JP2024026170A - 癌を処置するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】可溶性ヒトCD39の酵素活性を阻害する抗体又は抗体フラグメントを提供する。【解決手段】ヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つ可溶性細胞外ドメインヒトCD39ポリペプチドのATPアーゼ活性を阻害することができる抗体又は抗体フラグメントであって、特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又は抗体フラグメント。【選択図】図6
Description
関連出願の相互参照
本願は、任意の図面、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる2018年6月18日提出の米国仮特許出願第62/686,165号明細書の利益を主張する。
本願は、任意の図面、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる2018年6月18日提出の米国仮特許出願第62/686,165号明細書の利益を主張する。
配列表の参照
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、2019年5月27日作成の「CD39-9_ST25」という名称で提供されており、サイズは、72kBである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、2019年5月27日作成の「CD39-9_ST25」という名称で提供されており、サイズは、72kBである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、可溶性ヒトCD39の酵素活性を阻害する抗原結合化合物(例えば、抗体)に関する。本発明は、そのような化合物を産生する細胞;そのような化合物並びにその抗体、フラグメント、バリアント及び誘導体を製造する方法;それを含む医薬組成物;疾患、例えば癌を診断、処置又は予防するためにこの化合物を使用する方法にも関する。
8種の異なるENTPD遺伝子は、NTPDアーゼタンパク質ファミリのメンバーをコードする。個々のNTPDアーゼサブタイプは、細胞内での位置と機能特性とが異なる。細胞膜結合型ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼは、ヌクレオチドのcリン酸塩及びbリン酸塩を加水分解することにより、細胞表面でのヌクレオチドレベルを制御する。
NTPDアーゼ1(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1)(CD39/ENTPD1又は血管CD39としても既知である)は、別の酵素CD73(エクト-5’-ヌクレオチダーゼ)と一緒に機能して、細胞外アデノシン三リン酸(ATP)及び細胞外アデノシン二リン酸(ADP)を加水分解してアデノシンを生成し、このアデノシンは、アデノシン受容体に結合してT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞の応答を阻害し、それにより免疫系が抑制される。CD73/CD39経路を介したアデノシンの生成は、制御性T細胞(Treg)の免疫抑制機能の主要な機構として認識されている。一部のヒト癌では、CD39+Tregの数が増加しており、いくつかのインビボモデルを使用して、腫瘍の増殖及び転移の促進におけるCD39+Tregの重要性が実証されている。しかしながら、CD39は、腫瘍細胞によっても発現されており、CD39+腫瘍細胞は、アデノシン経路を介して免疫抑制を媒介する可能性がある。癌細胞中のCD39は、ATPアーゼ活性を示し、CD73と一緒にアデノシンを生成する。CD73+CD39+癌細胞は、CD39依存的及びアデノシン依存的に、CD4 T細胞及びCD8 T細胞の増殖並びに細胞傷害性エフェクターCD8T細胞(CTL)の生成を阻害した。CD39は、いくつかの固形腫瘍(結腸直腸癌、頭頸部癌、膵癌)及び慢性リンパ球性白血病で増加していることが報告されている。CD39発現細胞中のCD39に結合して阻害する抗体は、特許文献1で開示されている。抗体「A1」(eBiosciences,Inc.)は、染色用途に使用され、細胞中のCD39活性を中和する能力を示さない。非特許文献1では、FcγRに結合し、且つエフェクター機能を有する抗CD39が使用されているが、ブロッキングであるとも述べられている。実際には、CD39をブロックしないか又は純粋なブロッカーでない抗体の使用と組み合わされた、様々な細胞タイプ(例えば、白血球及び腫瘍細胞)によるCD39発現により、抗体の根本的な活性の評価のための設定は複雑になる。今日まで、CD39活性部位の唯一の報告された阻害剤は、依然として、ARL67156に例示される小分子の非加水分解性ATP類似体であり、これは、この活性部位の直接阻害が必要であることを示唆する。しかしながら、ARL67156は、CD39に特異的ではなく、他のNTPDアーゼ(例えば、NTPDアーゼ1、NTPDアーゼ3、NPP1又はマウスNTPDアーゼ8)も阻害し、さらに弱い競合阻害剤としてのものであるにすぎない(非特許文献2)。
C39は、N末端及びC末端の付近の2つの膜貫通ドメインと、短い細胞質N末端セグメント及び細胞質C末端セグメントと、活性部位を含む大きい細胞外ドメインとを有する。しかしながら、CD39は、概して、この分子の2つの端部における2つの膜貫通ドメインによって膜に固定されているが、CD39の可溶性触媒活性型がヒト及びマウスの循環中でも見られ得ることも最近報告されている(非特許文献3)。様々な抗CD39抗体が説明されているにもかかわらず、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができる抗体は、報告されていない。
Hayes et al.(2015)Am.J.Transl.Res.7(6):1181-1188
Levesque et al.(2007)Br.J.Pharmacol.152:141-150
Yegutkin et al.,(2012)FASEB J.26(9):3875-3883
本発明者らは、可溶性(細胞外ドメイン)ヒトCD39タンパク質の酵素活性(ATPアーゼ活性)を阻害する抗体を得ている。この抗体は、さらに、腫瘍細胞等の細胞の表面で発現されるヒトCD39タンパク質上に存在するエピトープに結合し、細胞膜結合型CD39酵素(細胞の表面で発現されるCD39)の酵素活性(ATPアーゼ活性)を強力に阻害する。本抗体は、有利には、膜結合型及び可溶性CD39タンパク質、例えば腫瘍細胞から放出又は排出される可溶性CD39の両方を中和することにより、個体におけるCD39活性のより大きい中和を達成し、それにより例えば癌及び/又は感染性疾患の処置のために免疫抑制を減少させるために使用され得る。膜結合型CD39酵素の酵素活性(ATPアーゼ活性)を阻害する他の抗CD39抗体が既に説明されているが、この抗体は、細胞膜に結合しない可溶性CD39タンパク質を阻害しない。
ある実施形態において、提供されるのは、抗CD39抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質(例えば、抗体又は抗体フラグメント、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など)であって、抗原結合ドメインは、配列番号8、9及び10に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトIGHV1-3遺伝子、例えばIGHV1-3*01由来のフレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列(及び任意選択によりヒトIGHJ1遺伝子、例えばIGHJ1*01由来のさらなるフレームワーク4(FR4)アミノ酸配列)を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号11、12及び13に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトIGKV4-1(例えば、IGK4-1*01)遺伝子由来のフレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列及び任意選択によりヒトIGKJ4(例えば、IGKJ4*01)遺伝子由来のさらなるフレームワーク4(FR4)アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、抗CD39抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質である。ある実施形態において、VHは、48、67、71及び76からなる群から選択されるKabat位置における異なる残基(例えば、非ヒトフレームワーク中に存在する残基)による、ヒトフレームワーク配列中に存在する残基の1つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。ある実施形態において、VHは、例えば、Kabat位置60及び/又は64において重鎖CDR2中の1つ又は複数のアミノ酸置換を含む。任意選択により、位置60における残基は、セリンである(例えば、CDR2は、N60S置換を含む)。任意選択により、Kabat位置64に存在する残基は、グルタミンである(例えば、CDR2は、K64Q置換を含む)。ある実施形態において、Kabat位置24においてVL中に存在する残基は、リジンである(例えば、CDR1は、R24K置換を含む)。任意選択により、フェニルアラニンがKabat位置36においてVL中に存在する。
ある実施形態において、提供されるのは、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質(例えば、抗体又は抗体フラグメント、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など)であって、抗原結合ドメインは、配列番号27~34の何れか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含み、且つ任意選択により48、67、71及び76からなる群から選択されるKabat位置における異なる残基(例えば、非ヒトフレームワーク中に存在する残基)による、ヒトフレームワーク配列中に存在する残基の1つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号35~37の何れか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択によりフェニルアラニンがKabat位置36に存在する軽鎖可変領域(VL)とを含む抗原結合ドメイン又はそのような抗原結合ドメインを含む、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質である。ある実施形態において、VHは、Kabat位置60及び/又は64において重鎖CDR2中の1つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む。任意選択により、Kabat位置60において重鎖中に存在する残基は、セリン残基である。任意選択により、Kabat位置64において重鎖中に存在する残基は、グルタミン残基である。ある実施形態において、VLは、Kabat軽鎖位置24において軽鎖CDR2中のアミノ酸置換をさらに含み、任意選択により、さらに、位置24において軽鎖中に存在する残基は、リジン残基である。
任意選択により、Kabat重鎖位置48におけるアミノ酸は、イソロイシンである。任意選択により、Kabat重鎖位置67におけるアミノ酸は、アラニンである。任意選択により、Kabat重鎖位置71におけるアミノ酸は、バリンである。任意選択により、Kabat重鎖位置76におけるアミノ酸は、アルギニンである。
ある実施形態において、VHは、Kabat位置67においてアラニン残基及び位置71においてバリンを含む。
ある実施形態において、VHは、Kabat位置48においてイソロイシン残基、Kabat位置67においてアラニン残基、Kabat位置71においてバリン及びKabat位置76においてアルギニンを含む。
ある実施形態において、VLは、Kabat位置36(FR2)においてフェニルアラニンを含む。ある実施形態において、VLは、Kabat位置24(CDR1)においてリジンを含む。
何れかの実施形態において、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質(例えば、モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など)は、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号36又は37のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むとして特徴付けられ得る。
ある実施形態において、提供されるのは、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質(例えば、モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など)であって、抗原結合ドメインは、配列番号8、9及び10に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトフレームワーク(例えば、ヒト起源のFR1、FR2、FR3及びFR4)を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号11(又は17又は18)、12及び13に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトフレームワーク(例えば、ヒト起源のFR1、FR2、FR3及びFR4)を含む軽鎖可変領域(VL)とを含み、(VH)は、配列番号31又は6のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖可変領域(VL)は、配列番号36又は37の何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質である。
何れかの実施形態において、VHは、Kabat位置48、67、71及び76の1つ、2つ、3つ又は全てにおいて置換を含むとして特徴付けられ得る。ある実施形態において、位置48における残基は、イソロイシン(例えば、M48I置換)である。ある実施形態において、位置67における残基は、アラニン(例えば、V67A置換)である。ある実施形態において、位置71における残基は、バリン(例えば、R71V置換)である。ある実施形態において、位置76における残基は、アルギニン(例えば、S76R置換)である。何れかの実施形態において、VLは、Kabat位置36において置換を含むとして特徴付けられ得る。ある実施形態において、位置36における残基は、フェニルアラニン(例えば、Y36F置換)である。
ある実施形態において、VHは、ヒトVHフレームワークアミノ酸配列を含み、且つVLは、ヒトVLフレームワークアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、VHヒトアクセプターフレームワークのVHセグメントは、ヒトIGHV1-3遺伝子セグメント由来であり、任意選択により、さらに、J-セグメントは、ヒトIGHJ1遺伝子セグメント由来である。ある実施形態において、VHヒトフレームワークは、ヒトIGHV1-3*01遺伝子セグメント由来である。ある実施形態において、VLドメインヒトアクセプターフレームワークは、ヒトIGKV4-1遺伝子セグメント由来であり、任意選択により、さらに、J-セグメントは、ヒトIGKJ4遺伝子セグメント由来である。
ある実施形態において、提供されるのは、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質(例えば、モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など)であって、抗原結合ドメインは、
(a)配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号29、30、31、32、33又は34のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体結合ドメイン;及び
(b)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号29、30、31、32、33又は34のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体結合ドメイン
からなる群から選択される、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質である。
(a)配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号29、30、31、32、33又は34のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体結合ドメイン;及び
(b)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号29、30、31、32、33又は34のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む抗体結合ドメイン
からなる群から選択される、抗CD39抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質である。
何れかの実施形態において、抗体重鎖は、ヒトCH1定常ドメイン及びヒトFcドメイン、任意選択によりヒトIgG1アイソタイプのものを含み、任意選択により配列番号23、24、25又は26の何れか1つのアミノ酸配列をさらに含む。何れかの実施形態において、抗体軽鎖は、ヒト軽鎖定常ドメインを含み、任意選択により、定常ドメインは、ヒトカッパドメインである。
ある実施形態において、提供されるのは、配列番号38のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号39のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗CD39抗体である。
ある実施形態において、提供されるのは、配列番号38のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗CD39抗体である。
ある実施形態において、提供されるのは、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗CD39抗体又は抗体フラグメントである。
ある実施形態において、提供されるのは、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗CD39抗体又は抗体フラグメントである。
何れかの実施形態において、抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質、任意選択により抗体又は抗体フラグメントは、可溶性CD39タンパク質(sCD39)に結合し、且つそのATPアーゼ活性を阻害又は中和するとして特徴付けられ得る。ある実施形態において、sCD39タンパク質は、膜結合型CD39中に見出される2つの膜貫通ドメイン(すなわちN末端及びC末端付近の膜貫通ドメイン)を欠いている。ある実施形態において、sCD39は、例えば、ヒト個体における循環中に見出される非膜結合型sCD39タンパク質である。ある実施形態において、sCD39は、配列番号43のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、任意選択によりC末端タグ又は別の非CD39由来アミノ酸配列をさらに含み;任意選択により、配列番号43のアミノ酸配列は、配列番号1の配列のそのN末端残基1~37をさらに欠いている。sCD39タンパク質は、CD39のThr38-Val478フラグメントを含むか又はそれからなるとして特徴付けられ得る。C末端Hisタグを有するThr38-Val478タンパク質は、R&D Systems,Inc.(製品番号4397-EN)から市販されている。ある実施形態において、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントは、例えば、本明細書で開示された(例えば、実施例、方法を参照されたい)の細胞の非存在下において、例えば腫瘍細胞上清中で実行される方法又はアッセイに従って溶液中のsCD39と共にインキュベートした場合、sCD39のATPアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、本タンパク質、本抗体又は本抗体フラグメントは、可溶型(細胞外ドメインタンパク質)及び膜結合型の両方でヒトCD39タンパク質に特異的に結合する。
理論に拘束されることを望まないが、一部の抗体は、膜結合型CD39(memCD39)のドメイン運動を阻害することにより、膜結合型CD39を中和し得るが、可溶性CD39タンパク質(sCD39)の活性に類似の影響を及ぼさない。memCD39は、ホモ多量体として生じるが、sCD39は単量体であることが報告されており、加えて、memCD39中の膜貫通ドメインは、活性部位との機能的関係の基礎をなす動的運動を受けることも報告されている。その結果、sCD39と異なり、memCD39は、抗体により媒介される中和を可能にする設定を提示する場合がある。1つの可能性は、(例えば、memCD39ホモ多量体内の)2つのmemCD39分子に同時に結合する二価抗体の使用が機能的中和に必要とされることである。
sCD39(及びmemCD39)の活性を中和する本抗体は、二価バインダーとしての使用に加えて、sCD39に加えてmemCD39を標的としているかどうかにかかわらず、一価バインダーとしても有効であり得る。その結果、ある実施形態において、提供されるのは、ヒトCD39タンパク質(sCD39及び/又はmemCD39)に一価で結合し、且つその酵素(ATPアーゼ)活性を中和する抗原結合タンパク質である。この抗原結合タンパク質は、任意選択により、単一のCD39タンパク質に結合し、且つ/又はCD39タンパク質に結合することができる単一の抗原結合ドメインを有するとして規定され得る。ある実施形態において、提供されるのは、ヒトCD39タンパク質(sCD39及び/又はmemCD39)に一価で結合し、且つその酵素(ATPアーゼ)活性を中和する抗体フラグメント(任意選択により、F(ab)フラグメント、一本鎖抗体、scFv、多重特異的抗体)である。ある実施形態において、ヒトCD39タンパク質に一価で結合するCD39中和抗原結合タンパク質は、多重特異的抗原結合タンパク質(例えば、多重特異的抗体、二重特異的抗体、三重特異的抗体等)である。ある実施形態において、ヒトCD39タンパク質に一価で結合するCD39中和抗原結合タンパク質は、CD39(sCD39及び/又はmemCD39)に結合する第1の(又は単一の)抗原結合ドメインと、CD39以外のタンパク質に結合する第2の抗原結合ドメインとを含む。
有利には、ある実施形態において、本抗体は、ヒトFcγ受容体(例えば、ヒトCD16、ヒトCD32a、ヒト32b及びヒトCD64の1つ又は複数(又は全て))への結合が減少しているか又はそれを実質的に欠いているように改変されているヒトFcドメインを含む。ある態様において、この抗体は、そのCD39阻害活性に関してADCC、CDC又は毒素により媒介されるCD39発現細胞の枯渇に依存しない。この抗体は、「純粋な」CD39ブロッカーとして使用され得、免疫調節活性を可能にする。
代替実施形態において、本結合分子は、この結合分子が、そのFcドメインを介してエフェクター機能を保持及び/又は媒介するように生成され得る。ある実施形態において、この抗体は、ヒトFcγ受容体(例えば、ヒトCD16、ヒトCD32a、ヒトCD32b及びヒトCD64の1つ又は複数(又は全て))に結合するヒトFcドメインを含む。
別の実施形態において、このFcドメインは、任意選択により、1つ又は複数のヒトFcγ受容体への結合を保持するが、1つ又は複数の他のヒトFcγ受容体への結合が減少していることにより、Fcγ受容体結合が減少するように改変され得る。
ある態様において、本抗体は、血管CD39に特異的に結合し、例えば、この抗体は、配列番号1の配列を有するポリペプチドに結合するが、分泌型CD39アイソフォームポリペプチド(例えば、CD39-L2ポリペプチド及び/又はCD39-L4ポリペプチド)に結合しない。任意選択により、本抗CD39抗体は、血管CD39に特異的に結合し、例えば、この抗体は、配列番号1の配列を有するポリペプチドに結合するが、膜結合型CD39アイソフォーム(例えば、CD39-L1ポリペプチド及び/又はCD39-L3ポリペプチド)に結合しない。
本開示の抗体は、細胞の表面で発現される膜結合型CD39タンパク質の酵素活性を阻害し得る。
ある態様において、この抗体は、そのCD39阻害活性に関してCD39下方調節に依存しない。
本開示の抗体は、CD39の内部移行の誘導の有無にかかわらず及びCD16(FcγIII受容体)の結合の有無にかかわらず、且つ/又はCD39発現細胞へのADCC及び/若しくはCDCの実質的な指向の有無にかかわらず、可溶性CD39の阻害に加えて、細胞の表面で発現される膜結合型CD39タンパク質の酵素活性を阻害し得る。任意選択により、この抗体は、Fcドメインを保持し、且つヒトFcRnへの結合を保持する。
ADCC及び/又はCDCの誘導により機能する抗体は、CD39のATPアーゼ活性の完全な中和/阻害を伴わなくても効率的であり得るが、十分な抗体がCD39発現細胞に結合してADCCが誘導される限り、中和する非枯渇性抗体は、ATPアーゼの酵素活性のより強力な阻害を必要とする場合がある。ある実施形態において、非枯渇性抗体は、任意選択により、さらにヒトへの抗体の投与に適合する濃度において、(例えば、本明細書で開示された方法によって評価される場合に)可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性の少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%の低下をもたらすであろう。ある実施形態において、非枯渇性抗体は、任意選択により、さらにヒトへの抗体の投与に適合する濃度において、本明細書で開示された方法によって測定される場合、(例えば、CD39+細胞(例えば、B細胞、Ramos細胞)によるAMP生成の減少によって評価される場合に)CD39発現細胞のATPアーゼ活性の少なくとも70%、80%、90%の低下をもたらすであろう。
抗体が結合するCD39上のエピトープは、様々な細胞(例えば、癌細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞、遺伝子移入細胞)によって発現されるCD39ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーによって決定される場合に高親和性で結合する。
抗体は、任意選択により、表面でCD39ポリペプチドを発現する細胞への結合に関して、2μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下、0.1μg/ml以下又は0.05μg/ml以下の、フローサイトメトリーによって決定されるEC50によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、この細胞は、表面でCD39を発現するように作製されている細胞である。ある実施形態において、この細胞は、表面でCD39を内因的に発現する細胞であり、例えば制御性T(TReg)細胞、B細胞、癌細胞、リンパ腫細胞(例えば、Ramos細胞)、白血病細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣癌細胞、黒色腫細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、食道癌細胞又は乳癌細胞である。
ある態様において、抗CD39抗体は、(a)細胞の表面で発現された膜結合型CD39タンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の酵素活性を阻害することができ、且つ(b)可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害することができる。ある実施形態において、この抗体は、ヒトFcγ受容体(例えば、CD16、CD32a、CD32b、CD64)及び/若しくはC1qに(例えば、この抗体のFcドメインを介して)実質的に結合せず、且つ/又はADCC及び/若しくはCDCをCD39発現細胞に実質的に向けない。任意選択により、この抗体は、Fcドメインを保持し、且つヒトFcRnへの結合を保持する。
ある実施形態において、この抗体は、抗CD39抗体の次の連続投与まで、所望の期間(例えば、1週間、2週間、1ヶ月)にわたり、sCD39及び/又はmemCD39の酵素活性を中和するのに有効な量で投与される。
ある実施形態において、この抗体は、少なくとも、sCD39タンパク質のATPアーゼ活性の阻害に関するEC50、EC70又はEC100に等しい抗体の血中濃度をもたらす投与量及び/又は頻度で投与され、任意選択により、この濃度は、少なくとも1週間、2週間、1ヶ月にわたり維持されるか、又は抗CD39抗体の次の連続投与まで維持される。
ある態様において、本抗体は、R138、M139及びE142(配列番号1を基準とする)からなる群から選択されるアミノ酸残基(例えば、これらの残基の1つ、2つ又は3つ)を含むCD39上のエピトープに結合する。
ある態様において、抗CD39抗体は、野生型CD39ポリペプチド(配列番号1のCD39ポリペプチド)と比較して、R138、M139及びE142(配列番号1を基準とする)からなる群から選択される残基の1つ、2つ又は3つで突然変異を有するCD39ポリペプチドへの結合の減少(例えば、実質的に完全な結合の喪失)を示し、任意選択により、突然変異体CD39ポリペプチドは、突然変異R138A、M139A及びE142Kを有する。任意選択のある態様において、この抗体は、突然変異体19以外の表1の突然変異体CD39ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
ある実施形態において、本CD39中和抗体は、精製済形態において、細胞フリーアッセイでsCD39タンパク質(例えば、腫瘍細胞培養上清からのsCD39)のATPアーゼ活性の低下を引き起こし得ることによって特徴付けられ得、任意選択により、少なくとも70%、80%又は90%の、sCD39によるAMP生成の減少を引き起こし、任意選択により、例えば本明細書で開示されたアッセイで評価される場合、(陰性対照と比較して)存在するATPの増加を生じさせる。例えば、sCD39阻害を、抗CD39抗体とのインキュベーション後に存在するATPの量に比例する発光ユニットを定量することによって評価し得る。ある実施形態において、このCD39中和抗体は、1μg/ml以下、任意選択により0.5μg/ml以下、任意選択により0.1μg/ml以下の、sCD39タンパク質のATPアーゼ活性の阻害に関するEC50によって特徴付けられ得る。
任意選択により、sCD39タンパク質のATPアーゼ活性の阻害を、試験抗体の用量範囲を37℃で1時間にわたり実施例、方法で説明されている可溶性組換えヒトCD39タンパク質と共にインキュベートする細胞フリーバージョンのアッセイにおいて、Cell Titer Glo(商標)(Promega)を使用して発光単位を定量することによって決定し、20μMのATPを、37℃でさらに30分にわたりプレートに添加した後にCell Titer Glo(商標)(CTG)試薬を添加し、暗所での5分にわたるインキュベーション後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量する(例えば、実施例、方法を参照されたい)。
ある実施形態において、sCD39タンパク質は、任意選択により、CD39を高レベルで発現する腫瘍細胞系、任意選択によりRamos腫瘍細胞からのヒト腫瘍細胞培養上清中に見出されるか又はそれから得られる排出sCD39タンパク質である。
任意選択により、本CD39中和抗体は、精製済形態において、CD39の細胞のATPアーゼ活性の低下を引き起こし得ることによってさらに特徴付けられ得、任意選択で、少なくとも70%、80%又は90%の、CD39発現細胞によるAMP生成の減少を生じさせる。ある実施形態において、このCD39中和抗体は、1μg/ml以下、任意選択により0.5μg/ml以下、任意選択により0.1μg/ml以下の、細胞によって発現されるCD39のATPアーゼ活性の阻害に関するEC50(例えば、CD39発現細胞によるAMP生成の阻害に関するEC50)によって特徴付けられ得る。
