BR112020024412A2

BR112020024412A2 - anticorpos, composição farmacêutica, kit, ácido nucleico, célula hospedeira, métodos de tratamento ou prevenção de câncer, de redução da atividade, de aumento da atividade e de aumento da ativação

Info

Publication number: BR112020024412A2
Application number: BR112020024412-0A
Authority: BR
Inventors: Stéphanie Chanteux; Laurent Gauthier; Nicolas GOURDIN; Carine Paturel; Ivan Perrot; Benjamin Rossi
Original assignee: Innate Pharma
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2021-03-23
Also published as: CN112334486A; US20230025732A1; AR115566A1; AU2019289646A1; SG11202012435UA; BR112020024412A8; EP3807316A1; JP2021528063A; CA3099893A1; EP3807316B1; TW202016142A; US20200024357A1; JP2024026170A; US11377503B2; EA202092518A1; KR20210023983A; WO2019243252A1; MX2020012107A

Abstract

anticorpos,composição farmacêutica,kit, ácido nucleico, célula hospedeira, métodos de tratamento ou prevenção de câncer, de redução da atividade, de aumento da atividade e de aumento da ativação. a presente invenção refere-se a compostos de ligação de antígenos que inibem a atividade enzimática de cd39 humano solúvel. a presente invenção também se refere a células produtoras desses compostos; métodos de fabricação desses compostos, seus anticorpos, fragmentos, variantes e derivados; composições farmacêuticas que os compreendem; e métodos de uso dos compostos para o diagnóstico, tratamento ou prevenção de doenças, tais como câncer.

Description

“ANTICORPOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE CÂNCER, DE REDUÇÃO DA ATIVIDADE, DE AUMENTO DA ATIVIDADE E DE AUMENTO DA ATIVAÇÃO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° US 62/686.165, depositado em 18 de junho de 2018, que é integralmente incorporado ao presente como referência, incluindo quaisquer desenhos.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido de patente está sendo depositado em conjunto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida na forma de arquivo intitulado “CD39-9_ST25”, criado em 27 de maio de 2019, com tamanho de 72 kB. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequências são integralmente incorporadas ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a compostos de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpos) que inibem a atividade enzimática de CD39 humano solúvel. A presente invenção também se refere a células produtoras desses compostos; métodos de fabricação desses compostos, seus anticorpos, fragmentos, variantes e derivados; composições farmacêuticas que os compreendem; e métodos de uso dos compostos para o diagnóstico, tratamento ou prevenção de doenças, tais como câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Oito genes de ENTPD diferentes codificam membros da família de proteínas de NTPDase. Os subtipos de NTPDase individuais diferem de localização celular e propriedades funcionais. Trifosfato difosfo-hidrolases de nucleosídeos ligadas por membranas de plasma controlam os níveis de nucleotídeos na superfície celular por meio de hidrdólise dos fosfatos c e b de nucleotídeos.

[005] NTPDase 1 (ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase 1), também conhecida como CD39/ENTPD1 ou CD39 vascular, funciona em conjunto com outra enzima, CD73 (ecto-5’-nucleotidase), para hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) e adenosina difosfato (ADP) extracelular para gerar adenosina, que se liga a receptores da adenosina e inibe reações de células T e células matadoras naturais (NK), de forma a suprimir o sistema imunológico.

A geração de adenosina por meio do processo de CD73/CD39 é reconhecida como mecanismo importante da função imunossupressora das células T reguladoras (Treg). O número de Tregs CD39+ aumenta em alguns cânceres humanos e a importância de Tregs CD39+ na promoção do crescimento e metástase de tumores foi demonstrada utilizando diversos modelos in vivo.

CD39 também é expresso, entretanto, por células de tumores e células de tumores CD39+ podem mediar a imunossupressão por meio do processo de adenosina. CD39 em células de câncer exibe atividade de ATPase e, em conjunto com CD73, gera adenosina. Células de câncer CD73+CD39+ inibiram a proliferação de células T CD4 e CD8 e a geração de células T CD8 efetoras citotóxicas (CTL) de forma dependente de adenosina e CD39. Relatou-se que CD39 aumentou em diversos tumores sólidos (câncer colorretal, câncer da cabeça e do pescoço e câncer pancreático), bem como em leucemia linfocítica crônica. Anticorpos que ligam e inibem CD39 em células que expressam CD39 são descritos em WO 2009/095478. Anticorpo “A1” (eBiosciences, Inc.) é utilizado para aplicações de manchas e não exibe a capacidade de neutralizar a atividade de CD39 em células. Hayes et al (2015), Am. J. Transl. Res. 7 (6): 1181-1188 faz uso de anti-CD39 que liga FcγR e possui função efetora, mas indica que também é bloqueadora. A expressão de CD39 sobre diferentes tipos de células, incluindo leucócitos e células de tumores, em combinação com o uso de anticorpos que não bloqueiam CD39 ou não são bloqueadores puros, cria um ambiente complexo para avaliação da atividade subjacente de anticorpos. Até o momento, o único inibidor relatado do local ativo de CD39 permanece análogo de ATP não hidrolisável de moléculas pequenas exemplificado por ARL67156, o que sugere que é necessária a inibição direta do local ativo. ARL67156, entretanto, não é específico para CD39 e também inibe outras NTPDases, tais como NTPDase1, NTPDase3, NPP1 ou NTPDase8 de camundongo e, além disso, somente como inibidor competitivo fraco (Levesque et al (2007), Br. J. Pharmacol. 152: 141-150).

[006] CD39 possui dois domínios transmembrana perto das extremidades com terminal N e C, segmentos com terminal N e C citoplasmáticos curtos e um domínio extracelular grande que contém o local ativo. Embora CD39 seja tipicamente ancorado à membrana pelos dois domínios transmembrana nas duas extremidades da molécula, entretanto, também se relatou recentemente que uma forma cataliticamente ativa solúvel de CD39 pode ser encontrada na circulação em seres humanos e camundongos (Yegutkin et al (2012), FASEB J. 26 (9): 3875-3883). Apesar dos diversos anticorpos anti-CD39 descritos, não foi relatado nenhum anticorpo capaz de inibir a atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] Os inventores obtiveram anticorpos que inibem a atividade enzimática (atividade de ATPase) de proteína CD39 humana solúvel (domínio extracelular). Os anticorpos ligam adicionalmente um epítopo presente sobre proteína CD39 humana expressa na superfície de células, incluindo células de tumores, e inibem potentemente a atividade enzimática (atividade de ATPase) da enzima CD39 ligada pela membrana celular (CD39, conforme expresso na superfície de células). Os anticorpos podem ser convenientemente utilizados para atingir neutralização maior da atividade de CD39 em indivíduos por meio da neutralização de proteína CD39 solúvel e ligada por membrana, incluindo CD39 solúvel liberado ou expelido por células de tumores, de forma a reduzir a imunossupressão, por exemplo, para o tratamento de câncer e/ou doenças infecciosas. Embora tenham sido descritos anteriormente outros anticorpos anti-CD39 que inibem a atividade enzimática (atividade de ATPase) da enzima CD39 ligada por membrana, esses anticorpos não inibem proteína CD39 solúvel que não é ligada à membrana celular.

[008] Em uma realização, é fornecido um domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou uma proteína que o compreende (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.), em que o domínio de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que possuem as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 8, 9 e 10 e as sequências de aminoácidos de cadeia principal FR1, FR2 e FR3 do gene IGHV1-3 humano, tais como IGHV1-3*01 (e, opcionalmente, sequências de aminoácidos de cadeia principal 4 (FR4) do gene IGHJ1 humano, tal como IGHJ1*01); e uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2 e CDR3 que contém as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 11, 12 e 13 e sequências de aminoácidos de cadeia principal FR1, FR2 e FR3 do gene IGKV4-1 humano (por exemplo, IGK4-1*01) e, opcionalmente, sequências de aminoácidos de cadeia principal 4 (FR4) adicionais do gene IGKJ4 humano (por exemplo, IGKJ4*01). Em uma realização, VH compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos de um resíduo presente em uma sequência de cadeia principal humana por um resíduo diferente (por exemplo, um resíduo presente em cadeia principal não humana) em posições Kabat selecionadas a partir do grupo que consiste de 48, 67, 71 e 76. Em uma realização, VH compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na CDR2 de cadeia pesada, tal como em posições Kabat 60 e/ou 64.

Opcionalmente, o resíduo na posição 60 é serina (por exemplo, a CDR2 compreende substituição N60S). Opcionalmente, o resíduo presente na posição Kabat 64 é glutamina (por exemplo, a CDR2 compreende uma substituição K64Q). Em uma realização, o resíduo presente em VL na posição Kabat 24 é lisina (por exemplo, a CDR1 compreende uma substituição R24K), opcionalmente em que uma fenilalanina está presente na VL na posição Kabat

36.

[009] Em uma realização, é fornecido um domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou uma proteína que compreende o domínio de ligação de antígenos (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.), em que o domínio de ligação de antígenos ou proteína compreende esse domínio de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID N° 27-34 e, opcionalmente, que compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos de um resíduo presente em uma sequência de cadeia principal humana por um resíduo diferente (por exemplo, resíduo presente em cadeia principal não humana) em posições Kabat selecionadas a partir do grupo que consiste de 48, 67, 71 e 76; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID N° 35-37, opcionalmente em que fenilalanina está presente na posição Kabat 36. Em uma realização, VH compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos na CDR2 de cadeia pesada nas posições

Kabat 60 e/ou 64. Opcionalmente, o resíduo presente na cadeia pesada na posição Kabat 60 é um resíduo de serina. Opcionalmente, o resíduo presente na cadeia pesada na posição Kabat 64 é um resíduo de glutamina. Em uma realização, VL compreende adicionalmente uma substituição de aminoácidos na CDR2 de cadeia leve na posição de cadeia leve de Kabat 24, opcionalmente ainda em que o resíduo presente na cadeia leve na posição 24 é um resíduo de lisina.

[0010] Opcionalmente, o aminoácido em posição de cadeia pesada de Kabat 48 é isoleucina. Opcionalmente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 67 é alanina. Opcionalmente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 71 é valina. Opcionalmente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 76 é arginina.

[0011] Em uma realização, VH compreende um resíduo de alanina na posição Kabat 67 e valina na posição 71.

[0012] Em uma realização, VH compreende um resíduo de isoleucina na posição Kabat 48, resíduo de alanina na posição Kabat 67, valina na posição Kabat 71 e arginina na posição Kabat 76.

[0013] Em uma realização, VL compreende fenilalanina na posição Kabat 36 (FR2). Em uma realização, VL compreende lisina na posição Kabat 24 (CDR1).

[0014] Em qualquer realização, um domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou proteína que compreende o domínio de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.) pode ser caracterizado como compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

[0015] Em uma realização, é fornecido um domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou proteína que compreende o domínio de ligação de antígenos (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.), em que o domínio de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que possui as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 8, 9 e 10 e cadeias principais humanas (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e FR4 de origem humana); e uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 11 (ou 17, ou 18), 12 e 13 e cadeias principais humanas (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e FR4 de origem humana), em que (VH) compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 ou 6 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID N° 36 ou 37.

[0016] Em qualquer realização, VH pode ser caracterizada como compreendendo uma substituição em uma, duas, três ou em todas as posições Kabat 48, 67, 71 e 76. Em uma realização, o resíduo na posição 48 é isoleucina (por exemplo, substituição M48I). Em uma realização, o resíduo na posição 67 é alanina (por exemplo, substituição V67A). Em uma realização, o resíduo na posição 71 é valina (por exemplo, substituição R71V). Em uma realização, o resíduo na posição 76 é arginina (por exemplo, substituição

S76R). Em qualquer realização, VL pode ser caracterizada como compreendendo uma substituição na posição Kabat 36. Em uma realização, o resíduo na posição 36 é fenilalanina (por exemplo, substituição Y36F).

[0017] Em uma realização, VH compreende sequências de aminoácidos de cadeia principal VH humana e VL compreende sequências de aminoácidos de cadeia principal VL humana. Em uma realização, o segmento VH da cadeia principal receptora humana VH é de um segmento genético IGHV1-3 humano, opcionalmente ainda em que o segmento J é de um segmento genético IGHJ1 humano. Em uma realização, a cadeia principal humana VH é de um segmento genético IGHV1-3*01 humano. Em uma realização, a cadeia principal receptora humana de domínio VL é de um segmento genético IGKV4-1 humano, opcionalmente ainda em que o segmento J é de um segmento genético IGKJ4 humano.

[0018] Em uma realização, é fornecido um domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou uma proteína que compreende o domínio de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpo monoclonal, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.), o domínio de ligação de antígenos selecionado a partir do grupo que consiste de: a. um domínio de ligação de anticorpos que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 29, 30, 31, 32, 33 ou 34; e b. um domínio de ligação de anticorpos que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 37 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 29, 30, 31, 32, 33 ou 34.

[0019] Em qualquer realização, uma cadeia pesada de anticorpo compreende um domínio constante CH1 humano e um domínio Fc humano, opcionalmente de isótipo IgG1 humano, opcionalmente que compreende ainda uma sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID N° 23, 24, 25 ou

26. Em qualquer realização, uma cadeia leve de anticorpo que compreende um domínio constante de cadeia leve humana, opcionalmente em que o domínio constante é um domínio capa humano.

[0020] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-CD39 que compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 39.

[0021] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-CD39 que compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 40.

[0022] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-CD39 ou fragmento de anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 39.

[0023] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-CD39 ou fragmento de anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 40.

[0024] Em qualquer realização, um domínio de ligação de antígenos ou uma proteína que o compreende, opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo, pode ser caracterizado como ligando-se e inibindo ou neutralizando a atividade de ATPase de uma proteína CD39 solúvel (sCD39).

Em uma realização, a proteína sCD39 não possui os dois domínios transmembrana (ou seja, os domínios transmembrana perto das extremidades com terminal N e C) encontrados em CD39 ligado por membrana. Em uma realização, sCD39 é uma proteína sCD39 não ligada por membrana encontrada na circulação, por exemplo, em um indivíduo humano. Em uma realização, sCD39 compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 43, opcionalmente, que compreende adicionalmente uma marca com terminal C ou outra sequência de aminoácidos não derivada de CD39; opcionalmente em que a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 43 adicionalmente não contém os resíduos com terminal N 1 a 37 da sequência de SEQ ID N° 1. A proteína sCD39 pode ser caracterizada como compreendendo ou consistindo do fragmento Thr38-Val478 de CD39. Proteína Thr38-Val478 com marca His C-terminal é disponível comercialmente por meio da R&D Systems, Inc. (produto número 4397-EN). Em uma realização, a proteína, o anticorpo ou fragmento de anticorpo inibe a atividade de ATPase de sCD39 quando incubado com sCD39 em solução, por exemplo, de acordo com os métodos ou testes conduzidos na ausência de células conforme descrito no presente (vide, por exemplo, Exemplos e Métodos), por exemplo, em sobrenadantes de células de tumores. Em uma realização, a proteína, anticorpo ou fragmento de anticorpo liga especificamente a proteína CD39 humana, em forma solúvel (proteína de domínio extracelular) e em forma ligada por membrana.

[0025] Sem desejar restrições à teoria, alguns anticorpos podem neutralizar CD39 ligado por membrana por meio de inibição do movimento de domínio de CD39 ligado por membrana (memCD39), mas sem afetar de forma similar a atividade da proteína CD39 solúvel (sCD39). Relatou-se que memCD39 ocorre na forma de homomultímero enquanto sCD39 é um monômero e, adicionalmente, que os domínios transmembrana em memCD39 sofrem movimentos dinâmicos subjacentes à relação funcional com o local ativo. Consequentemente, ao contrário de sCD39, memCD39 pode apresentar um ambiente que torna possível a neutralização mediada por anticorpos. Uma possibilidade é que o uso de um anticorpo bivalente que se liga simultaneamente a duas moléculas memCD39 (por exemplo, dentro de um homomultímero memCD39) é necessário para neutralização funcional.

[0026] Os anticorpos do presente que neutralizam a atividade de sCD39 (e memCD39) podem, além do uso como aglutinantes bivalentes, também ser eficazes como aglutinantes monovalentes, quer estejam ou não dirigindo memCD39 além de sCD39. Consequentemente, em uma realização, é fornecida uma proteína de ligação de antígenos que se liga de forma monovalente a uma proteína CD39 humana (sCD39 e/ou memCD39) e neutraliza a sua atividade enzimática (ATPase). A proteína de ligação de antígenos pode ser opcionalmente especificada como ligando-se a uma única proteína CD39 e/ou contendo um domínio de ligação de antígenos isolado capaz de ligar-se a uma proteína CD39. Em uma realização, é fornecido um fragmento de anticorpo, opcionalmente um fragmento de F(ab), anticorpo de fita simples, scFv, anticorpo multiespecífico, que se liga de forma monovalente a uma proteína CD39 humana (sCD39 e/ou memCD39) e neutraliza sua atividade enzimática (ATPase). Em uma realização, uma proteína de ligação de antígenos neutralizante de CD39 que se liga de forma monovalente a uma proteína CD39 humana é uma proteína de ligação de antígenos multiespecífica, tal como um anticorpo multiespecífico, anticorpo biespecífico,

anticorpo triespecífico etc. Em uma realização, uma proteína de ligação de antígenos neutralizante de CD39 que se liga de forma monovalente a uma proteína CD39 humana compreende primeiro (ou único) domínio de ligação de antígenos que liga CD39 (sCD39 e/ou memCD39) e um segundo domínio de ligação de antígenos que liga uma proteína diferente de CD39.

[0027] Convenientemente, em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc humano que é modificado para que seja reduzida ou substancialmente ausente a ligação a um receptor Fcγ humano, tal como um ou mais (ou todos) dentre CD16, CD32a, CD32b e CD64 humano. Em um aspecto, os anticorpos não dependem do esgotamento mediado por ADCC, CDC ou toxina de células que expressam CD39 para sua atividade inibidora de CD39. Esses anticorpos podem ser utilizados como bloqueadores de CD39 “puros”, permitindo a atividade imunomoduladora.

[0028] Em realização alternativa, a molécula de ligação pode ser produzida de forma que retenha e/ou medie a função efetora por meio do seu domínio Fc. Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc humano que se liga a um receptor de Fcγ humano, tal como um ou mais (ou todos) dentre CD16, CD32a, CD32b e CD64 humano.

[0029] Em outra realização, o domínio Fc pode ser modificado para reduzir a ligação de receptor de Fcγ, opcionalmente retendo a ligação a um ou mais receptores de Fcγ humanos, mas com ligação reduzida a um ou mais receptores de Fcγ humanos diferentes.

[0030] Em um aspecto, os anticorpos ligam especificamente CD39 vascular; o anticorpo liga, por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ ID N° 1, mas não liga um polipeptídeo de isoforma CD39 secretado, tal como um polipeptídeo CD39-L2 e/ou L4. Opcionalmente, o anticorpo anti-CD39 liga especificamente CD39 vascular; o anticorpo liga, por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ ID N° 1, mas não liga uma isoforma CD39 ligada por membrana, tal como um polipeptídeo CD39- L1 e/ou L3.

[0031] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem inibir a atividade enzimática de proteína CD39 ligada por membrana expressa na superfície das células.

[0032] Em um aspecto, os anticorpos não dependem da modulação de CD39 para sua atividade inibidora de CD39.

[0033] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem, além de inibir CD39 solúvel, ser capazes de inibir a atividade enzimática de proteína CD39 ligada por membrana expressa na superfície das células, com ou sem indução da internalização de CD39 e com ou sem ligação de CD16 (receptor de FcγIII) e/ou com ou sem dirigir substancialmente ADCC e/ou CDC para uma célula que expresse CD39. Opcionalmente, os anticorpos retêm um domínio Fc e retêm ligação a FcRn humano.

[0034] Embora os anticorpos que funcionam por meio da indução de ADCC e/ou CDC possam ser eficientes mesmo sem neutralização/inibição completa da atividade de ATPase de CD39, desde que anticorpo suficiente seja ligado a uma célula que expressa CD39 para induzir ADCC, a neutralização de anticorpos sem esgotamento pode necessitar de inibição mais forte da atividade enzimática de ATPase. Em uma realização, um anticorpo sem esgotamento fornecerá redução de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da atividade de ATPase de uma proteína CD39 solúvel (conforme determinado, por exemplo, por meio dos métodos descritos no presente), opcionalmente ainda em concentração compatível com a administração de anticorpos a seres humanos. Em uma realização, um anticorpo sem esgotamento fornecerá redução de pelo menos 70%, 80% ou 90% da atividade de ATPase de uma célula que expressa CD39 (conforme determinado, por exemplo, por meio de redução da geração de AMP por uma célula CD39+ tal como célula B, célula de

Ramos, conforme medido por meio dos métodos descritos no presente), opcionalmente ainda em concentração compatível com a administração de anticorpos a seres humanos.

[0035] O epítopo sobre CD39 ligado pelos anticorpos está presente sobre polipeptídeos CD39 conforme expresso por uma série de células, tais como células de câncer, células T CD4, células T CD8, células B, células transfectadas e liga-se com alta afinidade, conforme determinado por meio de citometria de fluxo.

[0036] Um anticorpo pode ser opcionalmente caracterizado por EC50, conforme determinado por meio de citometria de fluxo, de não mais de 2 µg/ml, não mais de 1 µg/ml, não mais de 0,5 µg/ml, não mais de 0,1 µg/ml ou não mais de 0,05 µg/ml, para ligação a células que expressam, na sua superfície, um polipeptídeo CD39. Em uma realização, as células são células que são elaboradas para expressar CD39 na sua superfície. Em uma realização, as células são células que expressam CD39 de forma endógena na sua superfície, tais como células T reguladoras (TReg), células B, células de câncer, células de linfoma (por exemplo, células de Ramos), células de leucemia, células de câncer da bexiga, células de glioma, células de glioblastoma, células de câncer do ovário, células de melanoma, células de câncer da próstata, células de câncer da tireoide, células de câncer do esôfago ou células de câncer de mama.

[0037] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD39 é capaz de: (a) inibir a atividade enzimática de proteína CD39 ligada por membrana (por exemplo, que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1) expressa na superfície das células; e (b) inibir a atividade enzimática de proteína CD39 solúvel. Em uma realização, os anticorpos não se ligam substancialmente (por exemplo, por meio do seu domínio Fc) a receptores de Fcγ humanos (por exemplo, CD16, CD32a, CD32b e CD64) e/ou C1q e/ou não dirigem substancialmente ADCC e/ou CDC em direção a uma célula que expressa CD39. Opcionalmente, os anticorpos retêm um domínio Fc e retêm ligação a FcRn humano.

[0038] Em uma realização, os anticorpos são administrados em quantidade eficaz para neutralizar a atividade enzimática de sCD39 e/ou memCD39 por um período de tempo desejado, tal como uma semana, duas semanas ou um mês, até a próxima administração sucessiva de anticorpo anti- CD39.

[0039] Em uma realização, os anticorpos são administrados em dosagem e/ou frequência que fornece concentração de anticorpo no sangue igual a pelo menos EC50, EC70 ou EC100 para inibição da atividade de ATPase de proteína sCD39, opcionalmente em que a concentração é mantida por pelo menos uma semana, duas semanas, um mês ou até a próxima administração sucessiva do anticorpo anti-CD39.

[0040] Em um aspecto, o anticorpo liga um epítopo sobre CD39 que compreende um resíduo de aminoácido (por exemplo, um, dois ou três dos resíduos) selecionado a partir do grupo que consiste de R138, M139 e E142 (com referência a SEQ ID N° 1).

[0041] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD39 exibe ligação reduzida (por exemplo, perda de ligação substancialmente completa) a um polipeptídeo CD39 que contém uma mutação em um, dois ou três dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de: R138, M139 e E142 (com referência a SEQ ID N° 1), em comparação com um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem (polipeptídeo CD39 de SEQ ID N° 1); opcionalmente, o polipeptídeo CD39 mutante possui as mutações: R138A, M139A e E142K. Em um aspecto opcional, o anticorpo não possui perda de ligação a nenhum dos polipeptídeos CD39 mutantes da Tabela 1, exceto o mutante 19.

[0042] Em uma realização, os anticorpos neutralizantes de CD39 podem ser caracterizados por serem capazes, em forma purificada, de causar redução da atividade de ATPase de proteína sCD39 em um teste livre de células (por exemplo, sCD39 de sobrenadantes de cultivo de células de tumores), opcionalmente causando redução da geração de AMP por sCD39, de pelo menos 70%, 80% ou 90%; opcionalmente causando aumento da presença de ATP (em comparação com controle negativo), por exemplo, conforme determinado nos testes descritos no presente. Pode-se determinar a inibição de sCD39, por exemplo, por meio da quantificação de unidades de luminescência que são proporcionais à quantidade de ATP presente após a incubação com anticorpo anti-CD39. Em uma realização, os anticorpos neutralizantes de CD39 podem ser caracterizados por EC 50 para inibição da atividade de ATPase de proteína sCD39 de não mais de 1 µg/ml, opcionalmente não mais de 0,5 µg/ml e, opcionalmente, não mais de 0,1 µg/ml.

