはY、X4はSまたはT、X8はDまたはS、X11はI、SまたはT、X13はRまたはS、X14はGまたはR、X21はFまたはL、X24はNまたはS、X26はLまたはV、X28はAまたはP、X33はFまたはL、X14はTまたはVであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR3はSEQ ID NO：19-21と48-50のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は骨格領域L-FR3を含んでいてもよく、前記L-FR3はSEQ ID NO:71に示すアミノ酸配列：YX2X3SGVPSRFSGSX14SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCを含み得る。ここで、X2はLまたはR、X3はQまたはY、X14はGまたはRであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR3はSEQ ID NO：19-21のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は骨格領域L-FR4含んでいてもよく、前記L-FR4はSEQ ID NO:73に示すアミノ酸配列：FGX3GTKLEIKを含み得る。ここでX3はGまたはQであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記L-FR4はSEQ ID NO：22および51のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、フレーム領域L-FR4を含んでいてもよく、前記L-FR4は、SEQ ID NO：22に示すアミノ酸配列： FGQGTKLEIKを含み得る。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VLは、SEQ ID NO：64に示すアミノ酸配列：DIX3MTQSX8X9X10X11X12X13SX15GDRVX20ITCX24ASQHVSX31AX33X34WYQQKPGX42X43PKLLIX49SASYX54X55X56GVPX60RFX63GX65X66SGTDFTX73TIX76SX78QX80EDX83AX85YYCQQX91YX93X94PX96TFGX100GTKLEIKを含み得る。ここで、X3はQまたはV、X8はHまたはP、X9はKまたはS、X10はFまたはS、且、X11はLまたはM、X12はFまたはS、X13はAまたはT、X15はIまたはV、X20はSまたはT、X24はKまたはR、X31はNまたはT、X33はLまたはV、X34はAまたはN、X42はKまたはQ、X43はAまたはS、X49はHまたはY、X54はLまたはR、X55はQまたはY、X56はSまたはT、X60はDまたはS、X63はI、SまたはT、X65はSまたはR、X66はGまたはR、X73はLまたはF、X76はSまたはN、X78はLまたはV、X80はAまたはP、X83はFまたはL、X85はTまたはV、X91はHまたはY、X93はIまたはS、X94はLまたはT、X96はWまたはY、X100はQまたはGであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VLは、SEQ ID NO：2、10、11、13、33および34のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域VLを含みんでいてもよく、前記VLはSEQ ID NO:63に示すアミノ酸配列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX24ASQHVSTAX33X34WYQQKPGKAPKLLIYSASYX54X55SGVPSRFSGSX66SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIKを含み得る。ここで、X24はKまたはR、X33はLまたはV、X34はAまたはN、X54はLまたはR、X55はQまたはY、X66はGまたはRであってもよい。例えば、IMGT定義規則に従って決定された配列であってもよい。例えば、前記抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VLは、SEQ ID NO：10、11および13のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の抗原結合タンパク質は、軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記軽鎖定常領域は、ヒト軽鎖定常領域配列を含み得る。例えば、ヒトκ軽鎖定常領域を含み得る。例えば、本願に記載の単離抗原結合タンパク質の軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域CDR-HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR2はSEQ ID NO：56に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3は、SEQ ID NO：57に示すアミノ酸配列を含み得る。例えば、本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域CDR-HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR2はSEQ ID NO：4および42のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3はSEQ ID NO：5および43のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域CDR-HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1、前記HCDR2および前記HCDR3はそれぞれSEQ ID NO：3、4 および5に示すアミノ酸配列を順に含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変領域CDR-LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記LCDR1はSEQ ID NO：65に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2はSEQ ID NO：7 に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3は、SEQ ID NO：66に示すアミノ酸配列を含み得る。例えば、本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変領域CDR-LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記LCDR1はSEQ ID NO：6および52のいずれかに示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2はSEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3は、SEQ ID NO：8および53のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変領域CDR-LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記LCDR1、前記LCDR2および前記LCDR3はそれぞれSEQ ID NO：6、 7および8に示すアミノ酸配列を順に含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR2はSEQ ID NO：56に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3はSEQ ID NO：57に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR1はSEQ ID NO：65に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2はSEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3はSEQ ID NO：66に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含んでいてもよく、前記HCDR2はSEQ ID NO：4と42のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3は、SEQ ID NO：5および43のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR1は、SEQ ID NO：6および52のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2は、SEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3は、SEQ ID NO：8および53のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1、前記HCDR2、前記HCDR3、前記LCDR1、前記LCDR2および前記LCDR3はそれぞれ、SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8ミノ酸配列を順に含み得る。
いくつかの態様では、本願に記載の単離抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでいてもよく、前記HCDR1、前記HCDR2、前記HCDR3、前記LCDR1、前記LCDR2および前記LCDR3はそれぞれ、SEQ ID NO：3、42、43、52、７、53に示すアミノ酸配列を順に含み得る。
本願では、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：55に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：64に示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:14のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO:111、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:13のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：54に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：63に示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:14のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO:111、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:13のいずれか一項に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：9に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：10に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：9に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：11に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：12に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：13に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：14に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：11に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：1に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：2に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：32に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：34に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：32に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：33に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に記載の単離抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含んでいてもよく、前記重鎖定常領域はヒトIgG1の定常領域に由来していてもよく、前記軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域に由来していてもよい。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：9に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：10に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は重鎖定常領域と軽鎖可変領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO：29に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、HB0030とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：9に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：11に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO：29に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、HB0031とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：12に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：13に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO：29に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、HB0032とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：14に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：11に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO：29に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、HB0033とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHはSEQ ID NO：1に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLはSEQ ID NO：2に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO：30に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、900424とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO：32に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLは、SEQ ID NO：34に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO：30に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域がSEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、900423とも呼ばれる。