任意選択により、細胞によって発現されるCD39のATPアーゼ活性の阻害は、ATPの加水分解によって生成されたAMPを定量することにより、Ramos細胞中でのATPアーゼ活性の中和を評価することによって決定される(例えば、実施例、方法を参照されたい)。
ある態様において、CD39発現細胞によるATPアーゼ活性の中和を、CD39発現細胞(例えば、本明細書で使用されるRamosリンパ腫細胞、例えばATCC、リファレンスCRL-1596から入手可能)を抗体と接触させ、且つ例えば質量分析によってAMPの産生を評価することによって決定し、生成されたAMPの減少は、ATPアーゼ活性の中和を示す。任意選択により、抗体は、このアッセイにおいて、少なくとも70%、80%又は90%の、生成されたAMPの減少を生じさせる。任意選択により、抗体は、少なくとも70%、80%又は90%の、B細胞による細胞外ATPアーゼ活性の減少を生じさせる。
ある態様において、中和抗CD39抗体は、sCD39及び細胞表面で発現されるCD39(memCD39)の両方に存在する抗原性決定基に結合する。
ある態様において、中和抗CD39抗体は、抗体mAb20、mAb21(又はそれらの親I-394抗体)が結合するCD39上のエピトープへの結合に関して競合する(例えば、mAb20、mAb21又はI-394の何れかの重鎖及び軽鎖CDR又は可変領域を有する抗体とCD39ポリペプチド上のエピトープへの結合に関して競合する)。
本明細書の実施形態の何れかのある態様において、抗原結合化合物は、モノクローナル抗体mAb20、mAb21(又はそれらの親I-394抗体)と同一のエピトープに結合し、且つ/又はCD39ポリペプチドへの結合に関して競合する(例えば、mAb20、mAb21(又はI-394)の重鎖及び軽鎖CDR又は可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ/又はCD39ポリペプチドへの結合に関して競合する)。ある実施形態において、抗原結合化合物は、配列番号38及び39のVH及びVL領域をそれぞれ有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ/又はCD39ポリペプチドへの結合に関して競合する。
ある実施形態において、抗CD39抗体は、mAb20、mAb21(又はI-394)が結合するCD39上のアミノ酸残基からなる群から選択される1つ、2つ又は3つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
何れかの実施形態において、本結合分子(例えば、抗体又は抗体フラグメント)は、抗体I-394に関する重鎖CDR1、2及び3(例えば、本明細書に記載のもの)を含む可変重鎖ドメイン(VH)と、それぞれのI-394抗体に関する軽鎖CDR1、2及び3(例えば、本明細書に記載のもの)の含む可変軽鎖ドメイン(VL)とを含むか、又はCDR(又は重鎖CDR及び/若しくは軽鎖CDRのセット)が前記CDR(又は重鎖CDR及び/若しくは軽鎖CDRの前記セット)に対する少なくとも70%、80%、90%又は95%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、VH及びVLは、それぞれヒト起源のフレームワークドメインを含む(例えば、VH及びVLは、配列番号6及び7のそれぞれのVH及びVLと異なる)。任意選択により、CDRは、Kabat又はIMGTナンバリングスキームに従って決定される。
ある態様において、抗体又は抗体フラグメントを含むタンパク質は、FcドメインとヒトCD16A、CD16B、CD32A、CD32B及び/又はCD64ポリペプチドとの間の結合を(同一アイソタイプの野生型Fcドメインと比較して)減少させるように改変されているFcドメインを含み、抗体は、(i)配列番号31の重鎖可変領域のCDR1、2及び3を含む重鎖と、(ii)配列番号36又は37の軽鎖可変領域のCDR1、2及び3を含む軽鎖とを含む。ある態様において、このFcドメインは、このFcドメインとヒトC1qポリペプチドとの間の結合を(同一のアイソタイプの野生型Fcドメインと比較して)減少させるように改変されている。ある実施形態において、この抗体は、220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330及び331(Kabat EUナンバリング)からなる群から選択される残基の何れか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、この抗体は、234、235、237、322、330及び331からなる群から選択される残基の何れか3つ、4つ、5つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を有する。
ある実施形態において、腫瘍微小環境及び/又は循環においてsCD39の活性を中和するのに十分な量及び頻度において、癌を有する個体に本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍微小環境中におけるアデノシンの生成及び/又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍微小環境中におけるAMPの生成及び/又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍細胞によって発現されるCD39の活性を中和するのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、白血球又はリンパ球(例えば、CD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞及び/又はB細胞)によって発現されるCD39の活性を中和するのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。
本抗体は、CD39により媒介されるATP加水分解の阻害で有用であり、例えばそれにより腫瘍微小環境及び/又は循環中におけるアデノシンの濃度の低下がもたらされる。従って、この抗体は、例えば、癌の処置において、T細胞、B細胞及びアデノシン受容体(A2A受容体)を発現する他の細胞へのCD39及び/又はアデノシンの免疫抑制効果の逆転で有用であるであろう。ある実施形態において、本抗CD39抗体は、T細胞中での増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性及び/又はNFκB活性のアデノシンにより媒介される阻害を中和する。
別の態様において、提供されるのは、個体を処置するための方法であって、本明細書で説明された抗CD39抗原結合化合物の何れかの治療的有効量を個体(例えば、疾患、腫瘍等を有する個体)に投与することを含む方法である。
本抗体は、腫瘍微小環境中への且つ/又は循環中での、例えば、限定されないが、(例えば、参照値と比較した)CD39/CD73軸のアデノシン生成、ATP異化又は異化活性の検出可能な有意な増加又は上昇により特徴付けられる腫瘍中でのアデノシンの産生、量及び/又は濃度の阻害において有用である。さらに、増加濃度において、可溶性CD39を中和する抗体は、CD39/CD73軸の異化活性の実質的に完全な阻害を提供する。ある実施形態において、抗体は、CD73タンパク質の存在により特徴付けられる腫瘍(例えば、可溶性CD73及び/又はCD73発現細胞を有する腫瘍;CD73陽性腫瘍)中の腫瘍微小環境中へのアデノシンの産生、量及び/又は濃度の阻害において有用である。
ある実施形態において、可溶性CD39タンパク質を中和する本開示の抗体は、有利には、CD73遮断物と組み合わせて使用することができ、例えば、本開示の抗体は、癌を有する個体にCD73の活性を阻害する薬剤と組み合わせて投与することができる。
ある態様において、提供されるのは、個体を処置するための方法であって、CD39ポリペプチドを阻害する本開示の抗原結合化合物の治療的有効量を個体(例えば、疾患、腫瘍等を有する個体)に投与することを含むか、それから基本的になるか又はそれからなる方法である。ある実施形態において、この抗CD39抗原結合化合物(例えば、抗体)を第2の治療薬と組み合わせて個体に投与する。ある実施形態において、第2の治療剤は、ヒトCD73の5’-エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤(例えば、抗体)である。ある実施形態において、第2の治療剤は、ヒトPD-1の阻害活性を中和する薬剤(例えば、抗体)、任意選択により抗PD-1抗体、任意選択により抗PD-L1抗体である。ある実施形態において、第2の治療剤は、腫瘍細胞からのATPの細胞外放出を誘導し、且つ/又は腫瘍細胞の死滅を誘導する薬剤又は処置(例えば、化学療法剤、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、メイタンシノイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、チューブリシン、ドラスタチン若しくはアウリスタチン、エンジイン、アマトキシン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位体、治療タンパク質若しくはペプチド又は毒素)を含む。
ある実施形態において、この抗CD39抗原結合化合物(例えば、抗体)を、癌を有する個体であって、ヒトPD-1の阻害活性を中和する薬剤による処置への反応が不良であるか、又はこの反応に関する予後が不良である個体に投与する。ある実施形態において、この抗体は、細胞アッセイにおいてCD39ポリペプチドを阻害する。この化合物は、ある実施形態において、非枯渇性抗体(結合する細胞を枯渇させない抗体、例えばFcサイレント抗体)である。任意選択により、この化合物は、二価でCD39ポリペプチドに結合する。任意選択により、この抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。任意選択により、この抗体は、ヒトFcγ受容体(例えば、CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及び/又はCD64)への結合を排除するように改変されたIgG(例えば、IgG1)アイソタイプの重鎖定常領域を含む。
ある態様において、提供されるのは、CD39発現細胞(例えば、個体の白血球及び/又は腫瘍細胞)によるATP加水分解を減少させるための方法又は細胞性CD39の酵素活性の中和のための方法であって、CD39発現細胞を、CD39を阻害する本開示の抗原結合化合物(例えば、抗体又は抗体フラグメント)と接触させることを含む方法である。ある実施形態において、CD39発現細胞を本開示の抗原結合化合物と接触させるステップは、CD39を阻害する抗原結合化合物の治療的有効量を個体に投与することを含む。ある実施形態において、この個体は、癌を有する。
ある態様において、提供されるのは、(例えば、個体での)腫瘍環境中に存在するアデノシンを減少させるための方法であって、CD39ポリペプチドを阻害する本開示の抗原結合化合物(例えば、抗体又は抗体フラグメント)の治療的有効量を個体に投与することを含むか、それから基本的になるか又はそれからなる方法である。ある実施形態において、この個体は、癌を有する。
ある実施形態において、CD39ポリペプチドを阻害する抗体の有効量とは、個体におけるATPからAMPへのCD39に媒介される異化の阻害に関する少なくともEC50(任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100)の血中濃度を(例えば、抗原結合化合物のその後の投与までに)達成及び/又は維持するのに有効な量である。ある実施形態において、CD39ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量とは、個体の血管外組織中におけるATPからAMPへのCD39に媒介される異化の阻害に関するEC50(任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100)を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、CD39ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量とは、個体におけるATPからAMPへのCD39に媒介される異化の阻害に関するEC50(任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100)を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、CD39ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量は、1~20mg/kg体重である。ある実施形態において、この有効量を1週間毎、2週間毎、1ヶ月毎又は二ヶ月毎に個体に投与する。
任意選択により、この個体は、癌を有するか又は癌を有しやすいヒトである。任意選択により、この個体は、CD39及び/又は存在(分泌若しくは放出)又は可溶性のCD39タンパク質を発現する悪性細胞によって特徴付けられる癌を有するか又はこの癌を有しやすいヒトである。任意選択により、この個体は、癌を有するか又を有しやすく、且つ循環性の可溶性細胞外CD39タンパク質又はCD39を発現する腫瘍浸潤性の白血球を検出可能なレベルで有するヒトである。
この抗体は、任意選択により、10-9M未満(それよりも良好な)、好ましくは10-10M未満若しくは好ましくは10-11M未満のヒトCD39ポリペプチドに対する結合親和性(KD)によって特徴付けられ、且つ/又は1μg/ml未満(それよりも良好な結合)におけるEC50でのヒトCD39との結合によって特徴付けられ、好ましくは、この抗体は、細胞表面でヒトCD39を発現する細胞(例えば、腫瘍細胞)への結合に関して、0.5μg/ml以下、任意選択により0.2μg/ml以下、任意選択により0.1μg/ml以下のEC50を有する。
この抗体は、任意選択により、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
この抗体は、任意選択により、1μg/ml未満(それよりも良好な)、任意選択により0.5μg/ml未満の、CD39発現細胞(例えば、Ramos腫瘍細胞)中におけるCD39の酵素活性の中和に関するEC50によって特徴付けられる。
ある実施形態において、この抗体は、結合特異性と、CD39の酵素活性を中和する能力とを保持するモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。ある実施形態において、この抗体は、IgG1抗体である。例えば、この抗体は、ヒトIgG1アイソタイプのFcドメインであって、このFcドメインと、Fcγ受容体(例えば、CD16)との間の結合を減少させるように改変されているヒトIgG1アイソタイプのFcドメインを含む抗体であり得る。ある実施形態において、抗体又はフラグメントは、Fcドメインを欠いているか、又は抗体介在細胞性細胞傷害(ADCC)及び/若しくはCDCを誘導しないFcドメインを含み;任意選択により、抗体又はそのフラグメントは、FcγRIIIA(CD16)ポリペプチドに結合しないFcドメインを含む。ある実施形態において、Fcドメイン(例えば、ヒトIgG1アイソタイプ、ヒトIgG2アイソタイプ、ヒトIgG3アイソタイプ又はヒトIgG4アイソタイプに由来する)は、野生型Fcドメインと比較してアミノ酸改変(例えば、置換)を含み、この置換により、このFcドメイン(又はそれを含有する抗体)のFcγ受容体(例えば、CD16)に結合する能力及び/又は補体に結合する能力が低下する。ある実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、毒性部分に連結されていない。
また、提供されるのは、ヒト抗CD39抗体を産生させる方法であって、先述の特性の何れかを有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞及び抗CD39抗体の発現に適切な条件下でこのような細胞を培養し、且つ任意選択により産生された抗体を回収するか又は精製することを含む方法である。本開示は、このようなタンパク質、核酸、ベクター及び/又は細胞及び一般的には活性成分又は本組成物の処方、送達、安定性若しくは他の特徴を促進する不活性成分であり得る1つ以上のさらなる成分(例えば、様々な担体)を含む、組成物、例えば薬学的に許容可能な組成物及びキットにも関する。本開示は、CD39介在性生物学的活性の調整などにおいて、例えばそれに関連する疾患、特に癌の処置において、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物及び/又は組成物を作製し且つ使用する、様々な新規の及び有用な方法にさらに関する。
本開示は、リンパ球(例えば、T細胞)の活性の増強を、それを必要とする対象において行う方法、又はリンパ球(例えば、T細胞)の活性を回復させるための方法、又はリンパ球(例えば、T細胞)のアデノシンにより媒介される阻害を軽減する方法であって、上述の組成物の何れかの有効量を対象に投与することを含む方法も提供する。ある実施形態において、この対象は、癌に罹患している患者である。例えば、この患者は、固形腫瘍、例えば結腸直腸癌、腎癌、卵巣癌、肺癌、乳癌又は悪性の黒色腫に罹患している可能性がある。代わりに、この患者は、造血癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫に罹患している可能性がある。
本開示は、個体の疾患の処置のための方法であって、この処置は、CD39の酵素活性の中和のために(例えば、0.05~1μg/ml、0.1~1μg/mlのEC100)、少なくともEC50(例えば、0.01~0.5μg/mlのEC50)、任意選択によりEC70又は任意選択によりEC100に対応する血液(若しくは血清)又は血管外組織(例えば、腫瘍環境)中における濃度を抗CD39抗体の2回の連続する投与間で達成及び/又は維持するのに有効な量で抗CD39抗体を少なくとも1回(任意選択により少なくとも2回)投与する少なくとも1回の投与サイクルにわたり、CD39の酵素活性を中和する抗CD39抗体を個体に投与することを含む、方法も提供する。この抗体を、例えば少なくとも約0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml又は2μg/mlの循環又は細胞外組織(例えば、腫瘍環境)中における濃度を達成及び/又は維持するための量で投与し得る。例えば、0.05~1μg/ml又は0.1~1μg/mlの血管外組織中における濃度を達成するために、この抗CD39抗体を、0.5~10μg/ml又は1~10μg/mlの抗CD39抗体の循環中における濃度を達成するのに有効な量で投与する。任意選択により、この抗CD39抗体を、抗CD39抗体の2回の連続投与間で少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間及び/又は投与サイクル全体にわたって少なくとも2回投与し、且つ抗CD39抗体の濃度を少なくとも上述の濃度に維持するのに有効な量で投与する。
本開示は、個体の疾患の処置のための方法であって、この処置は、少なくとも1μg/ml、任意選択により少なくとも10μg/ml、任意選択により1~100μg/mlの抗CD39抗体の血中濃度又は組織中濃度を抗CD39抗体の2回の連続する投与間で達成及び/又は維持するのに有効な量で抗CD39抗体を少なくとも1回(任意選択により少なくとも2回)投与する少なくとも1回の投与サイクルにわたり、CD39の酵素活性を中和する抗CD39抗体を個体に投与することを含む、方法も提供する。任意選択により、この抗CD39抗体を抗CD39抗体の2回の連続投与間で少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間及び/又は投与サイクル全体にわたって少なくとも2回投与し、且つ少なくとも1μg/ml、任意選択により少なくとも10μg/ml、任意選択により1~100μg/mlの抗CD-39抗体の連続した血中濃度又は組織中濃度を維持するのに有効な量で投与する。
これらの態様は、本明細書に記載された説明でより詳細に説明されており、追加の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載された説明から明らかになるであろう。
定義
「含む」が使用される場合、これは、「から基本的になる」又は「からなる」に任意選択により置き換えられ得る。
「含む」が使用される場合、これは、「から基本的になる」又は「からなる」に任意選択により置き換えられ得る。
ヒトCD39(「血管」CD39、NTPdアーゼ1、ENTPD1、ATPDアーゼ及び血管ATPジホスホヒドロラーゼとしても既知である)は、ATPアーゼ活性を示す。CD39は、細胞外ATP及び細胞外ADPをAMPに加水分解し、このAMPは、別の酵素5-プライムヌクレオチダーゼによりアデノシンにさらに変換される。「血管」ヒトCD39成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、受入番号P49961においてGenbankで示されており(この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる)、且つ下記のとおりである。
本明細書に関連して、「中和する」又は「中和すること」は、CD39ポリペプチドを指す場合(例えば、「CD39を中和する」、「CD39の活性を中和する」又は「CD39の酵素活性を中和する」)、CD39のATP加水分解(ATPアーゼ)活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特にAMP及び/又はADPのCD39により媒介される生成の阻害を含み、すなわちATPからAMP及び/又はADPへのCD39により媒介される異化の阻害を含む。膜結合型CD39の場合、これを、例えばATPからAMP及び/又はADPへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する細胞アッセイにおいて直接的又は間接的に測定し得る。可溶性CD39の場合、これを、試験化合物と共に、本明細書で説明された組換え可溶性CD39をインキュベートし、次いでATPからAMP及び/又はADPへの変換を測定することにより、直接的又は間接的に測定し得る。例えば、本明細書で説明されているように、例えば存在するATPの量に比例する発光単位を定量することにより、ATPの消失及び/又はAMPの生成を評価し得る。ある実施形態において、例えば本明細書で説明されたアッセイ(例えば、ATPの消失及び/又はAMPの生成)を参照すると、抗体調製物は、ATPからAMPへの変換の少なくとも60%の減少を生じさせるか、ATPからAMPへの変換の少なくとも70%の減少を生じさせるか、又はATPからAMPへの変換の少なくとも80%又は90%の減少を生じさせる。
「癌の処置」などが抗CD39結合物質(例えば、抗体)に関して言及される場合には常に、これは、(a)癌の処置の方法であって、このような治療を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量で(治療的有効量)、好ましくは本明細書中で指定されるような用量(量)で(好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中で)抗CD39結合物質を投与する(少なくとも1回の処置)ステップを含む方法;(b)(特にヒトにおける)癌の処置のための抗CD39結合物質の使用又はその処置における使用のための抗CD39結合物質;(c)癌の処置のための医薬品の製造のための抗CD39結合物質の使用、任意選択により、抗CD39結合物質を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置のための医薬品又は有効用量の癌の処置に適切な抗CD39結合物質を含む医薬品の製造のために抗CD39結合物質を使用する方法;又は(d)本願が提出される国で特許を得ることを可能とする主題に従う、a)、b)及びc)の何れかの組み合わせを含み得る。
本明細書中で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、エピトープに免疫特異的に結合可能な三次元構造を含むドメインを指す。従って、ある実施形態において、このドメインは、超可変領域、任意選択により、抗体鎖のVH及び/又はVLドメイン、任意選択により、少なくともVHドメインを含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、非免疫グロブリン骨格からのポリペプチドドメインを含み得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含み得る。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、下記の5種の主要なクラスの1つに割り当てられる:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM。これらのいくつかは、サブクラス又はアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及び同類のもの)にさらに分類される。代表的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対は1本の「軽」鎖(約25kDa)及び1本の「重」鎖(約50~70kDa)を有する。各鎖のN末端は、抗原認識に主に関与する約100~110又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」及び「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。IgGは、生理学的状況において最も共通する抗体であるため、及び実験室で最も容易に作製されるため、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト又はそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」は、本明細書中に記載の抗体の何れかの何らかの断片又は誘導体も含む。
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープ又はネイティブタンパク質の何れかの組換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばCD39に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的な結合を決定するための他の方法を以下でさらに記載し、これらは、当技術分野で周知である。
抗体が特定のモノクローナル抗体(例えば、抗体I-394)と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組換えCD39分子又は表面発現CD39分子の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて参照抗体のCD39ポリペプチド又はCD39発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag](式中、[Ab-Ag]は、抗体-抗原複合体のモル濃度であり、[Ab]は未結合抗体のモル濃度であり、[Ag]は未結合抗原のモル濃度である)として定められる解離定数Kdにより与えられる。親和性定数Kaは、1/Kdにより定義される。mAbの親和性を決定するための方法は、Harlow,et al.,Antibody:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan et al.,eds,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)及びMuller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。mAbの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)スクリーニング(BIAcore(商標)SPR分析装置による分析など)の使用である。
本明細書に関連して、「決定基」はポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指す。
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば、抗体又は受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造/構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列(一次構造)上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、従って分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す(二次、三次及び/又は四次構造)アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。従って、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
用語「内在化」(「細胞内内在化」と交換可能に使用される)は、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移行させるプロセスに関連する分子的な、生化学的な及び細胞の事象を指す。分子の細胞内内在化の原因となるプロセスは、公知であり、特に細胞外分子(例えば、ホルモン、抗体及び小さい有機分子)、膜関連分子(例えば、細胞表面受容体)並びに細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体(例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜関連分子に結合した抗体)の内在化を伴い得る。そのため、「内在化の誘導及び/又は増加」は、細胞内内在化が開始される事象並びに/又は細胞内内在化の速度及び/若しくは程度が増加する事象を含む。
「薬剤」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
本明細書中での目的のために、「ヒト化」抗体は、1つ以上のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばCDRと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「CDR」(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24~34(L1)、50~56(L2)及び89~97(L3)及び重鎖可変ドメイン中の31~35(H1)、50~65(H2)及び95~102(H3);Kabat et al.1991)及び/又は「超可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基26~32(L1)、50~52(L2)及び91~96(L3)及び重鎖可変ドメイン中の26~32(H1)、53~55(H2)及び96~101(H3);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol1987;196:901-917)又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Kabat et al.、前出に記載の方法により行われる。「Kabat位置」、「Kabatにおけるような可変ドメイン残基付番」及び「Kabatによる」などの句は、本明細書中で、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Kabat付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFR若しくはCDRの短縮又はそれへの挿入に対応する少数の又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、CDR H2の残基52の後に1つのアミノ酸挿入(Kabatによる残基52a)及び重鎖FR残基82の後に残基の挿入(例えば、Kabatによる残基82a、82b及び82cなど)を含み得る。残基のKabat付番は、「標準的な」Kabat付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。
「フレームワーク」又は「FR」残基は、本明細書中で使用される場合、CDRとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、CDRによって分離される近接領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)にさらに分けられ得る。