[0043] Opcionalmente, a inibição da atividade de ATPase de proteína sCD39 é determinada por meio de quantificação de unidades de luminescência utilizando Cell Titer Glo® (Promega), em uma versão livre de células do teste na qual faixas de dosagem de anticorpo de teste são incubadas com proteína CD39 humana recombinante solúvel descrita nos Exemplos, Métodos, por uma hora a 37 °C, em que 20 µM de ATP são adicionados às placas por trinta minutos adicionais a 37 °C antes da adição de reagente Cell Titer Glo® (CTG) e a luz emitida é quantificada utilizando um luminômetro Enspire® após incubação por cinco minutos no escuro (vide, por exemplo, Exemplos e Métodos).

[0044] Em uma realização, a proteína sCD39 é proteína sCD39 expelida encontrada ou obtida de sobrenadantes de cultivo de células de tumores humanos, opcionalmente de uma linhagem de células de tumores que expressa CD39 em alto nível, opcionalmente de células de tumores Ramos.

[0045] Opcionalmente, os anticorpos neutralizantes de CD39 podem ser adicionalmente caracterizados por serem capazes, em forma purificada, de causar redução da atividade de ATPase de CD39 das células, opcionalmente causando redução da geração de AMP por células que expressam CD39, de pelo menos 70%, 80% ou 90%. Em uma realização, os anticorpos neutralizantes de CD39 podem ser caracterizados por EC 50 para inibição da atividade de ATPase (por exemplo, EC50 para inibição da geração de AMP por uma célula que expressa CD39) de CD39 expressa por uma célula de não mais de 1 µg/ml, opcionalmente não mais de 0,5 µg/ml e, opcionalmente, não mais de 0,1 µg/ml.

[0046] Opcionalmente, a inibição da atividade de ATPase de CD39 expresso por uma célula é determinada por meio de determinação da neutralização da atividade de ATPase em células de Ramos por quantificação de AMP gerado por hidrólise de ATP (vide, por exemplo, Exemplos e Métodos).

[0047] Em um aspecto, a neutralização da atividade de ATPase por uma célula que expressa CD39 é determinada trazendo-se células de expressão de CD39 (por exemplo, células de linfoma de Ramos conforme utilizado no presente, disponíveis, por exemplo, por meio da ATCC, referência CRL-1596) em contato com um anticorpo e determinando-se a produção de AMP, por exemplo, por meio de espectrometria de massa, em que a redução de AMP gerada indica a neutralização da atividade de ATPase. Opcionalmente, um anticorpo causa redução de AMP gerado de pelo menos 70%, 80% ou 90% neste teste. Opcionalmente, um anticorpo causa redução da atividade de ATPase extracelular por células B de pelo menos 70%, 80% ou 90%.

[0048] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD39 neutralizante liga um determinante antigênico presente em sCD39 e CD39 expressos na superfície celular (memCD39).

[0049] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD39 neutralizante concorre pela ligação a um epítopo sobre CD39 ligado por anticorpo mAb20 ou mAb21 (ou seu anticorpo I-394 parental) (por exemplo, que concorre pela ligação a um epítopo sobre um polipeptídeo CD39 com um anticorpo que possui as CDRs de cadeia leve e pesada ou regiões variáveis de qualquer um dentre mAb20, mAb21 ou I-394).

[0050] Em um aspecto de qualquer uma das realizações do presente, um composto de ligação de antígenos liga o mesmo epítopo e/ou concorre pela ligação a um polipeptídeo CD39 com anticorpo monoclonal mAb20 ou mAb21 (ou seu anticorpo I-394 parental) (por exemplo, que liga o mesmo epítopo e/ou concorre pela ligação a um polipeptídeo CD39 com um anticorpo que possui as CDRs de cadeia leve e pesada ou regiões variáveis de mAb20 ou mAb21 (ou I-394)). Em uma realização, um composto de ligação de antígenos liga o mesmo epítopo e/ou concorre pela ligação a um polipeptídeo CD39 com um anticorpo que possui, respectivamente, região VH e VL de SEQ ID N° 38 e 39.

[0051] Em uma realização, um anticorpo anti-CD39 liga um epítopo que compreende um, dois ou três resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste dos resíduos de aminoácidos sobre CD39 ligado por mAb20 ou mAb21 (ou I-394).

[0052] Em qualquer realização, a molécula de ligação (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) compreende o domínio de cadeia pesada variável (VH) que compreende CDR1, 2 e 3 de cadeia pesada (por exemplo, conforme descrito no presente) para o anticorpo I-394 e um domínio de cadeia leve variável (VL) que compreende CDR 1, 2 e 3 de cadeia leve (por exemplo, conforme descrito no presente) para o anticorpo I-394 correspondente, ou uma sequência de aminoácidos na qual a CDR (ou conjunto de CDRs de cadeia leve e/ou pesada) possui identidade de aminoácidos de pelo menos 70%, 80%, 90% ou 95% para a mencionada CDR (ou o mencionado conjunto de CDRs de cadeia leve e/ou pesada, em que cada um dentre VH e VL compreende domínios de cadeia principal de origem humana (por exemplo, VH e VL são diferentes de VH e VL correspondentes de SEQ ID N° 6 e 7). Opcionalmente, CDRs são determinadas de acordo com esquemas de numeração de Kabat ou IMGT.

[0053] Em um aspecto, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende proteína compreende um domínio Fc que é modificado (em comparação com um domínio Fc do tipo selvagem do mesmo isótipo) para reduzir a ligação entre o domínio Fc e polipeptídeos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64 humanos, em que o anticorpo compreende: (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID N° 31 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID N° 36 ou 37. Em um aspecto, o domínio Fc é modificado (em comparação com domínio Fc do tipo selvagem do mesmo isótipo) para reduzir a ligação entre o domínio Fc e o polipeptídeo C1q humano.

Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição de aminoácidos em uma região constante de cadeia pesada de qualquer um, dois, três, quatro, cinco ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330 e 331 (numeração EU de Kabat). Em uma realização, o anticorpo possui uma substituição de aminoácidos em uma região constante de cadeia pesada em quaisquer três, quatro, cinco ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de: 234, 235, 237, 322, 330 e 331.

[0054] Em uma realização, os anticorpos são administrados a indivíduos portadores de câncer em quantidade e frequência suficientes para neutralizar a atividade de sCD39 no microambiente do tumor e/ou na circulação. Em uma realização, os anticorpos são administrados em quantidade e frequência suficientes para reduzir a geração e/ou a concentração de adenosina no microambiente do tumor. Em uma realização, os anticorpos são administrados em quantidade e frequência suficientes para reduzir a geração e/ou a concentração de AMP no microambiente do tumor. Em uma realização, os anticorpos são administrados em quantidade e frequência suficientes para neutralizar a atividade de CD39 expressa por células de tumores. Em uma realização, os anticorpos são administrados em quantidade e frequência suficientes para neutralizar a atividade de CD39 expressa por leucócitos ou linfócitos, tais como células T CD4, células T CD8, células TReg e/ou células B.

[0055] Os anticorpos serão úteis na inibição da hidrólise de ATP mediada por CD39, por exemplo, de forma a gerar redução da concentração de adenosina no microambiente do tumor e/ou em circulação. Esses anticorpos serão úteis, portanto, na reversão do efeito imunossupressivo de CD39 e/ou adenosina sobre células T, células B e outras células que expressam receptores de adenosina (receptores A2A), por exemplo, no tratamento de câncer. Em uma realização, o anticorpo anti-CD39 neutraliza a inibição mediada por adenosina da proliferação, produção de citoquinas, citotoxicidade e/ou atividade de NFκB em células T.

[0056] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de indivíduos, em que o método compreende a administração a indivíduos (por exemplo, indivíduos portadores de doença, tumor etc.) de quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos de ligação de antígenos anti-CD39 descritos no presente.

[0057] Os anticorpos serão úteis na inibição da produção, quantidades e/ou concentrações de adenosina para o microambiente de tumores e/ou em circulação, incluindo, mas sem limitações, tumores caracterizados pela geração de adenosina, catabolismo de ATP ou atividade catabólica detectável, significativa, aumentada ou elevada do eixo CD39/CD73 (por exemplo, em comparação com valor de referência). Além disso, em concentrações crescentes, os anticorpos que neutralizam CD39 solúvel fornecem inibição substancialmente completa da atividade catabólica do eixo CD39/CD73. Em uma realização, os anticorpos serão úteis na inibição da produção, quantidades e/ou concentrações de adenosina no microambiente de tumor em tumores caracterizados pela presença de proteína CD73 (por exemplo, tumores com CD73 solúvel e/ou células que expressam CD73; tumores positivos para CD73).

[0058] Em uma realização, os anticorpos de acordo com a presente invenção que neutralizam proteína CD39 solúvel podem ser convenientemente utilizados em combinação com o bloqueio de CD73; os anticorpos de acordo com a presente invenção podem, por exemplo, ser administrados a indivíduos portadores de câncer em combinação com um agente que inibe a atividade de CD73.

[0059] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de indivíduos, em que o método compreende, consiste essencialmente ou consiste de: administração a indivíduos (por exemplo, indivíduos portadores de doença, tumor etc.) de quantidade terapeuticamente ativa de um composto de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção que inibe um polipeptídeo CD39. Em uma realização, o composto de ligação de antígenos anti-CD39 (por exemplo, anticorpo) é administrado a indivíduos em combinação com segundo agente terapêutico. Em uma realização, o segundo agente terapêutico é um agente (por exemplo, anticorpo) que neutraliza a atividade de 5’-ectonucleotidase de CD73 humano. Em uma realização, o segundo agente terapêutico é um agente (por exemplo, anticorpo) que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano, opcionalmente anticorpo anti-PD-1, opcionalmente um anticorpo anti-PD-L1. Em uma realização, o segundo agente terapêutico compreende um agente ou tratamento (por exemplo, agente quimioterapêutico, taxano, antraciclina, camptotecina, epotilonas, mitomicina, combrestatina, vinca alcaloide, mostarda de nitrogênio, maitansinoides, caliqueamicina,

duocarmicina, tubulisina, dolastatina ou auristatina, enedi-ina, amatoxina, pirrolobenzodiazepina, etilenoimina, radioisótopo, peptídeo ou proteína terapêutica ou toxina) que induz a liberação extracelular de ATP de células de tumores e/ou induz a morte de células de tumores.

[0060] Em uma realização, o composto de ligação de antígeno anti-CD39 (por exemplo, anticorpo) é administrado a um indivíduo portador de câncer, que possui baixa resposta, ou prognóstico de resposta, ao tratamento com um agente que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano. Em uma realização, o anticorpo inibe um polipeptídeo CD39 em teste celular. O composto, em uma realização, é um anticorpo sem esgotamento (anticorpo que não esgota as células às quais se liga, tais como anticorpos silenciosos para Fc). Opcionalmente, o composto liga-se a polipeptídeos CD39 de forma bivalente. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Opcionalmente, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de isótipo IgG (por exemplo, IgG1) modificada para eliminar a ligação a receptores de Fcγ humanos (por exemplo, CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64).

[0061] Em um aspecto, é fornecido um método de redução da hidrólise de ATP por uma célula que expressa CD39 (por exemplo, um leucócito e/ou célula de tumor em indivíduo) ou um método de neutralização da atividade enzimática de CD39 celular, em que o método compreende: colocação da célula que expressa CD39 em contato com um composto de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) de acordo com a presente invenção que inibe CD39. Em uma realização, a etapa de colocação da célula que expressa CD39 em contato com um composto de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção compreende a administração a indivíduos de quantidade terapeuticamente ativa de um composto de ligação de antígenos que inibe CD39. Em uma realização, o indivíduo é portador de câncer.

[0062] Em um aspecto, é fornecido um método de redução da adenosina presente no ambiente de tumor (por exemplo, em indivíduos), em que o método compreende, consiste essencialmente ou consiste de: administração a indivíduos de quantidade terapeuticamente ativa de um composto de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) de acordo com a presente invenção que inibe um polipeptídeo CD39. Em uma realização, o indivíduo é portador de câncer.

[0063] Em uma realização, a quantidade ativa de um anticorpo que inibe um polipeptídeo CD39 é quantidade eficaz para atingir e/ou manter (por exemplo, até a administração subsequente de composto de ligação de antígenos) concentração em sangue pelo menos de EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para inibição do catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP em indivíduos. Em uma realização, a quantidade ativa de um composto de ligação de antígenos que inibe um polipeptídeo CD39 é quantidade eficaz para atingir EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para inibição do catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP em tecidos extravasculares de indivíduos. Em uma realização, a quantidade ativa de um composto de ligação de antígenos que inibe um polipeptídeo CD39 é quantidade eficaz para atingir EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para inibição do catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP em indivíduos. Em uma realização, a quantidade ativa de um composto de ligação de antígenos que inibe polipeptídeo CD39 é de 1 a 20 mg/kg de peso do corpo. Em uma realização, a quantidade ativa é administrada a indivíduos semanalmente, a cada duas semanas, mensalmente ou a cada dois meses.

[0064] Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano portador ou que é susceptível de ser portador de câncer. Opcionalmente, o indivíduo é um ser humano portador ou que é susceptível de ser portador de câncer caracterizado por células malignas que expressam CD39 e/ou presença (secreção ou perda) ou proteína CD39 solúvel. Opcionalmente, o indivíduo é ser humano portador ou que é susceptível de ser portador de câncer e que possui níveis detectáveis de proteína CD39 extracelular solúvel em circulação ou leucócitos infiltrados em tumores que expressam CD39.

[0065] Os anticorpos são opcionalmente caracterizados por afinidade de ligação (KD) para polipeptídeo CD39 humano de menos de (melhor que) 10-9 M, preferencialmente menos de 10-10 M, ou preferencialmente menos de 10-11 M e/ou por meio de ligação de CD39 humano com EC50 de menos de (melhor ligação que) 1 µg/ml, preferencialmente em que o anticorpo possui EC50 de não mais de 0,5 µg/ml, opcionalmente não mais de 0,2 µg/ml, opcionalmente não mais de 0,1 µg/ml, para ligação a células (por exemplo, células de tumores) que expressam CD39 humano na superfície celular.

[0066] Os anticorpos são opcionalmente anticorpos quiméricos, humanos ou humanizados.

[0067] Os anticorpos são opcionalmente caracterizados por EC50 para neutralização da atividade enzimática de CD39 em células que expressam CD39 (por exemplo, células de tumor de Ramos) de menos de (melhor que) 1 µg/ml, opcionalmente menos de 0,5 µg/ml.

[0068] Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento que retém especificidade de ligação e capacidade de neutralizar a atividade enzimática de CD39. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo IgG1. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo que compreende domínio Fc de isótipo IgG1 humano modificado para reduzir a ligação entre o domínio Fc e um receptor de Fcγ (por exemplo, CD16). Em uma realização, o anticorpo ou fragmento não possui domínio Fc ou compreende um domínio Fc que não induz citotoxicidade celular mediada por anticorpo

(ADCC) e/ou CDC; opcionalmente, o anticorpo ou seu fragmento compreende um domínio Fc que não se liga a um polipeptídeo FcγRIIIA (CD16). Em uma realização, o domínio Fc (por exemplo, de isótipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano) compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição) em comparação com um domínio Fc do tipo selvagem, em que a substituição reduz a capacidade do domínio Fc (ou anticorpos que o contêm) de ligar-se a um receptor de Fcγ (por exemplo, CD16) e/ou ligar complemento.

Em uma realização, o anticorpo ou seu fragmento não é ligado a uma porção tóxica.

[0069] São também fornecidos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado que possui qualquer uma das propriedades acima, um vetor que compreende esse ácido nucleico, uma célula que compreende esse vetor e um método de produção de anticorpos anti-CD39 humanos, que compreende o cultivo dessa célula sob condições apropriadas para expressão do anticorpo anti-CD39 e recuperação ou purificação opcional do anticorpo produzido. A presente invenção também se refere a composições, tais como kits e composições farmaceuticamente aceitáveis, que compreendem essas proteínas, ácidos nucleicos, vetores e/ou células e tipicamente um ou mais ingredientes adicionais que podem ser ingredientes ativos ou ingredientes inativos que promovem a formulação, fornecimento, estabilidade ou outras características da composição (por exemplo, várias portadoras). A presente invenção refere-se ainda a diversos métodos novos e úteis que elaboram e utilizam esses anticorpos, ácidos nucleicos, vetores, células, organismos e/ou composições, por exemplo, na modulação de atividades biológicas mediadas por CD39, tais como no tratamento de doenças relacionadas, notadamente cânceres.

[0070] A presente invenção também fornece um método de potencialização da atividade de linfócitos (por exemplo, células T) em um paciente dele necessitado ou de restauração da atividade de linfócitos (por exemplo, células T), ou um método de liberação da inibição de linfócitos (por exemplo, células T) mediada por adenosina, que compreende a administração ao paciente de quantidade eficaz de qualquer uma das composições acima.

Em uma realização, o paciente é um paciente que sofre de câncer. O paciente pode sofrer, por exemplo, de tumor sólido, tal como câncer colorretal, câncer renal, câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer de mama ou melanoma maligno. Alternativamente, o paciente pode sofrer de câncer hematopoiético, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, mieloma múltiplo ou linfoma não de Hodgkin.

[0071] A presente invenção também fornece um método de tratamento de doenças em indivíduos, em que o tratamento compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-CD39 que neutraliza a atividade enzimática de CD39 por pelo menos um ciclo de administração no qual o anticorpo anti-CD39 é administrado pelo menos uma vez, opcionalmente pelo menos duas vezes, em quantidade eficaz para atingir e/ou manter, entre duas administrações sucessivas do anticorpo anti-CD39, concentração em sangue (soro) ou tecido extravascular (por exemplo, ambiente de tumor) que corresponde pelo menos a EC50 (por exemplo, EC50 de 0,01 a 0,5 µg/ml), opcionalmente EC70 ou opcionalmente EC100, para neutralização da atividade enzimática de CD39 (por exemplo, EC100 de 0,05 a 1 µg/ml, de 0,1 a 1 µg/ml).

O anticorpo pode, por exemplo, ser administrado em quantidade para atingir e/ou manter concentração em circulação ou em tecido extravascular (por exemplo, ambiente de tumor) de pelo menos cerca de 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1 µg/ml ou 2 µg/ml. Para atingir concentração em tecido extravascular de 0,05 a 1 µg/ml, ou 0,1 a 1 µg/ml, por exemplo, o anticorpo anti-CD39 é administrado em quantidades eficazes para atingir concentração em circulação do anticorpo anti-CD39 de 0,5 a 10 µg/ml ou de 1 a 10 µg/ml. Opcionalmente, o anticorpo anti-CD39 é administrado pelo menos duas vezes em quantidades eficazes para manter a concentração do anticorpo anti-CD39 pelo menos na concentração mencionada acima por pelo menos uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, entre duas administrações sucessivas do anticorpo anti-CD39 e/ou ao longo de todo o ciclo de administração.

[0072] A presente invenção também fornece um método de tratamento de doenças em indivíduos, em que o tratamento compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-CD39 que neutraliza a atividade enzimática de CD39 por pelo menos um ciclo de administração no qual o anticorpo anti-CD39 é administrado pelo menos uma vez, opcionalmente pelo menos duas vezes, em quantidade eficaz para atingir e/ou manter, entre duas administrações sucessivas do anticorpo anti-CD39, concentração em sangue ou tecido de anticorpo anti-CD39 de pelo menos 1 µg/ml, opcionalmente pelo menos 10 µg/ml e, opcionalmente, de 1 a 100 µg/ml.

Opcionalmente, o anticorpo anti-CD39 é administrado pelo menos duas vezes em quantidades eficazes para manter concentração contínua no sangue ou tecido do anticorpo anti-CD39 de pelo menos 1 µg/ml, opcionalmente pelo menos 10 µg/ml, opcionalmente de 1 a 100 µg/ml, por pelo menos uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, entre duas administrações sucessivas do anticorpo anti-CD39 e/ou ao longo de todo o ciclo de administração.

[0073] Estes aspectos são descritos mais completamente na descrição fornecida no presente e aspectos, características e vantagens adicionais serão evidentes a partir dela.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0074] A Figura 1 exibe um resultado de seleção representativo, que exibe os anticorpos I-397, I-398 e I-399 em comparação com o anticorpo I- 394 controle positivo.

[0075] A Figura 2A demonstra que os anticorpos BY40, I-394, I- 395 e I-396 inibem CD39 ligado por membrana celular, em que I-394 e I-395 exibem potência maior em todas as concentrações, bem como inibição máxima maior de CD39 celular em comparação com BY40. A Figura 2B demonstra que os anticorpos I-395 e I-396 inibem CD39 solúvel em comparação com anticorpos controle negativo (BY40) e controle positivo (I-394).

[0076] A Figura 3A exibe a posição de resíduos que sofreram mutação nos mutantes 5 (M5), 15 (M15) e 19 (M19) sobre a superfície da proteína CD39. A Figura 3B exibe resultados de ligação a mutantes 5, 15 e 19 para diferentes anticorpos.

[0077] A Figura 4 exibe a ligação de anticorpo I-394 a células que expressam CD39 humano, conforme determinado por meio de citometria de fluxo. I-394 liga células que expressam CD39 humano (CHO-huCD39), células que expressam CD39 de cynomolgus (CHO-cyCD39) e células de linfoma de Ramos, mas não a células que expressam CD39 murino (CHO-moCD39).

[0078] A Figura 5 exibe o anticorpo I-394 altamente potente no bloqueio da atividade enzimática de CD39 em células de tumores (Ramos), em células que expressam CD39 humano (CHO-huCD39) e em células que expressam CD39 de cynomolgus (CHO-cyCD39), conforme determinado por meio de quantificação das unidades de luminescência que são proporcionais à quantidade de ATP presente.

[0079] A Figura 6 demonstra que o anticorpo I-394 é altamente potente no bloqueio da atividade enzimática de proteína CD39 humana recombinante solúvel, conforme determinado por meio da quantificação de unidades de luminescência que são proporcionais à quantidade de ATP presente.

[0080] A Figura 7 demonstra que o anticorpo I-394 liga-se a CD39 humano, mas não a nenhuma das isoformas humanas CD39-L1, L2, L3 ou L4,

conforme determinado em teste ELISA.

[0081] A Figura 8 exibe o procedimento experimental de determinação do efeito da ativação de DC mediada por ATP sobre a ativação de células T CD4. DCs ativadas por ATP foram lavadas e incubadas em seguida com células T CD4 alogênicas (razão de 1 MoDC/4 células T) para uma reação de linfócitos misturados (MLR) durante cinco dias. A ativação e a proliferação de células T foram analisadas por meio da expressão de CD25 e diluição de Violeta de Traço Celular por meio de citometria de fluxo.

[0082] A Figura 9 exibe expressão de HLA-DR sobre moDC e a Figura 10 exibe a expressão de CD83 sobre moDC. Essas figuras demonstram que o anticorpo bloqueador anti-CD39 I-394 e inibidores químicos de CD39 geram ativação de moDC em cada um dentre 0,125 mM, 0,25 mM ou 0,5 mM.

O anticorpo anti-CD39 BY40 ou anticorpos anti-CD73, entretanto, não foram capazes de favorecer a ativação induzida por ATP de células dendríticas (DC), o que sugere que os anticorpos não são capazes de bloquear suficientemente a atividade enzimática para evitar catabolismo de ATP. As legendas, de cima para baixo, correspondem às barras no gráfico, da esquerda para a direita.

[0083] A Figura 11 exibe a expressão de CD25 e demonstra que MoDCs ativadas na presença de ATP foram capazes de induzir a ativação e a proliferação de células T em um teste de MLR; o aumento da ativação de MoDC mediada por ATP por anticorpo de bloqueio anti-CD39 I-394 resultou em proliferação e ativação de células T superior. As legendas, de cima para baixo, correspondem às barras no gráfico, da esquerda para a direita.

[0084] A Figura 12A exibe a faixa de dosagem de anticorpos anti- CD73 sobre a proliferação de células T CD4, na presença de ATP adicionado, em três doses diferentes de anticorpos anti-sCD39, 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml e 1 µg/ml. Os anticorpos anti-CD39 que são capazes de neutralizar CD39 humano solúvel exibem forte potencialização de anticorpos anti-CD37 na restauração da proliferação de células T CD4. A Figura 12B exibe a faixa de dosagem de anticorpos anti-CD73 sobre a proliferação de células T CD8, na presença de ATP adicionado e anticorpos anti-sCD39 exibem forte potencialização de anticorpos anti-CD73 na restauração da proliferação de células T CD8.