例えば、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含んでいてもよく、前記VHは、SEQ ID NO：32に示すアミノ酸配列を含み得、前記VLは、SEQ ID NO：33に示すアミノ酸配列を含み得；および、前記単離抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含んでいてもよく、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO：30に示すアミノ酸配列を含み得、前記軽鎖定常領域がSEQ ID NO：31に示すアミノ酸配列を含み得る。前記単離抗原結合タンパク質は、900428とも呼ばれる。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、前記TIGITタンパク質との結合について参照抗体と競合することができ、前記参照抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得、前記参照抗体の前記重鎖可変領域がHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み得、前記HCDR1がSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR2は、SEQ ID NO：56に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3は、SEQ ID NO：57に示すアミノ酸配列を含み得、前記参照抗体の前記軽鎖可変領域は、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み得、前記LCDR1は、SEQ ID NO：65に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2は、SEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3は、SEQ ID NO：66に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記単離抗原結合タンパク質は、前記TIGITタンパク質との結合について参照抗体と競合することができ、前記参照抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得、前記参照抗体の前記重鎖可変領域がHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み得、前記HCDR1がSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR2は、SEQ ID NO：4に示すアミノ酸配列を含み得、前記HCDR3は、SEQ ID NO：5に示すアミノ酸配列を含み得、前記参照抗体の前記軽鎖可変領域は、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み得、前記LCDR1は、SEQ ID NO：6に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR2は、SEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み得、前記LCDR3は、SEQ ID NO：8に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願に係るタンパク質、ポリペプチドおよび/またはアミノ酸配列はまた、少なくとも以下の範囲を含むものと理解されるべきである：前記タンパク質またはポリペプチドと同一または類似の機能を有する変異体または同族体。
本願では、前記変異体は、前記タンパク質および/または前記ポリペプチド(例えば、本願に記載されている抗原結合タンパク質)のアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、）または追加されたタンパク質またはポリペプチドであってもよい。例えば、前記機能的変異体は、少なくとも1個、例えば1～30個、1～20個または1～10個、例えば1、2、3、4または5個のアミノ酸置換、欠失および／または挿入によるアミノ酸変化を既に有するタンパク質またはポリペプチドからなるものであってもよい。前記機能的変異体は、実質的に、変化する(置換、欠落、追加など)前の前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的特性を保持することができる。例えば、前記機能的変異体は、改変前の前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも60%、70%、80%、90%、または100% を維持していてもよい (例えば、抗原結合能力)。例えば、前記置換は、保守的な置換であってもよい。
本願では、前記抗原結合タンパク質のアミノ酸配列の一部は、特定種の抗体における対応するアミノ酸配列と相同であってもよいし、特定のクラスに属するものであってもよい。例えば、抗体の可変領域と定常領域の両方は、動物種（例えば、ヒト）の抗体の可変領域と定常領域の両方に由来してもよい。本願では、前記同族体は、前記タンパク質および/または前記ポリペプチド（例えば、本願に記載その単離抗原結合フラグメント）のアミノ酸配列と少なくとも約85%（例えば、少なくとも約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%以上）の配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。
本願では、相同性は一般的に2つ以上の配列間の類似性、類似性または関連性と定義される。「配列相同性率」は、マッチングする2つの配列を比較ウィンドウで比較し、両配列に同じ核酸塩基（例えばA、T、C、G、）または同じアミノ酸残基（例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Glyn、CysおよびMet）がある位置数を求め、一致した数の数を算出することができる。Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、Met）より、一致した位置の数を求め、その数を比較ウィンドウ内の全位置数（ウィンドウサイズ）で割り、100を乗じたものを配列相同率として算出した。配列相同性率を決定するための比較は、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野で知られている様々な方法で実施され得る。当業者は、比較される完全長配列範囲内または標的配列領域内で最大の比較を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を比較するための適切なパラメータを決定することができる。これらの相同性は、FASTAおよびBLASTの方法で測定することもできる。FASTAアルゴリズムの説明は、以下を参照されたい。R．PearsonおよびD．J．Lipman.「Improved tools for biological sequence comparison」、Proc.Natl．Acad．Sci．）、 85： 2444-2448、 1988；およびD.J．LipmanおよびW.R．Pearson 「Rapid and sensitive protein similarity searches」、Science、227：1435-1441、1989。BLASTアルゴリズムの説明は、以下を参照されたい。S.Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．MyersおよびDLipmanの'A basic local comparison (alignment) search tool'、Journal of Molecular Biology、215：403-410、1990。
本願に記載の抗原結合タンパク質（例えば、TIGIT抗体）は、TIGIT抗原を特異的に結合することが可能である。「特異的結合」 TIGIT抗原の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、通常、約1nMのKD値またはより高い親和性（例えば、1 nM、100 pM、10 pM、2 pMまたは1 pM）でTIGITに結合することができるが、TIGIT配列を欠く他のタンパク質には結合しない。例えば、「特異的結合」TIGITに対する抗体は、ヒトCD226、ヒトCD155、およびヒトCD112に結合しない。本願に記載の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、TIGIT抗原またはその標識体（例えば、蛍光標識TIGIT抗原）に特異的に結合し、TIGITエピトープを欠く他のタンパク質には結合しない。抗原結合タンパク質（例えば、抗体）がTIGIT抗原と結合するかどうかは、当該技術分野で知られている任意のアッセイを使用して決定することができる。結合親和性を決定するための当技術分野で既知のアッセイの例には、表面プラズモン共鳴（例えば、BIACORE）または類似の技術（例えば、KinExaまたはOCTET）が含まれる。いくつかの態様では、本願に記載のTIGIT抗体は、サルおよび／またはマウスのTIGITとも交差反応することができる。例えば、フロー分析技術や酵素結合免疫測定法などで検出される。本出願では、「交差反応性」とは、抗体が他の生物種由来の相同タンパク質と反応する能力を指す。
本願に記載の抗原結合タンパク質（例えば、TIGIT抗体）は、TIGITのCD155リガンドへの結合を阻害するものである。阻害試験は、例えば、前記抗原結合タンパク質（例えば、TIGIT抗体）と抗原（または、抗原を発現し得る細胞）および抗原のリガンド（または、リガンドを発現する細胞）とを混合し、抗原結合タンパク質が抗原のリガンドと競合的に結合する能力を検出マーカーの強度（例えば、蛍光強度または濃度）に基づき反応させる競合アッセイを用いて実施可能である。例えば、本願に記載の抗原結合タンパク質（例えば、TIGIT抗体）によるTIGIT抗原とCD155リガンドの結合を阻害するためのIC50は、フローサイトメトリーを用いて検出した場合、約0.1μg/ml－0.05μg/mlである。
多重特異性抗体
別の態様では、TIGITタンパク質に特異的に結合することができる第1の標的部分を含み得る多重特異性抗体を提供する。本願では、前記多重特異性抗体の前記第1の標的部分は本願の前記単離抗原結合タンパク質を含み得る。
別の態様では、TIGITタンパク質に特異的に結合することができる第1の標的部分を含み得る多重特異性抗体を提供する。本願では、前記多重特異性抗体の前記第1の標的部分は本願の前記単離抗原結合タンパク質を含み得る。
いくつかの態様では、前記多重特異性抗体はさらに、第2の標的部分を含み得る。例えば、前記第2の標的部分は腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる。さらに、例えば、前記第2の標的部分はPD-L1とPD-1との相互作用を阻害することができる。さらに、例えば、前記第2の標的部分はPD-L1タンパク質に特異的に結合することができる。さらに、例えば、前記PD-L1タンパク質に結合することができる第2の標的部分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。さらに、例えば、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗原結合フラグメントはFab、Fab’、Fvフラグメント、F(ab’)2、scFv、di-scFvおよび/またはdAbを含む。さらに、例えば、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体から選ばれる。
本願では、前記多重特異性抗体の第2の標的部分はPD-L1タンパク質に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、HCDR3を含み得、例えば前記HCDR3はSEQ ID NO:102に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、HCDR2を含み得、例えば前記HCDR2はSEQ ID NO:101に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、HCDR1を含み得、例えば前記HCDR1はSEQ ID NO:100に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み得、例えば、前記HCDR1、HCDR2およびHCDR3はそれぞれSEQ ID NO:100、101および102に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、VHを含み得、例えば前記VHはSEQ ID NO:106または108に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、LCDR3を含み得、例えば前記LCDR3はSEQ ID NO:105に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、LCDR2を含み得、例えば前記LCDR2はSEQ ID NO:104に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、LCDR1を含み得、例えば前記LCDR1はSEQ ID NO:103に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はLCDR1、LCDR2およびLCDR3含み得、例えば、前記LCDR1、LCDR2およびLCDR3はそれぞれSEQ ID NO:103、104および105に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体は、VLを含み得、例えば前記VLはSEQ ID NO:107または109に示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記多重特異性抗体は第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み得る。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記TIGITタンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび前記TIGITタンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み得、さらに前記第2のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含み得る。
いくつかの態様では、前記第1のポリペプチド鎖における前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成することができる。いくつかの態様では、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、C-ペプチドを介して、scFvを構成することができる。例えば、前記C-ペプチドは、SEQ ID NO:74-77のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。例えば、前記TIGITタンパク質に結合することができるscFvの配列はSEQ ID NO:97-99のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記第1のポリペプチド鎖において、前記TIGITタンパク質に結合することができるscFvは前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端またはC末端に位置し得る。
例えば、前記第1のポリペプチド鎖において、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端と、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結することができ、前記TIGITタンパク質に結合することができるVLのC末端と、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結することができる。