「Fcドメイン」、「Fc部分」及び「Fc領域」という用語は、例えば、ヒトγ(ガンマ)重鎖の約アミノ酸(aa)230~約aa450からの、抗体重鎖のC末端断片又は他のタイプの抗体重鎖(例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ)におけるその対応配列又はその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるKabatアミノ酸付番は、この開示を通じて使用される(Kabat et. al.(1991)Sequences of Protein of Immunological Interest,5th ed.,United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MDを参照されたい)。
「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」という用語は、実質的に又は基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度及び均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー並びに天然のアミノポリマー及び非天然のアミノポリマーに適用される。
「組換え」という用語は、例えば、細胞若しくは核酸、タンパク質(例えば、抗体若しくは抗体フラグメント)又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されているか、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ(非組換え)形態内では見出されない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本明細書に関連して、ポリペプチド又はエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性及び/又は親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
「同一性」又は「同一である」という用語は、2つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、2つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合のポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム(すなわち「アルゴリズム」)により扱われるギャップアライメント(存在する場合)を用いた2つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and DevereuX,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991;及びCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載のものが挙げられるが限定されない。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.12,387(1984);Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.),BLASTP、BLASTN and FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))を含む、GCGプログラムパッケージが挙げられる。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)及び他のソース(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894;Altschul et al.、前出)から公開されている。周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
抗体の製造
抗CD39抗原結合ドメイン又はそのようなドメインを含むタンパク質(例えば、抗体又は抗体フラグメント)は、可溶性ヒトCD39ポリペプチド、例えば膜結合型CD39で見出されるN末端及びC末端付近の2つの膜貫通ドメインを欠いているヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つそれを中和する。ある実施形態において、この薬剤は、CD39のATPアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、アデノシンのCD39により媒介される生成を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、ATPからAMPへのCD39により媒介される異化を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、リンパ球活性(例えば、T細胞)のアデノシンにより媒介される阻害を阻害する。ある態様において、この抗体は、完全長抗体、抗体フラグメント及び合成又は半合成の抗体由来分子から選択される。
抗CD39抗原結合ドメイン又はそのようなドメインを含むタンパク質(例えば、抗体又は抗体フラグメント)は、可溶性ヒトCD39ポリペプチド、例えば膜結合型CD39で見出されるN末端及びC末端付近の2つの膜貫通ドメインを欠いているヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つそれを中和する。ある実施形態において、この薬剤は、CD39のATPアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、アデノシンのCD39により媒介される生成を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、ATPからAMPへのCD39により媒介される異化を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、リンパ球活性(例えば、T細胞)のアデノシンにより媒介される阻害を阻害する。ある態様において、この抗体は、完全長抗体、抗体フラグメント及び合成又は半合成の抗体由来分子から選択される。
可溶性(及び任意選択により膜結合型)CD39タンパク質の酵素活性(ATPアーゼ活性)を強力に阻害する抗体は、ある実施形態において、可溶性(及び任意選択により膜結合型)CD39タンパク質の高次構造の1つにおいて、この可溶性(及び任意選択により膜結合型)CD39タンパク質のドメイン移動を固定又は制限し得、それにより、この可溶性CD39タンパク質がその基質を加水分解することを防ぐ。この抗体は、これを可溶性(及び任意選択により膜結合型)CD39のC末端ドメイン及びN末端ドメインの両方に同時に結合することによって達成し得る。
ある実施形態において、抗CD39抗原結合ドメイン又はこの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質(例えば、抗体又は抗体フラグメント、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体等)は、相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)を含む。この抗原結合ドメインを、所望の特性及び/又は改善された特性をもたらすように設計又は改変し得る。
ある実施形態において、抗CD39抗原結合タンパク質は、ヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つその活性を阻害し得、この抗原結合タンパク質は、フレームワーク(例えば、ヒト起源のアミノ酸配列を有するフレームワーク)並びにCDR1、CDR2及びCDR3をそれぞれ含むVH及びVLを含む。ある実施形態において、この抗原結合タンパク質は、CD39に結合した場合、CD39のドメイン移動を制限する。任意選択により、VHフレームワーク及び/又はVLフレームワーク(例えば、FR1、FR2、FR3及び/又はFR4)は、ヒト起源である。
特定の実施形態において、この結合分子及び結合ドメインは、例えば、2本のポリペプチド鎖で見出される関連VLドメイン及び関連VHドメインの形態の免疫グロブリン可変ドメインに由来し得るか、又は一本鎖抗原結合ドメイン(例えば、scFv、VHドメイン、VLドメイン、dAb、V-NARドメイン又はVHHドメイン)に由来し得る。
ある態様において、このCD39結合剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体から選択される抗体である。
ある態様において、この薬剤は、本明細書でさらに開示されているように、ヒトIgG1の定常ドメイン又はFcドメインに由来する(例えば、改変されている)定常ドメイン又はFcドメインを含む抗体のフラグメントである。
ある態様において、この薬剤は、抗体フラグメントであって、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’-SHフラグメント、F(ab)2フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、重鎖Ig(ラマIg又はラクダIg)、VHHフラグメント、単一ドメインFV及び一本鎖抗体フラグメントから選択される抗体フラグメントを含む。ある態様において、この薬剤は、合成又は半合成の抗体由来分子であって、scFv、dsFV、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、IgNAR及び多重特異性(例えば、二重特異性)抗体から選択される合成又は半合成の抗体由来分子を含む。この薬剤は、任意選択により、Fcドメインをさらに含み得る。
ある態様において、この抗体は、少なくとも部分的に精製された形態である。
ある態様において、この抗体は、基本的に単離された形態である。
抗体を、当技術分野で既知の様々な技術により製造し得る。ある実施形態において、本開示の抗体を(例えば、ファージディスプレイライブライから生成された)抗体ライブラライからの選択により製造する。別の実施形態において、CD39ポリペプチド(好ましくは、可溶性ヒトCD39細胞外ドメインポリペプチド)を含む免疫原による非ヒト動物(好ましくはマウス)への免疫付与により、抗体を産生させる。このCD39ポリペプチドは、任意選択により、完全長CD39ポリペプチドのフラグメント又は誘導体(典型的には免疫原性フラグメント)であり得、このフラグメント又は誘導体を含み得、すなわちCD39ポリペプチドを発現する細胞の表面上に露出したエピトープを含むこのポリペプチドの一部であり得るか又はこの一部を含み得る。そのようなフラグメントは、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約7つの連続したアミノ酸を含み、さらにより好ましくは、その少なくとも約10の連続したアミノ酸を含む。フラグメントは、典型的には、受容体の細胞外ドメインに基本的に由来する。ある実施形態において、この免疫原は、脂質膜中(典型的には細胞の表面)に野生型ヒトCD39ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、この免疫原は、任意選択により処理されているか又は溶解している、無傷の細胞(特に無傷のヒト細胞)を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、組換えCD39ポリペプチドである。
抗原で非ヒト哺乳動物に免疫付与するステップを、マウス中で抗体の産生を刺激するための当技術分野で公知のあらゆる方法で実行し得る(例えば、E.Harlow and D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1988)を参照されたい。この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる)。この抗体を産生するハイブリドーマの単離は、公知であり、当技術分野で公知のあらゆる方法で実行し得る。
例えば、(Ward et al.Nature,341(1989)p.544、この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる)で開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても抗体を製造し得る。
抗体の競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか1つを使用して、CD39(特にモノクローナル抗体mAb20又はmAb21と実質的に又は基本的に同一のCD39上の領域)に結合する1つ又は複数の抗体の特定を容易に決定し得る。多くのそのようなアッセイは、日常的に実行されており、且つ当技術分野で公知である(例えば、1997年8月26日に刊行された米国特許第5,660,827号明細書を参照されたい。この明細書は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる)。
例えば、検査する試験抗体が異なる供給源動物から得られる場合又は異なるIgアイソタイプ由来である場合、例えばその開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開2018/167267号パンフレットに開示のとおり、対照(例えば、mAb20又はmAb21)と試験抗体とを混合し(又はプレ吸着させ)、CD39ポリペプチドを含有するサンプルに適用させる簡単な競合アッセイを利用し得る。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコル及びBIACORE分析の使用は、そのような競合研究での使用に適している。
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって公知のように行い得る。このようなマッピング/特徴評価方法の一例として、抗CD39抗体に対するエピトープ領域は、CD39タンパク質における露出アミン/カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、HXMS(質量分析により検出される水素-重水素交換)の使用であり、ここで受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素/重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に加わる骨格アミド基は、逆交換から保護され、従って重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシンのタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離及び/又はエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ehring H,Analytical Biochemistry,Vol.267(2)pp.252-259(1999)Engen,J.R.and Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73,256A-265Aを参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング(NMR)であり、一般的には遊離抗原及び抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元NMRスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、15Nで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがNMR-スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは、一般に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop.2004;(44):149-67;Huang et al.,Journal of Molecular Biology,Vol.281(1)pp.61-67(1998);及びSaito and Patterson,Methods.1996 Jun;9(3):516-24を参照されたい。
エピトープマッピング/特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Downard,J Mass Spectrom.2000 Apr;35(4):493-503及びKiselar and Downard,Anal Chem.1999 May 1;71(9):1792-1801を参照されたい。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピング及び同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域/配列は、プロテアーゼ消化により、例えばCD39に対して約1:50の比率でトリプシンを使用することによってpH7~8でo/n消化を使用することにより、続いてペプチド同定のために質量分析(MS)を行うことにより決定し得る。続いて、抗CD39結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料及び抗体とインキュベートし、続いて例えばトリプシン(それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる)による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も又は代替的に同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化により、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、従っておそらく免疫原性/抗原性について関連がないと思われるCD39ポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、結合に関与する可能性が高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体(すなわち折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体)を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、Clackson and Wells,Science 1995;267:383-386;及びWells,Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1-6を参照されたい。
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Wang et al.,Nature 1992;355:275-278は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成及びX結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のFab断片の物理学的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴(SPR、BIACORE)及び反射型干渉分光法(RifS)が挙げられる。例えば、Faegerstam et al.,Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14;Nice et al.,J.Chromatogr.1993;646:159-168;Leipert et al.,Angew.Chem.Int.Ed.1998;37:3308-3311;Kroeger et al.,Biosensors and Bioelectronics 2002;17:937-944を参照されたい。
典型的には、本明細書で提供される抗CD39抗体は、約104~約1011M-1(例えば、約108~約1010M-1)の範囲において、CD39ポリペプチド(例えば、本明細書の実施例で製造された単量体CD39ポリペプチド)に対する親和性を有する。例えば、抗CD39抗体は、例えば、(例えば、BIAcore(商標)SPR分析装置での分析による)表面プラズモン共鳴(SPR)スクリーニングによって決定される場合、CD39に関して1×10-9M未満の平均解離定数(KD)を有し得る。特定のより例示的な態様において、本開示は、CD39に関して約1×10-8M~約1×10-10M又は1×10-9M~約1×10-11MのKDを有する抗CD39抗体を提供する。
抗体は、例えば、約100、60、10、5又は1ナノモル以下の(すなわちより親和性の)平均KD、好ましくはサブナノモルの平均KD又は任意選択により約500、200、100若しくは10ピコモル以下の平均KDによって特徴付けられ得る。例えば、チップ表面上において、組換えにより産生されたヒトCD39タンパク質を固定し、その後、溶液中で試験する抗体を適用することにより、KDを決定し得る。ある実施形態において、この方法は、CD39への結合に関して抗体I-394、例えばmAb1~24の何れかと競合することができる(b)からの抗体を選択するステップ(d)をさらに含む。
本開示のモノクローナル抗体(例えば、抗体mAb20又はmAb21)をコードするDNAを、(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)従来の手順を使用して容易に単離して配列決定し得る。ある態様において、提供されるのは、本明細書の何れかの実施形態の抗CD39抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸である。単離すると、このDNAを発現ベクターに入れることができ、次いでこの発現ベクターを宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞)に遺伝子移入して、この組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他の箇所で説明されているように、そのようなDNA配列は、多数の目的の何れかのために改変され得、例えば抗体をヒト化するために、フラグメント又は誘導体を製造するために、又は例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位中で抗体の配列を改変するために改変され得る。ある実施形態において、提供されるのは、抗体(例えば、mAb20又はmAb21)の軽鎖及び/又は重鎖をコードする単離核酸配列並びにそのような核酸を(例えば、ゲノム中に)含む組換え宿主細胞である。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現は、当技術分野で公知である(例えば、Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5,pp.256(1993);及びPluckthun,Immunol.130,p.151(1992)を参照されたい)。
sCD39及び/若しくはmemCD39に結合することができ、且つ/又は他の所望の特性を有することができる抗体が特定されると、典型的には、この抗体も、他のポリペプチド(例えば、無関係のポリペプチド)に結合する能力に関して、本明細書で説明されたもの等の方法を使用して評価される。理想的には、この抗体は、CD39のみに相当な親和性で結合するが、無関係のポリペプチド又はNTPDアーゼファミリの他のポリペプチド(特にCD39-L1、CD39-L2、CD39-L3及びCD39-L4若しくはNTPDアーゼ8)に有意なレベルで結合しない。しかしながら、CD39に対する親和性が他の無関係なポリペプチド)に対するよりも相当に大きい(例えば、10×、100×、500×、1000×、10,000×又はより高い)限り、この抗体は、本方法での使用に適していることが認識されるであろう。
ある実施形態において、抗CD39抗体は、それらがヒトFcγ受容体、例えばCD16A、CD16B、CD32A、CD32B及び/又はCD64の何れか1つ以上に実質的な特異的結合を有しないように調製され得る。このような抗体は、Fcγ受容体に対する結合を欠くこと又は低い結合性を有することが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。代替的に、Fc受容体結合を回避するために、F(ab’)2断片など、定常領域を含まない(又は部分的に含む)抗体断片を使用し得る。Fc受容体結合は、例えば、BIACOREアッセイにおけるFc受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含め、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、Fc受容体への結合を最小化又は除外するためにFc部分が修飾される(例えば、1、2、3、4、5つ又はそれを超えるアミノ酸置換を導入することによって)何らかの抗体IgGアイソタイプを一般に使用し得る(例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第03/101485号パンフレットを参照されたい)。Fc受容体結合を評価するための細胞に基づくアッセイなどのアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第03/101485号パンフレットに記載されている。
ある実施形態において、抗体は、エフェクター細胞との最小限の相互作用を有する「Fcサイレント」抗体を生じるFc領域における1つ以上の特異的突然変異を含み得る。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のFc領域における突然変異によって得ることができ、当技術分野において記載されてきた。N297A突然変異、LALA突然変異(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.vol.20(6):685-691);D265A(Baudino et al.,2008,J.Immunol.181:6664-69)及びHeusser et al.,国際公開第2012/065950号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に1、2、3つ又はそれを超えるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体はIgG1又はIgG2であり、残基233~236、任意選択により、233~238(EU付番)において1つ、2つ又は3つの置換を含む。一実施形態では、抗体はIgG4であり、残基327、330及び/又は331(EU付番)に1つ、2つ又は3つの置換を含む。サイレントFc IgG1抗体の例は、IgG1 Fcアミノ酸配列におけるL234A及びL235A突然変異を含むLALA突然変異体である。Fcサイレント突然変異の別の例は、例えば、DAPA(D265A、P329A)突然変異(米国特許第6,737,056号明細書)としてIgG1抗体において用いられる、残基D265又はD265及びP329における突然変異である。別のサイレントIgG1抗体は、残基N297における突然変異(例えば、N297A、N297S突然変異)を含み、その結果、グリコシル化/非グリコシル化抗体を生じる。他のサイレント突然変異は、残基L234及びG237における置換(L234A/G237A);残基S228、L235及びR409における置換(S228P/L235E/R409K、T、M、L);残基H268、V309、A330及びA331における置換(H268Q/V309L/A330S/A331S);残基C220、C226、C229及びP238における置換(C220S/C226S/C229S/P238S);残基C226、C229、E233、L234及びL235における置換(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A;残基K322、L235及びL235における置換(K322A/L234A/L235A);残基L234、L235及びP331における置換(L234F/L235E/P331S);残基234、235及び297における置換;残基E318、K320及びK322における置換(L235E/E318A/K320A/K322A);残基(V234A、G237A、P238S)における置換;残基243及び264における置換;残基297及び299における置換;EU付番系によって定義される残基233、234、235、237及び238がPAAAP、PAAAS及びSAAASから選択される配列を含む置換(国際公開第2011/066501号パンフレットを参照されたい)を含む。
ある実施形態において、抗体は、Fc領域に1つ以上の特異的突然変異を含むことができる。例えば、そのような抗体は、ヒトIgG1起源のFcドメインを含み、Kabat残基234、235、237、330及び/又は331における突然変異を含む。そのようなFcドメインの一例は、Kabat残基L234、L235及びP331における置換(例えば、L234A/L235E/P331S又は(L234F/L235E/P331S))を含む。このようなFcドメインの別の例は、Kabat残基L234、L235、G237及びP331における置換(例えば、L234A/L235E/G237A/P331S)を含む。このようなFcドメインの別の例は、Kabat残基L234、L235、G237、A330及びP331における置換(例えば、L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)を含む。ある実施形態において、抗体は、Fcドメイン、任意選択により、ヒトIgG1アイソタイプのFcドメインを含む抗体であり、L234X1置換、L235X2置換及びP331X3置換を含み、X1はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X2はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X3はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、任意選択により、X1はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり;任意選択により、X2はグルタミン酸又はその保存的置換であり;任意選択により、X3はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Fcドメイン、任意選択により、ヒトIgG1アイソタイプのFcドメインを含む抗体であり、L234X1置換、L235X2置換、G237X4置換及びP331X4置換を含み、X1はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X2はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X3はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、X4はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、X1はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり;任意選択により、X2はグルタミン酸又はその保存的置換であり;任意選択により、X3はアラニン又はその保存的置換であり;任意選択により、X4はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Fcドメイン、任意選択により、ヒトIgG1アイソタイプのFcドメインを含む抗体であり、L234X1置換、L235X2置換、G237X4置換、G330X4置換及びP331X5置換を含み、X1はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X2はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、X3はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、X4はアラニン以外のアミノ酸残基、X5はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、X1はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり;任意選択により、X2はグルタミン酸又はその保存的置換であり;任意選択により、X3はアラニン又はその保存的置換であり;任意選択により、X4はセリン又はその保存的置換であり;任意選択により、X5はセリン又はその保存的置換である。本明細書で使用されている略記法では、形式は、野生型残基:ポリペプチド中の位置:突然変異体残基であり、残基位置は、KabatによるEU付番に従って示される。
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも90%、95%若しくは99%同一のアミノ酸配列を含むが、Kabat位置234、235及び331にアミノ酸残基を保持する(下線)。