[0085] A Figura 13 exibe anticorpos titulados sobre células de linfoma de Ramos por meio de citometria de fluxo. Anticorpos H2L1, H2L1*, H4L1 e H4L1* (mAbs8, 9, 20 e 21, respectivamente) exibiram a melhor ligação.

[0086] A Figura 14 exibe a inibição da atividade de ATPase em linhagens de células de tumores de Ramos e Mino que expressam CD39 ligado por membrana. Anticorpos H4L1 e H4L1* (mAb20 e mAb21) foram as mais potentes no bloqueio da atividade enzimática de CD39.

[0087] A Figura 15A demonstra que o anticorpo I-394 (cadeias leve e pesada parentais) possui temperatura de agregação mais alta (TAgr) e estabilidade aprimorada em comparação com anticorpo BY40. A Figura 15B demonstra que anticorpos variantes humanizados do anticorpo I-394 com regiões variáveis H2L1 (mAb8), H2L1* (mAb9), H4L1 (mAb20) e H4L1* (mAb21) possuem alta temperatura de agregação (TAgr) e boa estabilidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0088] “Que compreende”, quando utilizado, pode ser opcionalmente substituído por “que consiste essencialmente de” ou por “que consiste de”.

[0089] CD39 humano, também conhecido como CD39 “vascular”, NTPdase1, ENTPD1, ATPDase e ATP difosfo-hidrolase vascular, exibe atividade de ATPase. CD39 hidrolisa ATP extracelular e ADP em AMP, que é adicionalmente convertido em adenosina por outra enzima, 5-prime nucleotidase. A sequência de aminoácidos da cadeia de polipeptídeos maduros CD39 humana “vascular” é exibida em Genbank com o número de acesso

P49961, cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência, conforme segue: 1 MEDTKESNVK TFCSKNILAI LGFSSIIAVI ALLAVGLTQN KALPENVKYG IVLDAGSSHT; 61 SLYIYKWPAE KENDTGVVHQ VEECRVKGPG ISKFVQKVNE IGIYLTDCME RAREVIPRSQ; 121 HQETPVYLGA TAGMRLLRME SEELADRVLD VVERSLSNYP FDFQGARIIT GQEEGAYGWI; 181 TINYLLGKFS QKTRWFSIVP YETNNQETFG ALDLGGASTQ VTFVPQNQTI ESPDNALQFR; 241 LYGKDYNVYT HSFLCYGKDQ ALWQKLAKDI QVASNEILRD PCFHPGYKKV VNVSDLYKTP; 301 CTKRFEMTLP FQQFEIQGIG NYQQCHQSIL ELFNTSYCPY SQCAFNGIFL PPLQGDFGAF; 361 SAFYFVMKFL NLTSEKVSQE KVTEMMKKFC AQPWEEIKTS YAGVKEKYLS EYCFSGTYIL; 421 SLLLQGYHFT ADSWEHIHFI GKIQGSDAGW TLGYMLNLTN MIPAEQPLST PLSHSTYVFL; e 481 MVLFSLVLFT VAIIGLLIFH KPSYFWKDMV (SEQ ID N° 1)

[0090] No contexto do presente, “neutralizar” ou “neutralização”, com referência ao polipeptídeo CD39 (por exemplo, “neutraliza CD39”, “neutraliza a atividade de CD39” ou “neutraliza a atividade enzimática de CD39”), designa um processo no qual a atividade de hidrólise de ATP (ATPase) de CD39 é inibida. Isso compreende notadamente a inibição da geração mediada por CD39 de AMP e/ou ADP, ou seja, a inibição do catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP e/ou ADP. Para CD39 ligado por membrana, isso pode ser medido, por exemplo, em teste celular que mede a capacidade de um composto de teste de inibir a conversão de ATP em AMP e/ou ADP, seja direta ou indiretamente. Para CD39 solúvel, isso pode ser medido por meio da incubação de CD39 solúvel recombinante conforme descrito no presente com um composto de teste e medição da conversão de ATP em AMP e/ou ADP, seja direta ou indiretamente. O desaparecimento de ATP e/ou a geração de AMP podem ser determinados, conforme descrito no presente, por exemplo, por meio da quantificação de unidades de luminescência que são proporcionais à quantidade de ATP presente. Em uma realização, uma preparação de anticorpo causa redução de pelo menos 60% da conversão de ATP em AMP, redução de pelo menos 70% da conversão de ATP em AMP ou redução de pelo menos 80% ou 90% da conversão de ATP em AMP, com referência, por exemplo, aos testes descritos no presente (por exemplo, desaparecimento de ATP e/ou geração de AMP).

[0091] Sempre que “tratamento de câncer” ou similar for mencionado com referência a agente de ligação anti-CD39 (por exemplo, anticorpo), isso pode incluir: (a) método de tratamento de câncer, em que o mencionado método compreende a etapa de administração (para pelo menos um tratamento) de um agente de ligação anti-CD39 (preferencialmente em um material veículo farmaceuticamente aceitável) a um indivíduo, mamífero, especialmente ser humano, necessitado desse tratamento, em dose que permita o tratamento de câncer (quantidade terapeuticamente eficaz), preferencialmente em dose (quantidade) especificada no presente; (b) uso de agente de ligação anti-CD39 para o tratamento de câncer, ou agente de ligação anti-CD39, para uso no mencionado tratamento (especialmente em seres humanos); (c) uso de um agente de ligação anti-CD39 para fabricação de preparação farmacêutica para o tratamento de câncer, método de uso de agente de ligação anti-CD39 para fabricação de preparação farmacêutica para o tratamento de câncer, que compreende opcionalmente a mistura de um agente de ligação anti-CD39 com veículo farmaceuticamente aceitável ou preparação farmacêutica que compreende uma dose eficaz de agente de ligação anti-CD39 que é apropriado para o tratamento de câncer; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) e (c), de acordo com o objeto passível de patenteamento nos países onde é depositado o presente pedido.

[0092] Da forma utilizada no presente, a expressão “domínio de ligação de antígenos” designa um domínio que compreende uma estrutura tridimensional capaz de ligar-se imunoespecificamente a um epítopo. Em uma realização, portanto, o mencionado domínio pode compreender uma região hipervariável, opcionalmente um domínio VH e/ou VL de uma cadeia de anticorpos, opcionalmente pelo menos um domínio VH. Em outra realização, o domínio de ligação pode compreender pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR) de uma cadeia de anticorpos. Em outra realização, o domínio de ligação pode compreender um domínio de polipeptídeo de um suporte não de imunoglobulina.

[0093] O termo “anticorpo”, da forma utilizada no presente, pode incluir anticorpos monoclonais e policlonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são atribuídos a uma dentre cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Várias destas são adicionalmente divididas em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e similares. Um exemplo de unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, em que cada par possui uma cadeia “leve” (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50-70 kDa).

O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é principalmente responsável pelo reconhecimento de antígenos. As expressões cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) designam essas cadeias leve e pesada, respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados “alfa”, “delta”, “épsilon”, “gama” e “mu”, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG são os exemplos de classes de anticorpos empregados no presente, pois são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque são os mais facilmente elaborados em ambiente de laboratório. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Exemplos específicos de anticorpos são anticorpos humanizados, quiméricos, humanos ou apropriados para seres humanos de outra forma. “Anticorpos” também inclui qualquer fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos descritos no presente.

[0094] A expressão “liga-se especificamente a” indica que um anticorpo pode ligar-se preferencialmente em um teste de ligação competitiva ao parceiro de ligação, tal como CD39, conforme determinado utilizando formas recombinantes das proteínas, seus epítopos ou proteínas nativas presentes sobre a superfície de células alvo isoladas. Testes de ligação competitiva e outros métodos de determinação da ligação específica são descritos adicionalmente abaixo e bem conhecidos na técnica.

[0095] Quando se afirma que um anticorpo “concorre com” um anticorpo monoclonal específico (por exemplo, anticorpo I-394), indica-se que o anticorpo concorre com o anticorpo monoclonal em um teste de ligação utilizando moléculas CD39 recombinantes ou moléculas CD39 expressas na superfície. Caso um anticorpo de teste reduza a ligação de um anticorpo de referência a um polipeptídeo CD39 ou célula que expressa CD39 em um teste de ligação, por exemplo, afirma-se que o anticorpo “concorre” respectivamente com o anticorpo de referência.

[0096] O termo “afinidade”, da forma utilizada no presente, indica a resistência da ligação de um anticorpo a um epítopo. A afinidade de um anticorpo é fornecida pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x

[Ag] / [Ab-Ag], em que [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo de anticorpo e antígeno, [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do antígeno não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1/Kd. Métodos de determinação da afinidade de mAbs podem ser encontrados em Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, Coligan et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, NY (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983) e essas referências são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Um método padrão bem conhecido na técnica para determinar a afinidade de mAbs é o uso de seleção de ressonância de plasma de superfície (SPR) (tal como por meio de análise com um dispositivo analítico de SPR BIAcore®).

[0097] Dentro do contexto do presente, “determinante” designa um local de interação ou ligação sobre um polipeptídeo.

[0098] O termo “epítopo” designa um determinante antigênico e é a área ou região sobre um antígeno à qual se liga um anticorpo. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácidos envolvidos diretamente na ligação, bem como resíduos de aminoácidos que são eficientemente bloqueados pelo peptídeo ou anticorpo de ligação de antígeno específico, ou seja, resíduos de aminoácidos dentro da “pegada” do anticorpo. É a forma mais simples ou a menor área estrutural sobre uma molécula de antígeno complexa que pode combinar-se, por exemplo, com um anticorpo ou receptor. Os epítopos podem ser lineares ou de conformação/estruturais. A expressão “epítopo linear” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que são contíguos sobre a sequência linear de aminoácidos (estrutura primária). A expressão “epítopo estrutural ou de conformação” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que não são todos contíguos e, portanto, representam partes separadas da sequência linear de aminoácidos que são colocadas em proximidade entre si por meio de dobra da molécula (estruturas secundárias, terciárias e/ou quaternárias). Um epítopo de conformação é dependente da estrutura tridimensional. A expressão “de conformação” é frequentemente utilizada, portanto, de forma intercambiável com “estrutural”.

[0099] O termo “internalização”, utilizado de forma intercambiável com “internalização intracelular”, designa os eventos moleculares, bioquímicos e celulares associados ao processo de translocação de uma molécula da superfície extracelular de uma célula para a superfície intracelular de uma célula. Os processos responsáveis pela internalização intracelular de moléculas são bem conhecidos e podem envolver, entre outros, a internalização de moléculas extracelulares (tais como hormônios, anticorpos e moléculas orgânicas pequenas); moléculas associadas a membranas (tais como receptores da superfície celular); e complexos de moléculas associadas a membranas ligadas a moléculas extracelulares (por exemplo, um ligante ligado a um receptor transmembrana ou um anticorpo ligado a uma molécula associada a membrana). “Indução e/ou aumento da internalização” compreende, portanto, eventos em que a internalização intracelular é indicada e/ou a velocidade e/ou extensão da internalização intracelular aumenta.

[00100] O termo “agente” é utilizado no presente para indicar um composto químico, mistura de compostos químicos, macromolécula biológica ou extrato preparado com materiais biológicos. A expressão “agente terapêutico” indica um agente que possui atividade biológica.

[00101] Para os propósitos do presente, anticorpo “humanizado” indica um anticorpo no qual a região de cadeia principal constante e variável de uma ou mais imunoglobulinas humanas é fundida à região de ligação, tal como a CDR, de uma imunoglobulina animal. Esses anticorpos são projetados para manter a especificidade de ligação do anticorpo não humano do qual são derivadas as regiões de ligação, mas evitar reação imunológica contra o anticorpo não humano.

[00102] A expressão “região hipervariável”, da forma utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, os resíduos 24- 34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al, 1991) e/ou os resíduos de um “circuito hipervariável” (por exemplo, os resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917) ou sistema similar de determinação de aminoácidos essenciais responsáveis pela ligação de antígenos. Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácidos nesta região é realizada por meio do método descrito em Kabat et al, acima. Expressões como “posição Kabat”, “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” e “de acordo com Kabat” no presente designam esse sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve. Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de peptídeos pode conter mais ou menos aminoácidos correspondentes à redução ou inserção em FR ou CDR do domínio variável.

Domínio variável de cadeia pesada pode incluir, por exemplo, um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com sequência numerada de Kabat “padrão”.

[00103] Por resíduos de “cadeia principal” ou “FR”, da forma utilizada no presente, indica-se a região de um domínio variável de anticorpo exclusivo das regiões definidas como CDRs. Cada cadeia principal de domínio variável de anticorpo pode ser adicionalmente subdividida nas regiões contíguas separadas pelas CDRs (FR1, FR2, FR3 e FR4).

[00104] As expressões “domínio Fc”, “parte Fc” e “região Fc” designam um fragmento com terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, cerca de aminoácido (aa) 230 a cerca de aa 450 de cadeia pesada γ (gama) humana ou sua sequência correspondente em outros tipos de cadeias pesadas de anticorpos (por exemplo, α, δ, ε e µ para anticorpos humanos) ou um de seus alótipos de ocorrência natural. A menos que especificado em contrário, a numeração de aminoácidos de Kabat comumente aceita para imunoglobulinas é utilizada ao longo de todo o presente relatório descritivo (vide Kabat et al (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, quinta edição, United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD).

[00105] As expressões “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” designam material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando métodos de química analítica tais como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia de líquidos de alto desempenho. Proteínas que são a substância predominante presente em preparações são substancialmente purificadas.

[00106] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são uma substância artificial que imita um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos não de ocorrência natural.

[00107] O termo “recombinante”, quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula, ácido nucleico, proteína (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificada por meio da introdução de proteínas ou ácidos nucleicos heterólogos ou da alteração de uma proteína ou ácido nucleico nativo, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desta forma. Portanto, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de forma anormal, subexpressos ou não expressos.

[00108] Dentro do contexto do presente, a expressão anticorpo que “liga" um polipeptídeo ou epítopo designa um anticorpo que liga o mencionado determinante com especificidade e/ou afinidade.

[00109] O termo “identidade” ou “idêntico”, quando utilizado em relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, designa o grau de relação de sequências entre polipeptídeos, conforme determinado pelo número de coincidências entre cordões de dois ou mais resíduos de aminoácidos. “Identidade” mede o percentual de coincidências idênticas entre a menor dentre duas ou mais sequências com alinhamentos de lacuna (se houver) abordadas por um modelo matemático ou programa de computador específico (ou seja, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por meio de métodos conhecidos. Esses métodos incluem, mas sem limitações, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque,

1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M.

Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

[00110] Métodos de determinação da identidade são projetados para fornecer a melhor coincidência entre as sequências testadas.

Métodos de determinação da identidade são descritos em programas de computador disponíveis ao público. Métodos de programa de computador para determinação da identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, que inclui GAP (Devereux et al, Nucl. Acid Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)).

O programa BLASTX é disponível ao público por meio do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al, acima). O conhecido algoritmo de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[00111] O domínio de ligação de antígenos anti-CD39 ou proteína (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que compreende esse domínio liga e neutraliza polipeptídeo CD39 humano solúvel, tal como um polipeptídeo CD39 humano que não contém os dois domínios transmembrana perto das extremidades com terminal N e C encontradas em CD39 ligado a membrana. Em uma realização, o agente inibe a atividade de ATPase de CD39. Em uma realização, o anticorpo inibe a geração de adenosina mediada por CD39. Em uma realização, o anticorpo inibe o catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP. Em uma realização, o anticorpo inibe a inibição mediada por adenosina da atividade de linfócitos (por exemplo, células T). Em um aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um anticorpo com comprimento total, fragmento de anticorpo e uma molécula derivada de anticorpo sintético ou semissintético.

[00112] Os anticorpos que inibem potentemente a atividade enzimática (atividade de ATPase) da proteína CD39 solúvel (e, opcionalmente, ligada por membrana) podem, em uma realização, imobilizar ou restringir o movimento de domínio da proteína CD39 solúvel (e, opcionalmente, ligada por membrana) em uma das suas conformações, de forma a evitar que ela hidrolise o seu substrato. Os anticorpos podem atingir isso por meio de ligação a domínios com terminal C e N de CD39 solúvel (e, opcionalmente, ligado por membrana) ao mesmo tempo.

[00113] Em uma realização, um domínio de ligação de antígeno anti-CD39 ou uma proteína de ligação de antígenos que compreende o domínio de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, proteína de ligação multiespecífica, anticorpo biespecífico etc.) compreende regiões de determinação da complementaridade (CDR) e regiões de cadeia principal (FR). Os domínios de ligação de antígenos podem ser projetados ou modificados de forma a fornecer propriedades desejadas e/ou aprimoradas.

[00114] Em uma realização, uma proteína de ligação de antígenos anti-CD39 é capaz de ligar-se e inibir a atividade de um polipeptídeo CD39 humano, em que a proteína de ligação de antígenos compreende VH e VL, em que cada qual compreende uma cadeia principal (por exemplo, cadeia principal que possui sequência de aminoácidos de origem humana) e CDR1, CDR2 e CDR3. Em uma realização, a proteína de ligação de antígenos restringe o movimento de domínio de CD39 quando ligada a CD39.

Opcionalmente, a cadeia principal de VH e/ou VL (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) é de origem humana.

[00115] Em certas realizações, as moléculas de ligação e os domínios podem ser derivados de domínios variáveis de imunoglobulina, por exemplo, na forma de domínios VL e VH associados, encontrados sobre duas cadeias de polipeptídeos ou um domínio de ligação de antígenos de fita simples tal como scFv, domínio VH, domínio VL, dAb, domínio V-NAR ou domínio VHH.

[00116] Em um aspecto, o agente de ligação CD39 é um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo totalmente humano, anticorpo humanizado e anticorpo quimérico.

[00117] Em um aspecto, o agente é um fragmento de anticorpo que compreende um domínio Fc ou constante derivado de um domínio Fc ou constante de IgG1 humano, por exemplo, modificado, conforme descrito adicionalmente no presente.

[00118] Em um aspecto, o agente compreende um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento de Fab, fragmento de Fab’, fragmento de Fab’-SH, fragmento de F(ab)2, fragmento de F(ab’)2, fragmento de Fv, Ig de cadeia pesada (Ig de camelo ou lhama), fragmento de VHH, FV de domínio simples e fragmento de anticorpo de fita simples. Em um aspecto, o agente compreende uma molécula derivada de anticorpo sintético ou semissintético selecionada a partir de scFv, dsFv, minicorpo, diacorpo, triacorpo, corpo capa e IgNAR; e anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico). O agente pode opcionalmente compreender ainda um domínio Fc.

[00119] Em um aspecto, o anticorpo encontra-se em forma ao menos parcialmente purificada.

[00120] Em um aspecto, o anticorpo encontra-se em forma essencialmente isolada.

[00121] Anticorpos podem ser produzidos por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Em uma realização, anticorpos de acordo com a presente invenção são produzidos por meio de seleção de uma biblioteca de anticorpos (por exemplo, conforme gerado por meio da biblioteca de exibição de fagos). Em outra realização, anticorpos são produzidos por meio da imunização de animais não humanos, preferencialmente camundongos, com um imunogene que compreende um polipeptídeo CD39, preferencialmente um polipeptídeo de domínio extracelular CD39 humano solúvel. O polipeptídeo CD39 pode opcionalmente ser ou compreender um fragmento ou derivado de polipeptídeo CD39 com comprimento total, tipicamente um fragmento imunogênico, ou seja, uma parte do polipeptídeo que compreende um epítopo exposto sobre a superfície de células que expressam um polipeptídeo CD39.

Esses fragmentos contêm tipicamente pelo menos cerca de sete aminoácidos consecutivos da sequência de polipeptídeos madura e, de preferência ainda maior, pelo menos cerca de dez de seus aminoácidos consecutivos. Os fragmentos tipicamente são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor. Em uma realização, o imunogene compreende um polipeptídeo CD93 humano do tipo selvagem em uma membrana de lipídios, tipicamente na superfície de uma célula. Em realização específica, o imunogene compreende células intactas, particularmente células humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas. Em outra realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo CD39 recombinante.

[00122] A etapa de imunização de mamíferos não humanos com um antígeno pode ser conduzida de qualquer forma bem conhecida na técnica para estimular a produção de anticorpos em camundongos (vide, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência). O isolamento de hibridomas produtores dos anticorpos é bem conhecido e pode ser conduzido de qualquer forma conhecida na técnica.

[00123] Anticorpos podem também ser produzidos por meio da seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, conforme descrito, por exemplo, em Ward et al, Nature, 341 (1989), pág. 544, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência).

[00124] A identificação de um ou mais anticorpos que se liga(m) a CD39, particularmente de forma substancial ou essencialmente a mesma região sobre CD39 de anticorpo monoclonal mAb20 ou mAb21, pode ser facilmente determinada utilizando qualquer um dentre uma série de testes de seleção imunológica nos quais é possível determinar a competição de anticorpos. Muitos desses testes são rotineiramente praticados e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n°

5.660.827, emitida em 26 de agosto de 1997, que é especificamente incorporada ao presente como referência).

[00125] Quando os anticorpos de teste a serem examinados forem obtidos de animais fonte diferentes, por exemplo, ou forem mesmo de isótipo Ig diferente, pode ser empregado um simples teste de competição no qual os anticorpos controle (por exemplo, mAb20 ou mAb21) e de teste são misturados (ou previamente adsorvidos) e aplicados a uma amostra que contém polipeptídeos CD39, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT n° WO 2018/167267, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Protocolos com base em Western Blot e o uso de análise BIACORE são apropriados para uso nesses estudos de competição.

[00126] A determinação da ligação ou não de um anticorpo dentro de uma região de epítopo pode ser conduzida de formas conhecidas pelos técnicos no assunto.

Como um exemplo desses métodos de mapeamento e caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti-

CD39 pode ser determinada por meio de “pegada” de epítopo utilizando modificações químicas das aminas/carboxilas expostas na proteína CD39. Um exemplo específico desse método de pegada é o uso de HXMS (troca de hidrogênio e deutério detectada por meio de espectrometria de massa), em que ocorre permuta de hidrogênio e deutério de prótons de amida de proteína ligante e receptor, ligação e retropermuta, em que os grupos amida de cadeia principal que participam da ligação de proteínas são protegidos contra retropermuta e, portanto, permanecerão deuterados.

Regiões relevantes podem ser identificadas nesse ponto por meio de proteólise péptica, separação de cromatografia de líquidos de alto desempenho de micro-orifícios rápida e/ou espectrometria de massa de ionização de eletropulverização.

Vide, por exemplo, Ehrning, H., Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2), págs. 252-259

(1999), Engen, J.

R. e Smith, D.

L. (2001), Anal.

Chem. 73, 256A-265A.

Outro exemplo de método de identificação de epítopos apropriado é mapeamento de epítopos de ressonância magnética nuclear (NMR), em que é tipicamente comparada a posição dos sinais em espectros de NMR bidimensionais do antígeno livre e do antígeno em complexo com o peptídeo de ligação de antígenos, tal como um anticorpo.

O antígeno tipicamente é seletivamente marcado isotopicamente com 15N, de forma que sejam observados no espectro de NMR apenas sinais correspondentes ao antígeno e nenhum sinal do peptídeo de ligação de antígenos.

Sinais de antígenos originários de aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígenos tipicamente alterarão a posição no espectro do complexo em comparação com o espectro do antígeno livre e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados desta forma.

Vide, por exemplo, Ernst Chering Res.

Found

Workshop, 2004; (44): 149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol.

281 (1), págs. 61-67 (1988); e Saito e Patterson, Methods, junho de 1996; 9 (3): 516-24.

[00127] Mapeamento/caracterização de epítopos podem ser também realizados utilizando métodos de espectrometria de massa. Vide, por exemplo, Downard, J. Mass Spectrom., abril de 2000; 35 (4): 493-503 e Kiselar e Downard, Anal. Chem., 1° de maio de 1999; 71 (9): 1792-1801. Métodos de digestão de protease podem também ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopos. Sequências/regiões relevantes para determinantes antigênicos podem ser determinadas por meio de digestão de protease, utilizando, por exemplo, tripsina em razão de cerca de 1:50 para CD39 ou digestão o/n sob pH 7-8, seguida por análise de espectrometria de massa (MS) para identificação de peptídeos. Os peptídeos protegidos contra a divisão de tripsina pelo aglutinante anti-CD39 podem ser identificados em seguida por meio de comparação de amostras submetidas a digestão de tripsina e amostras incubadas com anticorpo e submetidas em seguida a digestão, por exemplo, por tripsina (de forma a revelar pegada para o aglutinante). Outras enzimas, tais como quimotripsina, pepsina etc., podem também ou alternativamente ser utilizadas em métodos de caracterização de epítopos similares. Além disso, digestão enzimática pode fornecer um método rápido de análise se uma sequência determinante antigênica potencial encontra-se dentro de uma região do polipeptídeo CD39 que não seja exposta na superfície e, consequentemente, muito provavelmente não é relevante em termos de imunogenicidade e antigenicidade.