さらに、例えば、前記第1のポリペプチド鎖において、前記TIGITタンパク質に結合することができるVHのN末端と、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結することができ、前記TIGITタンパク質に結合することができるVHのC末端と、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結することができる。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は、定常領域、例えばヒトIgG定常領域を含んでいてもよく、前記ヒトIgG定常領域は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のscFvのN末端に位置し得る。本願では、前記ヒトIgG定常領域は、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に位置し得る。
いくつかの態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に直接または間接に連結するすることができ、例えば、C-ペプチドを介して連結することができる。いくつかの別の態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端に位置し得る。例えば、前記定常領域はSEQ ID NO:29または30に示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端に直接または間接に連結するすることができ、例えば、C-ペプチドを介して連結することができる。例えば、前記C-ペプチドは、SEQ ID NO:74-77のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記第1のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:85-87のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VHを含み得、さらに、前記第2のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VL、前記TIGITタンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記TIGITタンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み得る。
いくつかの態様では、前記第2のポリペプチド鎖における前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成する。いくつかの態様では、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、C-ペプチドを介して、scFvを構成する。
いくつかの態様では、前記第2のポリペプチド鎖において、前記TIGITタンパク質に結合することができるscFvは、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端またはC末端に位置し得る。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記PD-L1タンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記PD-L1タンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み、さらに、前記第2のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含む。
いくつかの態様では、前記第1のポリペプチド鎖における前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成する。いくつかの態様では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、C-ペプチドを介して、scFvを構成する。例えば、前記C-ペプチドは、SEQ ID NO:74-77のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。例えば、前記PD-L1タンパク質に結合することができるscFvの配列はSEQ ID NO:89-96のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記第1のポリペプチド鎖において、前記PD-L1タンパク質に結合することができるscFvは、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端またはC末端に位置し得る。
例えば、前記第1のポリペプチド鎖において、前記PD-L1タンパク質に結合することができるVLのN末端と、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体的VHのC末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結し、前記PD-L1タンパク質に結合することができるVLのC末端と、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結する。
さらに、例えば、前記第1のポリペプチド鎖において、前記PD-L1タンパク質に結合することができるVHのN末端と、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体的VHのC末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結し、前記PD-L1タンパク質に結合することができるVHのC末端と、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端とは、C-ペプチドを介して選択的に連結する。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は、ヒトIgG定常領域を含んでいてもよく、前記ヒトIgG定常領域は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のscFvのN末端に位置し得る。本願では、前記ヒトIgG定常領域は、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に位置し得る。例えば、前記定常領域はSEQ ID NO:29または30に示すアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に直接または間接に連結するすることができ、例えば、C-ペプチドを介して連結することができる。いくつかの別の態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのC末端、さらに、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端に位置し得る。
いくつかの態様では、前記ヒトIgG定常領域は、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端に直接または間接に連結するすることができ、例えば、C-ペプチドを介して連結することができる。例えば、前記C-ペプチドは、SEQ ID NO:74-77のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記第1のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:78-83のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み得る。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VHを含み得、さらに、前記第2のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VL、前記PD-L1タンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記PD-L1タンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み得る。
本願では、前記第1のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VHを含み得、さらに、前記第2のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VL、前記PD-L1タンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび、前記PD-L1タンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み得る。
いくつかの態様では、前記第2のポリペプチド鎖における前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成する。いくつかの態様では、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、リンカーを介して、scFvを構成する。
いくつかの態様では、前記第2のポリペプチド鎖において、前記PD-L1タンパク質に結合することができるscFvは、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端またはC末端に位置し得る。
本願では、前記TIGITタンパク質（またはPD-L1タンパク質）に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質（またはPD-L1タンパク質）に結合することができる抗体のVLとは、scFvの形成を容易にするために修飾され得、例えば、前記抗体の特異的な結合性および結合親和性に影響を与えることなく、アミノ酸変異を発生させることができる。例えば、ジスルフィド結合を形成するために、アミノ酸変異を発生させ、scFvの構造をより安定にすることができる。前記アミノ酸変異は当技術分野でよく見られるもので、例えば、骨格領域のアミノ酸変異、さらに、軽鎖可変領域の100番目のアミノ酸QがCに変異し、または重鎖可変領域の44番目のアミノ酸RまたはGがCに変異する。これらの変異前および変異ごのVH、VLも、本願の保護範囲内である。
例えば、本願では、前記多重特異性抗体は図7Aに示す構造を含み得る。ここで、前記第1のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:78-83のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含み、さらに、前記第2のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:84に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、本願では、前記多重特異性抗体は図7Bに示す構造を含み得る。ここで、前記第1のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:85-87のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含み、さらに、前記第2のポリペプチド鎖はSEQ ID NO:88に示すアミノ酸配列を含み得る。
核酸、ベクター、細胞
別の態様では、本願はまた、単離された1種または複数の核酸分子を提供する。前記1種または複数の核酸分子は、本願に記載の多重特異性抗体をコードすることができる。例えば、前記1つまたは複数の核酸分子の各々は、完全な前記多重特異性抗体もしくはその一部（例えば、第1の標的部分、第2の標的部分、HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、軽鎖または重鎖の1つまたは複数）をコードすることができる。
別の態様では、本願はまた、単離された1種または複数の核酸分子を提供する。前記1種または複数の核酸分子は、本願に記載の多重特異性抗体をコードすることができる。例えば、前記1つまたは複数の核酸分子の各々は、完全な前記多重特異性抗体もしくはその一部（例えば、第1の標的部分、第2の標的部分、HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、軽鎖または重鎖の1つまたは複数）をコードすることができる。
本願に記載の核酸分子は、単離され得る。例えば、（i）in vitro、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって、（ii）クローン組み換えによって、（iii）精製、例えば酵素消化およびゲル電気泳動による段階的分離によって、または（iv）合成、例えば化学合成によって製造または合成され得る。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は、組換えDNA技術によって調製された核酸分子である。
本願では、多重特異性抗体をコードする核酸は、制限フラグメント操作または合成オリゴヌクレオチドのオーバーラップ伸長PCRを視聴することを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々な方法によって調製することができ、詳細は、Sambrookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；およびAusubeら Current Protocols in Molecular Biology ，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993を参照されたい。
別の態様では、本願は、本願に記載の1種また複数の核酸分子を含む、1種また複数のベクターを提供する。各ベクターは、前記核酸分子を1種また複数を含み得る。また、前記ベクターは適切な宿主細胞において、適切な条件下で当該ベクターを選ぶマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含み得る。また、前記ベクターはコード領域が適切な宿主において正しく発現されることを可能にする発現制御要素を含み得る。そのような制御要素は本分野の技術者に周知であり、例えば、それらは、プロモータ、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子転写またはmRNA翻訳を調節する他の制御要素を含み得る。いくつかの実施形態では、前記発現制御配列は、調整可能な要素である。前記発現制御配列の特定の構造は、種または細胞タイプの機能によって異なり得るが、通常、TATA、キャッピング配列、CAAT配列などの転写および翻訳開始に関与する5 '非転写配列と5'および3 '非翻訳配列を含み得る。例えば、5’非転写発現制御配列はプロモータ領域を含み得、プロモータ領域は転写制御のための核酸に機能的に連結するプロモータ配列を含み得る。前記発現制御配列は、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列をさらに含み得る。本願では、好適なプロモータは、例えば、SP6、T3及びT7ポリメラーゼのプロモータ、ヒトU6RNAプロモータ、CMVプロモータ及びその人工異種プロモータ（例えばCMV）であって、そのプロモータの一部が他の細胞タンパク質（例えばヒトGAPDH、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素）遺伝子のプロモータの一部に融合してもよく、これらはさらにイントロンを含んでも含まなくてもよい。本願に記載の１種または複数の核酸分子は、発現制御要素に作動可能に連結することができる。前記ベクターは、例えば、プラスミド、粘菌、ウイルス、ファージ、または、例えば、遺伝子工学において通常使用される他のベクターから構成され得る。例えば、前記ベクターは、発現ベクトルである。
一方、本願は、本願は宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本願に記載の1つ以上の核酸分子および／または本願に記載の1つ以上のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、各種または各宿主細胞は本願に記載の1種または1つの核酸分子またはベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、各種または各宿主細胞は本願に記載の複数（例えば、2つ以上）または複数種類（例えば、2種類以上）の核酸分子またはベクターを含み得る。例えば、本願に記載のベクターは、前記宿主細胞、例えば、植物、菌類または酵母の細胞等の真核生物細胞に導入することができる。本願に記載のベクターは、電気穿孔、lipofectineトランスフェクション、lipofectaminトランスフェクションなどの当分野で知られている方法によって、前記宿主細胞に導入されてもよい。
製造方法