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも90%、95%若しくは99%同一のアミノ酸配列を含むが、Kabat位置234、235及び331にアミノ酸残基を保持する(下線)。
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも90%、95%若しくは99%同一のアミノ酸配列を含むが、Kabat位置234、235、237、330及び331にアミノ酸残基を保持する(下線)。
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも90%、95%若しくは99%同一の配列を含むが、Kabat位置234、235、237及び331にアミノ酸残基を保持する(下線)。
Fcサイレント抗体は、ADCC活性を媒介しないか又は低いADCC活性を媒介し、すなわち、Fcサイレント抗体は、50%未満の特異的細胞溶解であるADCC活性を示す。好ましくは、抗体は、実質的にADCC活性を欠き、例えば、Fcサイレント抗体は、5%未満又は1%未満のADCC活性(特異的細胞溶解)を示す。Fcサイレント抗体は、CD39発現細胞の表面でのCD39のFcγR媒介性架橋の欠如も生じ得る。
ある実施形態において、抗体は、220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331及び409(重鎖定常領域における残基の付番はKabatによるEU付番に従う)からなる群から選択される任意の1、2、3、4、5つ又はそれを超える残基において重鎖定常領域に置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基234、235及び322における置換を含む。ある実施形態において、抗体は残基234、235及び331における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基234、235、237及び331における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基234、235、237、330及び331における置換を有する。一実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG1サブタイプのものである。アミノ酸残基は、KabatによるEU付番に従って示される。
ある実施形態において、本抗体は、この抗体のインビボ半減期を増加させるためにヒトFcRnポリペプチドへの結合を増加させるアミノ酸置換を含むFcドメインを含む。例示的な突然変異がStrohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.Vol.20(6):685-691で説明されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトIgG1アイソタイプの抗体で使用される置換の例は、Kabat残基M252、S254及びT256における置換;残基T250及びM428における置換;残基N434における置換;残基H433及びN434における置換;残基T307、E380及びN434における置換;残基T307、E380及びN434における置換;残基M252、S254、T256、H433、N434及び436における置換;残基I253における置換;残基P257、N434、D376及びN434における置換である。
ある実施形態において、本抗体は、プロテアーゼによる開裂に対する感受性の低下を付与するアミノ酸置換を含むFcドメインを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、腫瘍形成に関連するプロテイナーゼの最も顕著なファミリを表す。癌細胞は、MMPを発現し得るが、細胞外MMPの大部分は、様々なタイプの間質細胞によりもたらされ、この間質細胞は、腫瘍に浸潤し、且つプロテイナーゼ及びプロテイナーゼ阻害剤の特定のセットをそれぞれ産生し、これらは、細胞外空間に放出され、腫瘍周辺の環境を特異的に変更する。腫瘍微小環境中に存在するMMPは、ヒンジ領域内で抗体を開裂し得、そのため腫瘍部位内で機能するように設計されている治療用抗体の不活性化につながる場合がある。ある実施形態において、アミノ酸置換を含むFcドメインは、GluV8、IdeS、ゼラチナーゼA(MMP2)、ゼラチナーゼB(MMP-9)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-7(MMP-7)、ストロメリシン(MMP-3)及びマクロファージエラスターゼ(MMP-12)からなる群から選択されるプロテアーゼの何れか1つ、2つ、3つ又はより多く(又は全て)による開裂に対する感受性が低下している。ある実施形態において、開裂に対する感受性が低下している抗体は、残基E233-L234及び/又はL235でアミノ酸置換を含むFcドメインを含む。ある実施形態において、この抗体は、残基E233、L234、L235及びG236でアミノ酸置換を含むFcドメインを含む。ある実施形態において、この抗体は、残基233~238の1つ又は複数でアミノ酸置換を含むFcドメインを含み、その結果、例えばE233-L234-L235-G236配列がP233-V234-A235に置き換えられる(G236は欠失している)。例えば、国際公開第99/58572号パンフレット及び同第2012087746号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗原結合化合物を、任意の所望の段階において、CD39の酵素活性を阻害し(特にsCD39のATPアーゼ活性をブロックし)、且つ可溶性CD39タンパク質による(及び任意選択により、さらにCD39発現細胞による)ADP及びAMP(及びCD73と一緒にアデノシン)の産生を減少させ、次いでリンパ球のアデノシンにより媒介される阻害の活性を回復させ、且つ/又はこの阻害を軽減する能力に関して評価し得る。
抗体の阻害活性(例えば、免疫増強能力)を、例えばATPの消失(加水分解)及び/又はAMPの生成を検出するためのアッセイで評価し得る。
可溶性組換えヒトCD39タンパク質を阻害する抗体の能力を、可溶性CD39タンパク質と共に試験抗体をインキュベートした後にATPを検出することにより試験し得る。簡潔に説明すると、試験抗体の用量範囲を37℃で1時間にわたり実施例1で説明する可溶性組換えヒトCD39タンパク質と共にインキュベートするアッセイにおいて、Cell Titer Glo(商標)(Promega)を使用してATPを定量し得る。37℃でさらに30分にわたりプレートに20μMのATPを添加した後、CTG試薬を添加する。暗所での5分間の短いインキュベーション後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量する。
CD39タンパク質を発現する細胞を阻害する抗体の能力を、細胞(例えば、Ramos細胞、CD39が遺伝子移入された細胞等)と共に試験抗体をインキュベートした後にATPを検出することにより試験し得る。例えば、実施例、方法を参照されたい。細胞を試験抗体と共に37℃で1時間にわたりインキュベートし得る。次いで、細胞を37℃でさらに1時間にわたり20μMのATPと共にインキュベートする。プレートを400gで2分にわたり遠心分離し、細胞上清を発光マイクロプレート(白色ウェル)に移す。この上清にCTGを添加し、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して、暗所での5分間のインキュベーション後に放射光を定量する。抗CD39抗体の有効性を、抗体の存在下での放射光と、ATPのみ(最大光放射)並びにATP及び細胞(最小光放射)とを比較することにより決定する。
抗体の存在下でのAMPへのATPの加水分解の減少、及び/又はATPの増加、及び/又はAMPの生成の減少は、この抗体がCD39を阻害することを示す。ある実施形態において、例えば実施例、方法のように、試験抗体と共に、CD39ポリペプチドを発現する細胞(例えば、Ramos細胞)をインキュベートした後、Cell Titer Glo(商標)(Promega)を使用してATPを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、細胞によって発現されるCD39ポリペプチドの酵素活性の少なくとも60%の低下を生じさせることができ、好ましくは、この抗体は、細胞中においてCD39ポリペプチドの酵素活性の少なくとも70%、80%又は90%の低下を生じさせる。
ある実施形態において、例えば実施例、方法のように、試験抗体と共に可溶性組換えCD39ポリペプチドをインキュベートした後、Cell Titer Glo(商標)(Promega)を使用してATPを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、(例えば、細胞の非存在下で)可溶性組換えCD39ポリペプチドの酵素活性の少なくとも60%の低下を生じさせることができ、好ましくは、可溶性組換えCD39ポリペプチドの酵素活性の少なくとも70%、80%又は90%の低下を生じさせることができる。
抗体の活性を、例えばリンパ球活性のアデノシンにより媒介される阻害を軽減するために、又はリンパ球活性の活性化を生じさせるために免疫細胞(例えば、アデノシン受容体発現免疫細胞;A2A受容体発現細胞)の活性を調節する能力に関する間接アッセイでも測定し得る。これを、例えばサイトカイン放出アッセイを使用して対処し得る。別の例において、抗体を、リンパ球の増殖を調節する能力に関する間接アッセイで評価し得る。
CD39上のエピトープ
ある態様において、本抗体は、細胞表面で発現されたCD39上に存在する抗原決定基に結合する。
ある態様において、本抗体は、細胞表面で発現されたCD39上に存在する抗原決定基に結合する。
ある態様において、本抗体は、mAb1~24(又はI-394)のVH及びVLを有する抗体と実質的に同一のエピトープに結合する。ある実施形態において、この抗体は、抗体mAb1~24(又はI-394)が結合するエピトープと少なくとも部分的に重複するか、又はこのエピトープ中の少なくとも1つの残基を含むCD39のエピトープに結合する。この抗体が結合する残基は、CD39ポリペプチドの表面上(例えば、細胞の表面上で発現されるCD39ポリペプチド中)に存在すると特定され得る。
CD39突然変異体が遺伝子移入された細胞への抗CD39抗体の結合を測定し得、且つ抗CD39抗体の、野生型CD39ポリペプチド(例えば、配列番号1)に結合する能力と比較し得る。抗CD39抗体と突然変異体CD39ポリペプチド(例えば、表1の突然変異体)との間の結合の減少は、(例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のFACS試験のような既知の方法により測定した場合若しくは突然変異体ポリペプチドへの結合のBiacore試験により測定した場合に)結合親和性の減少が存在すること及び/又は(例えば、抗CD抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおいてBmaxの減少により実証される場合に)抗CD39抗体の総結合能力の減少が存在することを意味する。結合の有意な減少は、抗CD39抗体がCD39に結合している場合、突然変異した残基が抗CD39抗体への結合に直接関与していること又はこの結合タンパク質に近接していることを示す。
いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、抗CD39抗体と突然変異体CD39ポリペプチドとの間の結合親和性及び/又は結合能力が、この抗体と野生型CD39ポリペプチドとの間の結合と比較して40%超、50%超、55%超、60%超、65%超、70%超、75%超、80%超、85%超、90%超又は95%超減少していることを意味する。特定の実施形態において、結合は、検出可能な限界未満まで減少する。いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、突然変異体CD39ポリペプチドへの抗CD39抗体の結合が、この抗CD39抗体と野生型CD39ポリペプチドとの間で観測されているものの、50%未満(例えば、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%又は10%未満)である場合に証明される。
いくつかの実施形態において、抗体mAb1~24(又はI-394)が結合するアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸に置換されている突然変異体CD39ポリペプチドの場合の結合が、そのような置換を含まない野生型CD39ポリペプチド(例えば、配列番号1のポリペプチド)への結合と比較して有意に低いことを示す抗CD39抗体が提供される。
ある実施形態において、抗体は、この抗体と、配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型CD39ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合にR138、M139及びE142(配列番号1を基準にする)からなる群から選択される残基の1つ又は複数(又は全て)で突然変異を含む突然変異体CD39ポリペプチドへの結合が減少している。
例示的な抗体可変領域の配列
本開示の抗体の例としては、抗体mAb1~mAb24の何れか1つのVHドメインと、VLドメインとを含む抗体が挙げられる。抗CD39抗体mAb1~mAb24のVH及びVL配列は、表A及びBに提供される(実施例13)。
本開示の抗体の例としては、抗体mAb1~mAb24の何れか1つのVHドメインと、VLドメインとを含む抗体が挙げられる。抗CD39抗体mAb1~mAb24のVH及びVL配列は、表A及びBに提供される(実施例13)。
本開示に係る1つの例示的な高い効力の抗CD39 VH及びVLペアは、抗体mAb20のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており(配列番号31)、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている(配列番号36)。このような抗体は、例えば、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し得る。
本開示に係る別の例示的な高い効力の抗CD39 VH及びVLペアは、抗体mAb21のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており(配列番号31)、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている(配列番号37)。このような抗体は、例えば、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し得る。
ある態様において、ヒトCD39ポリペプチドに結合する単離抗体は、ヒト起源のVH及びVLフレームワーク(例えば、FR1、FR2、FR3及びFR4)を含むとして特定され得る。ある態様において、この抗体は、下記を含む:アミノ酸配列:DYNMH(配列番号8)若しくはその少なくとも4つの連続したアミノ酸の配列を含むHCDR1であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、HCDR1;アミノ酸配列:YIVPLNGGSTFNQKFKG(配列番号9)若しくはその少なくとも4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ若しくは10の連続したアミノ酸の配列を含むHCDR2であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得、任意選択によりKabat位置61においてアスパラギン酸が置換されており、任意選択によりKabat位置65においてリジンが置換されている、HCDR2;アミノ酸配列:GGTRFAY(配列番号10)若しくはその少なくとも4つ、5つ若しくは6つの連続したアミノ酸の配列を含むHCDR3であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、HCDR3;アミノ酸配列:RASESVDNFGVSFMY(配列番号11)若しくはその少なくとも4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ若しくは10の連続したアミノ酸の配列を含むLCDR1であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得、任意選択によりKabat位置24においてアルギニンが置換されている、LCDR1;アミノ酸配列:GASNQGS(配列番号12)若しくはその少なくとも4つ、5つ若しくは6つの連続したアミノ酸の配列を含むLCDR2領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、LCDR2領域;及び/又はアミノ酸配列:QQTKEVPYT(配列番号13)若しくはその少なくとも4つ、5つ、6つ、7つ若しくは8つの連続したアミノ酸の配列を含むLCDR3領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の1つ若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、LCDR3領域。CDR位置は、Kabatナンバリングに従い得る。
ある実施形態において、HCDR2は、式Iのアミノ酸配列:Y-I-V-P-L-N-G-G-S-T-F-Xaa1-Q-K-F-Xaa2-G(配列番号14)又はその部分配列を含み、式中、Xaa1は、任意のアミノ酸残基であり得、任意選択により、Xaa1は、アスパラギン又はセリンであり;Xaa2は、任意のアミノ酸残基であり得、任意選択により、Xaa2は、リジン又はグルタミンである。ある実施形態において、HCDR2は、アミノ酸配列:YIVPLNGGSTFSQKFKG(配列番号15)を含む。ある実施形態において、HCDR2は、アミノ酸配列:YIVPLNGGSTFSQKFQG(配列番号16)を含む。
ある実施形態において、LCDR1は、式IIのアミノ酸配列:Xaa3-A-S-E-S-V-D-N-F-G-V-S-F-M-Y(配列番号17)を含み、式中、Xaa3は、任意のアミノ酸残基であり得、任意選択により、Xaa3は、リジン又はアルギニンである。ある実施形態において、LCDR1は、アミノ酸配列:KASESVDNFGVSFMY(配列番号18)を含む。
ある実施形態において、本抗体は、ヒトサブグループIGHV1-3由来の重鎖フレームワークを(任意選択によりIGHJ1と一緒に)含み、任意選択により、IGHV1-3は、IGHV1-3*01である。ある実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトサブグループIGKV4-1由来の軽鎖フレームワークを(任意選択によりIGKJ4と一緒に)含む。
ある態様において、本発明は、ヒトCD39ポリペプチドに結合する抗原結合ドメイン又は抗体であって、
(a)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(b)配列番号9、14、15又は16のアミノ酸配列を含むCDR-H2;
(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H3;
(d)配列番号11、17又は18のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(e)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L2;
(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L3;及び
(g)ヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列
を含む抗原結合ドメイン又は抗体を提供する。
(a)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(b)配列番号9、14、15又は16のアミノ酸配列を含むCDR-H2;
(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR-H3;
(d)配列番号11、17又は18のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(e)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-L2;
(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-L3;及び
(g)ヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列
を含む抗原結合ドメイン又は抗体を提供する。
本抗体は、例えば、抗体の親和性、安定性又は他の特性を増強させるためのヒト重鎖及び/又は軽鎖フレームワークにわたる1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はより多くのアミノ酸置換をさらに含み得る。任意選択により、置換は、非ヒト哺乳動物(例えば、マウス又はラット)中の特定の位置に存在する残基を導入する。
本明細書のVH配列の実施形態の何れかにおいて、Kabat重鎖位置67におけるアミノ酸は、アラニンであり得る。
本明細書のVH配列の実施形態の何れかにおいて、Kabat重鎖位置71におけるアミノ酸は、バリンである。
本明細書のVH配列の実施形態の何れかにおいて、Kabat重鎖位置76におけるアミノ酸は、アルギニンである。
本明細書のVH配列のいくつかの実施形態において、Kabat重鎖位置48におけるアミノ酸は、イソロイシンであり得る。本明細書のVH配列の他の実施形態において、Kabat重鎖位置48におけるアミノ酸は、メチオニンであり得る。
ある実施形態において、VHは、Kabat位置67においてアラニン残基及び位置71においてバリンを含む。
ある実施形態において、VHは、Kabat位置48においてイソロイシン残基、Kabat位置67においてアラニン残基、Kabat位置71においてバリン及びKabat位置76においてアルギニンを含む。
本明細書のVL配列の実施形態の何れかにおいて、VLは、Kabat位置36(FR2)においてフェニルアラニンを含む。ある実施形態において、VLは、Kabat位置24(CDR1)においてリジンを含む。
本明細書のVH及びVLドメイン中の位置は、Kabatナンバリングシステム(Kabat et al.(1991)Sequences of Protein of Immunological Interest,5th ed.,United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD)を使用して記載される。
ある態様において、抗CD39抗体は、配列番号38のアミノ酸配列を有する重鎖に対する少なくとも約80%の配列同一性(例えば、少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、99%又はより高い同一性)を有する重鎖を含む。
ある態様において、抗CD39抗体は、配列番号39又は40のアミノ酸配列を有する軽鎖に対する少なくとも約80%の配列同一性(例えば、少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、99%又はより高い同一性)を有する軽鎖を含む。
ある態様において、指定した重鎖、軽鎖、可変領域、FR及び/又はCDR配列は、1つ又は複数の配列改変を含み得、例えば置換(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ又はより多くの配列改変)を含み得る。ある実施形態において、この置換は、保存的改変である。
本発明のさらなる目的は、本明細書で開示された抗体の機能保存的バリアントも包含する。「機能保存的バリアント」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を変更せずに変化させたものであり、例えば、限定されないが、アミノ酸の、類似特性(例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など)を有するアミノ酸による置き換えが挙げられる。保存されていると示されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なり得、その結果、類似機能の任意の2つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性パーセントは、変動し得、且つ例えばアラインメントスキームに従い、例えば類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくCluster法により決定される70%~99%であり得る。「機能保存的バリアント」は、BLAST又はFASTAアルゴリズムにより決定される少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、一層好ましくは少なくとも90%、一層より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性を有し、且つそれが比較される天然又は親タンパク質と同一又は実質的に類似の特性又は機能を有するポリペプチドも含む。
何れかの実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、任意選択により、抗体I-394(すなわち配列番号6及び7に示されるVH及びVLアミノ酸配列をそれぞれ有する)以外の抗体であると特定され得る。何れかの実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、任意選択により、抗体I-395、I-396、I-397、I-398又はI-399(例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる2018年3月16日に出願されたPCT特許出願PCT/欧州特許出願公開第2018/056661号明細書で開示されたVH及びVLアミノ酸配列を有する)以外の抗体であると特定され得る。何れかの実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、任意選択により、米国特許出願公開第2016/0137747A1号明細書で開示された抗体By40、Ba54g又はBY12(例えば、By40、Ba54g又はBY12のVH及びVLアミノ酸配列を有するもの以外の抗体;そのような抗体を産生するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体BY40以外の抗体であると特定され得る。
抗体のフラグメント及び誘導体(別途明記しない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本願で使用される用語1つ又は複数の「抗体」に包含される)を当技術分野で既知の技術により製造し得る。「フラグメント」は、無傷の抗体の一部を含み、一般には抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として下記が挙げられる:Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’-SHフラグメント、F(ab’)2フラグメント及びFvフラグメント;ダイアボディ;連続したアミノ酸残基の1つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント(本明細書では、「一本鎖抗体フラグメント」又は「一本鎖ポリペプチド」と称される)、例えば、限定されないが、(1)一本鎖Fv分子、(2)会合した重鎖部分を有しない、1つのみの軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド又はこの軽鎖可変ドメインの3つのCDRを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント、及び(3)会合した軽鎖部分を有しない、1つのみの重鎖可変領域を含む一本鎖ポリペプチド又はこの重鎖可変領域の3つのCDRを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント;並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性(例えば、二重特異性)抗体。含まれるのは、特にナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「dAb」である。
1mg/mL~500mg/mLの濃度で含む医薬処方物中に抗CD39抗体が組み込まれ得、前記処方物のpHは2.0~10.0である。本処方物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は、一般に溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む処方物として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師又は患者が使用前にそれに溶媒及び/又は希釈剤を添加する。
別の実施形態において、本医薬処方物は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液及び緩衝液を含み、この抗体は1mg/mL又はそれを超える濃度で存在し、前記処方物のpHは約2.0~約10.0である。
別の実施形態において、本処方物のpHは、約2.0~約10.0、約3.0~約9.0、約4.0~約8.5、約5.0~約8.0及び約5.5~約7.5からなる一覧から選択される範囲である。
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物はキレート剤も含む。さらなる実施形態において、本処方物は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
ペプチド医薬処方物中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸)が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然のことながら、医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば動脈における、静脈における、心臓における投与及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下における、筋肉又は腹部における投与において、このような処置を必要とする患者に投与し得る。医薬組成物の投与は、このような処置を必要とする患者への、いくつかの投与経路を通じて、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬側、口腔における投与、経口、胃腸における投与、鼻腔、肺、例えば細気管支及び肺胞又はそれらの組み合わせを通じた投与、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を通じた投与、ウレタル(uretal)及び非経口投与であり得る。
適切な抗体処方物は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによっても決定し得る。いくつかのモノクローナル抗体は、リツキサン(リツキシマブ)、ハーセプチン(トラスツズマブ)、ゾーレア(オマリズマブ)、ベクザー(トシツモマブ)、キャンパス(アレムツズマブ)、ゼバリン、オンコリム(Oncolym)など、臨床的状況で有効であることが示されており、抗体と共に同様の処方物を使用し得る。例えば、モノクローナル抗体は、100mg(10mL)又は500mg(50mL)の何れかの単回使用バイアルで、9.0mg/mL塩化ナトリウム、7.35mg/mLクエン酸ナトリウム二水和物、0.7mg/mLポリソルベート80及び注射のための滅菌水中でIV投与用に処方された10mg/mLの濃度で供給され得る。pHは6.5に調整する。別の実施形態において、本抗体は、pHが6.0の約20mMクエン酸Na、約150mM NaClを含む処方物中で供給される。
疾患の診断及び処置
本開示の抗CD39剤を使用して個体(特にヒト個体)を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書で説明された抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。典型的には、この個体は、癌又は感染性疾患(例えば、ウイルス感染、細菌感染)に罹患しているか又はこれらのリスクがある。ある実施形態において、この個体は、循環及び/又は組織サンプル(例えば、腫瘍サンプル若しくは腫瘍隣接組織サンプル)において、検出可能な可溶性(細胞外)CD39タンパク質を有する。