[00128] Mutagênese dirigida a local é outro método útil para elucidação de epítopo de ligação. Em “varredura de alanina”, por exemplo, cada resíduo dentro de um segmento de proteína é substituído por um resíduo de alanina e as consequências para a afinidade de ligação são medidas. Caso a mutação gere redução significativa da afinidade de ligação, ela é mais provavelmente envolvida na ligação. Anticorpos monoclonais específicos para epítopos estruturais (ou seja, anticorpos que não ligam a proteína desdobrada) podem ser utilizadas para verificar que a substituição de alanina não influencie a dobra geral da proteína. Vide, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383-386; e Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1-6.

[00129] Pode-se também utilizar microscopia eletrônica para “pegadas” de epítopos. Wang et al, Nature 1992; 355: 275-278, por exemplo, utilizaram aplicação coordenada de microscopia crioeletrônica, reconstrução de imagens tridimensionais e cristalografia de raios X para determinar a pegada física de um fragmento de Fab sobre a superfície de capsídeos de vírus mosaico do feijão fradinho nativo.

[00130] Outras formas de teste “livre de marca” de avaliação de epítopos incluem ressonância de plasma da superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência refletométrica (RifS). Vide, por exemplo, Fägerstam et al, Journal of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice et al, J.

Chromatogr. 1993; 646: 159-168; Leipert et al, Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308–3311; Kröger et al, Biosensors and Bioelectronics 2002; 17: 937-944.

[00131] Tipicamente, anticorpos anti-CD39 fornecidos no presente possuem afinidade para polipeptídeo CD39 (por exemplo, um polipeptídeo CD39 monomérico produzido nos Exemplos do presente) na faixa de cerca de 104 a cerca de 1011 M-1 (por exemplo, cerca de 108 a cerca de 1010 M-1). Anticorpos anti-CD39 podem possuir, por exemplo, constante de dissociação média (KD) de menos de 1 x 10-9 M com relação a CD39, conforme determinado, por exemplo, por meio de seleção de ressonância de plasma de superfície (SPR) (por exemplo, por meio de análise com um dispositivo analítico SPR BIAcore®). Em um exemplo de aspecto mais específico, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD39 que possuem KD de cerca de 1 x 10-8 M a cerca de 1 x 10-10 M ou cerca de 1 x 10-9 M a cerca de 1 x 10-11 M,

para CD39.

[00132] Anticorpos podem ser caracterizados, por exemplo, por KD médio de não mais de cerca de (ou seja, melhor afinidade que) 100, 60, 10, 5 ou 1 nanomolar, preferencialmente subnanomolar ou, opcionalmente, não mais de cerca de 500, 200, 100 ou 10 picomolar. KD pode ser determinado, por exemplo, por meio da imobilização de proteínas CD39 humanas produzidas de forma recombinante sobre uma superfície de chip, seguida pela aplicação do anticorpo a ser testado em solução. Em uma realização, o método compreende adicionalmente uma etapa (d) de seleção de anticorpos de (b) que sejam capazes de concorrer pela ligação a CD39 com anticorpo I-394 ou, por exemplo, qualquer um dentre mAbs 1-24.

[00133] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção, tais como o anticorpo mAb20 ou mAb21, pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). Em um aspecto, é fornecido um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo anti- CD39 de qualquer realização do presente. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Conforme descrito em outros pontos do presente relatório descritivo, essas sequências de DNA podem ser modificadas por qualquer um dentre um grande número de propósitos, tal como para anticorpos de humanização, produção de fragmentos ou derivados, ou para modificar a sequência do anticorpo, por exemplo, no local de ligação de antígenos, a fim de otimizar a especificidade de ligação do anticorpo. Em uma realização, é fornecida uma sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica uma cadeia leve e/ou cadeia pesada de anticorpo (por exemplo, mAb20 ou mAb21), bem como uma célula hospedeira recombinante que compreende (por exemplo, no seu genoma) esse ácido nucleico.

Expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo é bem conhecida na técnica (vide, por exemplo, Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5, págs. 256 (1993); e Pluckthun, Immunol. 130, pág. 151 (1992).

[00134] Após a identificação de anticorpos que são capazes de ligar sCD39 e/ou memCD39 e/ou que possuem outras propriedades desejadas, eles também serão tipicamente determinados utilizando métodos tais como os descritos no presente, pela sua capacidade de ligação a outros polipeptídeos, incluindo polipeptídeos não relacionados. Idealmente, os anticorpos ligam-se com afinidade substancial apenas a CD39 e não se ligam em nível significativo a polipeptídeos não relacionados ou outros polipeptídeos da família de NTPDase, notadamente CD39-L1, L2, L3 e L4 ou NTPDase8.

Apreciar-se-á, entretanto, que, desde que a afinidade para CD39 seja substancialmente maior (por exemplo, 10x, 100x, 500x, 1000x, 10.000x ou mais) que para outros polipeptídeos não relacionados, os anticorpos são apropriados para uso nos métodos de acordo com o presente.

[00135] Em uma realização, os anticorpos anti-CD39 podem ser preparados de forma que não possuam ligação específica substancial para receptores de Fcγ humanos, tais como qualquer um ou mais dentre CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64). Esses anticorpos podem compreender regiões constantes de diversas cadeias pesadas que conhecidamente não possuem ou possuem baixa ligação a receptores de Fcγ. Alternativamente, fragmentos de anticorpos que não compreendem (ou compreendem partes de) regiões constantes, tais como fragmentos de F(ab’)2, podem ser utilizados para evitar a ligação de receptores de Fc. Pode-se determinar a ligação de receptor de Fc de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ligação de teste de um anticorpo a proteína receptora de Fc em teste BIACORE. Além disso, geralmente, pode-se utilizar qualquer isótipo de IgG de anticorpo no qual a parte de Fc é modificada (por exemplo, por meio da introdução de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais substituições de aminoácidos) para minimizar ou eliminar a ligação a receptores de Fc (vide, por exemplo, WO 03/101485, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). Testes como os testes baseados em células para determinar a ligação de receptor de Fc são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO 03/101485.

[00136] Em uma realização, o anticorpo pode compreender uma ou mais mutações específicas na região Fc que resultam em anticorpos “silenciosos para Fc” que possuem interação mínima com células efetoras.

Funções efetoras silenciadas podem ser obtidas por meio de mutação na região Fc dos anticorpos e foram descritas na técnica: mutação N297A, as mutações LALA (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20 (6): 685-691); e D265A (Baudino et al, 2008, J. Immunol. 181: 6664-69); vide também Heusser et al, WO 2012/065950, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Em uma realização, um anticorpo compreende uma, duas, três ou mais substituições de aminoácidos na região de articulação. Em uma realização, o anticorpo é IgG1 ou IgG2 e compreende uma, duas ou três substituições nos resíduos 233-236, opcionalmente 233-238 (numeração de EU). Em uma realização, o anticorpo é IgG4 e compreende uma, duas ou três substituições nos resíduos 327, 330 e/ou 331 (numeração de EU). Exemplos de anticorpos IgG1 de Fc silenciosos são o mutante LALA que compreende mutação L234A e L235A na sequência de aminoácidos Fc de IgG1. Outro exemplo de mutação silenciosa de Fc é mutação no resíduo D265 ou em D265 e P329, por exemplo, conforme utilizado em anticorpo IgG1 como mutação DAPA (D265A, P329A) (US 6.737.056). Outro anticorpo IgG1 silencioso compreende uma mutação no resíduo N297 (por exemplo, mutação N297A, N297S), que resulta em anticorpos aglicosilados/não glicosilados. Outras mutações silenciosas incluem: substituições nos resíduos L234 e G237 (L234A/G237A); substituições nos resíduos S228, L235 e R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); substituições nos resíduos H268, V309, A330 e A331 (H268Q/V309L/A330S/A331S); substituições nos resíduos C220, C226, C229 e P238 (C220S/C226S/C229S/P238S); substituições nos resíduos C226, C229, E233, L234 e L235 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; substituições nos resíduos K322, L235 e L235 (K322A/L234A/L235A); substituições nos resíduos L234, L235 e P331 (L234F/L235E/P331S); substituições nos resíduos 234, 235 e 297; substituições nos resíduos E318, K320 e K322 (L235E/E318A/K320A/K322A); substituições nos resíduos V234A, G237A e P238S; substituições nos resíduos 243 e 264; substituições nos resíduos 297 e 299; substituições tais como os resíduos 233, 234, 235, 237 e 238 definidos pelo sistema de numeração EU compreendem uma sequência selecionada a partir de PAAAP, PAAAS e SAAAS (vide WO 2011/066501).

[00137] Em uma realização, o anticorpo pode compreender uma ou mais mutações específicas na região Fc. Esse anticorpo pode compreender, por exemplo, um domínio Fc com origem em IgG1 humano e compreende uma mutação no(s) resíduo(s) de Kabat 234, 235, 237, 330 e/ou

331. Um exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/P331S ou L234F/L235E/P331S). Outro exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235, G237 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/G237A/P331S). Outro exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235, G237, A330 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S). Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, opcionalmente de isótipo de IgG1 humano, que compreende: substituição L234X1, substituição L235X2 e substituição P331X3,

em que X1 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X2 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina e X 3 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X 1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X2 é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras;

opcionalmente, em que X3 é serina ou uma de suas substituições conservadoras.

Em outra realização, o anticorpo compreende um domínio Fc,

opcionalmente de isótipo de IgG1 humano, que compreende: substituição

L234X1, substituição L235X2, substituição G237X4 e substituição P331X4, em que X1 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X 2 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X 3 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de glicina e X4 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X2 é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X3 é alanina ou uma de suas substituições conservadoras; e, opcionalmente, X 4 é serina ou uma de suas substituições conservadoras.

Em outra realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, opcionalmente de isótipo de IgG1 humano, que compreende: substituição L234X1, substituição L235X2,

substituição G237X4, substituição G330X4 e substituição P331X5, em que X1 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X2 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X3 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de glicina, X4 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de alanina e X5 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras;

opcionalmente, em que X2 é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X3 é alanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X4 é serina ou uma de suas substituições conservadoras; e, opcionalmente, X5 é serina ou uma de suas substituições conservadoras. Na notação abreviada utilizada no presente, o formato é: resíduo do tipo selvagem: posição no polipeptídeo: resíduo mutante, em que as posições de resíduos são indicadas de acordo com a numeração de EU de acordo com Kabat.

[00138] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS P G K (SEQ ID N° 23).

[00139] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS P G K (SEQ ID N° 24).

[00140] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235, 237, 330 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS P G K (SEQ ID N° 25).

[00141] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica,

mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235, 237 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS P G K (SEQ ID N° 26).

[00142] Anticorpos silenciosos para Fc mediam pouca ou nenhuma atividade de ADCC, o que significa que um anticorpo silencioso para Fc exibe atividade de ADCC que é de menos de 50% de lise celular específica.

Preferencialmente, anticorpos substancialmente não possuem atividade de ADCC; o anticorpo silencioso para Fc, por exemplo, exibe atividade de ADCC (lise celular específica) que é de menos de 5% ou menos de 1%. Anticorpos silenciosos para Fc podem também resultar na falta de retícula mediada por FcγR de CD39 na superfície de células que expressam CD39.

[00143] Em uma realização, o anticorpo possui uma substituição em uma região constante de cadeia pesada em qualquer um, dois, três, quatro, cinco ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 e 409 (a numeração de resíduos na região constante de cadeia pesada é de acordo com a numeração de UE de acordo com Kabat). Em uma realização, o anticorpo compreende substituição nos resíduos 234, 235 e 322. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235 e 331. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235, 237 e 331. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235, 237, 330 e

331. Em uma realização, o domínio Fc é do subtipo IgG1 humano. Resíduos de aminoácidos são indicados de acordo com numeração EU segundo Kabat.

[00144] Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácidos que aumenta a ligação a polipeptídeos FcRn humanos, a fim de aumentar a meia vida in vivo do anticorpo. Exemplos de mutações são descritos em Strohl, W., 2009, Curr.

Opin. Biotechnol., Vol. 20 (6): 685-691, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Exemplos de substituições utilizadas em anticorpos de isótipo IgG1 humano são substituições nos resíduos de Kabat M252, S254 e T256; substituições nos resíduos T250 e M428; substituições no resíduo N434; substituições nos resíduos H433 e N434; substituições nos resíduos T307, E380 e N434; substituições nos resíduos T307, E380 e N434; substituições nos resíduos M252, S254, T256, H433, N434 e 436; substituições no resíduo I253; substituições nos resíduos P257, N434, D376 e N434.

[00145] Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácidos que confere redução da sensibilidade à divisão por proteases. Metaloproteinases de matriz (MMPs) representam a família mais proeminente de proteinases associadas à tumorigênese. Embora células de câncer possam expressar MMPs, o volume do MMP extracelular é fornecido por diferentes tipos de células estromais que se infiltram no tumor e cada qual produz um conjunto específico de proteinases e inibidores da proteinase, que são liberados para o espaço extracelular e alteram especificamente o ambiente em volta do tumor. Os MMPs presentes no microambiente do tumor podem dividir anticorpos no interior da região de articulação e podem, portanto, gerar a desativação de anticorpos terapêuticos que são projetados para funcionar dentro do local do tumor. Em uma realização, o domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácido possui sensibilidade reduzida à divisão por qualquer uma, duas, três ou mais (ou todas) proteases selecionadas a partir do grupo que consiste de: GluV8, IdeS, gelatinase A (MMP2), gelatinase B (MMP-9), metaloproteinase de matriz 7 (MMP-7), estromelisina (MMP-3) e elastase de macrófago (MMP-12). Em uma realização, o anticorpo com sensibilidade reduzida à divisão compreende um domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácidos nos resíduos E233-L234 e/ou L235. Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácido nos resíduos E233, L234, L235 e G236. Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos 233-238, por exemplo, de forma que a sequência E233-L234-L235- G236 seja substituída por P233-V234-A235 (G236 é excluído). Vide, por exemplo, WO 99/58572 e WO 2012087746, cujos relatórios descritivos são incorporados ao presente como referência.

[00146] Um composto de ligação de antígenos pode, em qualquer estágio desejado, ter determinada sua capacidade de inibição da atividade enzimática de CD39, notadamente para bloquear a atividade de ATPase de sCD39 e reduzir a produção de ADP e AMP (e, em conjunto com CD73, adenosina) por proteína CD39 solúvel e, opcionalmente, ainda por uma célula que expressa CD39 e, por sua vez, restaurar a atividade e/ou liberar a inibição mediada por adenosina de linfócitos.

[00147] A atividade inibidora (por exemplo, potencial de aumento da imunicidade) de anticorpos pode ser determinada, por exemplo, em testes de detecção do desaparecimento (hidrólise) de ATP e/ou geração de AMP.

[00148] A capacidade do anticorpo de inibir proteína CD39 humana recombinante solúvel pode ser testada por meio da detecção de ATP após a incubação de anticorpo de teste com proteína CD39 solúvel.

Resumidamente, ATP pode ser quantificado utilizando-se Cell Titer Glo® (Promega), em um teste no qual as faixas de dosagem de anticorpo de teste são incubadas com proteína CD39 humana recombinante solúvel descrita no Exemplo 1, por uma hora, a 37 °C. 20 µM de ATP são adicionados às placas por trinta minutos adicionais a 37 °C antes da adição de reagente CTG. A luz emitida é quantificada utilizando-se um luminômetro Enspire® após curto período de incubação de cinco minutos no escuro.

[00149] A capacidade de um anticorpo de inibir células que expressam proteína CD39 pode ser testada por meio da detecção de ATP após incubação de anticorpo de teste com células (por exemplo, células de Ramos, células transfectadas com CD39 etc.). Vide, por exemplo, Exemplos, Métodos.

As células podem ser incubadas por uma hora a 37 °C com anticorpo de teste.

As células são incubadas em seguida com 20 µM de ATP por uma hora adicional a 37 °C. As placas são centrifugadas por dois minutos a 400 g e o sobrenadante celular é transferido para uma microplaca de luminescência (cavidades brancas). Adiciona-se CTG ao sobrenadante e a luz emitida é quantificada após incubação por cinco minutos no escuro utilizando um luminômetro Enspire®. A eficácia do anticorpo anti-CD39 é determinada por meio de comparação da luz emitida na presença de anticorpo com ATP isoladamente (emissão de luz máxima) e ATP em conjunto com células (emissão de luz mínima).

[00150] Redução da hidrólise de ATP em AMP e/ou aumento de ATP e/ou redução da geração de AMP, na presença de anticorpo, indicam que o anticorpo inibe CD39. Em uma realização, a preparação de anticorpo é capaz de causar redução de pelo menos 60% da atividade enzimática de um polipeptídeo CD39 expresso por uma célula;

preferencialmente, o anticorpo causa redução de pelo menos 70%, 80% ou 90% da atividade enzimática de um polipeptídeo CD39 em uma célula, conforme determinado por meio da detecção de ATP utilizando Cell Titer Glo® (Promega) após incubação de células que expressam polipeptídeo CD39 (por exemplo, células de Ramos) com um anticorpo de teste, por exemplo, como em Exemplos, Métodos.

[00151] Em uma realização, a preparação de anticorpo é capaz de causar redução de pelo menos 60% da atividade enzimática de um polipeptídeo CD39 recombinante solúvel (por exemplo, na ausência de células), preferencialmente redução de pelo menos 70%, 80% ou 90% da atividade enzimática de um polipeptídeo CD39 recombinante solúvel, conforme determinado por meio da detecção de ATP utilizando Cell Titer Glo® (Promega) após incubação de polipeptídeo CD39 recombinante solúvel com um anticorpo de teste, por exemplo, como em Exemplos, Métodos.

[00152] A atividade do anticorpo pode também ser medida em um teste indireto para determinar sua capacidade de modulação da atividade de células imunes (por exemplo, células imunes que expressam receptor de adenosina; células que expressam receptor de A2A), por exemplo, para liberar a inibição mediada por adenosina da atividade de linfócitos; ou para causar a ativação da atividade de linfócitos. Isso pode ser abordado, por exemplo, utilizando um teste de liberação de citoquinas. Em outro exemplo, um anticorpo pode ser avaliado em teste indireto para determinar sua capacidade de modulação da proliferação de linfócitos.

EPÍTOPOS SOBRE CD39

[00153] Em um aspecto, os anticorpos ligam um determinante antigênico presente sobre CD39 expresso na superfície celular.

[00154] Em um aspecto, os anticorpos ligam substancialmente o mesmo epítopo do anticorpo que contém VH e VL de mAbs1-24 (ou I-394). Em uma realização, os anticorpos ligam-se a um epítopo de CD39 que se sobrepõe ao menos parcialmente ou inclui pelo menos um resíduo no epítopo limitado pelo anticorpo mAbs1-24 (ou I-394). Os resíduos ligados pelo anticorpo podem ser especificados como estando presentes sobre a superfície do polipeptídeo CD39, por exemplo, em um polipeptídeo CD39 expresso sobre a superfície de uma célula.

[00155] A ligação de anticorpo anti-CD39 a células transfectadas com mutantes de CD39 pode ser medida e comparada com a capacidade de anticorpo anti-CD39 de ligar polipeptídeo CD39 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID N° 1). Redução da ligação entre um anticorpo anti-CD39 e um polipeptídeo CD39 mutante (por exemplo, mutante da Tabela 1) indica que existe redução da afinidade de ligação (por exemplo, conforme medido por meio de métodos conhecidos tais como teste de FACS de células que expressam um mutante específico, ou por meio de teste Biacore da ligação a polipeptídeos mutantes) e/ou redução da capacidade de ligação total do anticorpo anti-CD39 (conforme evidenciado, por exemplo, por redução de Bmax em plotagem da concentração de anticorpo anti-CD39 contra a concentração de polipeptídeo). Redução significativa da ligação indica que o resíduo que sofreu mutação é diretamente envolvido na ligação ao anticorpo anti-CD39 ou encontra-se em boa proximidade da proteína de ligação quando o anticorpo anti-CD39 é ligado a CD39.

[00156] Em algumas realizações, redução significativa da ligação indica que a afinidade de ligação e/ou a capacidade entre um anticorpo anti-CD39 e um polipeptídeo CD39 mutante é reduzida em mais de 40%, mais de 50%, mais de 55%, mais de 60%, mais de 65%, mais de 70%, mais de 75%, mais de 80%, mais de 85%, mais de 90% ou mais de 95% com relação à ligação entre o anticorpo e um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem. Em certas realizações, a ligação é reduzida abaixo de limites detectáveis. Em algumas realizações, evidencia-se redução significativa da ligação quando a ligação de um anticorpo anti-CD39 a um polipeptídeo CD39 mutante for de menos de 50% (por exemplo, menos de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ou 10%) da ligação observada entre o anticorpo anti-CD39 e um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem.

[00157] Em algumas realizações, são fornecidos anticorpos anti-CD39 que exibem ligação significativamente menor para polipeptídeo CD39 mutante no qual um resíduo em um segmento que compreende um resíduo de aminoácido ligado pelo anticorpo mAbs1-24 (ou I-394) é substituído por um aminoácido diferente, em comparação com ligação a um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem que não compreende essa(s) substituição(ões) (por exemplo, um polipeptídeo de SEQ ID N° 1).

[00158] Em uma realização, um anticorpo possui ligação reduzida a um polipeptídeo CD39 mutante que compreende uma mutação em um ou mais (ou todos os) resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de R138, M139 e E142 (com referência a SEQ ID N° 1), em cada caso com relação à ligação entre o anticorpo e um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1.

[00159] Exemplos de sequências de regiões variáveis de anticorpos:

[00160] Exemplos de anticorpos de acordo com a presente invenção incluem anticorpos que compreendem o domínio VH e o domínio VL de qualquer um dos anticorpos mAb1 a mAb24. As sequências VH e VL de anticorpos anti-CD39 mAb1 a mAb24 são fornecidas nas Tabelas A e B (Exemplo 13).

[00161] Um exemplo de par VL e VH anti-CD39 de alta potência de acordo com a presente invenção é o anticorpo mAb20, cuja sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada é relacionada abaixo (SEQ ID N° 31) e cuja sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é relacionada abaixo (SEQ ID N° 36). Esse anticorpo pode possuir, por exemplo, uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 9.

[00162] Outro exemplo de par VH e VL anti-CD39 de alta potência de acordo com a presente invenção é o do anticorpo mAb21, cuja sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada é relacionada abaixo (SEQ ID N° 31) e cuja sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é relacionada abaixo (SEQ ID N° 37). Esse anticorpo pode, por exemplo, possuir uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 40.

[00163] Em qualquer aspecto, um anticorpo isolado que liga um polipeptídeo CD39 humano pode ser especificado como compreendendo cadeias principais VH e VL (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e FR4) de origem humana. Em um aspecto, o anticorpo compreende: HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos: DYNMH (SEQ ID N° 8) ou uma sequência de pelo menos quatro de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos: YIVPLNGGSTFNQKFKG (SEQ ID N° 9) ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente, opcionalmente em que a asparagina na posição Kabat 61 é substituída e, opcionalmente, em que a lisina na posição Kabat 65 é substituída; HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos: GGTRFAY (SEQ ID N° 10) ou uma sequência de pelo menos 4, 5 ou 6 de seus aminoácidos contíguos,

opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos: RASESVDNFGVSFMY (SEQ ID N° 11) ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente, opcionalmente em que a arginina na posição Kabat 24 é substituída; região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos: GASNQGS (SEQ ID N° 12) ou uma sequência de pelo menos 4, 5 ou 6 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos: QQTKEVPYT (SEQ ID N° 13) ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

As posições de CDR podem ser de acordo com a numeração de Kabat.

[00164] Em uma realização, HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da Fórmula I: Y – I – V – P – L – N – G – G – S – T – F – Xaa1 – Q – K – F – Xaa2 – G (SEQ ID N° 14) ou uma de suas subsequências, em que Xaa 1 pode ser qualquer resíduo de aminoácido, opcionalmente em que Xaa 1 é asparagina ou serina e Xaa2 pode ser qualquer resíduo de aminoácido, opcionalmente em que Xaa 2 é lisina ou glutamina. Em uma realização, HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos: YIVPLNGGSTFSQKFKG (SEQ ID N° 15). Em uma realização, HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos: YIVPLNGGSTFSQKFQG (SEQ ID N° 16).