別の態様では、本願は、前記多重特異性抗体を調製する方法を提供する。前記方法は、前記多重特異性抗体が発現する条件下で、前記細胞を培養することを含み得る。これは、例えば、適切な培地、適切な温度およびインキュベーション時間などを用いることにより行うことができ、当業者には公知の方法である。
別の態様では、本願は、前記多重特異性抗体を調製する方法を提供する。前記方法は、前記多重特異性抗体が発現する条件下で、前記細胞を培養することを含み得る。これは、例えば、適切な培地、適切な温度およびインキュベーション時間などを用いることにより行うことができ、当業者には公知の方法である。
本願の抗ヒトTIGIT抗体を製造するための例示的な方法を実施例1に記載する。
ヒト化抗体は、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEを含む任意のタイプの免疫グロブリンから選択され得る。本願では、抗体はIgG抗体であり、IgG1アイソタイプを使用する。必要な定数構造ドメインの配列の最適化は、以下の実施例に記載の生物学的アッセイで抗体をスクリーニングし、所望の生物学的活性を得ることによって達成することができる。ここでも、どちらのクラスの軽鎖も、本明細書の化合物および方法に使用することができる。具体的には、κ、λ鎖またはその変異体が、本願の化合物および方法において利用可能である。
本願の抗ヒトTIGIT抗体をヒト化するための例示的な方法を、実施例2に記載する。
本願の多重特異性抗体またはそのフラグメントのDNA分子の配列は、PCRを用いた増幅やゲノムライブラリースクリーニングなどの従来技術によって、得ることができる。さらに、軽鎖と重鎖のコード配列を融合して、単鎖抗体を形成することもできる。
目的の配列が得られれば、組換え法によって大量に入手することができる。これは通常、ベクターにクローニングして細胞に移植し、増殖した宿主細胞から目的の配列を常法により単離することで行われる。
また、特にフラグメントの長さが短い場合には、人工合成により配列を合成することも可能である。多くの場合、非常に長いフラグメントは、いくつかの小さなフラグメントを合成し、それらをライゲーションすることで得ることができる。そして、この核酸分子は、当技術分野で知られている様々な既存のDNA分子（またはベクターなど）や細胞に導入することができる。
本願はまた、上記のような適当な核酸分子と適当なプロモータまたは制御配列とを含むベクターにも関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞を形質転換するために使用できる。宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞；あるいは酵母細胞などの下等真核細胞；あるいは哺乳類細胞などの高等真核細胞であってもよい例えば、動物細胞としては、CHO-S、CHO-K1、HEK-293細胞などを挙げることができる（ただし、これらに限定されるものではない）。
宿主細胞を組換えDNAで形質転換するための本願に記載のステップは、当技術分野でよく知られた技術で実施することができる。得られた形質転換体は、常法により培養することができ、その形質転換体は本願核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現する。使用する宿主細胞によっては、通常の培地を用いて適切な条件下で培養される。典型的には、形質転換された宿主細胞は、本願の多重特異性抗体の発現に適した条件下で培養される。次に、本願の多重特異性抗体は、プロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製ステップ、および当業者に知られている従来の分離および精製手段を使って精製することができる。
得られたモノクローナル抗体または多重特異性抗体は、通常の方法で同定することができる。例えば、モノクローナル抗体または多重特異性抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはin vitro結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリーソーティング（FACS）、ラジオイムノアッセイ（RIA）または酵素結合免疫吸着測定法（ELISA））により測定することができる。
医薬組成物
さらに、本願は組成物を提供する。いくつかの態様では、前記組成物は、本願の多重特異性抗体、および薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物であってよい。典型的には、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性ベクター媒体に調剤されてよい。調剤された医薬組成物は、従来の経路によって投与することができる。
さらに、本願は組成物を提供する。いくつかの態様では、前記組成物は、本願の多重特異性抗体、および薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物であってよい。典型的には、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性ベクター媒体に調剤されてよい。調剤された医薬組成物は、従来の経路によって投与することができる。
本願に記載の医薬組成物は、TIGITタンパク質分子またはPD-L1タンパク質分子に直接結合することができるため、TIGIT関連、PD-L1関連またはPD-1関連疾患の予防および治療に使用することができる。本願の医薬組成物は、安全かつ有効な量の、本願に記載された抗原結合タンパク質および薬学的に許容されるアジュバント（ベクターまたは賦形剤を含み得る）を含み得る。製剤は、投与形態に合わせる必要がある。
本願に記載の多重特異性抗体または医薬組成物は、良好な医療行為に合致した方法で調剤、投与、および使用することができる。この文脈で考慮すべきことは、治療される特定の状態、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、状態の病因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に知られている他の要因が含まれることである。
方法と用途
別の態様では、医薬品調製における前記多重特異性抗体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および/または前記医薬組成物の用途を提供する。前記医薬品は、TIGIT異常に関連する疾患などの疾患または病症の予防、寛解および/または治療に用いられる。いくつかの態様では、前記TIGIT異常に関連する疾患は、T細胞機能不全疾患であってもよい。T細胞の機能不全はT細胞の枯渇に反映され、NK細胞の増強とT細胞の活性化により、身体の免疫活性を高めて病気の治療や遅延、寛解を実現できる。例えば、前記TIGIT関連疾患は、腫瘍、癌または感染症であってもよい。例えば、前記TIGIT異常関連疾患は、CD155陽性またはPVR陽性の腫瘍、癌、免疫疾患または感染症であってもよく、中でも、腫瘍、癌、免疫疾患または感染症が挙げられる。いくつかの態様では、前記腫瘍は固形腫瘍または非固形腫瘍であってもよい。例えば、前記腫瘍は結腸癌であってもよい。
別の態様では、医薬品調製における前記多重特異性抗体、前記核酸分子、前記ベクター、前記細胞および/または前記医薬組成物の用途を提供する。前記医薬品は、TIGIT異常に関連する疾患などの疾患または病症の予防、寛解および/または治療に用いられる。いくつかの態様では、前記TIGIT異常に関連する疾患は、T細胞機能不全疾患であってもよい。T細胞の機能不全はT細胞の枯渇に反映され、NK細胞の増強とT細胞の活性化により、身体の免疫活性を高めて病気の治療や遅延、寛解を実現できる。例えば、前記TIGIT関連疾患は、腫瘍、癌または感染症であってもよい。例えば、前記TIGIT異常関連疾患は、CD155陽性またはPVR陽性の腫瘍、癌、免疫疾患または感染症であってもよく、中でも、腫瘍、癌、免疫疾患または感染症が挙げられる。いくつかの態様では、前記腫瘍は固形腫瘍または非固形腫瘍であってもよい。例えば、前記腫瘍は結腸癌であってもよい。
本願の抗原結合タンパク質は、腫瘍の成長を抑制し、および／または腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。いくつかの実施形態では、前記腫瘍は、大腸癌を含む。いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、TIGITの発現が異常な腫瘍または癌である。
例えば、大腸癌のマウスモデルにおいて、本願に記載の抗原結合タンパク質（例えば、TIGIT抗体）は、腫瘍の成長を遅らせることができる。
別の態様では、本願はさらに、前記多重特異性抗体を使用することを含む、CD155とTIGITとの結合を阻害する方法を提供する。
別の態様では、本願はさらに、前記多重特異性抗体を使用することを含む、PD-L1とPD-1との結合を阻害する方法を提供する。
以下の実施例は、理論に限定されることを意図するものではなく、本出願のタンパク質、調製方法、用途等を説明するためにのみ使用され、本願の範囲を限定するために使用されるものではない。以下の実施例では具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載されているような従来の条件、あるいはメーカーが推奨する条件に従っている。特に明記しない限り、割合と部数は重量割合と重量部数である。
実施例1 ヒトTIGITに対するマウスモノクローナル抗体-一次抗体の作製
1.1 マウス由来モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製
マウス由来のモノクローナル抗体の作製方法は、1975年にKohlerとMilsteinによって発明されたハイブリドーマ作製技術を用いた（Nature、1975、256：495-497）。ヒトTIGITのマウスFcタグタンパク質(ACRO、# tit-h5253)とフロイントアジュバントを乳化した後、BALB/c、CD1、C57BL/6の各系統に5匹ずつ皮下免疫を行った。3回の免疫後、血清を採取し、ELISAによる効力、FACSによる結合活性と機能活性を検査し、脾臓細胞とSP2/0骨髄腫細胞との融合に最適なマウスを選択した。ハイブリドーマポリクローナル細胞をHATでスクリーニングした後、ヒトTIGITと特異的に結合し、TIGIT-CD155結合を阻害できるポリクローナル細胞株をELISA法、FACS法で単クローン性をスクリーニングし、特異的に結合するモノクローン細胞株を再度ELISA、FACS法でスクリーニングして、サル、マウスTIGITとの結合性をテストしたところ TIGIT-CD155とTIGIT-CD122の結合を阻害するモノクローナル抗体のFACSスクリーニングを行い、その後、スクリーニングしたモノクローナル細胞株の細胞機能活性測定とアフィニティ（Biacore）スクリーニングを行って、配列解析用のヒトTIGIT抗体発現モノクローナルハイブリドーマ細胞株を得、スクリーニングデータを表1に示した。
1.1 マウス由来モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製
マウス由来のモノクローナル抗体の作製方法は、1975年にKohlerとMilsteinによって発明されたハイブリドーマ作製技術を用いた（Nature、1975、256：495-497）。ヒトTIGITのマウスFcタグタンパク質(ACRO、# tit-h5253)とフロイントアジュバントを乳化した後、BALB/c、CD1、C57BL/6の各系統に5匹ずつ皮下免疫を行った。3回の免疫後、血清を採取し、ELISAによる効力、FACSによる結合活性と機能活性を検査し、脾臓細胞とSP2/0骨髄腫細胞との融合に最適なマウスを選択した。ハイブリドーマポリクローナル細胞をHATでスクリーニングした後、ヒトTIGITと特異的に結合し、TIGIT-CD155結合を阻害できるポリクローナル細胞株をELISA法、FACS法で単クローン性をスクリーニングし、特異的に結合するモノクローン細胞株を再度ELISA、FACS法でスクリーニングして、サル、マウスTIGITとの結合性をテストしたところ TIGIT-CD155とTIGIT-CD122の結合を阻害するモノクローナル抗体のFACSスクリーニングを行い、その後、スクリーニングしたモノクローナル細胞株の細胞機能活性測定とアフィニティ（Biacore）スクリーニングを行って、配列解析用のヒトTIGIT抗体発現モノクローナルハイブリドーマ細胞株を得、スクリーニングデータを表1に示した。
ハイスループット・スクリーニングの結果、ヒトとサル両方の結合活性に高い親和性を持ち、TIGITの2つのリガンドであるCD155とCD122を同時に阻害し、生物学的活性を持つ最終モノクローナルハイブリドーマ細胞株を得ることに成功した。上記表1のハイブリドーマ細胞株は、ヒト化されたものである。
実施例2 抗TIGIT抗体の可変領域遺伝子配列のクローニングとヒト化
2.1 ハイブリドーマ細胞における抗体可変領域遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ細胞株が発現するマウス抗体の可変領域のcDNA配列は、TAKARAの5'RACE技術の原理に基づいてクローニングされた。簡単に説明すると、SMARTer 5' RACE合成実験キット（TAKARA、#634859）を用いて、説明書に従って、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子特異的cDNAを合成した。cDNA配列の5'および3'末端をPCRプライマーで修飾した。前記プライマーは、重鎖および軽鎖可変領域cDNAにそれぞれ適切なリード配列を付加するように設計されており、得られたPCR産物を既存の組み換え抗体発現重鎖ベクターpHB-Fcおよび軽鎖ベクターpHB-Cκにシームレスにクローニングすることを可能にするものである。pHB-Fc 発現ベクターは、抗体ADCCノックアウト（KO）効果を有するCH2上のL234AおよびL235A（Euエンコード）変異を有するヒトIgG1重鎖定常領域の遺伝子配列を含み、 pHB-Cκ ベクターは、ヒトκ軽鎖定常領域の遺伝子配列を含む。重鎖および軽鎖可変領域PCR増幅産物をIn-fusionクローニング試薬（TAKARA、#639650）により発現ベクターにクローニングし、大腸菌DH5α受容体細胞（YB Biotech、# FYE607-80VL）に形質転換させた。モノクローナルコロニーはサンガーシークエンス用に選択され、抗体可変領域配列を得るために分析された。B3/29F6が発現する抗TIGIT抗体の可変領域の配列は以下の通りであった。
2.1 ハイブリドーマ細胞における抗体可変領域遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ細胞株が発現するマウス抗体の可変領域のcDNA配列は、TAKARAの5'RACE技術の原理に基づいてクローニングされた。簡単に説明すると、SMARTer 5' RACE合成実験キット（TAKARA、#634859）を用いて、説明書に従って、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子特異的cDNAを合成した。cDNA配列の5'および3'末端をPCRプライマーで修飾した。前記プライマーは、重鎖および軽鎖可変領域cDNAにそれぞれ適切なリード配列を付加するように設計されており、得られたPCR産物を既存の組み換え抗体発現重鎖ベクターpHB-Fcおよび軽鎖ベクターpHB-Cκにシームレスにクローニングすることを可能にするものである。pHB-Fc 発現ベクターは、抗体ADCCノックアウト（KO）効果を有するCH2上のL234AおよびL235A（Euエンコード）変異を有するヒトIgG1重鎖定常領域の遺伝子配列を含み、 pHB-Cκ ベクターは、ヒトκ軽鎖定常領域の遺伝子配列を含む。重鎖および軽鎖可変領域PCR増幅産物をIn-fusionクローニング試薬（TAKARA、#639650）により発現ベクターにクローニングし、大腸菌DH5α受容体細胞（YB Biotech、# FYE607-80VL）に形質転換させた。モノクローナルコロニーはサンガーシークエンス用に選択され、抗体可変領域配列を得るために分析された。B3/29F6が発現する抗TIGIT抗体の可変領域の配列は以下の通りであった。
B3/29F6 VH SEQ ID NO:1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
B3/29F6 VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
下線部がCDRs（IMGTで定義されたもの、配列はそれぞれ以下の通り）。
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
B3/29F6 VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
下線部がCDRs（IMGTで定義されたもの、配列はそれぞれ以下の通り）。
2.2 IgG1 野生型キメラ発現ベクターの構築