本開示の抗CD39剤を使用して個体(特にヒト個体)を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書で説明された抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。典型的には、この個体は、癌又は感染性疾患(例えば、ウイルス感染、細菌感染)に罹患しているか又はこれらのリスクがある。ある実施形態において、この個体は、循環及び/又は組織サンプル(例えば、腫瘍サンプル若しくは腫瘍隣接組織サンプル)において、検出可能な可溶性(細胞外)CD39タンパク質を有する。
例えば、ある態様において、提供されるのは、リンパ球の活性の回復又は増強を、それを必要とする個体において行う方法であって、本開示の中和抗CD39抗体又は抗体フラグメントを前記個体に投与するステップを含む方法である。ある実施形態において、この方法は、リンパ球の活性の増加が有利である疾患又は免疫抑制、免疫抑制細胞若しくは例えばCD4T細胞、CD8T細胞、B細胞)により生成されたアデノシンにより引き起こされるか、若しくはこれらによって特徴付けられる疾患を有する個体のリンパ球(例えば、T細胞)の活性を増加させることに向けられる。この方法は、例えば、腫瘍微小環境(及びこの環境中における、CD39により媒介されるアデノシン産生)が、免疫系による認識の欠如(免疫逃避)に寄与し得ると疑われる固形腫瘍を有する個体を処置するのに特に有用であるであろう。腫瘍環境(腫瘍組織又は腫瘍隣接組織)は、例えば、CD39発現免疫細胞(例えば、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞)の存在によって特徴付けられ得る。
より具体的には、本方法及び本組成物は、様々な癌及び他の増殖性疾患並びに感染性疾患の処置に利用される。この方法は、リンパ球の抗標的細胞(例えば、抗腫瘍)活性を阻害するアデノシンを減少させることにより機能し、任意選択により、さらに、リンパ球の抗腫瘍活性を増加させ得るATPを増加させることにより機能することから、この方法は、非常に広い範囲の癌及び感染性疾患に適用可能である。ある実施形態において、本抗CD39組成物は、ヒトPD-1の阻害活性を中和する(例えば、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する)薬剤による処置に対する応答が低い(又は感受性ではない)個体の癌を処置するのに有用である。処置し得る癌の代表例として、特に腫瘍微小環境中のアデノシンが抗腫瘍免疫応答の抑制で強力な役割を果たし得る固形腫瘍が挙げられる。ある実施形態において、抗CD39抗体で処置されるヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を含む頭頸部の癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘導性の癌、例えば多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫/縦隔原発性B細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、T細胞リンパ腫及び前駆Tリンパ芽球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍及び前記癌の何れかの組み合わせを有する。本開示は、転移性癌の処置にも適用可能である。患者は、処置前、処置中又は処置後、上記臨床特性の1つ以上に対して試験又は選択され得る。
ある実施形態において、本抗CD39抗体又は抗体フラグメントを、例えば循環中における及び/又は組織(例えば、腫瘍若しくは腫瘍隣接組織)中における可溶性(細胞外)CD39タンパク質の検出可能な及び/又は上昇したレベルによって特徴付けられる癌の処置で使用する。
ある実施形態において、本抗CD39抗体又は抗体フラグメントを、CD39を発現する悪性細胞によって特徴付けられる癌の処置で使用する。
ある実施形態において、本抗CD39抗体又は抗体フラグメントを、CD39、任意選択によりsCD39、任意選択によりmemCD39の酵素活性の中和のために、少なくともEC50、任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100の血中濃度を(例えば、1週間、2週間、3週間、4週間にわたり及び/又は抗原結合化合物のその後の投与まで)個体において達成及び/又は維持するのに有効な量で投与する。ある実施形態において、抗CD39抗体の有効量とは、個体の血管外組織中において、CD39、任意選択によりsCD39、任意選択によりmemCD39の酵素活性の中和のために、EC50、任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、抗CD39抗体の有効量は、CD39、任意選択によりsCD39、任意選択によりmemCD39の酵素活性の中和の阻害のために、EC50、任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100を個体において達成(又は維持)するのに有効な量である。
任意選択により、ある実施形態において、ADCCによるCD39発現腫瘍細胞の枯渇を対象とするいくつかの抗体(例えば、受容体飽和をもたらすものと同等の又は実質的に低い濃度で完全な効力を提供し得る)とは対照的に、本抗CD39抗体は、実質的なFcγ受容体媒介活性を示さず、本抗CD39抗体を、抗CD39抗体の次の連続投与まで、所望の期間(例えば、1週間、2週間、1ヶ月)にわたり、CD39発現の下方制御を実質的に生じさせることなく、任意選択により、さらにCD39の酵素活性を中和するのに有効な量で投与する。
ある実施形態において、本抗CD39抗体又は抗体フラグメントを、ATPからAMPへのCD39により媒介される異化の阻害のために(例えば、sCD39のATPアーゼ活性の中和を評価することによる;可溶性(細胞外)CD39タンパク質のATPアーゼ活性の中和を評価することによる、実施例、方法を参照されたい)、少なくともEC50、任意選択によりEC70、任意選択により実質的にEC100の血中濃度を個体において(例えば、1週間、2週間、3週間、4週間にわたり及び/又は抗CD39抗体のその後の投与まで)達成及び/又は維持するのに有効な量で投与する。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、(例えば、PBMCで評価される場合に)循環中における50%、70%又は完全な(例えば、90%)の受容体飽和CD39発現細胞に必要な濃度と比べて高い循環中の濃度、任意選択により目的の血管外組織(例えば、腫瘍又は腫瘍環境)中の濃度を指定の期間にわたり達成又は維持する量で抗CD39抗体又は抗体フラグメントを、疾患を有する個体に投与することを含む方法である。任意選択により、達成される濃度は、指定の受容体飽和に必要な濃度と比べて少なくとも20%、50%又は100%高い。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、(例えば、CD39発現細胞(例えば、実施例、方法でのRamos細胞)上の抗CD39抗体を滴定することにより、フローサイトメトリーによって評価される場合に)CD39発現細胞への結合に関して、EC50、任意選択によりEC70か又は任意選択によりEC100と比べて高い循環中の濃度、任意選択により目的の血管外組織(例えば、腫瘍又は腫瘍環境)中の濃度を指定の期間にわたり達成又は維持する量で抗CD39抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む方法である。任意選択により、達成される濃度は、CD39発現細胞への結合に関して、EC50、任意選択によりEC70又は任意選択によりEC100と比べて少なくとも20%、50%又は100%高い。
EC50、EC70又はEC100を、例えば本明細書の実施例で示されているCD39の酵素活性の中和(例えば、ATPからAMPへの(又はATPから下流のアデノシンへの)加水分解を評価することによるB細胞中におけるATPアーゼ活性の中和)に関する細胞アッセイで評価し得る(実施例、方法を参照されたい)。CD39の酵素活性の中和に関する「EC50」は、この酵素活性の中和に関する最大の反応又は効果の50%を生じる抗CD39抗体の効率的な濃度を指す。CD39の酵素活性の中和に関する「EC70」は、最大の反応又は効果の70%を生じる抗CD39抗体の効率的な濃度を指す。CD39の酵素活性の中和に関する「EC100」は、この酵素活性のそのようは中和に関する実質的に最大の反応又は効果を生じる抗CD39抗体の効率的な濃度を指す。
いくつかの実施形態において、特に固形腫瘍の処置の場合、達成される濃度は、酵素活性の中和のために少なくともEC50又はEC70(任意選択により約EC100又は少なくとも約EC100)に対応する組織中(血管外、例えば腫瘍又は腫瘍環境中)の濃度をもたらすように設計されている。
ある実施形態において、抗CD39抗体の量は、1~20mg/kg体重である。ある実施形態において、この量を毎週、2週間毎、毎月又は2ヶ月毎に個体に投与する。
ある実施形態において、提供されるのは、癌を有するヒト個体を処置する方法であって、少なくとも1回の投与サイクル(任意選択により、少なくとも2回、3回、4回又はより多くの投与サイクル)にわたり、本開示の抗CD39抗体の有効量を個体に投与することを含み、このサイクルは、8週間以下の期間であり、少なくとも1回のサイクルのそれぞれに関して、抗CD39抗体の1回、2回、3回又は4回の用量は、1~20mg/kg体重の用量で投与される、方法である。ある実施形態において、この抗CD39抗体を静脈内注入により投与する。
ヒトを処置するための適切な処置プロトコルは、例えば、抗CD39抗体の本明細書で開示された量を患者に投与することを含み、この方法は、抗CD39抗体の少なくとも1回の用量を投与する少なくとも1回の投与サイクルを含む。任意選択により、抗CD39抗体の少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回又は8回の用量を投与する。ある実施形態において、投与サイクルは、2週間~8週間である。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の疾患(例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍)を処置又は予防するための方法であって、少なくとも1回の投与サイクルにわたりCD39の酵素活性を中和する抗CD39抗体を、疾患(例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍)を有する個体に投与することを含み、この投与サイクルは、抗CD39抗体の少なくとも1回目の及び2回目の(並びに任意選択により、3回目、4回目、5回目、6回目、7回目及び/若しくは8回目の又はさらなる)投与を含み、この抗CD39抗体は、(例えば、血液腫瘍の処置のために)少なくとも0.1μg/ml、任意選択により少なくとも0.2μg/ml、任意選択により少なくとも1μg/ml若しくは任意選択により少なくとも2μg/ml又は(例えば、固形腫瘍の処置のために、血液腫瘍の処置のために)任意選択により少なくとも約1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml若しくは20μg/ml、例えば1~100μg/ml、1~50μg/ml、1~20μg/ml若しくは1~10μg/mlの抗CD39抗体の血中濃度(血清濃度)を2回の連続した投与間で達成及び維持するのに有効な量で投与される、方法である。ある実施形態において、指定の継続的な血中濃度が維持され、この血中濃度は、指定の期間の持続期間(例えば、抗体の2回の投与間で数週間、すなわち1週間、2週間、3週間、4週間)にわたり指定の血中濃度を実質的に下回らず、すなわち、血中濃度は、指定の期間中に変化する可能性があるが、維持される指定の血中濃度は、最小濃度又は「トラフ」濃度を表す。ある実施形態において、抗CD39抗体の治療的有効量とは、抗体の投与後に少なくとも約1週間、約2週間又は約1ヶ月の期間にわたり、CD39の酵素活性の中和のために、血液及び/又は組織中において(少なくとも)EC50濃度、任意選択によりEC70濃度、任意選択によりEC100濃度をもたらすことができるそのような酵素の量である。
本開示の抗CD39抗体による処置の前又は処置中、可溶性(細胞外)CD39タンパク質、CD39発現細胞、アデノシン、ATP、ADP及び/又はAMPレベルの存在又はレベルを患者の腫瘍内で及び/又は患者の腫瘍に隣接して評価し、この患者が処置に適しているかどうかを評価し得る(例えば、患者が処置に反応する可能性があるかどうかを予測し得る)。可溶性(細胞外)CD39、CD39発現細胞、アデノシンのレベル、ATP、ADP及び/又はAMPの存在又はレベルの増加は、個体が本開示の抗CD39抗体(例えば、限定されないが、基質に結合したCD39を阻害する抗体)による処置に適している(例えば、この抗CD39抗体から利益を得る可能性が高い)ことを示す場合がある。
本開示の抗CD39抗体による処置の前又は処置中、アデノシン、ADP及び/又はAMPのレベルを任意選択により患者の腫瘍内で及び/又は患者の腫瘍に隣接して評価し、この患者が抗CD39抗体による処置から利益を得ているかどうかも評価し得る。処置(又は抗体の投与)前のレベルと比較した、投与(又は抗体の投与)後の比較されたアデノシン、ATP、ADP及び/又はAMPのレベルの低下は、個体が本開示の抗CD39抗体(例えば、限定されないが、基質に結合したCD39を阻害する抗体)による処置から利益を得ていることを示す場合がある。任意選択により、患者が抗CD39抗体による処置から利益を得ている場合、方法は、この患者に抗CD39抗体のさらなる用量を投与することをさらに含み得る(例えば、継続的な処置)。
ある実施形態において、患者の腫瘍内で及び/又は患者の腫瘍に隣接してアデノシン、ADP及び/又はAMPのレベルを評価することは、癌患者由来の組織(例えば、癌組織、癌の近位又周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織)からなる群から選択されるヒト組織の生物学的サンプルを患者から得ることと、この組織内のアデノシン、ATP、ADP及び/又はAMPのレベルを検出することとを含む。患者からのレベルは、このレベルを、例えば健康な個体に対応する参照レベルと比較し得る。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
a)循環又は腫瘍環境、任意選択的に腫瘍及び/又は隣接組織内において可溶性(細胞外)CD39タンパク質及び/又はCD39発現細胞を検出することと、
b)任意選択により、参照レベル(例えば、健常組織で観察されるレベル、任意選択により健康な個体又は抗CD39抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応するレベル)と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性(細胞外)CD39タンパク質及び/又はCD39発現細胞が循環又は腫瘍環境中に含まれていると決定すると、この個体に抗CD39抗体を投与することと
を含む方法を提供する。CD39発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば循環細胞又は腫瘍浸潤細胞、例えばCD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞、B細胞を含み得る。
a)循環又は腫瘍環境、任意選択的に腫瘍及び/又は隣接組織内において可溶性(細胞外)CD39タンパク質及び/又はCD39発現細胞を検出することと、
b)任意選択により、参照レベル(例えば、健常組織で観察されるレベル、任意選択により健康な個体又は抗CD39抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応するレベル)と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性(細胞外)CD39タンパク質及び/又はCD39発現細胞が循環又は腫瘍環境中に含まれていると決定すると、この個体に抗CD39抗体を投与することと
を含む方法を提供する。CD39発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば循環細胞又は腫瘍浸潤細胞、例えばCD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞、B細胞を含み得る。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
a)この個体が、任意選択により循環、任意選択により腫瘍及び/又は隣接組織において、検出可能な可溶性(細胞外)CD39を有するかどうかを評価することと、
b)任意選択により、参照レベル(例えば、健康な個体又は本開示の抗CD39抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応する)と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性(細胞外)CD39タンパク質を検出すると、この個体に本開示の抗CD39抗体を投与することと
を含む方法を提供する。
a)この個体が、任意選択により循環、任意選択により腫瘍及び/又は隣接組織において、検出可能な可溶性(細胞外)CD39を有するかどうかを評価することと、
b)任意選択により、参照レベル(例えば、健康な個体又は本開示の抗CD39抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応する)と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性(細胞外)CD39タンパク質を検出すると、この個体に本開示の抗CD39抗体を投与することと
を含む方法を提供する。
任意選択により、これらの方法の何れかにおいて、腫瘍環境内で可溶性CD39タンパク質及び/又はCD39発現細胞(又はアデノシン、ATP、ADP及び/若しくはAMP)を検出することは、癌組織及び/又は癌に近位の若しくは周辺の組織(例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織)を含む生物学的サンプルを個体から得ることと、sCD39タンパク質、CD39発現細胞(又はアデノシン、ATP、ADP及び/若しくはAMP)のレベルを検出することとを含む。CD39発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞、B細胞を含み得る。
癌を有する個体は、循環細胞上での又は腫瘍微小環境中の細胞上での(例えば、腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞、B細胞上での)sCD39の存在及び/又はCD39の発現を評価するための事前検出ステップなしで本抗CD39抗体により処置し得る。任意選択により、この処置方法は、個体からの血液からの又は腫瘍の生物学的サンプル(例えば、癌組織、癌の近位又周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織)におけるCD39の核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。生物学的サンプルが、CD39を発現する細胞を含むという決定(例えば、参照、例えば健常組織と比較した顕著な発現;高レベルでのCD39の発現、抗CD39抗体による高強度の染色)は、患者が、CD39を阻害する薬剤による処置から強い利益を有し得る癌を有することを示す。ある実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中におけるCD39の核酸又はポリペプチドの発現のレベルを決定することと、このレベルを、健康な個体(例えば、健常組織)に対応する参照レベルと比較することとを含む。生物学的サンプルが、sCD39タンパク質及び/又は参照レベルと比較して増加したレベルでCD39の核酸若しくはポリペプチドを発現する細胞を含むという決定は、患者が、本開示の抗CD39抗体により有利に処置され得る癌を有することを示す。ある実施形態において、生物学的サンプル中におけるCD39ポリペプチドを検出することは、可溶性細胞外CD39タンパク質を検出することを含む。ある実施形態において、生物学的サンプル中におけるCD39ポリペプチドを検出することは、悪性細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、TReg細胞、B細胞の表面上で発現されるCD39ポリペプチドを検出することを含む。ある実施形態において、生物学的サンプルが、CD39の核酸又はポリペプチドを顕著に発現する細胞を含むという決定は、患者が本開示の抗CD39抗体により有利に処置され得る癌を有することを示す。「顕著に発現される」は、CD39ポリペプチドに言及する場合、CD39ポリペプチドが、所与の患者から採取した相当な数の細胞中で発現されることを意味する。用語「顕著に発現される」の定義は、正確なパーセンテージ値に拘束されないが、いくつかの例では、「顕著に発現される」と言われている受容体は、患者から採取した腫瘍細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又はより多くで存在するであろう。
個体が、CD39ポリペプチドを発現する細胞によって特徴付けられる癌を有するかどうかを決定することは、例えば、癌環境(例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織)からの細胞を含む個体から生物学的サンプルを(例えば、生検を実施することにより)得ることと、前記細胞を、CD39ポリペプチドに結合する抗体と接触させることと、細胞がその表面上でCD39を発現するかどうかを検出することとを含み得る。任意選択により、個体が、CD39を発現する細胞を有するかどうかを決定することは、免疫組織化学アッセイを実行することを含む。
ある実施形態において、本明細書に記載の抗CD39抗体は、有利には、CD73陽性の癌を処置するために使用され得る。CD73発現は、ある範囲の腫瘍細胞、例えばとりわけ白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌及び乳癌において報告されている。CD73発現は、メラノーマ及び乳癌の前転移表現型とも関連している。
従って、提供されるのは、CD73陽性癌を有する個体における癌又は感染性疾患を処置又は予防するための方法であって、個体に本開示の抗CD39抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む方法である。ある実施形態において、本開示は、個体におけるCD73陽性癌の処置又は予防のための方法であって、可溶性ヒトCD39タンパク質に結合し、且つその活性を阻害する本開示の抗体を個体に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、CD73陽性癌は、一般に腫瘍又は腫瘍環境中のCD73発現細胞の存在により特徴付けられることが既知の癌である。
癌を有する患者は、腫瘍微小環境中の細胞上での(例えば、腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞上での)CD73の発現を評価するための事前検出ステップを用いるか又は用いずに抗CD39抗体で処置され得る。任意選択により、この処置方法は、個体からの腫瘍の生物学的サンプル中(例えば、癌組織、癌の近位又は周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織中)のCD73核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。生物学的サンプルがCD73発現細胞を含むという決定(例えば、参照、例えば健常組織と比較した顕著な発現;高レベルでのCD73の発現、抗CD73抗体による高強度の染色)は、患者が、sCD39を阻害する薬剤での処置(任意選択によりさらにCD73を阻害する薬剤との組合せ)から強い利益を有し得る癌を有することを示す。ある実施形態において、本方法は、生物学的サンプル中のCD73核酸又はポリペプチドの発現のレベルを決定することと、そのレベルを例えば健常個体(例えば、健常組織)に対応する参照レベルと比較することとを含む。生物学的サンプルが、CD73核酸又はポリペプチドを参照レベルと比較して増加しているレベルにおいて発現する細胞を含むという決定は、患者が、抗CD39抗体で処置され得る癌を有することを示す。任意選択により、生物学的サンプル中のCD73ポリペプチドを検出することは、悪性腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞の表面上で発現されるCD73ポリペプチドを検出することを含む。ある実施形態において、生物学的サンプルが、CD73核酸又はポリペプチドを発現する細胞を含むという決定は、患者が、抗CD39抗体での処置から特定の利益を誘導し得る癌を有することを示す。CD73ポリペプチドは、例えば、所与の患者から採取した相当の数の細胞中で発現され得、例えば、CD73は、患者から採取した腫瘍細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又はそれより多くで検出され得る。
個体がCD73ポリペプチドを発現する細胞により特徴付けられる癌を有するかどうかを決定することは、例えば、癌環境(例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織)からの細胞を含む個体から生物学的サンプルを(例えば、生検を実施することにより)得ることと、前記細胞を、CD73ポリペプチドに結合する抗体と接触させることと、細胞がその表面上でCD73を発現するかどうかを検出することとを含み得る。任意選択により、個体がCD73を発現する細胞を有するかどうかを決定又は検出することは、免疫組織化学アッセイを実行することを含む。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
a)腫瘍環境中において、任意選択により腫瘍及び/又は隣接組織内においてCD73発現細胞を検出することと、
b)腫瘍環境が、CD73発現細胞を、任意選択により参照レベル(例えば、健常組織で観察されるレベル)と比較して増加しているレベルにおいて含むと決定すると、可溶性ヒトCD39タンパク質に結合し、且つその活性を阻害する本開示の抗体をこの個体に投与することと
を含む方法を提供する。任意選択により、腫瘍環境内のCD73発現細胞を検出することは、個体から、癌組織及び/又は癌の近位若しくは周辺の組織(例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織)を含む生物学的サンプルを得ることと、CD73発現細胞のレベルを(例えば、免疫組織化学アッセイを実行することにより)検出することとを含む。CD73発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞を含み得る。
a)腫瘍環境中において、任意選択により腫瘍及び/又は隣接組織内においてCD73発現細胞を検出することと、
b)腫瘍環境が、CD73発現細胞を、任意選択により参照レベル(例えば、健常組織で観察されるレベル)と比較して増加しているレベルにおいて含むと決定すると、可溶性ヒトCD39タンパク質に結合し、且つその活性を阻害する本開示の抗体をこの個体に投与することと
を含む方法を提供する。任意選択により、腫瘍環境内のCD73発現細胞を検出することは、個体から、癌組織及び/又は癌の近位若しくは周辺の組織(例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織)を含む生物学的サンプルを得ることと、CD73発現細胞のレベルを(例えば、免疫組織化学アッセイを実行することにより)検出することとを含む。CD73発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞を含み得る。
本開示の抗CD39抗体組成物は、単剤療法において又はその抗体が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む1つ以上の他の治療剤との併用処置として使用され得る。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患又は状態に対する単剤療法においてその薬剤に対して一般的に使用される量及び治療計画で投与される。
ある実施形態において、本開示の抗CD39抗体組成物は、腫瘍細胞からのATPの細胞外放出を生じさせることができる化学療法剤との併用処置において使用され得る。
ある実施形態において、抗CD39中和抗体は、ヒトCD16への結合を欠くが、CD16発現エフェクター細胞(例えば、NK又はエフェクターT細胞)の活性を増強する。従って、ある実施形態において、第2の又はさらなる第2の治療薬は、(例えば、NK細胞によって発現されるCD16を介して)それが結合している細胞に対してADCCを誘導することができる抗体又は他のFcドメイン含有タンパク質である。一般的には、このような第の薬剤抗体又は他のタンパク質は、目的の抗原、例えば腫瘍細胞上に存在する抗原(腫瘍抗原)及びFcドメイン又はその一部に結合するドメインを含み、Fcドメインを介した抗原結合ドメイン及びFcγ受容体(例えば、CD16)への結合を示す。ある実施形態において、そのADCC活性は、少なくとも部分的にCD16によって媒介される。ある実施形態において、さらなる治療薬は、天然又は改変ヒトFcドメイン、例えばヒトIgG1又はIgG3抗体由来のFcドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ADCC」という用語は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCCを媒介する非特異的細胞傷害性細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球が含まれる。「ADCC誘導抗体」という用語は、当業者に公知のアッセイによって測定されるADCCを示す抗体を指す。そのような活性は、典型的には、Fc領域の様々なFcRとの結合によって特徴付けられる。いかなる特定の機構によっても限定されるものではないが、当業者は、抗体がADCCを示す能力が、例えば、そのサブクラス(IgG1又はIgG3など)による、Fc領域に導入された突然変異によるか又は抗体のFc領域における糖パターンの改変によるものであり得ることを認識するであろう。ADCCを誘発する抗体の例には、リツキシマブ(リンパ腫、CLLの処置用、トラスツズマブ(乳癌の処置用)、アレムツズマブ(慢性リンパ球性白血病の処置用)及びセツキシマブ(結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌の処置用)が挙げられる。ADCC増強抗体の例としては、GA-101(低フコシル化抗CD20)、margetuximab(Fc増強抗HER2)、メポリズマブ、MEDI-551(Fc操作抗CD19)、オビヌツズマブ(糖操作/低フコシル化抗CD20)、オカラツズマブ(Fc操作抗CD20)、XmAb(登録商標)5574/MOR208(Fc操作抗CD19)が挙げられるが限定されない。
ある実施形態において、抗CD39中和抗体は、ヒトPD-1の阻害活性(例えば、PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する)を中和する薬剤の有効性を、とりわけヒトPD-1の阻害活性を中和する薬剤による処置に対する応答が弱い(又は敏感でない)個人において増強する。従って、ある実施形態において、第2の又はさらなる第2の治療剤は、ヒトPD-1の阻害活性を中和する抗体又は他の薬剤である。
プログラム死1(PD-1)(「プログラム細胞死1」とも呼ばれる)は、CD28ファミリの受容体の阻害性メンバーである。完全なヒトPD-1配列は、GenBank受入番号U64863に見出すことができる。PD-1の阻害活性の阻害又は中和は、PD-L1誘導PD-1シグナル伝達を妨げるポリペプチド剤(例えば、抗体、Fcドメインに融合したポリペプチド、イムノアドヘシンなど)の使用を含み得る。現在、市販又は臨床評価中のPD-1/PD-L1経路を阻止する少なくとも6つの薬剤が存在する。1つの薬剤は、BMS-936558(ニボルマブ/ONO-4538、Bristol-Myers Squibb、以前はMDX-1106)である。ニボルマブ(商品名Opdivo(登録商標))は、PD-1及びCD80の両方へのPD-L1リガンドの結合を阻害するFDA認可完全ヒトIgG4抗PD-L1mAbであり、国際公開第2006/121168号パンフレットにおいて抗体5C4として記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。メラノーマ患者では、3mg/kgの用量で最も有意なORが観察されたが、他の癌のタイプでは10mg/kgであった。ニボルマブは、一般に癌の進行まで3週間毎に10mg/kgで投与される。「ヒトPD-1の阻害活性を低下させる」、「PD-1を中和する」又は「ヒトPD-1の阻害活性を中和する」という用語と、PD-1が、PD-1と、PD-L1又はPD-L2などの1つ以上のその結合パートナーとの間の相互作用から生じるシグナル伝達能力において阻害される過程を指す。PD-1の阻害活性を中和する薬剤は、PD-1と、PD-L1、PD-L2などのその結合パートナーの1つ以上との間の相互作用に起因するシグナル伝達を減少、阻止、阻害又は抑制する。従って、このような薬剤は、増殖、サイトカイン産生及び/又は細胞傷害性などのT細胞エフェクター機能を増強するように、Tリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介されるか又はそれを介した負の共刺激シグナルを減少させることができる。