[00165] Em uma realização, LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da Fórmula II:

Xaa3 – A – S – E – S – V – D – N – F – G – V – S – F – M – Y (SEQ ID N° 17) em que Xaa3 pode ser qualquer resíduo de aminoácido, opcionalmente em que Xaa3 é lisina ou arginina. Em uma realização, LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos: KASESVDNFGVSFMY (SEQ ID N° 18).

[00166] Em uma realização, o anticorpo compreende uma cadeia principal de cadeia pesada do subgrupo humano IGHV1-3 (opcionalmente em conjunto com IGHJ1) e, opcionalmente, o IGHV1-3 é IGHV1-3*01. Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia principal de cadeia leve do subgrupo humano IGKV4-1 (opcionalmente em conjunto com IGKJ4).

[00167] Em um aspecto, a presente invenção fornece um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo CD39 humano, que compreende: a. CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 8; b. CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 9, 14, 15 ou 16; c. CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 10; d. CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 11, 17 ou 18; e. CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 12; f. CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 13; e g. sequências de cadeia principal de cadeia leve e cadeia pesada.

[00168] O anticorpo pode compreender adicionalmente uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácidos ao longo das cadeias principais de cadeia leve e/ou pesada humanas para, por exemplo, aumentar a afinidade, estabilidade ou outras propriedades do anticorpo.

Opcionalmente, a substituição introduz um resíduo presente na posição específica em mamíferos não humanos (por exemplo, rato ou camundongo).

[00169] Em qualquer das realizações das sequências VH do presente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 67 pode ser alanina.

[00170] Em qualquer das realizações das sequências VH do presente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 71 é valina.

[00171] Em qualquer das realizações das sequências VH do presente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 76 é arginina.

[00172] Em algumas realizações das sequências VH do presente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 48 pode ser isoleucina. Em outras realizações das sequências VH do presente, o aminoácido na posição de cadeia pesada de Kabat 48 pode ser metionina.

[00173] Em uma realização, VH compreende um resíduo de alanina na posição Kabat 67 e valina na posição 71.

[00174] Em uma realização, VH compreende um resíduo de isoleucina na posição Kabat 48, resíduo de alanina na posição Kabat 67, valina na posição Kabat 71 e arginina na posição Kabat 76.

[00175] Em qualquer uma das realizações das sequências VL do presente, VL compreende fenilalanina na posição Kabat 36 (FR2). Em uma realização, VL compreende lisina na posição Kabat 24 (CDR1).

[00176] Posições nos domínios VH e VL do presente são descritas utilizando o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5ª Ed., United States Public

Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD).

[00177] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD39 compreende uma cadeia pesada que possui identidade de sequências de pelo menos cerca de 80% (por exemplo, identidade de pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) com a cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38.

[00178] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD39 compreende uma cadeia leve que possui pelo menos cerca de 80% da sequência/identidade (por exemplo, identidade de pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) com a cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 39 ou 40.

[00179] Em qualquer aspecto, as cadeias pesadas, cadeias leves, região variável, sequências de FR e/ou CDR especificadas podem compreender uma ou mais modificações de sequências, tais como uma substituição (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais modificações de sequências). Em uma realização, a substituição é uma modificação conservadora.

[00180] Um objeto adicional da presente invenção também engloba variantes conservadoras de funções dos anticorpos descritos no presente. “Variantes conservadoras de função” são aquelas nas quais um dado resíduo de aminoácido em proteínas ou enzimas foi alterado sem mudar a conformação geral e a função do polipeptídeo, incluindo, mas sem limitações, substituição de um aminoácido por um que possua propriedades similares (tais como polaridade, potencial de ligação de hidrogênio, ácida, básica, hidrofóbica, aromática e similares). Aminoácidos diferentes dos indicados como conservados podem diferir de proteína, de forma que o percentual de similaridade de sequências de aminoácidos ou proteínas entre quaisquer duas proteínas com função similar pode variar e pode ser, por exemplo, de 70% a 99% conforme determinado de acordo com um esquema de alinhamento tal como por meio do Método Cluster, em que a similaridade é baseada no algoritmo MEGALIGN. “Variante conservadora de função” também inclui um polipeptídeo que possui pelo menos 60% de identidade de aminoácidos conforme determinado por meio de algoritmos BLAST ou FASTA, preferencialmente pelo menos 75%, de maior preferência pelo menos 85%, ainda preferencialmente pelo menos 90% e, de preferência ainda maior, pelo menos 95%, e possui funções ou propriedades idênticas ou substancialmente similares à proteína nativa ou parental com a qual é comparada.

[00181] Em qualquer realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser opcionalmente especificado como sendo um anticorpo diferente do anticorpo I-394 (por exemplo, que possui as sequências de aminoácidos VH e VL exibidas em SEQ ID N° 6 e 7, respectivamente). Em qualquer realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser opcionalmente especificado como sendo um anticorpo diferente do anticorpo I- 395, I-396, I-397, I-398 ou I-399 (por exemplo, que possui as sequências de aminoácidos VH e VL descritas no pedido de patente PCT n° PCT/EP2018/056661 depositado em 16 de março de 2018, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). Em qualquer realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser opcionalmente especificado como sendo um anticorpo diferente do anticorpo By40, Ba54g ou BY12 descrito na patente norte-americana publicada US 2016/0137747A1 (por exemplo, que possui as sequências de aminoácidos VH e VL de By40, Ba54g ou BY12); um anticorpo diferente do anticorpo BY40 produzido pela linhagem de células de hibridoma que produz esse anticorpo.

[00182] Fragmentos e derivados de anticorpos (que são englobados pelo termo “anticorpo” ou “anticorpos” conforme utilizado no presente pedido, a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto) podem ser produzidos por meio de métodos conhecidos na técnica. “Fragmentos” compreendem uma porção do anticorpo intacto, geralmente o local de ligação de antígeno ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que é polipeptídeo que possui uma estrutura primária que consiste de uma sequência não interrompida de resíduos de aminoácidos contíguos (indicado no presente "fragmento de anticorpo de cadeia simples" ou "polipeptídeo de cadeia simples"), que inclui, sem limitações, (1) moléculas de Fv de cadeia simples, (2) polipeptídeos de cadeia simples que contêm apenas um domínio variável de cadeia leve ou um de seus fragmentos que contém as três CDRs no domínio variável de cadeia leve, sem porção de cadeia pesada associada; e (3) polipeptídeos de cadeia simples que contêm pelo menos uma região variável de cadeia pesada ou um de seus fragmentos que contém as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) formados a partir de fragmentos de anticorpos.

São incluídos, entre outros, um nanocorpo, anticorpo de domínio, anticorpo de domínio simples ou “dAb”.

[00183] Pode-se incorporar um anticorpo anti-CD39 em uma formulação farmacêutica que compreende concentração de 1 mg/ml a 500 mg/l, em que a mencionada formulação possui pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode compreender adicionalmente um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma realização, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação que compreende água. Essa formulação é tipicamente uma solução ou suspensão. Em realização adicional, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. A expressão “formulação aquosa” é definida como formulação que compreende pelo menos 50% p/p de água. De forma similar, a expressão “solução aquosa” é definida como solução que compreende pelo menos 50% p/p de água e a expressão “suspensão aquosa” é definida como suspensão que compreende pelo menos 50% p/p de água.

[00184] Em outra realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca por congelamento, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[00185] Em outra realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, seca por congelamento ou seca por pulverização) pronta para uso sem dissolução anterior.

[00186] Em aspecto adicional, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa desse anticorpo e um tampão, em que o anticorpo está presente em concentração de 1 mg/ml ou acima e a mencionada formulação possui pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

[00187] Em outra realização, o pH da formulação encontra- se na faixa selecionada a partir da lista que consiste de cerca de 2,0 a cerca de 10,0, cerca de 3,0 a cerca de 9,0, cerca de 4,0 a cerca de 8,5, cerca de 5,0 a cerca de 8,0 e cerca de 5,5 a cerca de 7,5.

[00188] Em realização adicional, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogênio fosfato de sódio, hidrogênio fosfato dissódico, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou suas misturas. Cada um desses tampões específicos constitui uma realização alternativa.

[00189] Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um agente isotônico. Em realização adicional, a formulação também compreende um agente quelante.

Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um estabilizante. Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um tensoativo. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 18ª edição, 1995.

[00190] É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica de peptídeos. Esses ingredientes adicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes de volume, modificadores da tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de soro humano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Naturalmente, esses ingredientes adicionais não deverão prejudicar a estabilidade geral da formulação farmacêutica.

[00191] Composições farmacêuticas que contêm um anticorpo podem ser administradas a pacientes necessitados desse tratamento em diversos locais, tais como locais tópicos, por exemplo pele e locais das mucosas, em locais que evitam absorção, tais como administração em artérias, veias, no coração e em locais que envolvem absorção, tais como administração na pele, sob a pele, em músculos ou no abdômen. A administração de composições farmacêuticas pode ser realizada por meio de diversas vias de administração, tais como subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, tal como por meio dos bronquíolos e alvéolos ou uma de suas combinações, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, tal como por meio da conjuntiva, uretal e parenteral a pacientes necessitados desse tratamento.

[00192] Formulações de anticorpos apropriadas podem ser também determinadas por meio de exame de experiências com outros anticorpos monoclonais terapêuticos já desenvolvidos. Demonstrou-se que diversos anticorpos monoclonais são eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab), Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumomab), Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym e formulações similares, que podem ser utilizadas com os anticorpos. Anticorpos monoclonais podem ser fornecidos, por exemplo, em concentração de 10 mg/ml em ampolas descartáveis de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml), formuladas para administração IV em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de di-hidrato citrato de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e água estéril para injeção. O pH é ajustado em 6,5. Em outra realização, o anticorpo é fornecido em formulação que compreende cerca de 20 mM de citrato de Na, cerca de 150 mM de NaCl, sob pH de cerca de 6,0.

DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DOENÇAS

[00193] São também fornecidos métodos de tratamento de indivíduos, notadamente indivíduos humanos, utilizando um agente anti-CD39 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme descrito no presente na preparação de uma composição farmacêutica para administração a pacientes humanos. Tipicamente, o indivíduo sofre ou encontra-se em risco de sofrer de câncer ou doença infecciosa (por exemplo, infecção viral ou infecção bacteriana). Em uma realização, o indivíduo possui proteína CD39 solúvel (extracelular) detectável em circulação e/ou em amostra de tecido (por exemplo, amostra de tumor ou tecido adjacente a tumor).

[00194] Em um aspecto, é fornecido, por exemplo, um método de restauração ou potencialização da atividade de linfócitos em indivíduos deles necessitados, que compreende a etapa de administração ao mencionado indivíduo de um anticorpo anti-CD39 neutralizante ou fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção. Em uma realização, o método refere-se ao aumento da atividade de linfócitos (por exemplo, células T)

em indivíduos portadores de doenças nas quais o aumento da atividade de linfócitos é benéfico, causado ou caracterizado por imunossupressão, células imunossupressivas ou, por exemplo, adenosina gerada por células T CD4, células T CD8 e células B. Os métodos serão particularmente úteis, por exemplo, para o tratamento de indivíduos portadores de tumor sólido nos quais se suspeita que o microambiente de tumores (e sua produção de adenosina mediada por CD39) pode contribuir para a falta de reconhecimento pelo sistema imunológico (escape imunológico). O ambiente de tumor (tecido de tumor ou tecido adjacente a tumores) pode, por exemplo, ser caracterizado pela presença de células imunes que expressam CD39, tais como células T CD4, células T CD8 e células B.

[00195] Mais especificamente, os métodos e composições são utilizados para o tratamento de uma série de cânceres e outras doenças proliferativas e doenças infecciosas. Como esses métodos operam por meio de redução da adenosina que inibe a atividade anticélulas alvo (por exemplo, antitumores) de linfócitos e, possivelmente, também por meio de aumento de ATP, que pode aumentar a atividade antitumores de linfócitos, eles são aplicáveis a uma faixa muito ampla de cânceres e doenças infecciosas. Em uma realização, as composições anti-CD39 são úteis para o tratamento de câncer em indivíduos que reagem mal (ou não são sensíveis) ao tratamento com um agente que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano, por exemplo, que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1. Exemplos representativos de cânceres que podem ser tratados incluem particularmente tumores sólidos nos quais adenosina no microambiente do tumor pode desempenhar forte papel na supressão da reação imunológica antitumores. Em uma realização, pacientes humanos tratados com anticorpo anti-CD39 são portadores de câncer do fígado, câncer dos ossos, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou do pescoço, incluindo carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço (HNSCC), câncer de mama, câncer do pulmão, câncer do pulmão não de células pequenas (NSCLC), câncer da próstata resistente à castração (CRPC), melanoma, câncer do útero, câncer do cólon, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer dos testículos, câncer do útero, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, linfoma não de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, angiogênese de tumores, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer das células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo os induzidos por amianto, malignidades hematológicas, incluindo, por exemplo, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin/linfoma de células B mediastinais primário, linfomas não de Hodgkin, linfoma mieloide agudo, leucemia mielógena crônica, leucemia linfoide crônica, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, linfoma das células grandes imunoblástico, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma das células manto, leucemia linfoblástica aguda, micose fungoide, linfoma de células grandes anaplástico, linfoma de células T, linfoma linfoblástico T precursor e quaisquer combinações dos mencionados cânceres.

A presente invenção também se aplica ao tratamento de cânceres metastáticos. Os pacientes podem ser testados ou selecionados para determinar um ou mais dos atributos clínicos descritos acima antes, durante ou após o tratamento.

[00196] Em uma realização, o anticorpo anti-CD39 ou fragmento de anticorpo é utilizado no tratamento de câncer caracterizado detectável e/ou níveis elevados de proteína CD39 solúvel (extracelular), por exemplo, em circulação e/ou em tecidos, tal como em tumor ou tecido adjacente a tumor.

[00197] Em uma realização, o anticorpo anti-CD39 ou fragmento de anticorpo é utilizado no tratamento de câncer caracterizado por células malignas que expressam CD39.

[00198] Em uma realização, o anticorpo anti-CD39 ou fragmento de anticorpo é administrado em quantidade eficaz para atingir e/ou manter em um indivíduo (por exemplo, por 1, 2, 3 ou 4 semanas e/ou até a administração subsequente de composto de ligação de antígenos) concentração no sangue pelo menos de EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para neutralização da atividade enzimática de CD39, opcionalmente sCD39, opcionalmente memCD39. Em uma realização, a quantidade ativa de anticorpo anti-CD39 é quantidade eficaz para atingir EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para neutralização da atividade enzimática de CD39, opcionalmente sCD39, opcionalmente memCD39, no tecido extravascular de um indivíduo. Em uma realização, a quantidade ativa de anticorpo anti-CD39 é quantidade eficaz para atingir (ou manter) em um indivíduo EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para inibição da neutralização da atividade enzimática de CD39, opcionalmente sCD39, opcionalmente memCD39.

[00199] Opcionalmente, em uma realização, ao contrário de alguns anticorpos que são dirigidos ao esgotamento de células de tumores que expressam CD39 por ADCC (que pode, por exemplo, fornecer eficácia total sob concentrações iguais ou substancialmente inferiores àquela que fornece saturação de receptores), o anticorpo anti-CD39 não exibe atividade mediada por receptor de Fcγ substancial e é administrado em quantidade eficaz para neutralizar a atividade enzimática de CD39 opcionalmente adicional, substancialmente sem causar modulação da expressão de CD39, por período de tempo desejado, tal como uma semana, duas semanas, um mês ou até a administração sucessiva seguinte de anticorpo anti-CD39.

[00200] Em uma realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CD39 é administrado em quantidade eficaz para atingir e/ou manter (por exemplo, por 1, 2, 3 ou 4 semanas e/ou até a administração subsequente de anticorpo anti-CD39) em indivíduos concentração no sangue pelo menos de EC50, opcionalmente EC70, opcionalmente substancialmente EC100, para inibição de catabolismo mediado por CD39 de ATP em AMP (por exemplo, determinando a neutralização da atividade de ATPase de sCD39; ou determinando a neutralização da atividade de ATPase de proteína CD39 (extracelular) solúvel, conforme Exemplos, Métodos).

[00201] Em uma realização, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos, em que o método compreende a administração a um indivíduo portador de doença de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CD39 em quantidade que atinge ou mantém, por período de tempo especificado, concentração em circulação, opcionalmente em um tecido extravascular de interesse (por exemplo, o tumor ou ambiente de tumor), que é mais alta que a concentração necessária para saturação de receptor de 50%, 70% ou total (por exemplo, 90%) de células que expressam CD39 em circulação (por exemplo, conforme determinado em PBMC). Opcionalmente, a concentração atingida é pelo menos 20%, 50% ou 100% mais alta que a concentração necessária para a saturação de receptor especificada.

[00202] Em uma realização, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos, em que o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CD39 em quantidade que atinge ou mantém, por período de tempo especificado, concentração em circulação, opcionalmente em tecido extravascular de interesse (por exemplo, o tumor ou ambiente de tumor), que é mais alta que EC50, opcionalmente EC70 ou opcionalmente EC100 para ligação a células que expressam CD39 (por exemplo, conforme determinado por meio de citometria de fluxo, titulação de anticorpo anti-CD39 sobre células que expressam CD39, tais como células de Ramos como em Exemplos, Métodos).

Opcionalmente, a concentração atingida é pelo menos 20%, 50% ou 100% mais alta que EC50, opcionalmente EC70 ou opcionalmente EC100, para ligação a células que expressam CD39.

[00203] EC50, EC70 ou EC100 pode ser determinada, por exemplo, em um teste celular para neutralização da atividade enzimática de CD39 conforme exibido nos Exemplos do presente, tal como a neutralização da atividade de ATPases em células B por meio de quantificação da hidrólise de ATP em AMP (ou ATP para adenosina abaixo no fluxo); vide Exemplos, Métodos. “EC50”, com relação à neutralização da atividade enzimática de CD39, designa a concentração eficiente de anticorpo anti-CD39 que produz 50% da sua reação máxima ou efeito com relação à neutralização da atividade enzimática. “EC70”, com relação à neutralização da atividade enzimática de CD39, designa a concentração eficiente de anticorpo anti-CD39 que produz 70% do seu efeito ou reação máxima. “EC100”, com relação à neutralização da atividade enzimática de CD39, designa a concentração eficiente de anticorpo anti-CD39 que produz seu efeito ou reação substancialmente máxima com relação a essa neutralização da atividade enzimática.

[00204] Em algumas realizações, particularmente para o tratamento de tumores sólidos, a concentração atingida é projetada para gerar concentração em tecidos (fora da vasculatura, por exemplo, no tumor ou ambiente de tumor) correspondente a pelo menos EC 50 ou EC70 para neutralização da atividade enzimática, opcionalmente cerca de, ou pelo menos cerca de EC100.

[00205] Em uma realização, a quantidade de anticorpo anti- CD39 é de 1 a 20 mg/kg de peso do corpo. Em uma realização, a quantidade é administrada a indivíduos semanalmente, a cada duas semanas, mensalmente ou a cada dois meses.

[00206] Uma realização fornecida é um método de tratamento de indivíduos humanos portadores de câncer, que compreende a administração ao indivíduo de quantidade eficaz de anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção para pelo menos um ciclo de administração (opcionalmente pelo menos dois, três, quatro ou mais ciclos de administração), em que o ciclo é um período de oito semanas ou menos, em que, para cada um dos pelo menos um ciclo, uma, duas, três ou quatro doses do anticorpo anti-CD39 são administradas em dose de 1-20 mg/kg de peso do corpo. Em uma realização, o anticorpo anti-CD39 é administrado por meio de infusão intravenosa.

[00207] Protocolos de tratamento apropriados para o tratamento de seres humanos incluem, por exemplo, a administração ao paciente de quantidade descrita no presente de um anticorpo anti-CD39, em que o método compreende pelo menos um ciclo de administração no qual pelo menos uma dose do anticorpo anti-CD39 é administrada. Opcionalmente, são administradas pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 doses do anticorpo anti-CD39.

Em uma realização, o ciclo de administração é de 2 semanas a 8 semanas.

[00208] Em uma realização, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de doenças (por exemplo, câncer, tumor sólido ou tumor hematológico) em indivíduos, em que o método compreende a administração a indivíduos portadores de doenças (por exemplo, câncer, tumor sólido ou tumor hematológico) de anticorpo anti-CD39 que neutraliza a atividade enzimática de CD39 por pelo menos um ciclo de administração, em que o ciclo de administração compreende pelo menos primeira e segunda (e, opcionalmente, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima e/ou oitava ou mais) administração do anticorpo anti-CD39, em que o anticorpo anti-CD39 é administrado em quantidade eficaz para atingir ou manter, entre duas administrações sucessivas, concentração no sangue (soro) de anticorpo anti- CD39 de pelo menos 0,1 µg/ml, opcionalmente pelo menos 0,2 µg/ml, opcionalmente pelo menos 1 µg/ml, opcionalmente pelo menos 2 µg/ml (por exemplo, para tratamento de tumor hematológico), opcionalmente pelo menos cerca de 1 µg/ml, 2 µg/ml, 10 µg/ml ou 20 µg/ml, por exemplo 1-100 µg/ml, 1-50 µg/ml, 1-20 µg/ml ou 1-10 µg/ml (por exemplo, para tratamento de tumor sólido e para tratamento de tumor hematológico). Em uma realização, é mantida concentração no sangue contínua especificada, em que a concentração no sangue não cai substancialmente abaixo da concentração no sangue especificada pela duração do período de tempo especificado (por exemplo, entre duas administrações de anticorpo, número de semanas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas), ou seja, embora a concentração no sangue possa variar durante o período de tempo especificado, a concentração no sangue especificada mantida representa concentração mínima ou de “calha”. Em uma realização, quantidade terapeuticamente ativa de anticorpo anti-CD39 é a quantidade desse anticorpo capaz de fornecer (pelo menos) a concentração EC50, opcionalmente a concentração EC70, opcionalmente a concentração EC100, no sangue e/ou em tecido para neutralização da atividade enzimática de CD39 pelo período de pelo menos cerca de uma semana, cerca de duas semanas ou cerca de um mês após a administração do anticorpo.

[00209] Antes ou durante o curso do tratamento com anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção, a presença ou os níveis de proteína CD39 solúvel (extracelular), células que expressam CD39,

adenosina, ATP, ADP e/ou AMP podem ser determinadas dentro e/ou ao lado do tumor do paciente para determinar se o paciente é adequado para tratamento (por exemplo, para prever se o paciente é propenso a reagir ao tratamento). O aumento da presença ou do dos níveis de CD39 (extracelular) solúvel, células que expressam CD39, níveis de adenosina, ATP, ADP e/ou AMP pode indicar que um indivíduo é apropriado para tratamento com (por exemplo, propenso a beneficiar-se de) um anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção (incluindo, mas sem limitações, um anticorpo que inibe CD39 ligado a substrato).

[00210] Antes ou durante o curso de tratamento com um anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção, os níveis de adenosina, ADP e/ou AMP podem opcionalmente ser também determinados dentro e/ou ao lado de um tumor de paciente para determinar se o paciente está se beneficiando do tratamento com anticorpo anti-CD39. Níveis reduzidos de adenosina, ATP, ADP e/ou AMP comparados após a administração (ou dosagem de anticorpo) em comparação com os níveis antes do tratamento (ou dosagem de anticorpo) podem indicar que um indivíduo está se beneficiando do tratamento com anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção (incluindo, mas sem limitações, anticorpos que inibem CD39 ligado a substrato). Opcionalmente, caso um paciente esteja se beneficiando do tratamento com o anticorpo anti-CD39, os métodos podem compreender adicionalmente a administração de doses adicionais do anticorpo anti-CD39 ao paciente (por exemplo, tratamento contínuo).

[00211] Em uma realização, na determinação dos níveis de adenosina, ADP e/ou AMP dentro e/ou ao lado do tumor de um paciente, a amostra de tecido compreende a obtenção do paciente de uma amostra biológica de tecido humano selecionado a partir do grupo que consiste de tecido de um paciente com câncer, tal como tecido de câncer, tecido próximo ou na periferia do câncer, tecido adjacente a câncer, tecido não tumoroso adjacente ou tecido adjacente normal e detecção dos níveis de adenosina, ATP, ADP e/ou AMP dentro do tecido. Os níveis do paciente podem ser comparados com o nível até um nível de referência, por exemplo, correspondente a indivíduos saudáveis.

[00212] Em uma realização, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos dele necessitados, em que o método compreende: a. detecção de proteína CD39 (extracelular) solúvel e/ou células que expressam CD39 em circulação ou no ambiente de tumor, opcionalmente no interior do tumor e/ou tecido adjacente; e b. mediante a determinação de que proteína CD39 (extracelular) solúvel e/ou células que expressam CD39 são compreendidas na circulação ou no ambiente de tumor, opcionalmente em nível mais alto em comparação com nível de referência (por exemplo, o nível observado em tecidos saudáveis; opcionalmente, nível correspondente a um indivíduo saudável ou indivíduo que não obtém benefício substancial de um anticorpo anti-CD39), administração ao indivíduo de anticorpo anti-CD39. As células que expressam CD39 podem compreender células de tumores ou leucócitos, tais como células infiltradas em tumores ou em circulação, tais como células T CD4, células T CD8, células TReg e células B.