IgG1野生型キメラ抗体とADCC KOキメラ抗体は同じ軽鎖ベクターを共有しており、違いはヒト重鎖定常領域配列を含むベクター上の重鎖CH2のアミノ酸234と235で、ADCC KO型はA234/A235、野生型はL234/L235である。IgG1野生型キメラ重鎖発現ベクターは、2.1に記載した方法と同様にして構築する。すなわち、重鎖可変領域遺伝子をリード配列を含むプライマーでPCRにより増幅し、ヒト重鎖定常領域配列（CH2 L234/L235） を含むベクターにシームレスライゲーション法によりクローニングし、IgG1野生型キメラ発現ベクターの構築を完成させた。
IgG1野生型キメラ抗体とADCC KOキメラ抗体は同じ軽鎖ベクターを共有しており、違いはヒト重鎖定常領域配列を含むベクター上の重鎖CH2のアミノ酸234と235で、ADCC KO型はA234/A235、野生型はL234/L235である。IgG1野生型キメラ重鎖発現ベクターは、2.1に記載した方法と同様にして構築する。すなわち、重鎖可変領域遺伝子をリード配列を含むプライマーでPCRにより増幅し、ヒト重鎖定常領域配列（CH2 L234/L235） を含むベクターにシームレスライゲーション法によりクローニングし、IgG1野生型キメラ発現ベクターの構築を完成させた。
2.3 キメラ抗体の発現
2.1および2.2で得られた発現ベクターを大腸菌で増幅し、エンドトキシン除去プラスミド抽出キット（TianJian Biotech、＃DP117）を用いて、キメラ抗体の一過性トランスフェクションに十分なプラスミドを調製した。発現に用いた宿主細胞は、CHO-S細胞（Thermo Fisher、 # R80007）である。CHO-S細胞は、別々に調製した2種類の重鎖ベクターと軽鎖ベクターを、ポリエーテルイミド（PEI、ポリサイエンス、# 24765-1）と混合してリポソーム複合体を形成し、インキュベーター内で5～7日間培養してトランスフェクションを行った。細胞培養上清を遠心分離で回収し、プロテインAアフィニティクロマトカラムで精製し、ADCC KO型ヒトマウスキメラ抗体（番号900424）とIgG1野生型ヒトマウスキメラ抗体（タンパク質番号900445）を取得した。
2.1および2.2で得られた発現ベクターを大腸菌で増幅し、エンドトキシン除去プラスミド抽出キット（TianJian Biotech、＃DP117）を用いて、キメラ抗体の一過性トランスフェクションに十分なプラスミドを調製した。発現に用いた宿主細胞は、CHO-S細胞（Thermo Fisher、 # R80007）である。CHO-S細胞は、別々に調製した2種類の重鎖ベクターと軽鎖ベクターを、ポリエーテルイミド（PEI、ポリサイエンス、# 24765-1）と混合してリポソーム複合体を形成し、インキュベーター内で5～7日間培養してトランスフェクションを行った。細胞培養上清を遠心分離で回収し、プロテインAアフィニティクロマトカラムで精製し、ADCC KO型ヒトマウスキメラ抗体（番号900424）とIgG1野生型ヒトマウスキメラ抗体（タンパク質番号900445）を取得した。
上記方法に従って、得られたキメラ抗体VHおよびVHのそれぞれの配列は以下の通りである：
900423および900428 VH SEQ ID NO：32
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGAPRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLSFVTTEDTATYYCASLGTDYYAMDYWGQGTSVIVSS
900424 VH SEQ ID NO:1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
900424 VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
900423 VL SEQ ID NO:34
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFIGRGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK
900428 VL SEQ ID NO:33
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFTGRGSGTDFTFTINSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK。
900423および900428 VH SEQ ID NO：32
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGAPRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLSFVTTEDTATYYCASLGTDYYAMDYWGQGTSVIVSS
900424 VH SEQ ID NO:1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
900424 VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
900423 VL SEQ ID NO:34
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFIGRGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK
900428 VL SEQ ID NO:33
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFTGRGSGTDFTFTINSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK。
ここで、900424、900423および900428の重鎖定常領域のアミノ酸配列はすべてSEQ ID NO:30に示す。軽鎖定常領域は、すべてヒトκ軽鎖定常領域（SEQ ID NO：31）である。
2.4 マウス由来抗ヒトTIGIT抗体のヒト化－ヒト化抗体の調製法
抗体のヒト化には、以下の方法を用いた。抗体の可変領域の配列をNCBI IgBlastデータベースの利用可能な配列と比較し、その上にCDRグラフト重・軽鎖を構築するのに適したヒト由来のコンフォメーション領域（FR領域）を同定・解析することでようやく同定することができた。
抗体のヒト化には、以下の方法を用いた。抗体の可変領域の配列をNCBI IgBlastデータベースの利用可能な配列と比較し、その上にCDRグラフト重・軽鎖を構築するのに適したヒト由来のコンフォメーション領域（FR領域）を同定・解析することでようやく同定することができた。
修飾は、ヒト抗体のFR領域の保存アミノ酸残基と重要アミノ酸残基に従って修飾部位を設計し、キメラ抗体の重鎖と軽鎖の可変領域に対してそれぞれヒト化変異を設計し、PCR技術を用いてヒト化点変異抗体発現プラスミドを増幅して構築した。このヒト化点変異型抗体発現プラスミドをCHO-S細胞で発現させ、精製してヒト化抗体タンパク質を得た。ELISA、Biacoreおよびフローサイトメトリーアッセイを用いて、受容体結合能、機能阻害活性およびADCC効果をスクリーニングし、優れた性能を有する4種類のヒト化抗TIGIT抗体を得た。
得られたヒト化抗 TIGIT 抗体のVHおよびVL配列を以下に示す：
900461および900464 VH SEQ ID NO：9
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKGLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900461 VL SEQ ID NO:10
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900464および900476 VL SEQ ID NO：11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTALAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900466 VH SEQ ID NO:12
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900466 VL SEQ ID NO:13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900476VH SEQ ID NO:14
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGNKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS。
900461および900464 VH SEQ ID NO：9
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKGLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900461 VL SEQ ID NO:10
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900464および900476 VL SEQ ID NO：11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTALAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900466 VH SEQ ID NO:12
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900466 VL SEQ ID NO:13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900476VH SEQ ID NO:14
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGNKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS。
ここで、下線部はCDRs（IMGTで定義）、900461、900464、900466および900476はそれぞれ品番HB0030、HB0031、HB0032およびHB0033に対する4つのヒト化抗体タンパク質番号である。
ここで、HB0030、HB0031、HB0032およびHB0033の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、全てSEQ ID NO:29に示し、軽鎖定常領域はすべてヒト人κ軽鎖定常領域（SEQ ID NO:31）である。
実施例3 キメラ抗体とヒト化抗体のアッセイ
3.1 ヒトTIGITを発現している細胞に対するTIGIT抗体の結合活性測定
キメラ抗体900324、900423、900424、900428、ヒト化抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033をヒトTIGIT（CHOK1-huTIGIT-2A3、Haber Bio）を発現する細胞に対する結合活性についてアッセイした。
3.1 ヒトTIGITを発現している細胞に対するTIGIT抗体の結合活性測定
キメラ抗体900324、900423、900424、900428、ヒト化抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033をヒトTIGIT（CHOK1-huTIGIT-2A3、Haber Bio）を発現する細胞に対する結合活性についてアッセイした。
全てのキメラ抗体とヒト化抗体を、1％BSAを含むPBS溶液（1％BSA/PBS）で20μg/mlに希釈し、96ウェルUプレートに1ウェルあたり20μL添加し、陰性対照（1％BSA/PBSのみ）を同時に設定した。対数増殖期のヒトTIGIT発現細胞（CHOK1-huTIGIT-2A3、 Huabo Bio）の懸濁液を採取し、遠心分離（1000rpm×5min）により培養液を捨て、1％BSA/PBSで生細胞密度1×106/mLに再懸濁し、96ウェルUプレートに抗TIGIT抗体とともに1ウェル当たり20μL（2×104細胞）、30分間室温にて添加した。96-ウェルU-プレートを1% BSA/PBSで再懸濁し、遠心分離（300g×3min）して上層を捨て、1回洗浄後、PE-シープアンチヒト-Fc (Jackson ImmunoResearch、#109-115-098) 1：200 希釈を加え、遮光し室温で15分反応させた。 96-ウェルUプレートを1% BSA/PBSで再懸濁し、遠心分離（300g×3min）して上層を捨て、この方法で3回洗浄し、最後に1ウェルあたり100μLの1% BSA/PBSで再懸濁し、PEチャンネルの蛍光強度をフローサイトメーターで測定した（BD、#Canto II）。
キメラ抗体結合生存率の結果を図1および表3に、ヒト化抗体結合生存率の結果を図2および表4に示すが、900324は特許出願WO2015009856A2における抗体10A7と軽鎖および重鎖の可変領域の配列が同じであるGenentech社の抗ヒトTIGIT抗体チラゴルマブをCHO細胞に一過的に発現させたものである。その結果、キメラ抗体、ヒト化抗体ともに、ヒトTIGIT（CHOK1-huTIGIT-2A3、Haber Bio社）を発現する細胞に対して良好で同等の親和性を有していることが確認された。
3.2 TIGIT抗原とTIGIT分子との結合に対するTIGIT抗体の阻害を測定する試験（競合法）
抗原huCD155-moFc（ACROBiosystems、#CD5-H5254）を1%BSAを含むPBS溶液で40μg/mlに希釈し、96ウェルUプレートに各ウェル10μLを加え、容量比1：1で連続希釈した抗TIGIT抗体とよく混ぜ、陽性対照も同時に設定した（CD155-moFcを加えたのみ）。対数増殖期のヒトTIGIT発現細胞（CHOK1-huTIGIT-2A3、 Huabo Bio）の懸濁液を遠心分離（1000rpm×5min）で除去し、培養液を1％BSA/PBSで生細胞密度1×106/mLに再懸濁し、96ウェルUプレートに20μL（2×104細胞）/ウェル加え、室温で30分CD155-moFcと抗TIGIT抗体と混合し、培養を継続した。96-ウェルUプレートを1% BSA/PBSで再懸濁し、遠心分離（300g×3min）して上層を捨て、1回洗浄後、Alexa488-gat anti-mouse-Fc (Jackson ImmunoResearch、#115-545-071) 1：300 希釈品を加え、遮光し室温で15分反応させた。U-wellプレートに1% BSA/PBSを加えて再懸濁し、遠心分離（300g×3min）で上層を捨て、この方法で3回洗浄し、最後に1 wellあたり100μLの 1% BSA/PBS を加えて再懸濁し、FITC チャンネルの蛍光強度をフローサイトメトリー（BD、#Canto II）により測定を行った。
抗原huCD155-moFc（ACROBiosystems、#CD5-H5254）を1%BSAを含むPBS溶液で40μg/mlに希釈し、96ウェルUプレートに各ウェル10μLを加え、容量比1：1で連続希釈した抗TIGIT抗体とよく混ぜ、陽性対照も同時に設定した（CD155-moFcを加えたのみ）。対数増殖期のヒトTIGIT発現細胞（CHOK1-huTIGIT-2A3、 Huabo Bio）の懸濁液を遠心分離（1000rpm×5min）で除去し、培養液を1％BSA/PBSで生細胞密度1×106/mLに再懸濁し、96ウェルUプレートに20μL（2×104細胞）/ウェル加え、室温で30分CD155-moFcと抗TIGIT抗体と混合し、培養を継続した。96-ウェルUプレートを1% BSA/PBSで再懸濁し、遠心分離（300g×3min）して上層を捨て、1回洗浄後、Alexa488-gat anti-mouse-Fc (Jackson ImmunoResearch、#115-545-071) 1：300 希釈品を加え、遮光し室温で15分反応させた。U-wellプレートに1% BSA/PBSを加えて再懸濁し、遠心分離（300g×3min）で上層を捨て、この方法で3回洗浄し、最後に1 wellあたり100μLの 1% BSA/PBS を加えて再懸濁し、FITC チャンネルの蛍光強度をフローサイトメトリー（BD、#Canto II）により測定を行った。
キメラ抗体結合活性の結果を図3および表5に、ヒト化抗体結合活性の結果を図4および表6に示す。その結果、キメラ抗体とヒト化抗体は、ヒトCD155に対して同等の阻害力を持ち、有意な阻害効果を示すことが明らかになった。
3.3 ヒト化モノクローナル抗体の親和性試験