ランブロリズマブ又はペンブロリズマブ(商品名Keytruda(商標))とも呼ばれるMK-3475(Merck社製ヒトIgG4抗PD1mAb)は、メラノーマの治療のためにFDAによって承認され、他の癌において試験されている。ペンブロリズマブは、疾患の進行まで2週間又は3週間毎に2mg/kg又は10mg/kgで試験した。Merck3745又はSCH-900475としても知られているMK-3475は、国際公開第2009/114335号パンフレットにも記載されている。
MPDL3280A/RG7446(アテゾリズマブ、商品名Tecentrig(登録商標)、Roche/Genentech社製抗PD-L1)は、FcγR結合及びその結果としての抗体依存性細胞傷害(ADCC)を最小限に抑えることによって効力及び安全性を最適化するように設計された、操作されたFcドメインを含むヒト抗PD-L1mAbである。1、10、15及び25mg/kg以下の用量のMPDL3280Aを3週間毎に最高1年間投与した。第3相試験では、MPDL3280AをNSCLCにおいて3週間毎に静脈内注入により1200mgで投与する。
AMP-224(Amplimmune及びGSK)は、Fcドメインに融合したPD-L2細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。PD-1を中和する薬剤の他の例は、PD-L2に結合する抗体(抗PD-L2抗体)を含み得、PD-1とPD-L2との間の相互作用を阻止する。
ピディリズマブ(CT-011;CureTech)(CureTech/Teva社製ヒト化IgG1抗PD1mAb)、ピディリズマブ(CT-011; CureTech)(例えば、国際公開第2009/101611号パンフレットを参照されたい)は別の例である。薬剤はリツキシマブ感受性再発性FLを有する30人の患者において試験され、患者は、4週間毎の3mg/kgでの静脈内CT-011の4回にわたる注入に、CT-011の最初の注入の2週間後に始まって毎週375mg/m2で4週間にわたり投与されるリツキシマブを組み合わせて処置された。
さらなる公知のPD-1抗体及び他のPD-1阻害剤としては、AMP-224(GSKにライセンスされたB7-DC/IgG1融合タンパク質)、国際公開第2012/145493号パンフレットに記載のAMP-514、国際公開第2011/066389号パンフレット及び米国特許出願公開第2013/034559号明細書に記載の抗体MEDI-4736(デュルバルマブ、商品名Imfinzi(商標)、AstraZeneca/Medimmuneにより開発された抗PD-L1)、国際公開第2010/077634号パンフレットに記載の抗体YW243.55.S70(抗PD-L1)、BMS-936559としても知られているMDX-1105は、国際公開第2007/005874号パンフレットに記載のBristol-Myers Squibbにより開発された抗PD-L1抗体及び国際公開第2006/121168号パンフレット、国際公開第2009/014708号パンフレット、国際公開第2009/114335号パンフレット及び国際公開第2013/019906号パンフレットに記載の抗体及び阻害剤が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。抗PD1抗体のさらなる例は、国際公開第2015/085847号パンフレット(Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co.Ltd.)に開示されており、例えばそれぞれ配列番号6、配列番号7及び/又は配列番号8の軽鎖可変ドメインCDR1、2及び3並びにそれぞれ配列番号3、配列番号4又は配列番号5の抗体重鎖可変ドメインCDR1、2及び3を有する抗体であり、配列番号は国際公開第2015/085847号パンフレットに従った付番であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。PD-1又はPD-L1への結合についてこれらの抗体の何れかと競合する抗体も使用することができる。
いくつかの実施形態において、PD-1中和剤は、PD-L1のPD-1への結合を阻害する抗PD-L1mAbである。いくつかの実施形態において、PD-1中和剤は、PD-1のPD-L1への結合を阻害する抗PD1mAbである。いくつかの実施形態では、PD-1中和剤は、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)に融合したPD-L1又はPD-L2の細胞外又はPD-1結合部分を含むイムノアドヘシンである。
処置方法において、抗CD39抗体及び第2の治療剤は、個別に、一緒に、又は連続して、又はカクテルにして投与し得る。いくつかの実施形態において、本抗原結合化合物は、第2の治療剤の投与前に投与される。例えば、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与のおよそ0~30日前に投与し得る。いくつかの実施形態において、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与の、約30分~約2週間、約30分~約1週間、約1時間~約2時間、約2時間~約4時間、約4時間~約6時間、約6時間~約8時間、約8時間~1日又は約1~5日前に投与する。いくつかの実施形態において、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与後に投与する。例えば、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与からおよそ0~30日後に投与し得る。いくつかの実施形態において、抗CD39抗体は、第2の治療剤の投与から、約30分~約2週間、約30分~約1週間、約1時間~約2時間、約2時間~約4時間、約4時間~約6時間、約6時間~約8時間、約8時間~1日又は約1~5日後に投与する。
方法
CD39突然変異体の生成
CD39突然変異体をPCRにより生成した。増幅した配列をアガロースゲル上で泳動させ、Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extractionキット(リファレンス740609)を使用して精製した。次いで、各突然変異体に関して生成した精製済PCR産物をClonTech InFusionシステムにより発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをMiniprepとして調製し、次いで配列決定した。配列決定後、Promega PureYield(商標)Plasmid Midiprep Systemを使用して、突然変異した配列を含むベクターをMidiprepとして調製した。HEK293T細胞をDMEM培地(Invitrogen)中で増殖させ、InvitrogenのLipofectamine 2000を使用してベクターを遺伝子移入し、48時間にわたりCO2インキュベータ中で37℃においてインキュベートした後、導入遺伝子の発現に関して試験した。下記の表に示すように、突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。下記の表1において標的となるアミノ酸突然変異を、配列番号1のナンバリングを使用して示す。
CD39突然変異体の生成
CD39突然変異体をPCRにより生成した。増幅した配列をアガロースゲル上で泳動させ、Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extractionキット(リファレンス740609)を使用して精製した。次いで、各突然変異体に関して生成した精製済PCR産物をClonTech InFusionシステムにより発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをMiniprepとして調製し、次いで配列決定した。配列決定後、Promega PureYield(商標)Plasmid Midiprep Systemを使用して、突然変異した配列を含むベクターをMidiprepとして調製した。HEK293T細胞をDMEM培地(Invitrogen)中で増殖させ、InvitrogenのLipofectamine 2000を使用してベクターを遺伝子移入し、48時間にわたりCO2インキュベータ中で37℃においてインキュベートした後、導入遺伝子の発現に関して試験した。下記の表に示すように、突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。下記の表1において標的となるアミノ酸突然変異を、配列番号1のナンバリングを使用して示す。
可溶性huCD39のクローニング、産生及び精製
分子生物学
下記のプライマー:TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC(配列番号41)(フォワード)及びCCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCGACATAGGTGGAGTGGGAGAG(配列番号42)(リバース)を使用して、ヒトPBMC cDNAからhuCD39タンパク質をクローニングした。次いで、精製済PCR産物を、InFusionクローニングシステムを使用して発現ベクター中にクローニングした。精製ステップのためにタンパク質のC末端部分にM2タグ(FLAGタグ、配列番号44において下線を引いた)を追加しており、(例えば、配列番号44の)CD39細胞外ドメインタンパク質は、何れの実施形態においても、M2タグを欠くように任意選択により指定され得ることが認識されるであろう。
分子生物学
下記のプライマー:TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC(配列番号41)(フォワード)及びCCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCGACATAGGTGGAGTGGGAGAG(配列番号42)(リバース)を使用して、ヒトPBMC cDNAからhuCD39タンパク質をクローニングした。次いで、精製済PCR産物を、InFusionクローニングシステムを使用して発現ベクター中にクローニングした。精製ステップのためにタンパク質のC末端部分にM2タグ(FLAGタグ、配列番号44において下線を引いた)を追加しており、(例えば、配列番号44の)CD39細胞外ドメインタンパク質は、何れの実施形態においても、M2タグを欠くように任意選択により指定され得ることが認識されるであろう。
huCD39タンパク質の発現及び精製
クローニングした配列の検証後、CHO細胞をヌクレオフェクト(nucleofect)し、次いで産生プールをサブクローニングして、huCD39タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラー中で増殖したhuCD39クローンから上清を回収し、M2クロマトグラフィーカラムを使用して精製し、M2ペプチドを使用して溶出させた。次いで、精製済タンパク質をS200サイズ排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。単量体に相当する精製済タンパク質をTBS PH7.5緩衝液で製剤化した。M2タグを有しないCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、下記のとおりであった。
クローニングした配列の検証後、CHO細胞をヌクレオフェクト(nucleofect)し、次いで産生プールをサブクローニングして、huCD39タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラー中で増殖したhuCD39クローンから上清を回収し、M2クロマトグラフィーカラムを使用して精製し、M2ペプチドを使用して溶出させた。次いで、精製済タンパク質をS200サイズ排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。単量体に相当する精製済タンパク質をTBS PH7.5緩衝液で製剤化した。M2タグを有しないCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、下記のとおりであった。
M2タグを有するCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質の最終アミノ酸配列は、下記のとおりであった。
可溶性CD39の酵素活性の阻害
産生された可溶性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、存在するATPの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりATP加水分解の評価を可能にするCell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。この方法では、可溶性CD39により媒介されるATP加水分解の阻害を評価し得る。簡潔に説明すると、100μg/ml~6×10-3μg/mlの抗CD39抗体の用量範囲を37℃で1時間にわたり、方法セクションで説明したアミノ酸配列(配列番号44)を有する400ng/mlの可溶性組換えヒトCD39タンパク質と共にインキュベートした。このプレートに37℃でさらに30分にわたり20μMのATPを添加した後、CTG(Cell Titer Glo)試薬を添加した。暗所での5分間の短いインキュベーション期間後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ATPのみ(最大光放射)並びにATP及び可溶性CD39タンパク質(最小光放射)との比較により、抗CD39抗体の効力を決定した。
産生された可溶性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、存在するATPの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりATP加水分解の評価を可能にするCell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。この方法では、可溶性CD39により媒介されるATP加水分解の阻害を評価し得る。簡潔に説明すると、100μg/ml~6×10-3μg/mlの抗CD39抗体の用量範囲を37℃で1時間にわたり、方法セクションで説明したアミノ酸配列(配列番号44)を有する400ng/mlの可溶性組換えヒトCD39タンパク質と共にインキュベートした。このプレートに37℃でさらに30分にわたり20μMのATPを添加した後、CTG(Cell Titer Glo)試薬を添加した。暗所での5分間の短いインキュベーション期間後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ATPのみ(最大光放射)並びにATP及び可溶性CD39タンパク質(最小光放射)との比較により、抗CD39抗体の効力を決定した。
細胞性CD39の酵素活性の阻害
抗体による、CD39を発現する細胞におけるCD39酵素活性の阻害を、存在するATPの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりATP加水分解の評価を可能にするCell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。そのため、このアッセイを、細胞培養上清中においてCD39により加水分解されるATPの阻害の評価を可能にするように設計した。簡潔に説明すると、5×104個のRamosヒトリンパ腫細胞、5×103個の、ヒトCD39を発現するCHO細胞、カニクイザルCD39を発現するCHO細胞及びマウスCD39を発現するCHO細胞を、30μg/ml~5×10-4μg/mlの抗CD39抗体と共に37℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を37℃でさらに1時間にわたり20μMのATPと共にインキュベートした。プレートを400gで2分にわたり遠心分離し、細胞上清50μlを発光マイクロプレート(白色ウェル)に移す。この上清にCellTiter-Glo(商標)Reagent(CTG)50μlを添加し、暗所での5分間のインキュベーション後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ATPのみ(最大光放射)並びにATP及び細胞(最小光放射)との比較により、抗CD39抗体の効力を決定した。
抗体による、CD39を発現する細胞におけるCD39酵素活性の阻害を、存在するATPの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりATP加水分解の評価を可能にするCell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。そのため、このアッセイを、細胞培養上清中においてCD39により加水分解されるATPの阻害の評価を可能にするように設計した。簡潔に説明すると、5×104個のRamosヒトリンパ腫細胞、5×103個の、ヒトCD39を発現するCHO細胞、カニクイザルCD39を発現するCHO細胞及びマウスCD39を発現するCHO細胞を、30μg/ml~5×10-4μg/mlの抗CD39抗体と共に37℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を37℃でさらに1時間にわたり20μMのATPと共にインキュベートした。プレートを400gで2分にわたり遠心分離し、細胞上清50μlを発光マイクロプレート(白色ウェル)に移す。この上清にCellTiter-Glo(商標)Reagent(CTG)50μlを添加し、暗所での5分間のインキュベーション後、Enspire(商標)ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ATPのみ(最大光放射)並びにATP及び細胞(最小光放射)との比較により、抗CD39抗体の効力を決定した。
抗体の生成:マウスにおける免疫付与及びスクリーニング
抗ヒトCD39抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質によりBalb/cマウスに免疫付与した。マウスに、腹腔内で、CD39タンパク質50μg及びComplete Freund Adjuvantの乳濁液による1回の1回目の免疫付与を行い、腹腔内でCD39タンパク質50μg及びIncomplete Freund Adjuvantの乳濁液による2回目の免疫付与を行い、最後に静脈内でCD39タンパク質10μgによる追加免疫を行った。免疫脾臓細胞を追加免疫の3日後にX63.Ag8.653不死化B細胞と融合させ、放射線照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、増殖中のクローンを、Clonepix(商標)2装置(Molecular Devices Corp.)を使用して採取した。
抗ヒトCD39抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質によりBalb/cマウスに免疫付与した。マウスに、腹腔内で、CD39タンパク質50μg及びComplete Freund Adjuvantの乳濁液による1回の1回目の免疫付与を行い、腹腔内でCD39タンパク質50μg及びIncomplete Freund Adjuvantの乳濁液による2回目の免疫付与を行い、最後に静脈内でCD39タンパク質10μgによる追加免疫を行った。免疫脾臓細胞を追加免疫の3日後にX63.Ag8.653不死化B細胞と融合させ、放射線照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、増殖中のクローンを、Clonepix(商標)2装置(Molecular Devices Corp.)を使用して採取した。
実施例1:既知の中和CD39 mAbのエピトープマッピング
抗体がどのように細胞性CD39の酵素(ATPアーゼ)活性を阻害することができるかについての洞察を得るために、本発明者らは、細胞アッセイにおいてCD39のATPアーゼ活性を阻害することが報告されている抗体(国際公開第2009/095478号パンフレットで開示されたBY40)が結合するエピトープを調べた。
抗体がどのように細胞性CD39の酵素(ATPアーゼ)活性を阻害することができるかについての洞察を得るために、本発明者らは、細胞アッセイにおいてCD39のATPアーゼ活性を阻害することが報告されている抗体(国際公開第2009/095478号パンフレットで開示されたBY40)が結合するエピトープを調べた。
抗CD39抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、CD39の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるCD39突然変異体を設計した。配列番号1のナンバリングを使用して表1に示す突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。
I-394の用量範囲(10~2.5~0.625~0.1563~0.0391~0.0098~0.0024~0.0006μg/ml)を、フローサイトメトリーにより、20種の生成した突然変異体で試験する。BY40抗体は、両方ともCD39の突然変異体5を発現する細胞への結合が完全に喪失していたが、あらゆる他の突然変異体への結合を喪失していなかった。突然変異体5は、残基Q96、N99、E143及びR147でアミノ酸置換を含む。CD39の表面上での突然変異体5の位置を図3Aに示す。
実施例2:既知の中和CD39 mAbは、組換え可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができない
細胞アッセイにおいてCD39のATPアーゼ活性を阻害することが報告されている2種の抗体(BY40及びBY12)を、組換え可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができるかどうかを決定するために評価した。上記で説明したように産生された可溶性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、Cell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。細胞性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を上記で示したように評価した。
細胞アッセイにおいてCD39のATPアーゼ活性を阻害することが報告されている2種の抗体(BY40及びBY12)を、組換え可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができるかどうかを決定するために評価した。上記で説明したように産生された可溶性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、Cell Titer Glo(商標)(Promega、リファレンスG7571)を使用して評価した。細胞性CD39タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を上記で示したように評価した。
予想したように、BY40は、細胞中においてCD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害した。しかしながら、BY40は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害することができなかった。図2Bは、BY40と、本明細書で特定された新規の抗体との比較を示す。
実施例3:sCD39の活性をブロックするための新規のmAbのスクリーニング
sCD39のATPアーゼ活性を中和する抗体を探すために一連の免疫付与を実行した。抗ヒトCD39抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質で動物に免疫付与した。まとめると、免疫付与の系列は、様々なプロトコルを含み、且つ様々なマウス株、ラット及びウサギを含む様々な動物におけるものであった。
sCD39のATPアーゼ活性を中和する抗体を探すために一連の免疫付与を実行した。抗ヒトCD39抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトCD39-M2細胞外ドメイン組換えタンパク質で動物に免疫付与した。まとめると、免疫付与の系列は、様々なプロトコルを含み、且つ様々なマウス株、ラット及びウサギを含む様々な動物におけるものであった。
最初の免疫付与プロトコルでは、一次スクリーニングは、野生型CHO細胞系及びhuCD39を発現するCHO細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清(SN)の試験を含んだ。細胞をそれぞれ0.1μM及び0.005μMのCFSEで染色した。フリーサイトメトリースクリーニングのために、全ての細胞を同程度に混合し、APCで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体(pAb)により、上清中における反応性抗体の存在が明らかになった。次いで、huCD39に結合した抗体に関して、開発して上記(方法)で説明したスクリーニングアッセイを使用して、可溶性CD39の酵素活性の阻害に関して上清をスクリーニングした。
結果は、多数の特異的CD39結合抗体を得ることができるが、これらの免疫付与の何れからの抗体も可溶性CD39の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。1つの可能性は、CD39上の優性エピトープが、CD39の触媒部位に又はこの触媒部位の付近に適切に配置されたいかなるエピトープも含まないことである。細胞性CD39を阻害する利用可能な抗体の少なさと、抗体を使用した酵素の触媒部位の阻害における既知の困難さとを考慮すると、sCD39を中和する抗体の非存在は、可溶性(細胞外ドメイン)CD39を阻害する抗体を得ることができないことを示す可能性がある。他の可能性は、機能しないスクリーニングアッセイ及び/又は不適切に折りたたまれた若しくは機能する可溶性CD39タンパク質に関し、なぜなら、特に可溶性CD39を阻害し得る抗体の欠如により、sCD39遮断アッセイの検証が妨げられるからである。
可溶性CD39を阻害し得る抗体の非存在を考慮して、抗体BY40のエピトープにより特定されるようにCD39の活性部位に結合する抗体の生成を促進するように設計されたスクリーニングプロトコルにより、さらなる免疫付与を実行した。簡潔に説明すると、一次スクリーニングは、上述の免疫付与と同様に野生型CHO細胞系及びhuCD39を発現するCHO細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清(SN)の試験、これに続く、野生型CD39と比較して表1に示すCD39突然変異体5を発現するHek-293T細胞への結合の喪失に関するスクリーニングを含んだ。突然変異体5は、残基Q96、N99、E143及びR147で置換を有する。しかしながら、再び結果は、突然変異体5への結合の喪失を示す多数の特異的CD39結合抗体を得ることができるが、最初の免疫付与の何れからの抗体も可溶性CD39の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。
実施例4:I-394抗体の特定
本発明者らは、BY40様抗体と競合しない抗体を有するために、Q96、N99、E143及びR147領域(突然変異体5により定義される)に結合しない抗CD39抗体を特定しようとした。CD39のATPアーゼ活性をブロックする能力を必要としないそのような抗体は、例えば、細胞性CD39を阻害するBY40抗体又はBY40様抗体の存在下で細胞上の遊離CD39タンパク質を検出して定量するための、BY40結合部位に結合する細胞性CD39を阻害する抗体の薬理学的研究に有用であり得る。
本発明者らは、BY40様抗体と競合しない抗体を有するために、Q96、N99、E143及びR147領域(突然変異体5により定義される)に結合しない抗CD39抗体を特定しようとした。CD39のATPアーゼ活性をブロックする能力を必要としないそのような抗体は、例えば、細胞性CD39を阻害するBY40抗体又はBY40様抗体の存在下で細胞上の遊離CD39タンパク質を検出して定量するための、BY40結合部位に結合する細胞性CD39を阻害する抗体の薬理学的研究に有用であり得る。
CD39突然変異体5への結合の喪失に関してハイブリドーマをスクリーニングした実施例3の免疫付与の結果から出発して、CD39突然変異体5への結合の喪失を示すものの中の1つではないハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマ(I-394)は、突然変異体5への結合の場合による部分的減少を示す非包括的なデータに起因するより広いプールの中の1つであったが、突然変異体5への結合を喪失せず、従って最初に保持されなかった。
可溶性CD39の酵素活性の阻害のためのさらなる免疫付与からの上清の継続的なスクリーニングに関連して、クローン化して産生した抗体I-394を対照として含めた。驚くべきことに、抗体I-394は、エピトープ特異的スクリーニングで保持されるクローンの中の1つでないにもかかわらず、この抗体は、上記(方法)で説明したアッセイにおいて可溶性CD39の酵素活性の強い阻害を示した。
ヒトFcγ受容体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及びCD64への結合の欠如をもたらす突然変異L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Kabat EUナンバリング)を有する改変されたFcドメインを有する、IgG1アイソタイプのヒト定常領域を有するI-394を産生させた。簡潔に説明すると、I-394抗体のVH配列及びVk配列(それぞれ配列番号6及び配列番号7に示すVH可変領域及びVk可変領域)を、上述の突然変異及びhuCk定常ドメインをそれぞれ有するhuIgG1定常ドメインを含む発現ベクターにクローニングした。これら2種の得られたベクターをCHO細胞系に共遺伝子移入した。細胞の確立されたプールを使用して、CHO培地中で抗体を産生させた。次いで、この抗体を、プロテインAを使用して精製した。I-394のぞれぞれの重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を下記に示す(Kabat CDRに下線を引いている)。
I-394重鎖可変ドメイン配列:
I-394軽鎖可変ドメイン配列:
I-394重鎖可変ドメイン配列:
次いで、抗体I-394を、CD39の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるCD39突然変異体への結合の喪失に関して試験した。配列番号1のナンバリングを使用して表1に示す突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。抗体I-394の用量範囲をフローサイトメトリーによって20種の突然変異体で試験した。図3Bに示すように、I-394は、CD39の突然変異体19を発現する細胞への結合の完全な喪失を示した。突然変異体19は、残基R138、M139及びE142で置換を含む。そのため、I-394のコアエピトープは、残基R138、M139及びE142の1つ又は複数(又は全て)を含む。
突然変異体5への結合を喪失し、且つ細胞性CD39を阻害する能力を有するが可溶性CD39を阻害する能力を有しない先行の抗体BY40と異なり、抗体I-394は、隣接する突然変異体19への結合を喪失し、突然変異体5への結合が強く減少する(しかし、いくつかの残基は、突然変異体5に結合する)。興味深いことに、突然変異体19の残基は、残基5のものに近接しているか又は隣接しており、その結果、I-394は、BY40と比較してエピトープのシフトを表す可能性がある。そのため、抗体I-394は、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性の阻害を可能にする抗CD39抗体に関する有用な新規のエピトープを提示する。同様に、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を中和するさらなる抗体を検出するためのスクリーニングアッセイの検証及び試験を可能とする特異的陽性対照も提供される。