[00213] Em uma realização, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos dele necessitados, em que o método compreende: a. determinação se o indivíduo possui CD39 (extracelular) solúvel detectável, opcionalmente em circulação, opcionalmente no interior do tumor e/ou tecido adjacente; e b. mediante detecção de CD39 (extracelular) solúvel,

opcionalmente em nível mais alto em comparação com nível de referência (por exemplo, correspondente a um indivíduo saudável ou indivíduo que não obtém benefício substancial de um anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção), administração ao indivíduo de anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção.

[00214] Opcionalmente, em qualquer dos métodos, detecção de proteína CD39 solúvel e/ou células que expressam CD39 (ou adenosina, ATP, ADP e/ou AMP) dentro do ambiente de tumor compreende a obtenção do indivíduo de uma amostra biológica que compreende tecido de câncer e/ou tecido próximo ou na periferia de câncer (por exemplo, tecido adjacente a câncer, tecido não tumoroso adjacente ou tecido adjacente normal) e detecção dos níveis de proteína sCD39 e células que expressam CD39 (ou adenosina, ATP, ADP e/ou AMP). Células que expressam CD39 podem compreender, por exemplo, células de tumores, células T CD4, células T CD8, células TReg e células B.

[00215] Um indivíduo portador de câncer pode ser tratado com o anticorpo anti-CD39 com ou sem uma etapa de detecção anterior para determinar a presença de sCD39 e/ou a expressão de CD39 sobre células em circulação ou sobre células no microambiente de tumores (por exemplo, sobre células de tumores, células T CD4, células T CD8, células TReg e células B).

Opcionalmente, o método de tratamento pode compreender uma etapa de detecção de ácido nucleico CD39 ou polipeptídeo em amostra biológica de sangue ou de tumor de indivíduos (por exemplo, em tecido de câncer, tecido próximo ou na periferia de câncer, tecido adjacente a câncer, tecido não tumoroso adjacente ou tecido adjacente normal). A determinação de que uma amostra biológica compreende células que expressam CD39 (por exemplo, que se expressam proeminentemente; que expressam CD39 em alto nível, alta intensidade de manchas com um anticorpo anti-CD39, em comparação com uma referência, tal como tecido saudável) indica que o paciente é portador de câncer que pode apresentar forte benefício do tratamento com um agente que inibe CD39. Em uma realização, o método compreende a determinação do nível de expressão de polipeptídeo ou ácido nucleico CD39 em amostras biológicas e comparação do nível com um nível de referência correspondente a um indivíduo saudável (por exemplo, tecido saudável). A determinação de que uma amostra biológica compreende proteína sCD39 e/ou células que expressam ácido nucleico CD39 ou polipeptídeo em nível que é mais alto em comparação com o nível de referência indica que o paciente é portador de câncer que pode ser convenientemente tratado com um anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção de polipeptídeo CD39 em uma amostra biológica compreende a detecção de proteína CD39 extracelular solúvel. Em uma realização, a detecção de polipeptídeo CD39 em amostras biológicas compreende a detecção de polipeptídeo CD39 expresso sobre a superfície de células malignas, células T CD4, células T CD8, células TReg e células B. Em uma realização, a determinação de que uma amostra biológica compreende células que expressam proeminentemente polipeptídeo ou ácido nucleico CD39 indica que o paciente é portador de câncer que pode ser convenientemente tratado com um anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção.

“Proeminentemente expresso”, com referência a um polipeptídeo CD39, indica que o polipeptídeo CD39 é expresso em quantidade substancial de células retiradas de um dado paciente. Embora a definição da expressão “proeminentemente expresso” não seja ligada por um valor percentual preciso, em alguns exemplos, afirma-se que um receptor considerado “proeminentemente expresso” estará presente em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais das células de tumores retiradas do paciente.

[00216] A determinação se um indivíduo é portador de câncer caracterizado por células que expressam um polipeptídeo CD39 pode compreender, por exemplo, a obtenção de amostra biológica (por exemplo, realizando biópsia) do indivíduo que compreende células do ambiente de câncer (por exemplo, tumor ou tecido adjacente a tumor), colocação das mencionadas células em contato com um anticorpo que liga um polipeptídeo CD39 e detecção da expressão ou não de CD39 pelas células sobre a sua superfície. Opcionalmente, a determinação se um indivíduo possui células que expressam CD39 compreende a condução de teste imuno-histoquímico.

[00217] Em uma realização, os anticorpos anti-CD39 descritos no presente podem ser utilizados convenientemente para tratar câncer positivo para CD73. A expressão de CD73 foi relatada em uma série de células de tumores, que inclui, entre outros, leucemia, câncer da bexiga, glioma, glioblastoma, câncer do ovário, melanoma, câncer da próstata, câncer da tireoide, câncer do esôfago e câncer de mama. A expressão de CD73 também foi associada a um fenótipo pró-metastático em melanoma e câncer de mama.

[00218] Consequentemente, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer ou doença infecciosa em indivíduos portadores de câncer positivo para CD73, em que o método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti- CD39 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer positivo para CD73 em indivíduos, em que o método compreende: administração ao indivíduo de um anticorpo de acordo com a presente invenção que liga e inibe a atividade de proteína CD39 humana solúvel. Em uma realização, o câncer positivo para CD73 é um câncer conhecido por ser geralmente caracterizado pela presença de células que expressam CD73 no tumor ou ambiente de tumor.

[00219] Um paciente portador de câncer pode ser tratado com o anticorpo anti-CD39 com ou sem uma etapa de detecção prévia para determinar a expressão de CD73 sobre células no microambiente de tumor (por exemplo, sobre célula de tumores, células T CD4, células T CD8 ou células B).

Opcionalmente, os métodos de tratamento podem compreender uma etapa de detecção de ácido nucleico CD73 ou polipeptídeo em amostras biológicas de tumores de indivíduos (por exemplo, em tecido de câncer, tecido próximo ou na periferia do câncer, tecido adjacente a câncer, tecido não tumoroso adjacente ou tecido adjacente normal). Determinação de que uma amostra biológica compreende células que expressam CD73 (por exemplo, que expressam proeminentemente; que expressam CD73 em alto nível, alta intensidade de manchas com um anticorpo anti-CD73, em comparação com referência, tal como tecido saudável) indica que o paciente é portador de câncer que pode receber forte benefício do tratamento com um agente que inibe sCD39 (ainda opcionalmente, em combinação com um agente que inibe CD73). Em uma realização, o método compreende a determinação do nível de expressão de um ácido nucleico CD73 ou polipeptídeo em amostras biológicas e comparação do nível com um nível de referência correspondente a um indivíduo saudável, por exemplo (tal como tecido saudável). Determinação de que uma amostra biológica compreende células que expressam ácido nucleico CD73 ou polipeptídeo em nível mais alto que o nível de referência indica que o paciente é portador de câncer que pode ser tratado com um anticorpo anti-CD39.

Opcionalmente, a detecção de polipeptídeo CD73 em uma amostra biológica compreende a detecção de polipeptídeo CD73 expresso sobre a superfície de células malignas, célula T CD4, célula T CD8 ou célula B. Em uma realização, determinação de que uma amostra biológica compreende células que expressam ácido nucleico CD73 ou polipeptídeo indica que os pacientes são portadores de câncer que pode receber benefício específico do tratamento com um anticorpo anti-CD39. Polipeptídeo CD73 pode, por exemplo, ser expresso em uma quantidade substancial de células retiradas de um dado paciente; CD73, por exemplo, pode ser detectado sobre pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais das células de tumores retiradas do paciente.

[00220] A determinação se o indivíduo é portador de câncer caracterizado por células que expressam um polipeptídeo CD73 pode, por exemplo, compreender a obtenção de uma amostra biológica (por exemplo, realizando biópsia) do indivíduo que compreende células do ambiente de câncer (por exemplo, tumor ou tecido adjacente a tumor), colocação das mencionadas células em contato com um anticorpo que liga um polipeptídeo CD73 e detecção se as células expressam CD73 sobre a sua superfície.

Opcionalmente, a determinação ou detecção se o indivíduo possui células que expressam CD73 compreende a condução de testes imuno-histoquímicos.

[00221] Em uma realização, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos dele necessitados, em que o método compreende: a. detecção de células que expressam CD73 no ambiente de tumor, opcionalmente dentro do tumor e/ou em tecido adjacente; e b. mediante determinação de que o ambiente de tumor compreende células que expressam CD73, opcionalmente em nível mais alto em comparação com nível de referência (por exemplo, o nível observado em tecido saudável), administração ao indivíduo de um anticorpo de acordo com a presente invenção que ligue e iniba a atividade de proteína CD39 humana solúvel. Opcionalmente, a detecção de células que expressam CD73 dentro do ambiente de tumor compreende a obtenção do indivíduo de uma amostra biológica que compreende tecido de câncer e/ou tecido próximo ou na periferia de câncer (por exemplo, tecido adjacente a câncer, tecido não tumoroso adjacente ou tecido adjacente normal) e detecção dos níveis de células que expressam CD73 (por exemplo, por meio da condução de testes imuno- histoquímicos). Células que expressam CD73 podem compreender, por exemplo, células de tumor, células T CD4, células T CD8 e células B.

[00222] As composições de anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas como monoterapia ou tratamentos combinados com um ou mais agentes terapêuticos diferentes, incluindo agentes normalmente utilizados para o propósito terapêutico específico para o qual o anticorpo está sendo administrado. O agente terapêutico adicional será normalmente administrado em quantidades e regimes de tratamento tipicamente utilizados para aquele agente em monoterapia para a doença específica ou condição sendo tratada.

[00223] Em uma realização, as composições de anticorpo anti-CD39 de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em tratamentos combinados com um agente quimioterapêutico capaz de causar liberação extracelular de ATP de células de tumores.

[00224] Em uma realização, os anticorpos neutralizantes anti-CD39 não apresentam ligação a CD16 humano, mas potencializam a atividade de células efetoras que expressam CD16 (por exemplo, células T efetoras ou NK). Consequentemente, em uma realização, o segundo agente terapêutico ou adicional é um anticorpo ou outra proteína que contém domínio Fc capaz de induzir ADCC em direção a uma célula à qual é ligado, tal como por meio de CD16 expresso por uma célula NK. Tipicamente, esse segundo agente anticorpo ou outra proteína compreenderá um domínio que se liga a um antígeno de interesse, tal como um antígeno presente sobre uma célula de tumor (antígeno de tumor) e um domínio Fc ou uma de suas partes, e exibirá ligação ao antígeno por meio do domínio de ligação de antígenos e a receptores de Fcγ (por exemplo, CD16) por meio do domínio Fc. Em uma realização, a sua atividade de ADCC será mediada, ao menos em parte, por CD16. Em uma realização, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que possui domínio Fc humano nativo ou modificado, tal como domínio Fc de um anticorpo IgG1 ou IgG3 humano. A expressão “citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” ou “ADCC” é bem compreendida na técnica e designa reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e, em seguida, causam lise da célula alvo. Células citotóxicas não específicas que mediam ADCC incluem células matadoras naturais (NK), macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A expressão “anticorpo indutor de ADCC” designa um anticorpo que demonstra ADCC conforme medido por meio de teste(s) conhecido(s) pelos técnicos no assunto.

Essa atividade é tipicamente caracterizada pela ligação da região Fc com vários FcRs. Sem limitações a nenhum mecanismo específico, os técnicos no assunto reconhecerão que a capacidade de um anticorpo de demonstrar ADCC pode dever-se, por exemplo, à sua subclasse (tal como IgG1 ou IgG3), por meio de mutações introduzidas na região Fc ou em virtude de modificações dos padrões de carboidratos na região Fc do anticorpo. Exemplos de anticorpos que induzem ADCC incluem rituximab (para o tratamento de linfomas, CLL, trastuzumab (para o tratamento de câncer de mama), alentuzumab (para o tratamento de leucemia linfocítica crônica) e cetuximab (para o tratamento de câncer colorretal e carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço). Exemplos de anticorpos amplificados por ADCC incluem, mas sem limitações: GA-101 (anti-CD20 hipofucosilado), margetuximab (anti-HER2 aprimorado por Fc), mepolizumab, MEDI-551 (anti-CD19 elaborado com Fc), obinutuzumab (anti-CD20 glicoelaborado/hipofucosilado), ocaratuzumab (anti- CD20 elaborado com Fc) e XmAb® 5574/MOR208 (anti-CD19 elaborado com

Fc).

[00225] Em uma realização, os anticorpos neutralizantes anti-CD39 aumentam a eficácia de agentes que neutralizam a atividade inibidora de PD-1 humano, por exemplo, que inibem a interação entre PD-1 e PD-L1, notadamente em indivíduos que reagem mal (ou não são sensíveis) a tratamento com agente que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano.

Consequentemente, em uma realização, o segundo agente terapêutico ou adicional é um anticorpo ou outro agente que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano.

[00226] Morte Programada 1 (PD-1) (também denominada “Morte Celular Programada 1”) é um membro inibidor da família de receptores CD28. A sequência PD-1 humana completa pode ser encontrada sob número de Acesso GenBank U64863. A inibição ou neutralização da atividade inibidora de PD-1 pode envolver o uso de um agente de polipeptídeo (por exemplo, anticorpo, polipeptídeo fundido a um domínio Fc, imunoadesina etc.) que evita a sinalização de PD-1 induzida por PD-L1. Existem atualmente seis agentes que bloqueiam o processo de PD-1/PD-L1 que são comercializados ou encontram-se em avaliação clínica. Um agente é BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; anteriormente MDX-1106).

Nivolumab (nome comercial Opdivo®) é um mAb anti-PD-L1 IgG4 totalmente humano aprovado pela FDA que inibe a ligação do ligante PD-L1 a PD-1 e CD80 e é descrito como anticorpo 5C4 em WO 2006/121168, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Para pacientes com melanoma, o OR mais significativo foi observado em dose de 3 mg/kg, enquanto, para outros tipos de câncer, foi de 10 mg/kg. Nivolumab é geralmente dosado a 10 mg/kg a cada três semanas até a progressão do câncer. As expressões “reduz a atividade inibidora de PD-1 humano”, “neutraliza PD-1” ou “neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano”

designam um processo no qual PD-1 é inibido na sua capacidade de transdução de sinal resultante da interação de PD-1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 ou PD-L2. Agentes que neutralizam a atividade inibidora de PD-1 reduzem, bloqueiam, inibem, eliminam ou interferem com a transdução de sinal resultante da interação de PD-1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 e PD-L2. Esse agente pode, portanto, reduzir o sinal coestimulante negativo mediado por ou por meio de proteínas da superfície celular expressas sobre linfócitos T, de forma a ampliar as funções efetoras de células T, tais como proliferação, produção de citoquinas e/ou citotoxicidade.

[00227] MK-3475 (mAb anti-PD1 de IgG4 humano da Merck), também denominado lambrolizumab ou pembrolizumab (nome comercial Keytruda®), foi aprovado pela FDA para o tratamento de melanoma e está sendo testado em outros cânceres. Pembrolizumab foi testado a 2 mg/kg ou 10 mg/kg a cada duas ou três semanas até a progressão da doença. MK- 3475, também conhecido como Merck 3745 ou SCH-900475, também é descrito em WO 2009/114335.

[00228] MPDL3280A/RG7446 (atezolizumab, nome comercial Tecentriq®, anti-PD-L1 da Roche/Genentech) é um mAb anti-PD-L1 humano que contém domínio Fc elaborado projetado para otimizar a eficácia e a segurança minimizando a ligação de FcγR e consequente citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Doses de ≤1, 10, 15 e 25 mg/kg de MPDL3280A foram administradas a cada três semanas por até um ano. No teste de fase 3, MPDL3280A é administrado a 1200 mg por meio de infusão intravenosa a cada três semanas em NSCLC.

[00229] AMP-224 (Amplimmune e GSK) é uma imunoadesina que compreende um domínio extracelular de PD-L2 fundido a um domínio Fc. Outros exemplos de agentes que neutralizam PD-1 podem incluir um anticorpo que liga PD-L2 (anticorpo anti-PD-L2) e bloqueia a interação entre PD-1 e PD-L2.

[00230] Pidlizumab (CT-011; CureTech) (mAb anti-PD1 de IgG1 humanizado da CureTech/Teva), Pidlizumab (CT-011; CureTech) (vide, por exemplo, WO 2009/101611) é outro exemplo; o agente foi testado em trinta pacientes com FL reincidente sensível a rituximab tratados com 3 mg/kg de CT- 011 intravenoso a cada quatro semanas por quatro infusões em combinação com rituximab dosado a 375 mg/m2 semanalmente por quatro semanas, a partir de duas semanas após a primeira infusão de CT-011.

[00231] Anticorpos PD-1 conhecidos adicionais e outros inibidores de PD-1 incluem AMP-224 (proteína de fusão B7-DC/IgG1 licenciada para GSK), AMP-514 descrito em WO 2012/145493, anticorpo MEDI-4736 (durvalumab, nome comercial Imfinzi®, anti-PD-L1 desenvolvido pela AstraZeneca/Medimmune) descrito em WO 2011/066389 e US 2013/034559, anticorpo YW243.55.S70 (anti-PD-L1) descrito em WO 2010/077634, MDX-1105, também conhecido como BMS-936559, é um anticorpo anti-PD-L1 desenvolvido pela Bristol-Myers Squibb descrito em WO 2007/005874 e anticorpos e inibidores descritos em WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 e WO 2013/019906, cujos relatórios descritivos são incorporados ao presente como referência. Exemplos adicionais de anticorpos anti-PD1 são descritos em WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), tais como anticorpos que possuem domínio variável de cadeia leve CDR1, 2 e 3 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 e/ou SEQ ID Nº 8, respectivamente, e um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo CDR1, 2 e 3 de SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5, respectivamente, em que as referências de SEQ ID N° são a numeração de acordo com WO 2015/085847, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Anticorpos que concorrem com quaisquer desses anticorpos pela ligação a PD-1 ou PD-L1 também podem ser utilizados.

[00232] Em algumas realizações, o agente neutralizante de PD- 1 é um mAb anti-PD-L1 que inibe a ligação de PD-L1 a PD-1. Em algumas realizações, o agente neutralizante de PD-1 é um mAb anti-PD1 que inibe a ligação de PD-1 a PD-L1. Em algumas realizações, o agente neutralizante de PD-1 é imunoadesina (por exemplo, imunoadesina que compreende uma parte de ligação de PD-1 ou extracelular de PD-L1 ou PD-L2 fundida a uma região constante (por exemplo, região Fc de sequência de imunoglobulina).

[00233] Nos métodos de tratamento, o anticorpo anti-CD39 e o segundo agente terapêutico podem ser administrados separadamente, em conjunto, sequencialmente ou em coquetel. Em algumas realizações, o composto de ligação de antígenos é administrado antes da administração do segundo agente terapêutico. O anticorpo anti-CD39 pode ser administrado, por exemplo, cerca de 0 a 30 dias antes da administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, o anticorpo anti-CD39 é administrado em cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de uma semana, cerca de uma hora a cerca de 2 horas, cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, cerca de 8 horas a um dia ou cerca de 1 a 5 dias antes da administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, um anticorpo anti-CD39 é administrado simultaneamente com a administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, um anticorpo anti-CD39 é administrado após a administração do segundo agente terapêutico. O anticorpo anti-CD39 pode ser administrado, por exemplo, cerca de 0 a 30 dias após a administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, o anticorpo anti-CD39 é administrado em cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de uma semana, cerca de uma hora a cerca de 2 horas, cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, cerca de 8 horas a um dia ou cerca de 1 a 5 dias antes da administração do segundo agente terapêutico.

EXEMPLOS

MÉTODOS GERAÇÃO DE MUTANTES DE CD39

[00234] Mutantes de CD39 foram gerados por meio de PCR.

As sequências amplificadas foram conduzidas sobre gel de agarose e purificadas utilizando o Kit de Extração de Gel Macherey Nagel PCR Clean-Up (referência 740609). Os produtos de PCR purificados gerados para cada mutante foram ligados em seguida a um vetor de expressão, com o sistema ClonTech InFusion. Os vetores que contêm as sequências que sofreram mutação foram preparados na forma de Miniprep e sequenciados. Após o sequenciamento, os vetores que contêm as sequências que sofreram mutação foram preparados na forma de Midiprep utilizando o Sistema Midiprep de Plasmídeos Promega PureYield®. Células HEK293T foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen), transfectadas com vetores utilizando Lipofectamina 2000 da Invitrogen e incubadas a 37 °C em um incubador de CO2 por 48 horas antes do teste da expressão de transgene. Mutantes foram transfectados em células Hek-293T, conforme exibido na tabela abaixo. As mutações de aminoácidos dirigidas da Tabela 1 abaixo são exibidas utilizando numeração de SEQ ID N° 1.

TABELA 1 Mutante Substituições 1 V77G H79Q Q444K G445D 2A V81S E82A R111A V115A 2B E110A R113T E114A 3 R118A S119A Q120K Q122H E123A 4 D150A E153S R154A S157K N158A L278F 5 Q96A N99A E143A R147E 6 K188R Substituição dos resíduos 190 a 207 por KTPGGS 7 A273S N275A I277S R279A 8 S294A K298G K303A E306A T308K Q312A 9 K288E K289A V290A E315R 10A Q354A D356S E435A H436Q 10B H428A T430A A431D D432A

Mutante Substituições Inserção 11 N371K L372K E375A K376G V377S 377V 12 K388N Q392K P393S E396A 13 A402P G403A K405A E406A 15 K87A E100A D107A 16 Q323A Q324A Q327A E331K 17 N334A S336A Y337G N346A 18 Q228A I230S D234A Q238A 19 R138A M139A E142K CLONAGEM, PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE HUCD39 SOLÚVEL

BIOLOGIA MOLECULAR

[00235] A proteína huCD39 foi clonada de cDNA de PBMC humano utilizando os primers a seguir: TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC (SEQ ID N° 41) (frontal) e

CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCGA CATAGGTGGAGTGGGAGAG (SEQ ID N° 42) (reverso). O produto de PCR purificado foi clonado em seguida em um vetor de expressão, utilizando o sistema de clonagem InFusion. Adicionou-se marca M2 (marca FLAG, sublinhada em SEQ ID N° 44) na parte C-terminal da proteína para a etapa de purificação; apreciar-se-á que uma proteína de domínio extracelular de CD39 (por exemplo, de SEQ ID N° 44) pode, em qualquer realização, ser opcionalmente especificada para não dispor da marca M2.

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS HUCD39

[00236] Após a validação da sequência clonada, as células de CHO foram nucleofectadas e o conjunto de produção foi subclonado em seguida para obter um clone celular produtor da proteína huCD39. O sobrenadante do clone huCD39 cultivado no rolo foi colhido e purificado utilizando coluna de cromatografia M2 e eluído utilizando o peptídeo M2. As proteínas purificadas foram carregadas em seguida sobre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanhos S200. A proteína purificada correspondente a um monômero foi formulada em um tampão de TBS com pH 7,5. A sequência de aminoácidos da proteína recombinante do domínio extracelular CD39-M2 sem marca M2 foi a seguinte:

MEDTKESNVKTFCSKNILAILGFSSIIAVIALLAVGLTQNKALPENVKYGIVLDAG SSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCM ERAREVIPRSQHQETPVYLGATAGMRLLRMESEELADRVLDVVERSLSNYPF DFQGARIITGQEEGAYGWITINYLLGKFSQKTRWFSIVPYETNNQETFGALDLG GASTQVTFVPQNQTIESPDNALQFRLYGKDYNVYTHSFLCYGKDQALWQKLA KDIQVASNEILRDPCFHPGYKKVVNVSDLYKTPCTKRFEMTLPFQQFEIQGIGN YQQCHQSILELFNTSYCPYSQCAFNGIFLPPLQGDFGAFSAFYFVMKFLNLTS EKVSQEKVTEMMKKFCAQPWEEIKTSYAGVKEKYLSEYCFSGTYILSLLLQGY

HFTADSWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHSTYV (SEQ ID N° 43).

[00237] A sequência de aminoácidos final da proteína recombinante do domínio extracelular CD39-M2 sem a marca M2 foi a seguinte:

HFTADSWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHSTYVDY KDDDDK (SEQ ID N° 44).

INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE CD39 SOLÚVEL

[00238] A inibição por anticorpos da atividade enzimática de proteína CD39 solúvel produzida foi avaliada utilizando Cell Titer Glo® (Promega, referência G7571) que permite a determinação de hidrólise de ATP utilizando reagente que gera sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. Desta forma, pode-se determinar a inibição da hidrólise de ATP mediada por CD39 solúvel. Resumidamente, faixas de dosagem de anticorpos anti-CD39 de 100 µg/ml a 6x10-3 µg/ml foram incubadas com 400 ng/ml de proteína CD39 humana recombinante solúvel que possui a sequência de aminoácidos descrita no capítulo Métodos (SEQ ID N° 44), por uma hora a 37 °C. 20 µM de ATP foram adicionados às placas por trinta minutos adicionais a 37 °C antes da adição de reagente CTG (Cell Titer Glo). A luz emitida foi quantificada utilizando-se um luminômetro Enspire® após curto período de incubação de cinco minutos no escuro. A eficácia do anticorpo anti-CD39 foi determinada por meio de comparação da luz emitida na presença de anticorpo com ATP isoladamente (emissão de luz máxima) e ATP em conjunto com proteína CD39 solúvel (emissão de luz mínima).

INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE CD39 CELULAR

[00239] A inibição da atividade enzimática de CD39 em células que expressam CD39 por anticorpos foi avaliada utilizando Cell Titer Glo® (Promega, referência G7571) que permite a determinação de hidrólise de ATP utilizando reagente que gera sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. O teste foi, portanto, projetado para permitir a determinação da inibição de ATP hidrolisado por CD39 no sobrenadante de cultivo celular.

Resumidamente, 5x104 células de linfoma humano de Ramos, 5x103 células de CHO que expressam CD39 humano, CD39 de cynomolgus e CD39 de camundongo foram incubadas por uma hora a 37 °C com anticorpos anti-CD39 de 30 µg/ml a 5x10-4 µg/ml. As células foram incubadas em seguida com 20 µM de ATP por uma hora adicional a 37 °C. As placas foram centrifugadas por dois minutos a 400 g e 50 µl de sobrenadante celular são transferidos para uma microplaca de luminescência (cavidades brancas). Foram adicionados 50 µl de Reagente CellTiter-Glo® (CTG) ao sobrenadante e a luz emitida foi quantificada após incubação por cinco minutos no escuro utilizando um luminômetro Enspire®. A eficácia do anticorpo anti-CD39 foi determinada por meio de comparação da luz emitida na presença de anticorpo com ATP isoladamente (emissão de luz máxima) e ATP em conjunto com células (emissão de luz mínima).

[00240] Geração de anticorpos: imunização e seleção em camundongos.

[00241] Para obter anticorpos anti-CD39 humanos, camundongos Balb/c foram imunizados com a proteína recombinante de domínio extracelular CD39-M2 humana recombinante descrita acima. Camundongos receberam primoimunização com emulsão de 50 µg de proteína CD39 e Adjuvante de Freund Completo, por via intraperitoneal, segunda imunização com emulsão de 50 µg de proteína CD39 e Adjuvante de Freund Incompleto, por via intraperitoneal e, por fim, enriquecimento com 10 µg de proteína CD39, por via intravenosa.

Células do baço imunes foram fundidas três dias após o enriquecimento com células B imortalizadas X63.Ag8.653 e cultivadas na presença de células do baço irradiadas. Hibridomas foram colocados em placas em meio que contém metilcelulose semissólido e clones em crescimento foram tomados utilizando um aparelho Clonepix® 2 (Molecular Devices Corp.).

EXEMPLO 1 MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS DE MABS CD39 NEUTRALIZANTES CONHECIDOS

[00242] A fim de obter conhecimento sobre a forma em que os anticorpos são capazes de inibir a atividade enzimática (ATPase) de CD39 celular, pesquisamos os epítopos ligados por anticorpos que foram relatados como inibindo a atividade de ATPase de CD39 em testes celulares: BY40 descrito na patente PCT n° WO 2009/095478.

[00243] A fim de definir os epítopos de anticorpos anti- CD39, projetamos mutantes CD39 definidos por substituições de aminoácidos expostos na superfície molecular sobre a superfície de CD39. Mutantes foram transfectados em células Hek-293T, conforme exibido na Tabela 1, utilizando numeração de SEQ ID N° 1.

[00244] Faixas de dosagem de I-394 (10 – 2,5 – 0,625 – 0,1563 – 0,0391 – 0,0098 – 0,0024 – 0,0006 µg/ml) são testadas sobre os 20 mutantes gerados por meio de citometria de fluxo. Anticorpos BY40 apresentaram perda completa de ligação a células que expressam o mutante 5 de CD39, sem perda de ligação a nenhum outro mutante. O Mutante 5 contém substituições de aminoácidos nos resíduos Q96, N99, E143 e R147. A posição do Mutante 5 sobre a superfície de CD39 é exibida na Figura 3A.

EXEMPLO 2 MABS CD39 NEUTRALIZANTES CONHECIDOS SÃO INCAPAZES DE INIBIR A ATIVIDADE DE ATPASE DE PROTEÍNA CD39 SOLÚVEL RECOMBINANTE

[00245] Os dois anticorpos que foram relatados por inibirem a atividade de ATPase de CD39 em testes celulares (BY40 e BY12) foram avaliados para determinar se são capazes de inibir a atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel recombinante. A inibição por anticorpos da atividade enzimática de proteína CD39 solúvel produzida conforme descrito acima foi avaliada utilizando Cell Titer Glo® (Promega, referência G7571). A inibição por anticorpos da atividade enzimática de proteína CD39 celular foi avaliada conforme indicado acima.

[00246] Conforme esperado, BY40 inibiu a atividade de ATPase de proteína CD39 em células. BY40 foi, entretanto, incapaz de inibir a atividade enzimática de proteína CD39 solúvel. A Figura 2B exibe comparação de BY40 com os novos anticorpos identificados no presente.

EXEMPLO 3 SELEÇÃO DE MABS NOVOS PARA BLOQUEIO DA ATIVIDADE DE SCD39

[00247] Conduziu-se uma série de imunizações para buscar anticorpos que neutralizam a atividade de ATPase de sCD39. Para obter anticorpos anti-CD39 humanos, animais foram imunizados com a proteína recombinante de domínio extracelular CD39-M2 humana recombinante descrita acima. Ao todo, a série de imunizações incluiu protocolos diferentes e em diferentes animais, incluindo diferentes linhagens de camundongos, ratos e coelhos.

[00248] Em protocolos de imunização iniciais, a seleção primária envolveu o teste de sobrenadante (SN) de clones em crescimento por meio de citometria de fluxo utilizando CHO do tipo selvagem e CHO que expressa linhagens celulares huCD39. Células foram manchadas com 0,1 µM e 0,005 µM de CFSE, respectivamente. Para seleção de citometria de fluxo, todas as células foram misturadas igualmente e a presença de anticorpos de reação em sobrenadantes foi revelada por anticorpo policlonal (pAb) anticamundongos de cabra marcado com APC. Para anticorpos que ligam huCD39, sobrenadantes foram selecionados em seguida pela inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel utilizando o teste de seleção desenvolvido e descrito acima (Métodos).

[00249] Os resultados demonstraram que, embora diversos anticorpos de ligação de CD39 específicos pudessem ser obtidos, nenhum dos anticorpos de nenhuma dessas imunizações exibiu inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel. Uma possibilidade é que epítopos dominantes sobre CD39 não incluem nenhum epítopo adequadamente posicionado naquele local catalítico de CD39 ou perto dele. Em vista dos poucos anticorpos disponíveis que inibem CD39 celular e das dificuldades conhecidas na inibição dos locais catalíticos de enzimas utilizando anticorpos, a ausência de anticorpos que neutralizam sCD39 pode indicar que não é possível obter anticorpos que inibem CD39 solúvel (domínio extracelular). Outras possibilidades referem-se a testes de seleção não funcionais e/ou proteína CD39 solúvel em funcionamento ou inadequadamente dobrada, particularmente porque a falta de qualquer anticorpo que possa inibir CD39 solúvel impede a validação de testes de bloqueio de sCD39.

[00250] Em vista da ausência de anticorpos capazes de inibir CD39 solúvel, conduziu-se imunização adicional com um protocolo de seleção projetado para favorecer a geração de anticorpos que ligam o local ativo de CD39 conforme identificado pelo epítopo de anticorpo BY40.

Resumidamente, a seleção primária envolveu o teste de sobrenadante (SN) de clones em crescimento por meio de citometria de fluxo utilizando CHO do tipo selvagem e CHO que expressa linhagens celulares huCD39, como nas imunizações anteriores, seguido por teste da perda de ligação de células Hek- 293T que expressam mutante 5 de CD39, em comparação com CD39 do tipo selvagem, conforme exibido na Tabela 1. O mutante 5 contém substituições nos resíduos Q96, N99, E143 e R147. Novamente, entretanto, os resultados demonstraram que, embora diversos anticorpos de ligação de CD39 específicos que exibissem perda de ligação ao mutante 5 pudessem ser obtidos, nenhum dos anticorpos de nenhuma das imunizações iniciais exibiu inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel.

EXEMPLO 4 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPO I-394

[00251] Buscamos identificar anticorpos anti-CD39 que não ligam a região Q96, N99, E143 e R147 (definida pelo mutante 5), a fim de ter anticorpos que não concorrem com anticorpos similares a BY40. Esses anticorpos que não necessitam possuir capacidade de bloquear a atividade de

ATPase de CD39 podem ser úteis para estudos farmacológicos de anticorpos que inibem CD39 celular que se liga ao local de ligação BY40, por exemplo, para detectar e quantificar proteínas CD39 livres sobre células na presença de BY40 ou anticorpos similares a BY40 que inibem CD39 celular.

[00252] A partir dos resultados da imunização do Exemplo 3 na qual hibridomas foram selecionados pela perda de ligação a mutante 5 de CD39, foi selecionado um hibridoma que não se encontrava entre aqueles que exibiram perda de ligação a mutante 5 de CD39. Esse hibridoma (I-394) estava entre o conjunto mais amplo devido a dados inconclusivos que indicam possível redução parcial da ligação ao mutante 5, mas não perdeu a ligação ao mutante 5 e, portanto, não foi retido inicialmente.

[00253] No contexto de seleção contínua de sobrenadantes a partir de imunizações adicionais para inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel, o anticorpo I-394 que havia sido clonado e produzido foi incluído como controle. Surpreendentemente, apesar do anticorpo I-394 não estar entre os clones retidos na seleção dirigida a epítopo, esse anticorpo exibiu forte inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel no teste descrito acima (Métodos).

[00254] I-394 foi produzido com regiões constantes humanas de isótipo IgG1 com domínio Fc modificado que possui as mutações L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (numeração EU de Kabat), o que resulta em falta de ligação a receptores Fcγ humanos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e CD64. Resumidamente, as sequências VH e Vk do anticorpo I-394 (as regiões variáveis VH e Vk exibidas em SEQ ID N° 6 e 7, respectivamente) foram clonadas em vetores de expressão que contêm os domínios constantes de huIgG1 que abrigam as mutações mencionadas acima e o domínio constante de huCk, respectivamente. Os dois vetores obtidos foram cotransfectados na linhagem celular de CHO. O conjunto estabelecido de células foi utilizado para produzir o anticorpo no meio CHO. O anticorpo foi purificado em seguida utilizando proteína A. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada correspondentes de I-394 são exibidas abaixo (CDRs de Kabat sublinhadas).

[00255] Sequência de domínio variável de cadeia pesada I- 394:

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHG

RTLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATLTVNTSSRTAYMELRSLTSEDSAAYY CARGGTRFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID N° 6).

[00256] Sequência de domínio variável de cadeia leve I-394:

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGVSFMYWFQQKP

GQPPNLLIYGASNQGSGVPARFRGSGSGTDFSLNIHPMEADDTAMYFCQQT KEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID N° 7).

[00257] Anticorpo I-394 foi testado em seguida para determinar a perda de ligação a mutantes CD39 definidos por substituições de aminoácidos expostos na superfície molecular sobre a superfície de CD39.

Mutantes foram transfectados em células Hek-293T, conforme exibido na Tabela 1, utilizando numeração de SEQ ID N° 1. Faixas de dosagem de anticorpos I-394 foram testadas sobre os 20 mutantes por meio de citometria de fluxo. Conforme exibido na Figura 3B, I-394 exibiu perda completa de ligação a células que expressam mutante 19 de CD39. O mutante 19 inclui substituições nos resíduos R138, M139 e E142. O epítopo central de I-394 inclui, portanto, um ou mais (ou todos os) resíduos R138, M139 e E142.

[00258] Ao contrário do anticorpo anterior BY40, que perde ligação ao mutante 5 e possui a capacidade de inibir CD39 celular, mas não CD39 solúvel, o anticorpo I-394 perde a ligação ao mutante adjacente 19, com ligação muito reduzida ao mutante 5 (mas com alguma ligação residual ao mutante 5). De forma interessante, os resíduos de mutante 19 encontram-se em boa proximidade ou adjacentes aos do resíduo 5, de forma que I-394 pode representar alteração de epítopo em comparação com BY40. O anticorpo I-394 apresenta, portanto, um novo epítopo valioso para anticorpos anti-CD39 que permite inibição da atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel. Ele também fornece um controle positivo específico que permite validação e teste de ensaios de seleção para detectar anticorpos adicionais que neutralizem a atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel.

EXEMPLO 5 SELEÇÃO NÃO DIRIGIDA A EPÍTOPO PARA NEUTRALIZAÇÃO DE MABS POR SCD39

[00259] Com base nos resultados para o Exemplo 4 que indicam que é possível a inibição mediada por anticorpos de CD39 solúvel, fusões das diferentes imunizações que utilizam protocolos diferentes do Exemplo 3 foram revisitadas, a fim de buscar anticorpos que neutralizem a atividade de ATPase de sCD39.

[00260] Foram avaliadas em seguida abordagens diferentes de seleção para inibição de ATPase. Em um experimento, utilizou-se anticorpo I-394 para enriquecer sobrenadantes de hibridomas de uma imunização do Exemplo 3 que foram considerados negativos para a capacidade de inibição da atividade de ATPase de CD39 solúvel. Esta adição de I-394 ao sobrenadante não restaurou a capacidade de sobrenadantes negativos de inibir a atividade de ATPase de CD39. O anticorpo I-394 foi purificado em seguida do sobrenadante negativo utilizando esferas revestidas com Proteína A e observamos que o I-394 purificado foi novamente capaz de inibir a atividade de ATPase e foi restaurado.

[00261] Em vista dos resultados acima, foram desenvolvidos novos protocolos de imunização e seleção, nos quais clones de crescimento de imunizações novas e passadas foram selecionados por meio de citometria de fluxo utilizando CHO do tipo selvagem e CHO que expressa linhagens celulares huCD39 sem determinar a inibição da atividade de ATPase de CD39 solúvel ou CD39 celular, sem orientação de seleção para epítopos. Embora os dados referentes à perda de ligação ao mutante 5 ou 19 fossem disponíveis para alguns hibridomas, esses dados não foram utilizados para seleção de clones, mas apenas retidos para fins de resgate de hibridomas para clonagem no caso de resultados negativos no teste de bloqueio de ATPase. Hibridomas que ligam CD39 foram selecionados, clonados e purificados em seguida utilizando Proteína A de acordo com o protocolo a seguir: - adição a 300 µl de sobrenadante de hibridomas de 10 µl de esferas de proteína A; - adição de NaCl para que fique em concentração final de 1,5 M; - rotação dos tubos por 3-4 horas a 4 °C; - centrifugação por 1 minuto a 1500 rpm; - eliminação do sobrenadante e realização de três lavagens com 1 ml de TBS; - eliminação de todo o TBS após a terceira lavagem; - adição de 50 µl de 0,1 M de citrato, pH 3, homogeneização e incubação à temperatura ambiente por cinco minutos; - centrifugação das esferas por um minuto a 1500 rpm; e - colheita dos 50 µl de eluição, rápida adição de 450 µl de TBS e armazenagem a 4 °C.

[00262] Os anticorpos obtidos foram selecionados em seguida em um teste comparativo pela capacidade de inibição da atividade de ATPase de CD39 até grau similar a I-394. Testes utilizados para inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel e celular foram conforme descrito acima (Métodos). Surpreendentemente, entre os exemplos de anticorpos produzidos desta forma, diversos exibiram inibição de CD39 solúvel (bem como inibição de

CD39 celular). A Figura 1 exibe um resultado de seleção representativo, que exibe os anticorpos I-397, I-398 e I-399 em comparação com o anticorpo I-394 controle positivo. De forma similar, os anticorpos I-395 e I-396 de imunização diferente inibiram a atividade enzimática de proteína CD39 solúvel. As Figuras 2A e 2B exibem os resultados para os anticorpos I-395 e I-396 para os quais foram disponíveis quantidades maiores de anticorpos para experimentos adicionais para neutralização de CD39 celular e solúvel. A Figura 2A demonstra que os anticorpos I-395 e I-396 inibem CD39 ligado por membrana celular em comparação com anticorpos BY40 e I-394, em que I-394 e I-395 exibem potência maior e inibição máxima de CD39 celular em comparação com BY40. A Figura 2B demonstra que os anticorpos I-395 e I-396 inibem CD39 solúvel em comparação com anticorpos BY40 e I-394. Embora BY40 não iniba CD39 solúvel em nenhuma concentração, I-394, I-395 e I-396 inibem CD39 solúvel, em que I-394 exibe a potência maior, seguido por I-395 e I-396 com potência mais baixa.

[00263] Os resultados obtidos levantam a possibilidade de que fator(es) em sobrenadantes de hibridoma estejam hidrolisando ATP rapidamente em cultivo celular e no teste de CD39 solúvel, de forma que nenhum sinal para ATP seja detectado na seleção de anticorpos utilizando métodos convencionais. O fator solúvel pode ser CD39 ou alguma outra enzima, por exemplo, produzida pelo parceiro de fusão.

[00264] Anticorpos foram clonados em seguida, com modificação para possuir regiões constantes humanas com domínio Fc de IgG1 que possui as mutações L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (numeração EU de Kabat), o que resulta em falta de ligação a receptores Fcγ humanos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e CD64, da mesma forma exibida no presente para I-

394. Os anticorpos resultantes podem ser submetidos em seguida a titulações e, em seguida, determinação de atividade mais detalhada conforme exibido nos

Exemplos 7-9 (titulação, inibição da atividade de ATPase) para realizar determinações de EC50 e IC50 para avaliar os anticorpos de acordo com a potência.

EXEMPLO 6 MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS DE MABS NEUTRALIZANTES DE SCD39

[00265] Conforme exibido no Exemplo 4, I-394 exibiu perda completa de ligação a células que expressam mutante 19 de CD39, mas sem perda de ligação ao mutante 5. A fim de definir os epítopos dos anticorpos anti- CD39 adicionais do Exemplo 5, eles foram testados para determinar a perda de ligação ao painel de mutantes CD39 conforme descrito no Exemplo 1 e na Tabela 1. Mutantes foram transfectados em células Hek-293T, conforme exibido na Tabela 1, utilizando numeração de SEQ ID N° 1. Faixas de dosagem de anticorpos de teste (10 – 2,5 – 0,625 – 0,1563 – 0,0391 – 0,0098 – 0,0024 – 0,0006 µg/ml) são testadas sobre os 20 mutantes gerados por meio de citometria de fluxo.

[00266] Os resultados demonstraram que os anticorpos selecionados no Exemplo 5 pela capacidade de inibição de CD39 solúvel representaram diversos epítopos diferentes. Dentre os anticorpos que exibiram inibição de CD39 extracelular solúvel no Exemplo 5, o anticorpo I-395 é um exemplo de anticorpo que exibiu perda de ligação ao mutante 5 que possui substituições nos resíduos Q96, N99, E143 e R147 e também perda de ligação ao mutante 19 que possui substituições nos resíduos R138, M139 e E142. O mutante 19 inclui substituições nos resíduos R138, M139 e E142. O epítopo central sobre CD39 de I-395 compreende, portanto, um, dois, três ou quatro dentre os resíduos Q96, N99, E143 e R147, bem como um, dois ou três dentre os resíduos R138, M139 e E142.

[00267] O anticorpo I-398, por outro lado, é um exemplo de anticorpo que exibiu perda de ligação ao mutante 19 que possui substituições nos resíduos R138, M139 e E142, mas não possui redução ou perda de ligação ao mutante 5 que possui substituições nos resíduos Q96, N99, E143 e R147.

[00268] Outros anticorpos que exibem inibição de CD39 extracelular solúvel no Exemplo 5 possuíam epítopos muito diferentes e não exibiram perda de ligação a nenhum dos mutantes 5 ou 19, o que sugere que CD39 solúvel pode também ser inibido por meio de ligação a outros sites sobre sCD39. Para alguns anticorpos, a perda de ligação a um dos 20 mutantes da Tabela 1 permitiu a localização do local de ligação sobre CD39, enquanto para outros o local de ligação permaneceu a ser determinado, pois eles não perderam a ligação a nenhum dos 20 mutantes. Dentre os anticorpos que exibem inibição da atividade de ATPase de CD39 solúvel no Exemplo 5, o anticorpo I-396 exibiu perda de ligação ao mutante 15 que possui substituições K87A, E100A e D107A, sem perda de ligação a nenhum dos outros 20 mutantes. O epítopo central sobre CD39 desse anticorpo compreende, portanto, um ou mais (ou todos os) resíduos K87, E100 e D107. O anticorpo I- 399 exibiu perda de ligação ao mutante 11 que possui substituições N371K, L372K, E375A, K376G, V377A e uma inserção de valina entre K376 e V377 (indicada na Tabela 1 como “inserção 377V”), sem perda de ligação a nenhum dos outros 20 mutantes. O epítopo central de CD39 desse anticorpo compreende, portanto, um ou mais (ou todos os) resíduos N371, L372, E375, K376 e V377. A Figura 3A exibe a posição de resíduos que sofreram mutação nos mutantes 5 (M5), 15 (M15) e 19 (M19) sobre a superfície da proteína CD39. A Figura 3B exibe resultados de ligação a mutantes 5, 15 e 19 para diferentes anticorpos.

[00269] Os resultados demonstram, portanto, que anticorpos que inibem CD39 solúvel podem ser obtidos contra epítopos diferentes. Os epítopos incluem epítopos definidos por um ou mais resíduos de mutante 19 que estão localizados ao lado do local de ligação de BY40 ou anticorpos similares a BY40 que inibem apenas CD39 celular, mas não CD39 solúvel (que perdem ligação ao mutante 5), epítopos que são definidos por um ou mais resíduos de mutante 19, mas também parcialmente pelo mutante 5, o que indica possivelmente alteração menor em comparação com BY40 ou anticorpos similares a BY40, epítopos definidos por um ou mais resíduos de mutante 19 e não por resíduos de mutante 5, bem como outros epítopos tais como os definidos por um ou mais resíduos de mutante 11 ou um ou mais resíduos de mutante 15, ou, adicionalmente, por outros anticorpos que não possuem ligação reduzida a nenhum dos mutantes 5, 15 ou 19 para os quais a localização de epítopos permanece a ser determinada.

EXEMPLO 7 TITULAÇÃO DE ANTICORPO SOBRE CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD39 POR MEIO DE

CITOMETRIA DE FLUXO

[00270] Anticorpo I-394 foi testado em dois experimentos repetidos para ligação a células de CHO que expressam CD39 humano, células de CHO que expressam CD39 de cynomolgus (Macaca fascicularis), células de CHO que expressam CD39 murino e células de linfoma de Ramos humano (ATCC®, referência CRL-1596). As células foram incubadas com várias concentrações de anticorpo anti-CD39 não marcado de 30 µg/ml a 5x10- 4 µg/ml, por 30 minutos a 4 °C. Após as lavagens, as células foram incubadas com anticorpo secundário marcado com H+L anticamundongos de cabra por 30 minutos a 4 °C.

[00271] Os resultados são exibidos na Figura 4. Anticorpo I- 394 liga-se a células que expressam CD39 humano (CHO-huCD39), células que expressam CD39 de cynomolgus (CHO-cyCD39) e células de linfoma de Ramos, mas não a células que expressam CD39 murino (CHO-moCD39). I-394 ligado a células de Ramos com valores EC50 de 0,16 µg/ml e 0,19 µg/ml no primeiro e no segundo conjunto de experimentos correspondentes. Vários outros anticorpos anti-CD39 exibiram valores EC50 comparáveis para ligação a células de Ramos.

EXEMPLO 8 DETERMINAÇÃO DE IC50 PARA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DE ATPASE CELULAR

[00272] A inibição pelo anticorpo I-394 da atividade de ATPase de CD39 em células que expressam CD39 foi avaliada utilizando-se o teste empregado para inibição da atividade enzimática de CD39 celular conforme descrito acima (Métodos).