本試験では、SPR法を用いて抗原抗体結合の動態と親和性を測定した。BIOCORE（GE社製、#Biacore 8K）を使用した。Sereis S Sensor Chip ProteinA chip（GE, #29-1275-56）を室温で20～30分平衡化し、チップを装置にセットした。抗体試料を平衡化バッファで実験作業濃度に希釈し、2～8℃で密封保存した。抗原であるヒスチジンタグ（His-Tag）ヒトTIGITタンパク質（huTIGIT、アクロバイオシステムズ、#TIT-H52H3）を平衡化バッファHBS-EP（10x）（GE、#BR-1006-69）で希釈し、希釈抗原は20nMから2.5倍希釈で濃度勾配を5回、ゼロ濃度を2回（すなわち平衡化バッファー）と最低濃度レプリケートを設定した。チップの再生にはpH1.5のグリシン溶液（GE、#BR100354）を使用した。サンプルは捕獲法マルチサイクル・キネティックプログラムを用いて解析し、有意な参照結合がないことを確認した上で、対応する解析プログラムを選択し、1：1結合モデルであるKineticsを選択して解析に適合させ、サンプルのキネティックパラメータを求めた。
本試験では、SPR法を用いて抗原抗体結合の動態と親和性を測定した。BIOCORE（GE社製、#Biacore 8K）を使用した。Sereis S Sensor Chip ProteinA chip（GE, #29-1275-56）を室温で20～30分平衡化し、チップを装置にセットした。抗体試料を平衡化バッファで実験作業濃度に希釈し、2～8℃で密封保存した。抗原であるヒスチジンタグ（His-Tag）ヒトTIGITタンパク質（huTIGIT、アクロバイオシステムズ、#TIT-H52H3）を平衡化バッファHBS-EP（10x）（GE、#BR-1006-69）で希釈し、希釈抗原は20nMから2.5倍希釈で濃度勾配を5回、ゼロ濃度を2回（すなわち平衡化バッファー）と最低濃度レプリケートを設定した。チップの再生にはpH1.5のグリシン溶液（GE、#BR100354）を使用した。サンプルは捕獲法マルチサイクル・キネティックプログラムを用いて解析し、有意な参照結合がないことを確認した上で、対応する解析プログラムを選択し、1：1結合モデルであるKineticsを選択して解析に適合させ、サンプルのキネティックパラメータを求めた。
アッセイ結果は、表７に示す通りである。huTIGITによる親和定数（KD（M））の結果より、本願のヒト化モノクローナル抗体HB0030は10-11桁に近い親和性を有し、極めて強い親和性を有することが示された。
実施例4 動物におけるin vivo有効性試験
この実験では、CT26.WT結腸癌モデルを皮下接種した免疫検出部位ヒト化マウスBALB/c-hPD1/hTIGITにおいて、抗ヒトTIGIT抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033の効果を調べた。
この実験では、CT26.WT結腸癌モデルを皮下接種した免疫検出部位ヒト化マウスBALB/c-hPD1/hTIGITにおいて、抗ヒトTIGIT抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033の効果を調べた。
この実験では、マウスの結腸がん細胞CT26.WT細胞を採取し、対数成長期のCT26.WT細胞を集め、培養液を除去してPBSで2回洗浄した後に接種した（CT26.WT細胞生存率は、担癌前、担癌後それぞれ98.57%および98.28%）。接種量は、5×105/100μL/匹。接種後11日目に平均腫瘍体積が94.02 mm3に達した時点で、腫瘍体積に応じてマウスをランダムにグループ分けし、各グループに8匹のマウスを配置した。グルーピングはその日をD0日と定義し、D0、D3、D7、D10、D14、D17に投与し、投与開始後、D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23で腫瘍の大きさを観測し、マウスの体重を量った。腫瘍体積計算方法：腫瘍体積（mm3）= 0.5×腫瘍長径×腫瘍短径2）。結果を図5に示す通りである。
図5の実験結果を観察すると、本願の抗TIGITヒト化モノクローナル抗体HB0030、HB0031、HB0032およびHB0033は、10mg／kgを単独投与した場合、有意な腫瘍抑制効果を有することが明らかである。
さらに、CT26.WT大腸がんモデルを皮下接種した免疫検出部位ヒト化マウスBALB/c-hPD1/hTIGITにおいて、HB0030と対照抗体チラゴルマブの10 mg/kg投与時の有効性を検討した。
さらに、CT26.WT大腸がんモデルを皮下接種した免疫検出部位ヒト化マウスBALB/c-hPD1/hTIGITにおいて、HB0030と対照抗体チラゴルマブの10 mg/kg投与時の有効性を検討した。
本実験では、対数増殖期のマウス大腸がん細胞からCT26細胞を採取し、培養液を除去してPBSで2回洗浄した後、5×105/100μL/個で接種した（担癌前後のCT26細胞の生存率はそれぞれ98.51%、97.250%である）。 接種後12日目に平均腫瘍体積が80.33 mm3に達した時点で、マウスを腫瘍の体積に応じてランダムにグルーピングし、各群に6匹のマウスを設定した。グルーピングはその日をD0日と定義し、D0、D3、D7、D10、D14、D17に投与し、投与開始後、D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23で腫瘍の大きさを観測し、マウスの体重を量った。腫瘍体積計算方法：腫瘍体積（mm3）= 0.5×腫瘍長径×腫瘍短径2）。結果を図6に示す通りである。
図6の結果を観察すると、本願の抗TIGIT抗体HB0030は、対照抗体チラゴルマブと比較して、より優れた腫瘍抑制効果が示された。
本試験では、接種後24日目に投与したマウスの全群で、体重に大きな変化は見られなかった。
実施例5 二重特異性抗体の重鎖および軽鎖の配列設計
HB0030を使用してPDL1-TIGIT二重特異性抗体、二重抗体の構造モードを構築するのは、Morrisonモード（IgG-scFv）に属し、即ち、IgG抗体の2つの重鎖のC末端にすべてもう1つの抗体のscFvフラグメントを連結するもので、その構造は図7A-7Bに示す。ここで、異なる抗体の形態を区別するために、TIGITが完全なIgGで、PD-L1がscFvの場合、この形態の二重特異性抗体はTIGIT-IgG-PD-L1-scFvと呼ばれ、その重鎖および軽鎖の主な構成設計は以下の表8の通りであり、PD-L1が完全なIgGで、TIGITがscFvの場合、この形態の二重特異性抗体はPD-L1-IgG-TIGIT-scFv と呼ばれ、その重鎖および軽鎖の主な構成設計は以下の表9の通りである。
HB0030を使用してPDL1-TIGIT二重特異性抗体、二重抗体の構造モードを構築するのは、Morrisonモード（IgG-scFv）に属し、即ち、IgG抗体の2つの重鎖のC末端にすべてもう1つの抗体のscFvフラグメントを連結するもので、その構造は図7A-7Bに示す。ここで、異なる抗体の形態を区別するために、TIGITが完全なIgGで、PD-L1がscFvの場合、この形態の二重特異性抗体はTIGIT-IgG-PD-L1-scFvと呼ばれ、その重鎖および軽鎖の主な構成設計は以下の表8の通りであり、PD-L1が完全なIgGで、TIGITがscFvの場合、この形態の二重特異性抗体はPD-L1-IgG-TIGIT-scFv と呼ばれ、その重鎖および軽鎖の主な構成設計は以下の表9の通りである。
表8および表9では、
１：900339抗体の配列は特許WO2020199860A1のタンパク質900339に由来する。900339-VLとは、900339の軽鎖可変領域を、900339-VHとは、900339の重鎖可変領域を指す。HB0030-VLとは、HB0030の軽鎖可変領域を、HB0030-VHとは、HB0030の重鎖可変領域を指す。
2：Q100Cとは、kabatの抗体ナンバリング規則に基づき、軽鎖可変領域の100番目のアミノ酸QをCに変異することを指し、R44CまたはG44Cとは、kabatの抗体ナンバリング規則に基づき、重鎖可変領域の44番目のアミノ酸RまたはGをCに変異することを指す。これら2つのアミノ酸の変異後、ジスルフィド結合が形成され、scFv領域の安定性を高め、二重抗体の創薬可能性を高められる。
3：Linker1のアミノ酸配列：(G4S)3（SEQ ID NO：74）、Linker2のアミノ酸配列：(G4S)4（SEQ ID NO：75）、Linker3のアミノ酸配列：(G4S)5（SEQ ID NO：76）、Linker4のアミノ酸配列：(G4S)6（SEQ ID NO：77）。
１：900339抗体の配列は特許WO2020199860A1のタンパク質900339に由来する。900339-VLとは、900339の軽鎖可変領域を、900339-VHとは、900339の重鎖可変領域を指す。HB0030-VLとは、HB0030の軽鎖可変領域を、HB0030-VHとは、HB0030の重鎖可変領域を指す。
2：Q100Cとは、kabatの抗体ナンバリング規則に基づき、軽鎖可変領域の100番目のアミノ酸QをCに変異することを指し、R44CまたはG44Cとは、kabatの抗体ナンバリング規則に基づき、重鎖可変領域の44番目のアミノ酸RまたはGをCに変異することを指す。これら2つのアミノ酸の変異後、ジスルフィド結合が形成され、scFv領域の安定性を高め、二重抗体の創薬可能性を高められる。
3：Linker1のアミノ酸配列：(G4S)3（SEQ ID NO：74）、Linker2のアミノ酸配列：(G4S)4（SEQ ID NO：75）、Linker3のアミノ酸配列：(G4S)5（SEQ ID NO：76）、Linker4のアミノ酸配列：(G4S)6（SEQ ID NO：77）。
実施例6 二重特異性抗体の発現および精製
実施例5で得られた発現ベクターを大腸菌で増幅し、エンドトキシン除去プラスミド抽出キット（TianJian Biotech、# DP117）を用いて、二重特異性抗体を発現するための一過性トランスフェクションに十分なプラスミドを調製した。発現に用いた宿主細胞は、CHO-S細胞（Thermo Fisher、 # R80007）である。CHO-S細胞は、別々に調製した2種類の重鎖ベクターと軽鎖ベクターを、ポリエーテルイミド（PEI、ポリサイエンス、# 24765-1）と混合してリポソーム複合体を形成し、インキュベーター内で5～7日間培養してトランスフェクションを行った。細胞培養上清を遠心分離で回収し、プロテインAアフィニティクロマトカラムで精製し、一連の二重特異性抗体を得、さらに、タンパク質の凝集状況を分子篩クロマトグラフィーによって判断した。
実施例5で得られた発現ベクターを大腸菌で増幅し、エンドトキシン除去プラスミド抽出キット（TianJian Biotech、# DP117）を用いて、二重特異性抗体を発現するための一過性トランスフェクションに十分なプラスミドを調製した。発現に用いた宿主細胞は、CHO-S細胞（Thermo Fisher、 # R80007）である。CHO-S細胞は、別々に調製した2種類の重鎖ベクターと軽鎖ベクターを、ポリエーテルイミド（PEI、ポリサイエンス、# 24765-1）と混合してリポソーム複合体を形成し、インキュベーター内で5～7日間培養してトランスフェクションを行った。細胞培養上清を遠心分離で回収し、プロテインAアフィニティクロマトカラムで精製し、一連の二重特異性抗体を得、さらに、タンパク質の凝集状況を分子篩クロマトグラフィーによって判断した。
二重特異性抗体の発現、精製および測定状況は図8、図9および表10に示す。測定結果によると、TIGIT-IgG-PD-L1-scFv形態の二重特異性抗体にとって、900683のSEC純度がよく、PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体にとって、900693のSEC純度がよい。還元および非還元SDS-PAGE図によると、TIGIT-IgG-PD-L1-scFv形態の二重特異性抗体でも、PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体でも、明らかに分解されていないので、タンパク質の安定性がよいことが示唆された。
実施例7 二重特異性抗体の動態パラメータの測定
本試験は、SPR法でPDL1-TIGIT二重特異性抗体、PDL1親モノクローナル抗体900339、TIGIT親モノクローナル抗体HB0030と抗原との結合動態および親和性を測定した。
本試験は、SPR法でPDL1-TIGIT二重特異性抗体、PDL1親モノクローナル抗体900339、TIGIT親モノクローナル抗体HB0030と抗原との結合動態および親和性を測定した。
試験方法は下記の通り。
Human Antibody Captrue Kit（GE、#BR-1008-39）およびアミノ基カップリングキット（GE、BR-1000-50）のカップリング法でAnti-Human Capture-CM5チップ（GE、#BR-1005-30）を準備した。チップを室温で20～30分間平衡化し、Biacore 8K装置にセットした。抗原と抗体を平衡緩衝液で試験動作濃度まで希釈した。抗原を平衡緩衝液で50nMに希釈し、さらに3倍の希釈度で7つの濃度勾配に希釈し、2つのゼロ濃度（即ち、平衡緩衝液）および1つの繰り返し濃度（一般に最低濃度繰り返し）を設定した。抗体、抗原、再生の順序で、10の抗原濃度（2つのゼロ濃度、7つの勾配濃度および1つの繰り返し濃度）で繰り返して試験解析を行い、抗原注入流量は30μL/分、結合時間は120秒、解離時間は600秒とした。解析完了後に、対応する分析プログラムでデータを解析し、明らかなreference bindingがないことを確認し、Kinetics、1:1 binding model、曲線当てはめで二重特異性抗体および親モノクローナル抗体の動態関連パラメータであるKa、KdおよびKD値を得た。
Human Antibody Captrue Kit（GE、#BR-1008-39）およびアミノ基カップリングキット（GE、BR-1000-50）のカップリング法でAnti-Human Capture-CM5チップ（GE、#BR-1005-30）を準備した。チップを室温で20～30分間平衡化し、Biacore 8K装置にセットした。抗原と抗体を平衡緩衝液で試験動作濃度まで希釈した。抗原を平衡緩衝液で50nMに希釈し、さらに3倍の希釈度で7つの濃度勾配に希釈し、2つのゼロ濃度（即ち、平衡緩衝液）および1つの繰り返し濃度（一般に最低濃度繰り返し）を設定した。抗体、抗原、再生の順序で、10の抗原濃度（2つのゼロ濃度、7つの勾配濃度および1つの繰り返し濃度）で繰り返して試験解析を行い、抗原注入流量は30μL/分、結合時間は120秒、解離時間は600秒とした。解析完了後に、対応する分析プログラムでデータを解析し、明らかなreference bindingがないことを確認し、Kinetics、1:1 binding model、曲線当てはめで二重特異性抗体および親モノクローナル抗体の動態関連パラメータであるKa、KdおよびKD値を得た。
測定結果は表11および表12に示す。結果として、TIGIT-IgG-PD-L1-scFv二重特異性抗体にとって、TIGITに対する二重抗体の親和性は親HB0030と同等で、PD-L1に対する二重抗体の親和性は親900339モノクローナル抗体よりやや高かった。PD-L1-IgG-TIGIT-scFv二重特異性抗体にとって、PD-L1に対する二重抗体900691、900692および900693の親和性は、親モノクローナル抗体900339と同等で、TIGITに対する900691、900692、900693の親和性は親モノクローナル抗体HB0030と比較し、同じオーダーにある。
実施例8 二重特異性抗体的の生物学的活性の測定
8.1 PDL1機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果
PDL1機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果を測定する試験手順は下記の通り。二重特異性抗体および900339親モノクローナル抗体用PBS溶液を10μg/mlに希釈し、さらに、2倍の比率で9つの勾配に希釈した。PD-1を過剰発現した標的細胞Jurkat-NFAT-PD-1-5B8をカウントし、5×10E5/mLに再懸濁し、30μl/ウェルで96ウェルの白色ベースプレートに広げた。PD-L1を過剰発現しているエフェクター細胞CHO-K1-OS8-PD-L1-8D6をカウントし、5×10E5/mLに再懸濁し、0μl/ウェルで前記Jurkat-NFAT-PD-1-5B8を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加えた。次に、希釈された二重特異性抗体および親対照抗体を30μl/ウェルで順次、細胞を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加え、37℃で6時間インキュベートした。インキュベート後に培養プレートを室温で少なくとも15分間平衡化した後、ウェル当たり90 μLのBIO-Glo assayを加え、室温で暗所で5分間反応させ、最後にMD i3xマイクロプレートリーダーの読み数でシグナル強度を測定した。
8.1 PDL1機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果