実施例5:sCD39中和mAbに関する非エピトープ特異的スクリーニング
可溶性CD39の抗体により媒介される阻害が可能であることを示す実施例4の結果に基づいて、sCD39のATPアーゼ活性を中和する抗体を探すために、実施例3と異なるプロトコルを使用する異なる免疫付与からの融合を再検討した。
可溶性CD39の抗体により媒介される阻害が可能であることを示す実施例4の結果に基づいて、sCD39のATPアーゼ活性を中和する抗体を探すために、実施例3と異なるプロトコルを使用する異なる免疫付与からの融合を再検討した。
次いで、ATPアーゼ阻害に関するスクリーニングのための様々なアプローチを評価した。一実験では、I-394抗体を使用して、可溶性CD39のATPアーゼ活性を阻害する能力が陰性であることが分かった実施例3の免疫付与のハイブリドーマから上清をスパイクした。上清へのI-394のこの添加により、CD39のATPアーゼ活性を阻害する陰性上清の能力は、回復しなかった。次いで、抗体I-394を、プロテインA被覆ビーズを使用して陰性上清から精製し、本発明者らは、精製されたI-394が再びATP活性を阻害し得ることを観察した。
上述の結果を考慮して、可溶性CD39又は細胞性CD39のATPアーゼ活性の阻害を評価することなく、且つエピトープに関するスクリーニングバイアスなしに、野生型CHO細胞系及びhuCD39を発現するCHO細胞系を使用するフローサイトメトリーにより、新たな免疫付与及び過去の免疫付与からの増殖クローンをスクリーニングする新たな免疫付与及びスクリーニングのプロトコルを開発した。突然変異体5又は突然変異体19への結合の喪失に関するデータが一部のハイブリドーマに関して利用可能であったが、そのようなデータをクローン選択に使用せず、ATPアーゼブロッキングアッセイにおいて陰性結果の場合にクローニングのためにハイブリドーマを救出する目的で保持するのみであった。CD39に結合するハイブリドーマを選択してクローニングし、次いで下記のプロトコルに従ってプロテインAを使用して精製した:
- ハイブリドーマ上清300μlにプロテインAビーズ10μlを添加する
- 最終濃度が1,5μMとなるようにNaClを添加する
- 4℃で3~4時間にわたりチューブを回転させる
- 1500rpmで1分間遠心分離する
- 上清を除去し、TBS 1mlによる3回の洗浄を実施する
- 3回目の洗浄後にTBSを全て除去する
- クエン酸塩0,1M pH3 50μlを添加し、ホモジナイズし、次いで5分にわたりRTでインキュベートする
- 1500rpmで1分にわたりビーズを遠心分離する
- 溶出液50μlを回収し、TBS 450μlを速やかに添加し、次いで4℃で貯蔵する。
- ハイブリドーマ上清300μlにプロテインAビーズ10μlを添加する
- 最終濃度が1,5μMとなるようにNaClを添加する
- 4℃で3~4時間にわたりチューブを回転させる
- 1500rpmで1分間遠心分離する
- 上清を除去し、TBS 1mlによる3回の洗浄を実施する
- 3回目の洗浄後にTBSを全て除去する
- クエン酸塩0,1M pH3 50μlを添加し、ホモジナイズし、次いで5分にわたりRTでインキュベートする
- 1500rpmで1分にわたりビーズを遠心分離する
- 溶出液50μlを回収し、TBS 450μlを速やかに添加し、次いで4℃で貯蔵する。
次いで、得られた抗体を、I-394と同程度までCD39のATPアーゼ活性を阻害する能力に関して比較アッセイでスクリーニングした。可溶性CD39及び細胞性CD39の酵素活性の阻害に使用するアッセイは、上記(方法)で説明したとおりであった。驚くべきことに、この方法で製造した例示的抗体のいくつかは、可溶性CD39の阻害(及び細胞性CD39の阻害)を示した。図1は、代表的なスクリーニング結果を示し、陽性対照I-394抗体と比較して抗体I-397、I-398及びI-399を示す。同様に、異なる免疫付与からの抗体I-395及びI-396は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害した。図2A及び図2Bは、抗体I-395及びI-396の結果を示しており、より多くの抗体が可溶性CD39中和及び細胞性CD39中和の両方の追加実験に利用可能であった。図2Aは、抗体I-395及びI-396が、両方ともBY40抗体及びI-394抗体と比較して細胞膜結合型CD39を阻害し、I-394及びI-395が、両方ともBY40と比較して大きい効力及び細胞性CD39の最大阻害を示すことを示す。図2Bは、抗体I-395及びI-396が、両方ともBY40抗体及びI-394抗体と比較して可溶性CD39を阻害することを示す。BY40は、いかなる濃度でも可溶性CD39を阻害しないが、I-394、I-395及びI-396は、全て可溶性CD39を阻害し、I-394が最大の効力を示し、続いてI-395がより低い効力を示し、次いでI-396がより低い効力を示す。
得られた結果は、ハイブリドーマ上清中の因子が、細胞培養と可溶性CD39アッセイとの両方でATPを迅速に加水分解する可能性を高め、その結果、従来の方法を使用した抗体のスクリーニングではATPに関するシグナルが検出されない。可溶性因子は、CD39又は例えば融合パートナーにより産生されるいくつかの他の酵素であり得る。
次いで、I-394に関して本明細書で示したのと同一の方法において、ヒトFcγ受容体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及びCD64への結合の欠如をもたらす突然変異L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Kabat EUナンバリング)を有するIgG1 Fcドメインを有するヒト定常領域を有するように改変された抗体をクローニングした。次に、得られた抗体を滴定にかけ、次いで効力に従って抗体をランク付けするためにEC50及びIC50の決定を評価するために、実施例7~9(滴定、ATPアーゼ活性の阻害)に示すようにより詳細な活性評価にかけることができる。
実施例6:sCD39中和mAbのエピトープマッピング
実施例4で示すように、I-394は、CD39の突然変異体19を発現する細胞への結合の完全な喪失を示したが、突然変異体5への結合を喪失していなかった。実施例5のさらなる抗CD39抗体のエピトープを定義するために、これらを、実施例1及び表1で説明されているCD39突然変異体のパネルへの結合の喪失に関して試験した。配列番号1のナンバリングを使用して表1に示す突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。試験抗体の用量範囲(10~2.5~0.625~0.1563~0.0391~0.0098~0.0024~0.0006μg/ml)を、フローサイトメトリーにより、20種の生成された突然変異体で試験する。
実施例4で示すように、I-394は、CD39の突然変異体19を発現する細胞への結合の完全な喪失を示したが、突然変異体5への結合を喪失していなかった。実施例5のさらなる抗CD39抗体のエピトープを定義するために、これらを、実施例1及び表1で説明されているCD39突然変異体のパネルへの結合の喪失に関して試験した。配列番号1のナンバリングを使用して表1に示す突然変異体をHek-293T細胞に遺伝子移入した。試験抗体の用量範囲(10~2.5~0.625~0.1563~0.0391~0.0098~0.0024~0.0006μg/ml)を、フローサイトメトリーにより、20種の生成された突然変異体で試験する。
結果は、可溶性CD39を阻害する能力に関して実施例5で選択された抗体がいくつかの異なるエピトープを表すことを示した。実施例5において可溶性細胞外CD39の阻害を示した抗体のうち、抗体I-395は、残基Q96、N99、E143及びR147で置換を有する突然変異体5への結合の喪失を示し、残基R138、M139及びE142で置換を有する突然変異体19への結合の装置も示した抗体の一例である。突然変異体19は、残基R138、M139及びE142で置換を含む。そのため、I-395のCD39上のコアエピトープは、残基Q96、N99、E143及びR147の1つ、2つ、3つ又は4つと、残基R138、M139及びE142の1つ、2つ又は3つとを含む。
一方、抗体I-398は、残基R138、M139及びE142で置換を有する突然変異体19への結合の喪失を示したが、残基Q96、N99、E143及びR147で置換を有する突然変異体5への結合が減少していないか又は喪失していない抗体の一例である。
実施例5において可溶性細胞外CD39の阻害を示した他の抗体は、非常に異なるエピトープを有し、且つ突然変異体5又は突然変異体19の何れかへの結合の喪失を示さず、これは、可溶性CD39がsCD39上の他の部位への結合によっても阻害され得ることを示唆する。一部の抗体の場合、表1の20種の突然変異体の1つへの結合の喪失により、CD39上の結合部位の位置特定が可能となり、他の場合、結合部位は、依然として決定されておらず、なぜなら、20種の突然変異体の何れに対しても結合が喪失されなかったからである。実施例5において可溶性CD39のATPアーゼ活性の阻害を示す抗体のうち、抗体I-396は、他の20種の突然変異体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換K87A、E100A及びD107Aを有する突然変異体15への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のCD39上のコアエピトープは、残基K87、E100及びD107の1つ又は複数(又は全て)を含む。抗体I-399は、他の20種の突然変異抗体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換N371K、L372K、E375A、K376G、V377Aを有し、且つK376とV377との間にバリンの挿入(表1では「挿入377V」と称される)を有する突然変異体11への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のCD39上のコアエピトープは、残基N371、L372、E375、K376及びV377の1つ又は複数(又は全て)を含む。図3Aは、CD39タンパク質の表面上の突然変異体5(M5)、突然変異体15(M15)及び突然変異体19(M19)中で突然変異した残基の位置を示す。図3Bは、様々な抗体に関する突然変異体5、突然変異体15及び突然変異体19への結合の結果を示す。
そのため、この結果は、可溶性CD39を阻害する抗体を様々なエピトープに対して得ることができることを示す。これらのエピトープとして下記が挙げられる:細胞性CD39のみを阻害し可溶性CD39を阻害しない(突然変異体5への結合を喪失している)BY40抗体又はBY40様抗体の結合部位に隣接して位置する突然変異体19の1つ又は複数の残基により定義されるエピトープ、突然変異体19の1つ又は複数の残基により定義されるが、突然変異体5によっても部分的に定義されるエピトープ(BY40抗体又はBY40様抗体と比較して小さいシフトを示す可能性がある)、突然変異体19の1つ又は複数の残基により定義され、且つ突然変異体5の残基により定義されないエピトープ並びに他のエピトープ、例えば突然変異体11の1つ若しくは複数の残基又は突然変異体15の1つ若しくは複数の残基により定義されるか、又は突然変異体5、突然変異体15若しくは当然変異体19の何れかへの結合が全く減少していない他の抗体によりさらに定義されるもの(エピトープの位置特定が依然として決定されていない)。
実施例7:フローサイトメトリーによる、CD39発現細胞に対する抗体滴定
抗体I-394を、ヒトCD39を発現するCHO細胞、カニクイザル(マカカ・ファスキクラリス(macaca fascicularis))CD39を発現するCHO細胞、マウスCD39を発現するCHO細胞及びヒトRamosリンパ腫細胞(ATCC(商標)、リファレンスCRL-1596)への結合に関して2回の反復実験で試験した。細胞を4℃で30分にわたり30μg/ml~5×10-4μg/mlの様々な濃度の非標識抗CD39と共にインキュベートした。洗浄後、4℃で30分にわたり細胞をヤギ抗マウスH+L標識二次抗体と共にインキュベートした。
抗体I-394を、ヒトCD39を発現するCHO細胞、カニクイザル(マカカ・ファスキクラリス(macaca fascicularis))CD39を発現するCHO細胞、マウスCD39を発現するCHO細胞及びヒトRamosリンパ腫細胞(ATCC(商標)、リファレンスCRL-1596)への結合に関して2回の反復実験で試験した。細胞を4℃で30分にわたり30μg/ml~5×10-4μg/mlの様々な濃度の非標識抗CD39と共にインキュベートした。洗浄後、4℃で30分にわたり細胞をヤギ抗マウスH+L標識二次抗体と共にインキュベートした。
結果を図4に示す。抗体I-394は、ヒトCD39を発現する細胞(CHO-huCD39)、カニクイザルCD39を発現する細胞(CHO-cyCD39)及びRamosリンパ腫細胞に結合したが、マウスCD39を発現する細胞(CHO-moCD39)に結合しなかった。I-394は、実験の第1のセット及び第2のセットそれぞれにおいて0.16μg/ml及び0.19μg/mlのEC50値でRamos細胞に結合した。いくつかの他の抗CD39抗体は、Ramos細胞への結合に関して同等のEC50値を示した。
実施例8:細胞性ATPアーゼ活性の阻害に関するIC50の決定
上記(方法)で説明した細胞性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、CD39発現細胞中におけるCD39のATPアーゼ活性の抗体I-394による阻害を評価した。
上記(方法)で説明した細胞性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、CD39発現細胞中におけるCD39のATPアーゼ活性の抗体I-394による阻害を評価した。
結果を図5に示す。I-394は、腫瘍(Ramos)細胞中におけるCD39酵素活性のブロックで非常に強力であり、試験した全ての他の抗体と比較して効力が高い。I-394は、ヒトCD39を発現する細胞(CHO-huCD39)中及びカニクイザルCD39を発現する細胞(CHO-cyCD39)中においてCD39酵素活性もブロックする。マウスCD39を発現する細胞(CHO-moCD39)を陰性対照として示す。算出したIC50(50,000個のRamos細胞によって発現されたCD39の酵素活性の50%の阻害)は、0.05μg/mlである。阻害最大値は、81.6%であった。アイソタイプ対照は、効果がなかった。
実施例9:組換え可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性の阻害に関するIC50の決定
上記(方法)で説明した可溶性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性の抗体I-394による阻害を評価した。結果を図6に示す。I-394は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害する。比較すると、抗体BY40は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害しなかった。算出したIC50は、0.003μg/mlである。阻害最大値は、74.9%であった。
上記(方法)で説明した可溶性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性の抗体I-394による阻害を評価した。結果を図6に示す。I-394は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害する。比較すると、抗体BY40は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性を阻害しなかった。算出したIC50は、0.003μg/mlである。阻害最大値は、74.9%であった。
実施例10:CD39-L1アイソフォーム、CD39-L2アイソフォーム、CD39-L3アイソフォーム、CD39-L4アイソフォームに対するELISA滴定
抗体I-394を、一晩4℃で500ng/ml又は1μg/mlにおいてPBS 1Xで96ウェルプレートにコーティングした、下記に示すアミノ酸配列を有する組換えヒトCD39アイソフォーム(Rec-huCD39アイソフォーム)への結合に関して試験した。ウェルをTBS Tween 20で洗浄し、TBSブロッキング緩衝液でRTにおいてさらに2時間飽和させた。一次抗体の用量範囲濃度をRTで2時間にわたりTBSブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ウェルをTBS Tween 20で洗浄した。二次抗体(TBSブロッキング緩衝液中のGAM-HRP又はGAH-HRP)をRTで1時間にわたりインキュベートし、TMBで明らかにした。光学密度をOD=450でEnspire(商標)により測定した。
抗体I-394を、一晩4℃で500ng/ml又は1μg/mlにおいてPBS 1Xで96ウェルプレートにコーティングした、下記に示すアミノ酸配列を有する組換えヒトCD39アイソフォーム(Rec-huCD39アイソフォーム)への結合に関して試験した。ウェルをTBS Tween 20で洗浄し、TBSブロッキング緩衝液でRTにおいてさらに2時間飽和させた。一次抗体の用量範囲濃度をRTで2時間にわたりTBSブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ウェルをTBS Tween 20で洗浄した。二次抗体(TBSブロッキング緩衝液中のGAM-HRP又はGAH-HRP)をRTで1時間にわたりインキュベートし、TMBで明らかにした。光学密度をOD=450でEnspire(商標)により測定した。
クローニングしたhuCD39(血管アイソフォーム)のアミノ酸配列:
ヒトCD39-L1(NTPDアーゼ2又はENTPD2としても既知である):
ヒトCD39-L2(NTPDアーゼ6又はENTPD6としても既知である):
ヒトCD39-L3(NTPDアーゼ3又はENTPD3としても既知である):
ヒトCD39-L4(NTPDアーゼ5又はENTPD5としても既知である):
ヒトCD39-L1(NTPDアーゼ2又はENTPD2としても既知である):
I-394は、CD39に結合したが、アイソフォームCD39-L1、CD39-L2、CD39-L3又はCD39-L4の何れにも結合しなかった。アイソタイプ対照抗体(IC)は、何れのCD39分子又はCD39-L分子にも結合しなかった。結果を図7に示す。
実施例11:樹状細胞の活性化
ATPは、炎症誘発活性を有するが、ATPのCD39により媒介される異化により、樹状細胞(DC)活性化を損ない得、次いで腫瘍抗原に対するより広範な適応免疫反応が変化すると考えられる。抗CD39抗体を使用するCD39遮断が、ATPの存在下での樹状細胞(DC)活性化のCD39により媒介される変化を克服し得たかどうかを評価するために、本発明者らは、ATPの存在下で抗CD39抗体と共に単球由来のDC(moDC)をインキュベートした。
ATPは、炎症誘発活性を有するが、ATPのCD39により媒介される異化により、樹状細胞(DC)活性化を損ない得、次いで腫瘍抗原に対するより広範な適応免疫反応が変化すると考えられる。抗CD39抗体を使用するCD39遮断が、ATPの存在下での樹状細胞(DC)活性化のCD39により媒介される変化を克服し得たかどうかを評価するために、本発明者らは、ATPの存在下で抗CD39抗体と共に単球由来のDC(moDC)をインキュベートした。
簡潔に説明すると、ヒト単球をヒトの健康な血液から精製し、6日にわたりGM-CSF及びIL-4の存在下でMoDCに分化させた。次いで、MoDCを24時間にわたりATP(Sigma、0.25~1mM)の存在下で活性化させ、フローサイトメトリーにより、CD80、CD83及びHLA-DRの発現を分析することによりDC活性化を評価した。任意選択により、CD39阻害剤:ARL6716(Tocris、250μM)、CD73阻害剤:APCP(Tocris 50μM)、抗CD39ブロッキング抗体I-394若しくはBY40(BY40に関して、国際公開第2009/095478号パンフレットを参照されたい)又は抗CD73ブロッキング抗体の存在下で1時間にわたりMoDCをプレインキュベートした。LPS(Invivogen、10ng/ml)を陽性対照として使用した。CD4T細胞活性化へのATPにより媒介されるDC活性化の生じた効果を評価するために、ATPにより活性化されたDCを洗浄し、次いで5日にわたる混合リンパ球反応(MLR)のために同種CD4T細胞と共にインキュベートした(比1 MoDC/4 T細胞)。T細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるCD25発現及びCell Trace Violet希釈により分析した(図8)。
結果を図9、図10及び図11に示す。陰性対照(培地)の存在下では、1mMのATPの存在下でmoDCの活性化を観察したが、0.125mM、0.25mM又は0.5mMでのATPではmoDCの活性化は可能でなかった。活性部位への結合によりCD39酵素活性を完全にブロックすると考えられるCD39の化学阻害剤の添加により、0.125mM、0.25mM又は0.5mMのそれぞれでmoDC活性化がもたらされる。しかしながら、抗CD39抗体(例えば、BY40抗体又は抗CD73抗体)は、樹状細胞(DC)のATPにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ATPの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。驚くべきことに、CD39のATPアーゼ活性を実質的に完全にブロックし、従ってATPの蓄積を可能にし得る抗CD39ブロッキング抗体I-394(図面では、濃度10μg/mlで示す)は、0.125mM、0.25mM又は0.5mMのそれぞれでHLA-DR又はCD83の発現によって評価した場合、moDC活性化を可能にした(図9及び図10)。興味深いことに、ATPの存在下で活性化されたMoDCは、MLRアッセイにおいてより良好なT細胞の活性化及び増殖を誘導し得た。さらに、抗CD39ブロッキング抗体I-394による、ATPにより媒介されるMoDCの活性化の増強により、より高いT細胞の増殖及び活性化がもたらされた(図11)。
ATPの存在下でCD39阻害剤がDCを活性化する能力の評価により、CD39の高度な阻害を達成し得る抗CD39抗体を特定して評価するための方法が提供される。さらに、DCへのCD39によりもたらされる免疫抑制効果を緩和するための抗CD39抗体の使用の可能性により、(特に腫瘍細胞上の)抗原に対する適応免疫反応の増強がもたらされ得る。さらに、そのような抗CD39抗体は、化学療法剤の免疫原性効果を増強するために使用される場合、特に興味深い場合がある。腫瘍細胞の壊死を生じさせる多くの化学療法剤は、ATPを誘導することができ、抗CD39抗体とのそのような薬剤の併用は、抗腫瘍反応を増強するのに特に有用であり得る。
実施例12:組換え可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害する抗体は、ATPの存在下でCD73遮断物を強力に増強する。
T細胞増殖アッセイ
健常ドナーからの末梢血をEFSから入手し、単核細胞をFicoll(商標)勾配上で単離した。リンパ球を52%のPercoll(商標)勾配上で細胞ペレットの回収によりさらに濃縮し、Cell Trace色素(Thermofisher)により、製造業者から提供されるTDSに従って染色した。染色細胞の5×104~1×105個を96丸底プレート中に分配し、抗huCD73抗体(国際公開第2016/131950号パンフレットに記載の抗体6E1)及び/又は抗huCD39 Ab(本明細書に記載のI-394)と共に37℃において1時間インキュベートし、抗CD3/抗CD28コーティングビーズ(ビーズ:細胞=1:4;Life Technologies)の添加により3~5日間活性化させた。T細胞増殖の阻害をATP(200μM)の添加により達成した。T細胞増殖及びAMPの免疫抑制効果をブロックするAbの能力を、フローサイトメトリーにより、増殖T細胞サブセットにおける色素希釈を定量することにより評価した。
T細胞増殖アッセイ
健常ドナーからの末梢血をEFSから入手し、単核細胞をFicoll(商標)勾配上で単離した。リンパ球を52%のPercoll(商標)勾配上で細胞ペレットの回収によりさらに濃縮し、Cell Trace色素(Thermofisher)により、製造業者から提供されるTDSに従って染色した。染色細胞の5×104~1×105個を96丸底プレート中に分配し、抗huCD73抗体(国際公開第2016/131950号パンフレットに記載の抗体6E1)及び/又は抗huCD39 Ab(本明細書に記載のI-394)と共に37℃において1時間インキュベートし、抗CD3/抗CD28コーティングビーズ(ビーズ:細胞=1:4;Life Technologies)の添加により3~5日間活性化させた。T細胞増殖の阻害をATP(200μM)の添加により達成した。T細胞増殖及びAMPの免疫抑制効果をブロックするAbの能力を、フローサイトメトリーにより、増殖T細胞サブセットにおける色素希釈を定量することにより評価した。
GraphPad Prism(商標)ソフトウェアを使用して、増殖T細胞の割合対抗CD73 Ab濃度をグラフにプロットする。
結果
抗体を、腫瘍環境中で見出され得る条件を表すことを意図する、添加されたATPの存在下でCD4又はCD8T細胞増殖を回復させる能力に関して検査した。抗CD73及びCD39のそれぞれを抗CD73又は抗CD39抗体の他方の3つの異なる用量における用量範囲において検査した。抗CD39抗体I-394は、CD4又はCD8T細胞増殖の回復において抗CD73抗体の効果を強力に増強し、その結果、低濃度の抗CD73抗体(例えば、0.01μg/ml未満、0.001μg/ml未満及びさらに0.001μg/ml未満)であっても、抗CD39抗体と組み合わせて使用した場合、CD4又はCD8T細胞増殖を強力に増強させた。さらに、抗CD73を用いず単独の用量範囲で検査した場合、抗CD39抗体I-394は、0.1μg/ml及び1μg/mlの濃度においてCD4又はCD8T細胞増殖の顕著な増強をもたらした。図12Aは、抗CD39抗体I-394の3つの異なる用量、0.01μg/ml、0.1μg/ml及び1μg/mlの何れかでのCD4T細胞増殖に対する抗CD73抗体6E1の用量範囲を示す。可溶性及び/又は単量体ヒトCD39を中和することができる抗CD39抗体は、CD4T細胞増殖の回復において抗CD73抗体での効果の強力な増強を示す。この効果は、抗CD73抗体が、抗CD73抗体での処理の過程中に腫瘍組織において観察され得る濃度範囲に対応する準最適活性である濃度において特に強力であった。0.01μg/mlの濃度において、抗CD39抗体は、抗CD73抗体の効力のおよそ1-logの増加を提供し、0.1μg/mlの濃度において、抗CD39抗体は、抗CD73抗体の効力のおよそ4-logの増加を提供した。従って、抗CD39抗体は、特に腫瘍組織中において、例えばCD73発現細胞を有する腫瘍中で抗CD73抗体の活性を増強させるために有用であり得る。さらに、検査した抗CD73抗体(可溶性CD73タンパク質を中和することができる)は、CD4T細胞増殖を回復させる高い能力を有した一方、他の抗体は、より低い効力を有し(例えば、酵素阻害アッセイにおいて、T細胞増殖アッセイ又は他の適切なアッセイにおいて評価)、抗sCD39抗体との組合せからより一層利益を受け得る。図12Bは、CD8T細胞増殖に対する抗CD73抗体の用量範囲を示す。ここでも、抗CD39抗体は、CD8T細胞増殖の回復において抗CD73抗体との強力な相乗及び/又は相加効果を示す。この効果は、抗CD73抗体が、抗CD73抗体での処理の過程中に腫瘍組織において観察され得る濃度範囲に対応する準最適活性である濃度において特に強力であった。
抗体を、腫瘍環境中で見出され得る条件を表すことを意図する、添加されたATPの存在下でCD4又はCD8T細胞増殖を回復させる能力に関して検査した。抗CD73及びCD39のそれぞれを抗CD73又は抗CD39抗体の他方の3つの異なる用量における用量範囲において検査した。抗CD39抗体I-394は、CD4又はCD8T細胞増殖の回復において抗CD73抗体の効果を強力に増強し、その結果、低濃度の抗CD73抗体(例えば、0.01μg/ml未満、0.001μg/ml未満及びさらに0.001μg/ml未満)であっても、抗CD39抗体と組み合わせて使用した場合、CD4又はCD8T細胞増殖を強力に増強させた。さらに、抗CD73を用いず単独の用量範囲で検査した場合、抗CD39抗体I-394は、0.1μg/ml及び1μg/mlの濃度においてCD4又はCD8T細胞増殖の顕著な増強をもたらした。図12Aは、抗CD39抗体I-394の3つの異なる用量、0.01μg/ml、0.1μg/ml及び1μg/mlの何れかでのCD4T細胞増殖に対する抗CD73抗体6E1の用量範囲を示す。可溶性及び/又は単量体ヒトCD39を中和することができる抗CD39抗体は、CD4T細胞増殖の回復において抗CD73抗体での効果の強力な増強を示す。この効果は、抗CD73抗体が、抗CD73抗体での処理の過程中に腫瘍組織において観察され得る濃度範囲に対応する準最適活性である濃度において特に強力であった。0.01μg/mlの濃度において、抗CD39抗体は、抗CD73抗体の効力のおよそ1-logの増加を提供し、0.1μg/mlの濃度において、抗CD39抗体は、抗CD73抗体の効力のおよそ4-logの増加を提供した。従って、抗CD39抗体は、特に腫瘍組織中において、例えばCD73発現細胞を有する腫瘍中で抗CD73抗体の活性を増強させるために有用であり得る。さらに、検査した抗CD73抗体(可溶性CD73タンパク質を中和することができる)は、CD4T細胞増殖を回復させる高い能力を有した一方、他の抗体は、より低い効力を有し(例えば、酵素阻害アッセイにおいて、T細胞増殖アッセイ又は他の適切なアッセイにおいて評価)、抗sCD39抗体との組合せからより一層利益を受け得る。図12Bは、CD8T細胞増殖に対する抗CD73抗体の用量範囲を示す。ここでも、抗CD39抗体は、CD8T細胞増殖の回復において抗CD73抗体との強力な相乗及び/又は相加効果を示す。この効果は、抗CD73抗体が、抗CD73抗体での処理の過程中に腫瘍組織において観察され得る濃度範囲に対応する準最適活性である濃度において特に強力であった。
実施例13:抗体I-394の強力なヒト化バリアントの生成
配列番号6及び7のVH及びVLアミノ酸配列をそれぞれ有する親抗体I-394を、ヒトサブグループIGHV1-3由来の重鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGHJ1*01(FR4)と一緒にVH中に導入し、且つヒトサブグループIGKV4-1由来の軽鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGKJ4*01(FR4)と一緒にVL中に導入することにより改変した。
配列番号6及び7のVH及びVLアミノ酸配列をそれぞれ有する親抗体I-394を、ヒトサブグループIGHV1-3由来の重鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGHJ1*01(FR4)と一緒にVH中に導入し、且つヒトサブグループIGKV4-1由来の軽鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGKJ4*01(FR4)と一緒にVL中に導入することにより改変した。
異なるヒトVH及びVL遺伝子セグメントに基づく三次元モデルをスーパーインポーズ処理し、全てのアミノ酸差異を1つずつ精査した。親キメラ(HPLP)及びヒト化(H0L0)抗体の両方の3Dモデルを使用してインシリコ分子設計を試行した。Discovery Studio(DSバージョン4.5)のModel Antibodyプロトコルを使用してFabフラグメントの3Dモデルを構築した。
N297S置換(N297結合グリコシル化を欠いている)又はL234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換(N297結合グリコシル化を保持する)]を含むFcドメインを含むヒトIgG1定常領域を有するI-394のキメラFabバージョンのモデリングに使用した重鎖及び軽鎖配列は、下記のとおりであった。
I-394-LP(親Fab軽鎖):
I-394-HP(親Fab重鎖):
I-394-LP(親Fab軽鎖):