PDL1機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果を測定する試験手順は下記の通り。二重特異性抗体および900339親モノクローナル抗体用PBS溶液を10μg/mlに希釈し、さらに、2倍の比率で9つの勾配に希釈した。PD-1を過剰発現した標的細胞Jurkat-NFAT-PD-1-5B8をカウントし、5×10E5/mLに再懸濁し、30μl/ウェルで96ウェルの白色ベースプレートに広げた。PD-L1を過剰発現しているエフェクター細胞CHO-K1-OS8-PD-L1-8D6をカウントし、5×10E5/mLに再懸濁し、0μl/ウェルで前記Jurkat-NFAT-PD-1-5B8を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加えた。次に、希釈された二重特異性抗体および親対照抗体を30μl/ウェルで順次、細胞を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加え、37℃で6時間インキュベートした。インキュベート後に培養プレートを室温で少なくとも15分間平衡化した後、ウェル当たり90 μLのBIO-Glo assayを加え、室温で暗所で5分間反応させ、最後にMD i3xマイクロプレートリーダーの読み数でシグナル強度を測定した。
PD-L1-IgG-TIGIT-scFv二重特異性抗体の測定結果は図10および表13に示す。結果として、PD-L1機能に対する900691、900692、900693二重特異性抗体とPD-L1親モノクローナル抗体900339の阻害効果は同等であった。
8.2 TIGIT機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果
TIGIT機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果を測定する試験手順は下記の通り。二重特異性抗体およびHB0030親モノクローナル抗体用PBS溶液を10μg/mlに希釈し、さらに、2倍の比率で9つの勾配に希釈した。TIGITを過剰発現した標的細胞Jurkat-TIGIT-22G8をカウントし、4×10E6/mLに再懸濁し、50μl/ウェルで96ウェルの白色ベースプレートに広げた。次に、希釈された二重特異性抗体および親対照抗体を50μl/ウェルで順次、細胞を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加え、37℃で10分間インキュベートした。次に20μg/mlの濃度のPHA 50μlおよび8ug/mlの濃度のCD155 50μlを加え、よく混ぜ、インキュベーターで24時間培養した。インキュベート後、1500rpm×5minで遠心分離して上清を除去し、ELISAキットでIL-2の含量を測定した。
TIGIT機能に対するPDL1-TIGIT二重特異性抗体の阻害効果を測定する試験手順は下記の通り。二重特異性抗体およびHB0030親モノクローナル抗体用PBS溶液を10μg/mlに希釈し、さらに、2倍の比率で9つの勾配に希釈した。TIGITを過剰発現した標的細胞Jurkat-TIGIT-22G8をカウントし、4×10E6/mLに再懸濁し、50μl/ウェルで96ウェルの白色ベースプレートに広げた。次に、希釈された二重特異性抗体および親対照抗体を50μl/ウェルで順次、細胞を広げた96ウェルの白色ベースプレートに加え、37℃で10分間インキュベートした。次に20μg/mlの濃度のPHA 50μlおよび8ug/mlの濃度のCD155 50μlを加え、よく混ぜ、インキュベーターで24時間培養した。インキュベート後、1500rpm×5minで遠心分離して上清を除去し、ELISAキットでIL-2の含量を測定した。
TIGIT-IgG-PD-L1-scFv二重特異性抗体の測定結果は図11および表14に示す。結果として、TIGIT-IgG-PD-L1-scFv形態の二重特異性抗体は、TIGIT親モノクローナル抗体HB0030と比較し、TIGIT機能に対する阻害効果に有意差が認められなかった。
実施例9 PDL1-TIGIT二重特異性抗体の熱安定性測定
PDL1-TIGIT二重特異性抗体の熱安定性試験手順は下記の通り。タンパク質安定性分析装置（UNcle,UNCHAINED LABS,US）で、PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体900691、900692および900693の融解温度（Tm）、凝集温度（Tagg）を測定し、TmおよびTaggの昇温範囲は25℃～95℃で、昇温速度は0.3℃であった。
PDL1-TIGIT二重特異性抗体の熱安定性試験手順は下記の通り。タンパク質安定性分析装置（UNcle,UNCHAINED LABS,US）で、PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体900691、900692および900693の融解温度（Tm）、凝集温度（Tagg）を測定し、TmおよびTaggの昇温範囲は25℃～95℃で、昇温速度は0.3℃であった。
PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体の熱安定性測定結果は表15に示す。結果として、PD-L1-IgG-TIGIT-scFv形態の二重特異性抗体900691、900692および900693の熱安定性データであるTmおよびTagg値はすべて65℃～70℃範囲内にあり、3つの二重特異性抗体の熱安定性が良好であることが示唆された。
実施例10 二重特異性抗体のinvivo腫瘍治療効果の測定
本試験は、B-hPD-1/hPD-L1/hTIGITのヒト化マウスでMC38-hPD-L1結腸癌動物モデルを構築し、供試抗体の治療効果を測定した。まず、B-hPD-1/hPD-L1/hTIGITのヒト化マウスでMC38-hPD-L1結腸癌モデルを構築し、腫瘍形成マウスはマウス腫瘍体積および体重によって、平均して1群に6匹、計7つの試験群に分けられ、腹腔内注射で、週に2回、合計6回投与した。具体的な投与計画は下表16の通りである。
本試験は、B-hPD-1/hPD-L1/hTIGITのヒト化マウスでMC38-hPD-L1結腸癌動物モデルを構築し、供試抗体の治療効果を測定した。まず、B-hPD-1/hPD-L1/hTIGITのヒト化マウスでMC38-hPD-L1結腸癌モデルを構築し、腫瘍形成マウスはマウス腫瘍体積および体重によって、平均して1群に6匹、計7つの試験群に分けられ、腹腔内注射で、週に2回、合計6回投与した。具体的な投与計画は下表16の通りである。
腫瘍体積および腫瘍重量の測定：群分け後に、腫瘍体積を週に2回測定し、試験完了後に、マウスの腫瘍を剥がして重量を量り、腫瘍増殖抑制率TGITVを算出し、統計学的に解析して、モデルマウスに対する試験薬の抗腫瘍効果を評価した。
体重および一般臨床観察：試験期間に週に2回の体重測定を行い、順応給餌期および試験期間に、1日1回の一般臨床観察を行い、モデルマウスに対する試験薬の安全性および耐性を評価した。
結果として、本願に記載の二重特異性抗体900693/900692/900691はMC38-hPD-L1結腸癌マウスの腫瘍体積および腫瘍重量の増加を抑制し、かつ、一定の安全性および耐性を有することを示した。
実施例11 二重特異性抗体のinvivo腫瘍治療効果の測定
本試験は、マウス結腸直腸癌細胞CT26-hPDL1を皮下接種したヒト化マウスBALB/C-hPD1/hPDL1/hTIGITマウスモデルを利用して、二重特異性抗体のinvivo腫瘍治療効果を評価した。
本試験は、マウス結腸直腸癌細胞CT26-hPDL1を皮下接種したヒト化マウスBALB/C-hPD1/hPDL1/hTIGITマウスモデルを利用して、二重特異性抗体のinvivo腫瘍治療効果を評価した。
マウス結腸直腸癌CT26-hPDL1細胞を雌ヒト化BALB/C-hPD1/hPDL1/hTIGITマウスの右背中の皮下に接種した。担癌マウスの腫瘍増殖が平均70.03mm3に達したとき、腫瘍体積により、ランダムに4つの群に分け、各群に6匹のマウスをそれぞれ900201（対照抗体、3 mg/kg）、900339（hPDL1抗体、3 mg/kg）、HB0030（TIGIT 抗体、3 mg/kg）および900693（二重特異性抗体, 4.1 mg/kg）群に分けた。群分け後、各群のマウスに対し、腹腔内注射で、3週間にかけて週に2回、合計6回投与した。毎週に腫瘍体積および体重を測定し、担癌マウスの体重および腫瘍体積推移と投与時間との関係を記録した。
結果は図12に示す（ここで、G1-G4はそれぞれ900201、900458、HB0030および900693の使用結果を示す）。図12の結果によると、本願の二重特異性抗体はマウス結腸直腸癌細胞CT26-hPDL1を皮下接種したヒト化マウスBALB/C-hPD1/hPDL1/hTIGITにおいて、有意な抗腫瘍効果を示し、900458およびHB0030よりも優れているので、潜在的な臨床効果が期待できる。
Claims (94)
- TIGITタンパク質に特異的に結合することができる第1の標的部分を含む多重特異性抗体であって、
前記第1の標的部分は単離された抗原結合タンパク質を含み、前記単離された抗原結合タンパク質は、
１）TIGITタンパク質を1×10-10Mまたはそれ以下のKD値で結合することができ、前記KD値は表面プラズモン共鳴によって決定される性質、
２）FACS解析においてCD155のTIGITへの結合を阻害することができる性質、および
３）腫瘍の成長およびおよび／または腫瘍細胞の増殖を抑制することができる性質のいずれかまたは複数の性質を持つ。 - 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域VHにおける少なくとも1つのCDRを含み、前記VHはSEQ ID NO：55に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域VLにおける少なくとも1つのCDRを含み、前記VLはSEQ ID NO:64に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１－３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記抗原結合フラグメントはFab、Fab’、Fvフラグメント、F(ab’)2、scFv、di-scFvおよび／またはdAbを含むことを特徴とする、請求項４に記載の多重特異性抗体。
- 前記抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４又は５に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質と参照抗体とは前記TIGITタンパク質に競争的に結合し、
前記参照抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記参照抗体の重鎖可変領域はHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含み、前記HCDR2はSEQ ID NO：4または42に示すアミノ酸配列を含み、前記HCDR3はSEQ ID NO：5または43に示すアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の軽鎖可変領域はLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、前記LCDR1はSEQ ID NO：6または52に示すアミノ酸配列を含み、前記LCDR2はSEQ ID NO：7に示すアミノ酸配列を含み、前記LCDR3はSEQ ID NO：8または53に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１－６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質はHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、前記HCDR3はSEQ ID NO：57に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１－７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR3はSEQ ID NO：5または43に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR2はSEQ ID NO：56に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR2はSEQ ID NO：4または42に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８－１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR1はSEQ ID NO：3に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８－１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は骨格領域H-FR1、H-FR2、H-FR3およびH-FR4を含むことを特徴とする、請求項１－１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR1のC末端は、前記HCDR1のN末端に直接または間接的に連結され、前記H-FR1は、SEQ ID NO：58に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR1はSEQ ID NO：23および35のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR2は前記HCDR1と前記HCDR2との間に位置し、前記H-FR2はSEQ ID NO：60に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR2はSEQ ID NO：24、25、26、36および37のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR3は前記HCDR2と前記HCDR3との間に位置し、前記H-FR3はSEQ ID NO：61に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR3はSEQ ID NO：27、38および39のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR4のN末端と前記HCDR3のC末端とを連結し、さらに、SEQ ID NO：62に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記H-FR4はSEQ ID NO：28、40および41のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３－２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質はVHを含み、前記VHはSEQ ID NO：55に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１－２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記VHはSEQ ID NO：110、1、9、12、14および32のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は抗体重鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項１－２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記抗体重鎖定常領域はヒトIgG定常領域に由来することを特徴とする、請求項２４に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質はLCDR1，LCDR2およびLCDR3を含み、前記LCDR1はSEQ ID NO：65に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１－２５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR1はSEQ ID NO：6および52のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR2はSEQ ID NO：7示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２６または２７に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR3はSEQ ID NO：66に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２６－２８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR3はSEQ ID NO：8または53に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２６－２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は骨格領域L-FR1，L-FR2，L-FR3およびL-FR4を含むことを特徴とする、請求項１－３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR1のC末端は、前記LCDR1のN末端に直接または間接的に連結され、前記L-FR1は、SEQ ID NO：68に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR1はSEQ ID NO：15、16、44および45のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR2は前記LCDR1と前記LCDR2との間に位置し、前記L-FR2はSEQ ID NO：70に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR2はSEQ ID NO：17、18、46および47のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR3は前記LCDR2と前記LCDR3との間に位置し、前記L-FR3はSEQ ID NO：72に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR3はSEQ ID NO：19-21および48-50のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR4のN末端と前記LCDR3のC末端とを連結し、さらに、前記L-FR4はSEQ ID NO：73に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記L-FR4はSEQ ID NO：22または51のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１－３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質はVLを含み、前記VLはSEQ ID NO：64に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１－３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記VLはSEQ ID NO：111、2、10、11、13、33および34のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４０に記載の多重特異性抗体。
- 前記TIGITタンパク質に結合することができる抗原結合タンパク質は抗体軽鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項１－４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記抗体軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域に由来することを特徴とする、請求項４２に記載の多重特異性抗体。
- さらに第2の標的部分を含むことを特徴とする、請求項１－４３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の標的部分が腫瘍関連抗原に特異的に結合することができることを特徴とする、請求項４４に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の標的部分はPD-L1とPD-1との相互作用を阻害することができることを特徴とする、請求項４４または４５に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2の標的部分はPD-L1タンパク質に特異的に結合することができることを特徴とする、請求項４４－４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1タンパク質に結合することができる第2の標的部分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことを特徴とする、請求項４７に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗原結合フラグメントはFab、Fab’、Fvフラグメント、F(ab’)2、scFv、di-scFvおよび/またはdAbを含むことを特徴とする請求項４８に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項４８－４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、前記HCDR3はSEQ ID NO：102に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４８－５０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR2はSEQ ID NO：101示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５１に記載の多重特異性抗体。
- 前記HCDR1はSEQ ID NO：100に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５１または５２に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1に結合することができる抗体は重鎖可変領域VHを含み、前記VHはSEQ ID NO：108または110に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４８－５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体はLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、前記LCDR3はSEQ ID NO：105に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４８－５４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR2はSEQ ID NO：104示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５５に記載の多重特異性抗体。
- 前記LCDR1はSEQ ID NO：103に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５５－５６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記PD-L1に結合することができる抗体は軽鎖可変領域VLを含み、前記VLはSEQ ID NO：107または109に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４８－５７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み、前記第1のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記TIGITタンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび前記TIGITタンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み、前記第2のポリペプチド鎖は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含むことを特徴とする請求項１－５８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖における前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成することを特徴とする請求項５９に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖において、前記TIGITタンパク質に結合することができるscFvは前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端またはC端に位置することを特徴とする請求項６０に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖はさらに、ヒトIgG定常領域を含み、前記ヒトIgG定常領域は前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC端、さらに前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に位置することを特徴とする請求項５９－６１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記scFvはC-ペプチドを含むことを特徴とする請求項６０－６２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記C-ペプチドはSEQ ID NO：74-77のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６３に記載の多重特異性抗体。
- 前記scFvの配列はSEQ ID NO：97-99のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６０－６４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖はSEQ ID NO：85-87のアミノ酸配列のいずれか1つから選ばれることを特徴とする請求項５９－６５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2のポリペプチド鎖はSEQ ID NO：88に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５９－６６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み、前記第1のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の重鎖可変領域VH、前記PD-L1タンパク質に結合することができる重鎖可変領域VHおよび前記PD-L1タンパク質に結合することができる軽鎖可変領域VLを含み、前記第2のポリペプチド鎖は前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体の軽鎖可変領域VLを含むことを特徴とする請求項１－６７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖における前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVHと、前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLとは、scFvを構成することを特徴とする請求項68に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖において、前記PD-L1タンパク質に結合することができるscFvは前記TIGITタンパク質に結合することができる抗体のVHのN末端またはC端に位置することを特徴とする請求項69に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖はさらに、ヒトIgG定常領域を含み、前記ヒトIgG定常領域は前記TIGIT1タンパク質に結合することができる抗体のVHのC端、さらに前記PD-L1タンパク質に結合することができる抗体のVLのN末端に位置することを特徴とする請求項６８－７０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記scFvはC-ペプチドを含むことを特徴とする請求項６９－７１のいずれか1項に記載の多重特異性抗体。
- 前記C-ペプチドはSEQ ID NO：74-77のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項72に記載の多重特異性抗体。
- 前記scFvの配列はSEQ ID NO：89-96のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６９－７３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第1のポリペプチド鎖はアミノ酸配列：SEQ ID NO：78-83のいずれか1つから選ばれることを特徴とする請求項６８－７４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第2のポリペプチド鎖はSEQ ID NO：84に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５９－７５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- ホモダイマーであることを特徴とする請求項１－７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードすることを特徴とする1種または複数の核酸分子。
- 請求項78に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項78に記載の核酸分子または請求項79に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を発現させる条件で、請求項80に記載の細胞を培養することを含むことを特徴とする請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体の調製法。
- 請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体、請求項７８に記載の核酸分子、請求項７９に記載のベクターおよび／または請求項８０に記載の細胞、および任意に選ばれる薬学的に許容されるアジュバントを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体、請求項７８に記載の核酸分子、請求項７９に記載のベクター、請求項８０に記載の細胞および／または請求項８２に記載の医薬組成物の医薬品製造における使用であって、前記医薬品は疾患または病症の予防、寛解および／または治療に用いられる。
- 前記疾患または病症はTIGIT関連疾患を含むことを特徴とする請求項83に記載の使用。
- 前記TIGIT関連疾患はT細胞機能不全疾患であることを特徴とする請求項８３－８４のいずれか１項に記載の使用。
- 前記疾病または病症は腫瘍であることを特徴とする請求項８３－８５のいずれか１項に記載の使用。
- 前記腫瘍は結腸癌であることを特徴とする請求項86に記載の使用。
- 前記方法はそれを必要とする被験者に請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を投与することを特徴とする疾患または病症を予防、寛解および/または治療する方法。
- 前記疾患または病症はTIGIT関連疾患を含むことを特徴とする請求項88に記載の方法。
- 前記TIGIT関連疾患はT細胞機能不全疾患であることを特徴とする請求項８８－８９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記疾病または病症は腫瘍であることを特徴とする請求項８８－９０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記腫瘍は結腸癌であることを特徴とする請求項91に記載の方法。
- 前記方法は請求項１－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を投与することを特徴とするCD155とTIGITとの結合を阻害する方法。
- 前記方法は請求項４６－７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を投与することを特徴とするPD-L1とPD-1との結合を阻害する方法。
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