重鎖及び軽鎖テンプレート構造を同定し、タンパク質構造データベース(Protein Data Bank)(PDB)リファレンス4M7K、1I7Z及び3D85をVH/VL界面、LC及びHCモデリングにそれぞれ使用した。使用したPDBデータベースは、RCSBメンバーRutgers及びUCSD/SDSCにより管理される構造バイオインフォマティクス研究共同体からのRCSB PDBであり、www.rcsb.org及びH.M.Berman,et al.(2000)The Protein Data Bank Nucleic Acids Research,28:235-242を参照されたい。PDBエントリー4M7Kのリファレンス:Teplyakov,A.,et al.(2014)Proteins 82:1563-1582。PDBエントリー1I7Zのリファレンス:Larsen,N.A.,et al.,(2001)J.Mol.Biol.311:9-15。PDBエントリー3D85のリファレンス:Beyer,B.M.,et al.(2008)J.Mol.Biol.382:942-955。
I-394のヒト化Fabバージョンのモデリングに使用した重鎖及び軽鎖配列は、下記のとおりであった。
I-394 Fab L0軽鎖:
I-394 Fab H0重鎖:
I-394 Fab L0軽鎖:
I-394のヒト化Fabバージョンのため、PDBリファレンス4NWT、4I77及び4JPIをVH/VL界面、LC及びHCモデリングにそれぞれ使用した。PDBエントリー4NWTのリファレンス:Bowers,P.M.,et al.,(2014)J.Biol.Chem.289:33557-33567。PDBエントリー4I77のリファレンス:Ultsch,M.,et al.,(2013)J.Mol.Biol.425:1330-1339。PDBエントリー4JPIのリファレンス:Jardine,J.,et al.,(2013)Science 340:711-716。
軽鎖及び重鎖ヒト化バリアントの中間選択のため、HPLP及びH0L0の3Dモデルをスーパーインポーズ処理し、全てのアミノ酸差異を1つずつ精査した。残基間の鎖間及び鎖外連結も評価して、所与の鎖中の復帰突然変異の導入によりいかなる重要な低エネルギー結合も破壊しないようにした。さらに、軽鎖及び重鎖ヒト化バリアントのため、Kabat CDRナンバリングスキームとIMGT CDRナンバリングスキームとの間の不一致により影響を受けるアミノ酸をHPLP及びH0L0の3Dモデルのオーバーレイで具体的に精査し;知見は、VH中のKabat残基50(IGMT CDR2残基でなくKabat)に存在する親残基(チロシン)を保持するが、位置60及び64(両方ともKabat CDR2残基)において親残基を保持しないVHバリアント(H2*、H3*及びH4*として*により指定される)の設計を促進した。同様に、位置24(Kabat CDR1残基)において親残基を保持しないVLバリアントL1*を産生させた。
アミノ酸改変を親配列中に導入した。抗CD39抗体VH及びVL配列を下記の表Aに提供する。配列番号27の親H0VHと比較して、H1は、R72V置換(FR3)を含有し;H2は、V68A(FR3)及びR72V(FR3)置換を含有し;H2*は、V68A(FR3)及びR72V(FR3)置換並びにN61S(CDR2)置換を含有し;H3は、M48I(FR2)、V68A(FR3)及びR72V(FR3)置換を含有し;H3は、M48I(FR2)、V68A(FR3)及びR72V(FR3)置換並びにCDR2中のN61S及びK65Q置換を含有し;H4は、M48I(FR2)、V68A(FR3)、R72V(FR3)及びS77R FR3)置換を含有し;且つH4*は、M48I(FR2)、V68A(FR3)、R72V(FR3)及びS77R(FR3)置換並びにCDR2中N61S及びK65Q置換を含有する。配列番号35の親L0鎖VLと比較して、L1は、Y40F置換(FR2)を含有し、且つL1*は、Y40F置換(FR2)及びR24K置換(CDR1)を含有する。
VH及びVL可変領域を有する抗体を、ヒトFcγ受容体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及びCD64への結合の損失をもたらす重鎖置換L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Kabat EUナンバリング)突然変異を有するFcサイレント組換えキメラヒトIgG1抗体として産生させた。
簡潔に説明すると、下記に示すVH及びVk配列を、huIgG1定常ドメイン(L234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換を有する)及びhuCk定常ドメインをそれぞれ含有するベクター中にクローン化した。2つの得られたベクターをCHO細胞系中にコンビナトリアル様式で共遺伝子移入してVH及びVLの組合せを生成した。樹立した細胞のプールを使用してCHO培地中で抗体を産生させた。次いで、プロテインAを使用して抗体を精製した。
親CDR移植ヒト化抗体(mAb1)に加え、親CDR移植バージョンと比較して異なるアミノ酸置換を含有する抗体の23種のさらなるヒト化バリアントを構築した。全ての抗体バリアントをヒトIgG1抗体としてCHO細胞中で良好に産生させた。得られた抗体mAb1~mAb24のVH及びVLを表Bに示す。
抗体mAb1~21を、CD39への結合に関して、実施例7に記載のフローサイトメトリーにより、ヒトCD39を発現するCHO細胞及びカニクイザル(マカカ・ファスキクラリス(macaca fascicularis))CD39を発現するCHO細胞を使用して評価した。全てのmAbは、ヒト及びカニクイザルCD39CHO細胞系に対する親I-394抗体への同等の結合を示した。
実施例14:抗体I-394のヒト化バリアントの活性
mAb1~24を、種々のアッセイによりCD39の結合及び阻害に関して、例えば特に高レベルのCD39を発現することが見出されたRamos腫瘍細胞系上に存在するCD39への結合、組換え産生sCD39の酵素活性の阻害並びにヒトCD39を発現するCHO細胞及びRamos腫瘍細胞からの細胞培養上清中で排出されるsCD39タンパク質の酵素活性の阻害に関してさらに評価した。
mAb1~24を、種々のアッセイによりCD39の結合及び阻害に関して、例えば特に高レベルのCD39を発現することが見出されたRamos腫瘍細胞系上に存在するCD39への結合、組換え産生sCD39の酵素活性の阻害並びにヒトCD39を発現するCHO細胞及びRamos腫瘍細胞からの細胞培養上清中で排出されるsCD39タンパク質の酵素活性の阻害に関してさらに評価した。
抗体をRamosリンパ腫細胞に対して、実施例7に記載の方法に従ってフローサイトメトリーにより滴定した。結果は、Ramos細胞系に対する全てのL0バリアントの結合は、親I-394抗体と比較して強くないことを示した一方、H2L1、H2L1*、H4L1及びH4L1*抗体(それぞれmAb8、9、20及び21)は、最良の結合を示し、全て親I-394抗体と同様であった。図13を参照されたい。
抗体を、可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害する能力に関して、上記(方法)で説明した可溶性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して検査した。全ての抗体は、良好な活性を示し、H3L1、H3L1*、H4L1及びH4L1*(それぞれmAb14、15、20及び21)は、全て親I-394抗体と同等であった一方、他の抗体は、わずかに低い効力を有した。抗体を、ヒトCD39を発現するCHO細胞からの細胞培養上清中で放出された可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害する能力に関しても、上記(方法)で説明した可溶性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して検査した。全ての抗体は、良好な活性を示し、H4L1及びH4L1*(mAb20及びmAb21)は、両方とも親I-394抗体と同等であった一方、他の抗体は、わずかに低い効力を有した。
抗体を検査し、実施例12に記載のアッセイでT細胞抑制の減少におけるその有効性を評価した。CD4T細胞活性化に対するATP媒介DC活性化の効果を検査するため、ATPにより活性化されたDCを洗浄し、次いで混合リンパ球反応(MLR)のために同種CD4T細胞と共に5日間インキュベートした(比1 MoDC/4 T細胞)。T細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるCD25発現及びCell Trace Violet希釈により分析した。結果は、重鎖H2、H3又はH4鎖をL1軽鎖と組み合わせて有する抗体が全て親I-394抗体と同程度に効率的である一方、L0軽鎖を有する抗体がそれほど効率的でないことを示した。
抗体を、膜結合型CD39を発現する細胞系中でのATPアーゼ活性の阻害における効力に関して検査した。CD39発現細胞中でのCD39のATPアーゼ活性の抗体による阻害は、上記(方法)で説明した細胞性CD39の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して評価した。抗体を最初にヒトCD39を発現するCHO細胞に対して評価し;この設定では、CHO遺伝子移入細胞系に対するバリアントmAb1~24と親I-394抗体との間の実質的な差異は、観察されなかった。しかしながら、抗体を腫瘍細胞系Ramos及びMinoに対して評価した場合、H4L1及びH4L1*抗体(mAb20及びmAb21)は、CD39酵素活性のブロックで他の全ての抗体と比較して強力であった。図14は、Mino細胞における結果を示す。遺伝子移入体及び腫瘍細胞におけるアッセイ間で観察された差異は、CHO細胞と比較してそれらの腫瘍細胞系中で見出される特に高いCD39発現から生じ得、抗体間の効力の差異の新事実が認められる。H4*重鎖及びL1又はL1*軽鎖を有する抗体もRamos腫瘍細胞に対して検査し;この設定では、H4*抗体mAb23及びmAb24は、mAb20及びmAb21よりもわずかに低い効力を有した。まとめると、腫瘍細胞由来sCD39(例えば、高レベルのCD39を発現する腫瘍細胞中)の最も強力な阻害剤は、H4重鎖を有する抗体、次いでH2重鎖を有する抗体、次いでH3重鎖を有する抗体であり、それぞれの場合にL1軽鎖を有する。1つの考えられる説明は、H2バリアントよりも効力を低くさせるH3バリアント中の有害な復帰突然変異(BM)が存在するが、それは、順次、親I-394のレベルに活性を回復させるH4重鎖バリアント中の置換により平衡されることである。従って、全てのヒト化バリアントの最も強力な抗体は、H4L1抗体(配列番号31のVH及び配列番号36のVLを有する)及びH4L1*抗体(配列番号31のVH及び配列番号37のVLを有する)であった。mAb20は、ヒトIGHV1-3遺伝子由来の重鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGHJ1*01遺伝子(FR4)と一緒に、且つ下記の置換(Kabatナンバリング):M48I(FR2)、V68A(FR3)、R72V(FR3)及びS77R(FR3)を有し、且つヒトサブグループIGKV4-1由来の軽鎖フレームワーク(FR1、FR2、FR3)をIGKJ4*01(FR4)と一緒に、且つY40F置換(FR2)を有する、配列番号8~13に示されるそれぞれの重鎖及び軽鎖CDRを有する。mAb21は、Kabat残基24において軽鎖CDR1中の置換(R24K置換)をさらに有する。
L234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換を有するH4L1抗体(mAb20)の全長重鎖を下記に示す。
H4L1抗体(mAb20)の全長軽鎖を下記に示す。
H4L1*抗体(mAb21)の全長軽鎖を下記に示す。
実施例15:抗体I-394のヒト化バリアントの安定性
全てL234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換を有するヒトIgG1アイソタイプとして産生された抗体mAb1~24及び従来技術の抗CD39抗体BY40をおよそ7mg/mLの濃度における下記の参照処方物中の安定性に関して検査した:pH6.0;ヒスチジン緩衝液(10mM);スクロース(200mM);NaCl(50mM);ポリソルベート80(PS80)(0.2g/L)。処方物の安定性を2つの貯蔵条件(+5℃±3℃及び+40±3℃においてモニタリングした。それぞれの試験のため、3つの時点:T0、T15D(15日間)及びT1M(1ヶ月)を実施した。凍結融解(F/T)及び熱シフト安定性アッセイ(TSSA)をフォーマット比較のために実行した。F/Tサイクルを実施するため、サンプルを-20℃において少なくとも2時間凍結させ、室温において少なくとも1時間融解させ、このF/Tサイクルを3回繰り返し、サンプルを最後の凍結/融解サイクルの24時間後に検査した。それぞれの時点において、下記の検査を実施した。
・粒子状物質(MFI)
・目視調査(外観)
・不純物(SE-HPLC)
・濁度(400nm)
・タンパク質濃度(280nm)(Nanodrop、Thermo Fisher Scientific Inc.を用いて実施)
全てL234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換を有するヒトIgG1アイソタイプとして産生された抗体mAb1~24及び従来技術の抗CD39抗体BY40をおよそ7mg/mLの濃度における下記の参照処方物中の安定性に関して検査した:pH6.0;ヒスチジン緩衝液(10mM);スクロース(200mM);NaCl(50mM);ポリソルベート80(PS80)(0.2g/L)。処方物の安定性を2つの貯蔵条件(+5℃±3℃及び+40±3℃においてモニタリングした。それぞれの試験のため、3つの時点:T0、T15D(15日間)及びT1M(1ヶ月)を実施した。凍結融解(F/T)及び熱シフト安定性アッセイ(TSSA)をフォーマット比較のために実行した。F/Tサイクルを実施するため、サンプルを-20℃において少なくとも2時間凍結させ、室温において少なくとも1時間融解させ、このF/Tサイクルを3回繰り返し、サンプルを最後の凍結/融解サイクルの24時間後に検査した。それぞれの時点において、下記の検査を実施した。
・粒子状物質(MFI)
・目視調査(外観)
・不純物(SE-HPLC)
・濁度(400nm)
・タンパク質濃度(280nm)(Nanodrop、Thermo Fisher Scientific Inc.を用いて実施)
得られた抗体H2L1(mAb8)、H2L1*(mAb9)、H4L1(mAb20)及びH4L1*(mAb21)は、全て良好な物理化学的安定性を示した。凝集温度(TAgg)を、抗体BY40と比較した親I-394抗体に関して図15Aに、且つH2L1、H2L1*、H4L1又はH4L1*鎖の組合せを有する抗体に関して図15Bに示す。I-394並びにH2L1、H2L1*、H4L1及びH4L1*抗体のそれぞれは、70℃に迫るTAggを示した。60℃に近いTAggを有する抗体BY40と比較して、H2L1、H2L1*、H4L1及びH4L1*抗体は、有意な安定性の利点を示す。抗体BY40の比較的低い固有安定性に関して考えられる1つの理由は、比較的高い予測疎水性をBY40抗体に付与するCDR中、特に重鎖CDR3中に位置するmAbの表面における多数の芳香族アミノ酸残基である。
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書中の他の箇所でなされる特定の文献の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、(法律によって許される最大の限度で)各参考文献が個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
「1つの(a)」及び「1つの(an)」及び「その(the)」という語及び同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈すべきである。
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である(例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値又は測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る)。
1つ又は複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」又は「含有する」などの語を使用した本明細書における何らかの態様又は実施形態の本明細書中の記述は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の1つ又は複数の要素「からなる」、「から基本的になる」又はそれを「実質的に含む」、本明細書における同様の態様又は実施形態に対する支持を提供するものとする(例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである)。
本明細書中で提供されるあらゆる実施例又は代表的な語(例えば、「など」)の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。
Claims (56)
- ヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つ可溶性細胞外ドメインヒトCD39ポリペプチドのATPアーゼ活性を阻害することができる抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号38のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号39又は40からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項1に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- ヒトIGHV1-3遺伝子由来の重鎖フレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列と、ヒトIGKV4-1遺伝子由来の軽鎖フレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列とを含む、請求項1又は2に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- ヒトCD39ポリペプチドに結合し、且つ可溶性細胞外ドメインヒトCD39タンパク質のATPアーゼ活性に結合し、及びそれを阻害することができる抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号8、9及び10に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトIGHV1-3遺伝子由来のフレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号17、12及び13に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3並びにヒトIGKV4-1遺伝子由来のフレームワークFR1、FR2及びFR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号36及び37からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、請求項4に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1~5の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1~5の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号32のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号36又は37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4又は5に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ヒト腫瘍細胞によって産生される可溶性細胞外ドメインヒトCD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができる、請求項1~15の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ヒトCD39発現腫瘍細胞からの細胞培養上清中で排出されるsCD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができる、請求項1~16の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記腫瘍細胞は、Ramos腫瘍細胞である、請求項1~17の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、外因的に添加されたATPの存在下で前記CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害し、任意選択により、外因的に添加されたATPは、20μMの濃度で提供される、請求項1~18の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、細胞の表面におけるヒトCD39タンパク質に結合することができ、且つ細胞の表面における前記CD39タンパク質のATPアーゼ活性を阻害することができる、請求項1~19の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ヒトCD39発現腫瘍細胞からの細胞培養上清中で排出されるsCD39タンパク質のATPアーゼ活性の50%超、任意選択により70%超、任意選択により80%超の低下を生じさせることができる、請求項1~20の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、CD39発現細胞による前記細胞外ATPアーゼ活性の少なくとも80%の低下を生じさせることができる、請求項1~21の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、1μg/ml以下の、CD39のATPアーゼ活性の阻害に関するEC50によって特徴付けられ、CD39の酵素活性の阻害は、ATPを定量することにより、Ramos細胞中におけるATPアーゼ活性の中和を評価することによって決定される、請求項1~22の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、Ramos細胞への結合に関して、2μg/ml以下、任意選択により1μg/ml以下、0.5μg/ml以下、0.1μg/ml以下の、フローサイトメトリーによって決定されるEC50によって特徴付けられる、請求項1~23の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、配列番号1のCD39ポリペプチドへの結合に関して、配列番号31及び36のそれぞれの重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する、請求項1~24の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ATPの存在下で樹状細胞の活性化を増加させることができる、請求項1~25の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、単球由来の樹状細胞が前記抗体及びATPと共にインビトロでインキュベートされる場合、前記moDC中における活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を生じさせることができる、請求項1~26の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 外因的に添加されたATPは、0.125mM、0.25mM又は0.5mMで提供される、請求項26又は27に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 活性化の細胞表面マーカーの発現の増加は、24時間にわたってATPの存在下でmoDCをインキュベートし、且つフローサイトメトリーによってmoDC上でCD80、CD83及び/又はHLA-DRの細胞表面発現を分析することによって評価される、請求項26~28の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 細胞表面マーカーの発現の前記増加は、陰性対照(例えば、培地)と比較して少なくとも40%、50%、75%又は80%である、請求項27~29の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ATPの存在下において、CD39を発現するDC細胞と共にT細胞がインビトロで共培養された場合にT細胞増殖を増加させることができる、請求項1~30の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体は、前記抗体と、配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型CD39ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合に突然変異R138R、M139A及びE142K(配列番号1を基準にする)を含む突然変異体CD39ポリペプチドへの減少した結合を有する、請求項1~31の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、裸の抗体、任意選択により細胞傷害剤に結合されていない抗体である、請求項1~32の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、抗体フラグメント、任意選択によりFcドメインを欠く抗体フラグメントである、請求項1~33の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、ヒトFcドメインを有する抗体であり、前記ヒトFcドメインは、前記FcドメインとヒトFcγ受容体との間の結合を減少させるように改変されている、請求項1~34の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体は、ヒトCD16、CD32a、CD32b及び/又はCD64ポリペプチドへの結合を実質的に欠く、請求項1~35の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、Fcドメインを含み、任意選択により、前記Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及び/又はCD64の1つ若しくは複数又は全てへの減少又は消失した結合を有するアミノ酸改変を含む、請求項1~36の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 前記抗体は、完全長抗体である、請求項1~37の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 改変されたヒトIgG1 Fcドメインを含み、前記改変されたヒトIgG1 Fcドメインは、Kabat残基N297においてN結合グリコシル化を含み、且つKabat残基234及び235、任意選択によりさらにKabat残基331、任意選択によりKabat残基234、235、237並びにKabat残基330及び/又は331においてアミノ酸置換を含み、任意選択により、前記Fcドメインは、L234A/L235E/P331S置換、L234F/L235E/P331S置換、L234A/L235E/G237A/P331S置換又はL234A/L235E/G237A/A330S/P331S置換を含む、請求項1~38の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
- 請求項1~39の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1~39の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含み、任意選択により請求項1~39の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを特異的に認識する標識された二次抗体又は抗体フラグメントをさらに含むキット。
- 請求項1~39の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸。
- 請求項1~39の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを産生する組換え宿主細胞。
- 疾患の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、請求項1~39の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメント又は請求項40に記載の組成物の有効量を前記個体に投与することを含む方法。
- 個体において可溶性CD39タンパク質のATPアーゼ活性を低下させるための方法であって、請求項1~39の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメント又は請求項40に記載の組成物の有効量を前記患者に投与することを含む方法。
- 前記個体は、癌を有する、請求項45に記載の方法。
- 癌を有する対象においてT細胞活性、NK細胞活性及び/若しくはB細胞活性を増加させ、且つ/又は癌を有する対象においてT細胞活性、NK細胞活性及び/若しくはB細胞活性のアデノシンにより媒介される阻害を軽減するための方法であって、請求項1~39の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメント又は請求項40に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
- 癌を有する対象において樹状細胞の活性化を増加させ、且つ/又は癌を有する対象においてDC細胞のATPにより媒介される活性化を回復させるための方法であって、請求項1~39の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメント又は請求項40に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
- 前記個体は、検出可能な可溶性CD39タンパク質を有する、請求項44~48の何れか一項に記載の方法。
- 前記個体は、循環、腫瘍組織及び/又は腫瘍隣接組織において、検出可能な可溶性CD39タンパク質を有する、請求項49に記載の方法。
- 癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
a)循環及び/又は腫瘍環境において可溶性CD39タンパク質を検出することと、
b)任意選択により、参照レベルと比較して増加しているレベルにおいて、可溶性CD39タンパク質が循環及び/又は腫瘍環境中に含まれていると決定すると、請求項1~39の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体フラグメント又は請求項40に記載の組成物を前記個体に投与することと
を含む方法。 - 可溶性CD39タンパク質を検出することは、前記個体から生物学的サンプルを得ることと、前記サンプルを、可溶性CD39タンパク質に結合する抗体と接触させることと、可溶性CD39タンパク質に結合された抗体を検出することとを含む、請求項51に記載の方法。
- 抗CD39抗体は、可溶性CD39タンパク質の酵素活性の中和に関する少なくともEC50に対応する血液(血清)及び/又は腫瘍組織中における濃度を達成するのに有効な量で少なくとも1回投与される、請求項44~52の何れか一項に記載の方法。
- 可溶性CD39タンパク質の酵素活性の中和は、前記CD39タンパク質が抗CD39抗体又は抗体フラグメントと共にインキュベートされるときに加水分解されたATPの減少を定量することにより、溶液中におけるCD39細胞外ドメインタンパク質のATPアーゼ活性の中和を評価することによって決定される、請求項44~53の何れか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍又は癌は、固形腫瘍である、請求項44~51の何れか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍又は癌は、頭頸部扁平上皮癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸直腸癌、メラノーマ、胃癌、食道癌又は乳癌である、請求項55に記載の方法。
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