[00273] Os resultados são exibidos na Figura 5. I-394 é altamente potente no bloqueio da atividade enzimática de CD39 em células de tumor (Ramos), com potência maior em comparação com todos os outros anticorpos testados. I-394 também bloqueia a atividade enzimática de CD39 em células que expressam CD39 humano (CHO-huCD39) e em células que expressam CD39 de cynomolgus (CHO-cyCD39). Células que expressam CD39 murino (CHO-moCD39) são exibidas como controle negativo. A IC50 calculada (inibição de 50% da atividade enzimática de CD39 expressa por

50.000 células de Ramos) é de 0,05 µg/ml. A inibição máxima foi de 81,6%. O controle de isótipos não apresentou efeito.

EXEMPLO 9 DETERMINAÇÃO DE IC50 PARA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DE ATPASE DE PROTEÍNA CD39 SOLÚVEL RECOMBINANTE

[00274] A inibição pelo anticorpo I-394 da atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel foi avaliada utilizando-se o teste empregado para inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel conforme descrito acima (Métodos). Os resultados são exibidos na Figura 6. I-394 inibe a atividade enzimática de proteína CD39 solúvel. Anticorpo BY40, em comparação, não inibiu a atividade enzimática de proteína CD39 solúvel. A IC50 calculada é de 0,003 µg/ml. A inibição máxima foi de 74,9%.

EXEMPLO 10 TITULAÇÃO ELISA SOBRE ISOFORMAS CD39-L1, L2, L3 E L4

[00275] Anticorpo I-394 foi testado para determinar a ligação a isoformas CD39 humanas recombinantes (isoformas Rec-huCD39) que possuem sequências de aminoácidos exibidas abaixo que foram revestidas em placas com 96 cavidades em PBS 1X a 500 ng/ml ou 1 µg/ml a 4 °C por uma noite. As cavidades foram lavadas em TBS Tween 20 e adicionalmente saturadas por duas horas à temperatura ambiente em tampão de bloqueio TBS. A concentração de faixa de dosagem de anticorpo primário foi incubada em tampão de bloqueio de TBS por duas horas à temperatura ambiente.

Cavidades foram lavadas em TBS Tween 20. Anticorpo secundário (GAM-HRP ou GAH-HRP em tampão de bloqueio TBS) foi incubado por uma hora à temperatura ambiente e revelado com TMB. A densidade óptica foi medida em Enspire® a OD=450.

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DO HUCD39 CLONADO (ISOFORMA VASCULAR)

[00276] CD39-L1 humano, também conhecido como NTPDase2 ou ENTPD2: 1 MAGKVRSLLP PLLLAAAGLA GLLLLCVPTR DVREPPALKY GIVLDAGSSH TSMFIYKWPA; 61 DKENDTGIVG QHSSCDVPGG GISSYADNPS GASQSLVGCL EQALQDVPKE RHAGTPLYLG; 121 ATAGMRLLNL TNPEASTSVL MAVTHTLTQY PFDFRGARIL SGQEEGVFGW VTANYLLENF; 181 IKYGWVGRWF RPRKGTLGAM DLGGASTQIT FETTSPAEDR ASEVQLHLYG QHYRVYTHSF; 241 LCYGRDQVLQ RLLASALQTH GFHPCWPRGF STQVLLGDVY QSPCTMAQRP QNFNSSARVS; 301 LSGSSDPHLC RDLVSGLFSF SSCPFSRCSF

NGVFQPPVAG NFVAFSAFFY TVDFLRTSMG; 361 LPVATLQQLE AAAVNVCNQT WAQQLLSRGY GFDERAFGGV IFQKKAADTA VGWALGYMLN; e 421 LTNLIPADPP GLRKGTDFSS WVVLLLLFAS ALLAALVLLL RQVHSAKLPS TI (SEQ ID N° 2).

[00277] CD39-L2 humano, também conhecido como NTPDase6 ou ENTPD6: 1 MKKGIRYETS RKTSYIFQQP QHGPWQTRMR KISNHGSLRV AKVAYPLGLC VGVFIYVAYI; 61 KWHRATATQA FFSITRAAPG ARWGQQAHSP LGTAADGHEV FYGIMFDAGS TGTRVHVFQF; 121 TRPPRETPTL THETFKALKP GLSAYADDVE KSAQGIRELL DVAKQDIPFD FWKATPLVLK; 181 ATAGLRLLPG EKAQKLLQKV KEVFKASPFL VGDDCVSIMN GTDEGVSAWI TINFLTGSLK; 241 TPGGSSVGML DLGGGSTQIA FLPRVEGTLQ ASPPGYLTAL RMFNRTYKLY SYSYLGLGLM; 301 SARLAILGGV EGQPAKDGKE LVSPCLSPSF KGEWEHAEVT YRVSGQKAAA SLHELCAARV; 361 SEVLQNRVHR TEEVKHVDFY AFSYYYDLAA GVGLIDAEKG GSLVVGDFEI AAKYVCRTLE; 421 TQPQSSPFSC MDLTYVSLLL QEFGFPRSKV LKLTRKIDNV ETSWALGAIF HYIDSLNRQK; e 481 SPAS (SEQ ID N° 3).

[00278] CD39-L3 humano, também conhecido como NTPDase3 ou ENTPD3: 1 MFTVLTRQPC EQAGLKALYR TPTIIALVVL LVSIVVLVSI TVIQIHKQEV LPPGLKYGIV;

61 LDAGSSRTTV YVYQWPAEKE NNTGVVSQTF KCSVKGSGIS SYGNNPQDVP RAFEECMQKV; 121 KGQVPSHLHG STPIHLGATA GMRLLRLQNE TAANEVLESI QSYFKSQPFD FRGAQIISGQ; 181 EEGVYGWITA NYLMGNFLEK NLWHMWVHPH GVETTGALDL GGASTQISFV AGEKMDLNTS; 241 DIMQVSLYGY VYTLYTHSFQ CYGRNEAEKK FLAMLLQNSP TKNHLTNPCY PRDYSISFTM; 301 GHVFDSLCTV DQRPESYNPN DVITFEGTGD PSLCKEKVAS IFDFKACHDQ ETCSFDGVYQ; 361 PKIKGPFVAF AGFYYTASAL NLSGSFSLDT FNSSTWNFCS QNWSQLPLLL PKFDEVYARS; 421 YCFSANYIYH LFVNGYKFTE ETWPQIHFEK EVGNSSIAWS LGYMLSLTNQ IPAESPLIRL; e 481 PIEPPVFVGT LAFFTAAALL CLAFLAYLCS ATRRKRHSEH AFDHAVDSD (SEQ ID N° 4).

[00279] CD39-L4 humano, também conhecido como NTPDase5 ou ENTPD5: 1 MATSWGTVFF MLVVSCVCSA VSHRNQQTWF EGIFLSSMCP INVSASTLYG IMFDAGSTGT; 61 RIHVYTFVQK MPGQLPILEG EVFDSVKPGL SAFVDQPKQG AETVQGLLEV AKDSIPRSHW; 121 KKTPVVLKAT AGLRLLPEHK AKALLFEVKE IFRKSPFLVP KGSVSIMDGS DEGILAWVTV; 181 NFLTGQLHGH RQETVGTLDL GGASTQITFL PQFEKTLEQT PRGYLTSFEM FNSTYKLYTH; 241 SYLGFGLKAA RLATLGALET EGTDGHTFRS ACLPRWLEAE WIFGGVKYQY GGNQEGEVGF;

301 EPCYAEVLRV VRGKLHQPEE VQRGSFYAFS YYYDRAVDTD MIDYEKGGIL KVEDFERKAR; 361 EVCDNLENFT SGSPFLCMDL SYITALLKDG FGFADSTVLQ LTKKVNNIET GWALGATFHL; e 421 LQSLGISH (SEQ ID N° 5).

[00280] I-394 ligou-se a CD39, mas não a nenhuma das isoformas CD39-L1, L2, L3 ou L4. Anticorpos controle de isótipos (IC) não se ligaram a nenhuma molécula de CD39 ou CD39-L. Os resultados são exibidos na Figura 7.

EXEMPLO 11

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

[00281] Embora ATP possua atividade pró-inflamatória, acredita-se que o catabolismo de ATP mediado por CD39 seja capaz de gerar ativação de células dendríticas (CD), alterando, por sua vez, reação imunológica adaptativa mais ampla contra antígeno de tumor. A fim de avaliar se o bloqueio de CD39 utilizando anticorpos anti-CD39 poderá superar alteração mediada por CD39 da ativação de células dendríticas (DC) na presença de ATP, incubamos DC derivado de monócitos (moDC) com anticorpos anti-CD39 na presença de ATP.

[00282] Resumidamente, monócitos humanos foram purificados a partir de sangue saudável humano e diferenciados em MoDC na presença de GM-CSF e IL-4 durante seis dias. MoDCs foram ativadas em seguida na presença de ATP (Sigma, 0,25 – 1 mM) por 24 horas e a ativação de DC foi determinada por meio de análise da expressão de CD80, CD83 e HLA-DR por meio de citometria de fluxo. Em alguns casos, MoDCs foram previamente incubadas por uma hora na presença de inibidor de CD39: ARL6716 (Tocris, 250 µM), inibidor de CD73: APCP (Tocris, 50 µM), anticorpo de bloqueio anti-CD39 I-394 ou BY40 (para BY40, vide WO 2009/095478), ou anticorpos de bloqueio anti-CD73. LPS (Invivogen, 10 ng/ml) foi utilizado como controle positivo. Para determinar o efeito resultante da ativação de DC mediada por ATP sobre a ativação de células T CD4, DCs ativadas por ATP foram lavadas e incubadas em seguida com células T CD4 alogênicas (razão de 1 MoDC/4 células T) para uma reação de linfócitos misturados (MLR) durante cinco dias. A ativação e a proliferação de células T foram analisadas por meio da expressão de CD25 e diluição de Violeta de Traço Celular por meio de citometria de fluxo (Figura 8).

[00283] Os resultados são exibidos nas Figuras 9, 10 e 11.

Na presença de controle negativo (meio), observou-se ativação de moDC na presença de 1 mM de ATP, mas ATP a 0,125 mM, 0,25 mM ou 0,5 mM não permitiu ativação de moDC. A adição de inibidores químicos de CD39 que se acredita bloquearem totalmente a atividade enzimática de CD39 por meio de ligação ao local ativo gera ativação de moDC em cada um dentre 0,125 mM, 0,25 mM ou 0,5 mM. Anticorpos anti-CD39, tais como BY40 ou anticorpos anti- CD73, entretanto, não foram capazes de favorecer a ativação induzida por ATP de células dendríticas (DC), o que sugere que os anticorpos não são capazes de bloquear suficientemente a atividade enzimática para evitar catabolismo de ATP. Surpreendentemente, o anticorpo de bloqueio anti-CD39 I-394 (exibido nas Figuras sob concentração de 10 µg/ml) que bloqueia de forma substancialmente completa a atividade de ATPase de CD39 e, portanto, pode permitir acúmulo de ATP, permitiu ativação de moDC conforme determinado por HLA-DR ou expressão de CD83 em cada um dentre 0,125 mM, 0,25 mM ou 0,5 mM (Figuras 9 e 10). De forma interessante, as MoDCs ativadas na presença de ATP foram capazes de induzir melhor ativação e proliferação de células T em um teste MLR. Além disso, a ampliação da ativação de MoDCs mediada por ATP por anticorpo de bloqueio anti-CD39 I-394 resultou em proliferação e ativação de células T mais altas (Figura 11).

[00284] A determinação da capacidade de inibidores de CD39 de ativar DC na presença de ATP fornece um método de identificação e avaliação de anticorpos anti-CD39 que são capazes de atingir alto grau de inibição de CD39.

[00285] Além disso, a possibilidade de uso de anticorpos anti-CD39 para liberar o efeito imunossupressivo exercido por CD39 sobre DC pode fornecer aumento da reação imunológica adaptativa para antígenos, notadamente sobre células de tumores. Além disso, esses anticorpos anti- CD39 podem ser de interesse específico quando utilizados para ampliar o efeito imunogênico de agentes quimioterapêuticos. Numerosos agentes quimioterapêuticos que causam necrose de células de tumores são capazes de induzir ATP; o uso combinado desses agentes em conjunto com anticorpos anti-CD39 pode ser particularmente útil para ampliar a reação antitumores.

EXEMPLO 12 ANTICORPOS QUE INIBEM A ATIVIDADE DE ATPASE DE PROTEÍNA CD39 SOLÚVEL RECOMBINANTE CAUSAM FORTE POTENCIALIZAÇÃO DO BLOQUEIO DE CD73 NA

PRESENÇA DE ATP TESTE DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T

[00286] Sangue periférico de doadores saudáveis foi obtido de EFS e células mononucleares foram isoladas sobre um gradiente Ficoll®.

Linfócitos foram adicionalmente enriquecidos sobre um gradiente Percoll® a 52% por meio de coleta das pelotas celulares e manchados com uma tintura Cell Trace (Thermofisher) após o TDS fornecido pelo fabricante. 5x104 a 1x105 células manchadas foram distribuídas em 96 placas com fundo abaulado, incubadas por uma hora a 37 °C com anticorpos anti-huCD73 (anticorpo 6E1 descrito em WO 2016/131950) e/ou Abs anti-huCD39 (I-394 descrito no presente) e ativadas por três a cinco dias por meio da adição de esferas revestidas com anti-CD3/anti-CD28 (esfera:célula = 1:4; Life Technologies). A inibição da proliferação de células T foi atingida por meio da adição de ATP (200 µM). A proliferação de células T e a capacidade de Abs de bloquear o efeito supressivo imune de AMP foram determinadas por meio de citometria de fluxo por quantificação da diluição da tintura no subconjunto de células T em proliferação.

[00287] O percentual de células T em proliferação vs.

concentração de Ab anti-CD73 é plotado em gráficos utilizando software GraphPad Prism®.

RESULTADOS

[00288] Os anticorpos foram testados para determinar a capacidade de restauração da proliferação de células T CD4 ou CD8 na presença de ATP adicionado, destinado a representar condições que podem ser encontradas no ambiente do tumor. Cada um dentre anti-CD73 e CD39 foi testado em faixa de dosagem em três doses diferentes do outro dentre o anticorpo anti-CD73 ou anti- CD39. Anticorpo anti-CD39 I-394 causa forte potencialização do efeito de anticorpos anti-CD73 na restauração da proliferação de células T CD4 ou CD8, de forma que mesmo concentrações baixas de anticorpos anti-CD73 (por exemplo, abaixo de 0,01 µg/ml, abaixo de 0,001 µg/ml e mesmo abaixo de 0,001 µg/ml) causaram forte aumento da proliferação de células T CD4 ou CD8, quando utilizados em combinação com anticorpos anti-CD39. Além disso, quando testado em faixa de dosagem isolado, sem anti-CD73, o anticorpo anti-CD73 I-394 resultou em notável aumento da proliferação de células T CD4 ou CD8 em concentrações de 0,1 µg/ml e 1 µg/ml. A Figura 12A exibe a faixa de dosagem de anticorpo anti-CD73 6E1 sobre a proliferação de células T CD4 em três doses diferentes de anticorpo anti- CD39 I-394, ou seja, 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml e 1 µg/ml. Os anticorpos anti-CD39 que são capazes de neutralizar CD39 humano solúvel e/ou monomérico exibem forte potencialização do efeito com anticorpos anti-CD73 na restauração da proliferação de células T CD4. O efeito foi particularmente forte em concentrações nas quais anticorpos anti-CD73 apresentaram atividade abaixo da ideal, correspondentes a faixas de concentrações que podem ser observadas em tecidos de tumores durante o transcurso do tratamento com um anticorpo anti-CD73. Em concentração de 0,01 µg/ml, os anticorpos anti-CD39 forneceram aumento de cerca de 1 log da potência de anticorpos anti-CD73 e concentração de 0,1 µg/ml, os anticorpos anti-CD39 forneceram aumento de cerca de 4 log da potência de anticorpos anti-CD73. Os anticorpos anti-CD39 podem, portanto, ser úteis para aumentar a atividade de anticorpos anti-CD73, particularmente em tecido de tumores, por exemplo em tumores que abrigam células que expressam CD73. Além disso, embora os anticorpos anti-CD73 testados (que são capazes de neutralizar proteína CD73 solúvel) possuíssem alta capacidade de restaurar a proliferação de células T CD4, outros anticorpos que possuem potência mais baixa (por exemplo, conforme determinado em um teste de inibição enzimática, em um teste de proliferação de células T ou outro teste apropriado) e podem beneficiar-se ainda mais da combinação com os anticorpos anti-sCD39. A Figura 12B exibe a faixa de dosagem de anticorpos anti-CD73 sobre a proliferação de células T CD8. Novamente, anticorpos anti-CD39 exibem forte sinergia e/ou efeito aditivo com anticorpos anti- CD73 na restauração da proliferação de células T CD8. O efeito foi particularmente forte sob concentrações nas quais anticorpos anti-CD73 apresentaram atividade abaixo da ideal, correspondentes a faixas de concentrações que podem ser observadas em tecidos de tumores durante o transcurso do tratamento com um anticorpo anti-CD73.

EXEMPLO 13 GERAÇÃO DE VARIANTES HUMANIZADAS POTENTES DO ANTICORPO I-394

[00289] Anticorpo parental I-394 que possui sequências de aminoácidos VH e VL de SEQ ID N° 6 e 7, respectivamente, foi modificado por meio da introdução na VH de cadeias principais de cadeia pesada (FR1, FR2 e FR3) do subgrupo humano IGHV1-3 em conjunto com IGHJ*01 (FR4) e a introdução na VL de cadeias principais de cadeia leve (FR1, FR2 e FR3) do subgrupo humano IGKV4-1, em conjunto com IGKJ4*01 (FR4).

[00290] Modelos tridimensionais baseados em segmentos genéticos VH e VL humanos diferentes foram sobrepostos e todas as diferenças de aminoácidos foram analisadas uma a uma. O projeto molecular in silico foi desafiado utilizando modelos 3D de anticorpos quiméricos (HPLP) e humanizados (H0L0) parentais. Modelos 3D de fragmentos de Fab foram construídos utilizando o protocolo de Anticorpo Modelo da Discovery Studio (DS versão 4.5).

[00291] As sequências de cadeias leve e pesada utilizadas para modelagem de versão Fab quimérica de I-394 com regiões constantes de IgG1 humano, incluindo um domínio Fc que compreende uma substituição N297S (que não possui glicosilação ligada a N297) ou substituições L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (que retêm glicosilação ligada a N297) foram as seguintes:

[00292] I-394LP (cadeia leve de Fab parental):

DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGVSFMYWFQQK PGQPPNLLIYGASNQGSGVPARFRGSGSGTDFSLNIHPMEADDTAMYFCQQT KEVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 19).

[00293] I-394-HP (cadeia pesada de Fab parental):

EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSPG RTLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATLTVNTSSRTAYMELRSLTSEDSAAYY CARGGTRFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK (SEQ ID N° 20).

[00294] Estruturas de modelo de cadeia leve e pesada foram identificadas e referências do Banco de Dados de Proteínas (PDB) 4M7K, 1I7Z e 3D85 foram utilizadas para interface VH/VL e modelagem de LC e HC, respectivamente, O banco de dados PDB utilizado é PDB RCSB da Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, administrado pelos membros RCSB Rutgers e UCSD/SDSC; consulte www.rcsb.org e H. M.

Berman et al (2000), The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-

242. Referência da inscrição PDB 4M7K: Teplyakov, A. et al (2014), Proteins 82: 1563-1582. Referência da inscrição PDB 1I7Z: Larsen, N. A. et al (2001), J.

Mol. Biol. 311: 9-15. Referência da inscrição PDB 3D85: Beyer, B. M. et al (2008), J. Mol. Biol. 382: 942-955.

[00295] As sequências de cadeia leve e pesada utilizadas para modelagem de versão de Fab humanizado de I-394 foram as seguintes.

[00296] Cadeia leve de Fab L0 I-394:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNFGVSFMYWYQQK PGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQT KEVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 21).

[00297] Cadeia pesada de Fab H0 I-394:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPG QRLEWMGYIVPLNGGSTFNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYY CARGGTRFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK (SEQ ID N° 22).

[00298] Para a versão de Fab humanizada de I-394, referências de PDB 4NWT, 4ITT e 4JPI foram utilizadas para interface de VH/VL e modelagem de LC e HC, respectivamente. Referência da inscrição PDB 4NWT: Bowers, P. M. et al (2014), J. Biol. Chem. 289: 33557-33567.

Referência da inscrição PDB 4ITT: Ultsch, M. et al (2013), J. Mol. Biol. 425: 1330-1339. Referência da inscrição PDB 4JPI: Jardine, J. et al (2013), Science 340: 711-716.

[00299] Para a seleção intermediária de variantes humanizadas de cadeia leve e pesada, modelos 3D HPLP e H0L0 foram sobrepostos e todas as diferenças de aminoácidos foram analisadas uma a uma. Conexões intracadeias e extracadeias entre os resíduos também foram determinadas, a fim de não romper nenhuma ligação de baixa energia importante introduzindo contramutação em uma dada cadeia. Além disso, para variantes humanizadas de cadeia leve e pesada, aminoácidos que sofreram o impacto das discrepâncias entre esquemas de numeração de CDR Kabat e IMGT foram especificamente analisados na sobreposição de modelos 3D HPLP e H0L0; as descobertas alertaram para o projeto de variantes VH (designadas por a* como H2*, H3* e H4*) que retiveram o resíduo parental (tirosina) presente no resíduo de Kabat 50 na VH (resíduo de CDR2 Kabat, mas não IGMT), mas que não retiveram os resíduos parentais nas posições 60 e 64 (resíduos CDR2 de Kabat). De forma similar, foi produzida a variante VL L1*, que não reteve o resíduo parental na posição 24 (resíduo de CDR1 de Kabat).

[00300] Modificações de aminoácidos foram introduzidas em sequências parentais. As sequências VH e VL do anticorpo anti-CD39 são fornecidas abaixo na Tabela A. Em comparação com a VH H0 parental de SEQ ID N° 27, H1 contém uma substituição R72V (FR3); H2 contém uma substituição V68A (FR3) e R72V (FR3); H2* contém uma substituição V68A (FR3) e R72V (FR3), bem como uma substituição N61S (CRD2); H3 contém uma substituição M48I (FR2), V68A (FR3) e R72V (FR3); H3 contém uma substituição M48I (FR2), V68A (FR3) e R72V (FR3), bem como substituições N61S e K65Q em CDR2; H4 contém uma substituição M48I (FR2), V68A (FR3), R72V (FR3) e S77R (FR3); e H4* contém uma substituição M48I (FR2),

V68A (FR3), R72V (FR3) e S77R (FR3), bem como substituições N61S e K65Q em CDR2. Em comparação com a VL de cadeia L0 parental de SEQ ID N° 35, L1 contém uma substituição Y40F (FR2) e L1* contém uma substituição Y40F (FR2) e substituição R24K (CDR1).

TABELA A Domínio V SEQ ID Sequência de aminoácidos

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H0” 27 GQRLEWMGYIVPLNGGSTFNQKFKGRVTITRDTSASTAYMEL

SSLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H1” 28 GQRLEWMGYIVPLNGGSTFNQKFKGRVTITVDTSASTAYMEL

SSLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H2” 29 GQRLEWMGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATITVDTSASTAYMEL

SSLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H3” 30 GQRLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATITVDTSASTAYMELS

SLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H4” 31 GQRLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATITVDTSARTAYMELS

SLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H2*” 32 GQRLEWMGYIVPLNGGSTFSQKFKGRATITVDTSASTAYMEL

SSLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H3*” 33 GQRLEWIGYIVPLNGGSTFSQKFQGRATITVDTSASTAYMELS

SLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

Domínio V SEQ ID Sequência de aminoácidos

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAP VH “H4*” 34 GQRLEWIGYIVPLNGGSTFSQKFQGRATITVDTSARTAYMELS

SLRSEDTAVYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSS

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNFGVSFMYWYQQ VL “L0” 35 KPGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE

DVAVYYCQQTKEVPYTFGGGTKVEIK

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNFGVSFMYWFQQ VL “L1” 36 KPGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE

DVAVYYCQQTKEVPYTFGGGTKVEIK

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDNFGVSFMYWFQQ VL “L1*” 37 KPGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE

DVAVYYCQQTKEVPYTFGGGTKVEIK

[00301] Os anticorpos que possuem as regiões variáveis VH e VL foram produzidos na forma de anticorpos IgG1 humanos quiméricos recombinantes omissos para Fc com mutação de substituições de cadeias pesadas L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (numeração EU de Kabat), que resulta em perda de ligação a receptores de Fcγ humanos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e CD64.

[00302] Resumidamente, as sequências VH e Vk exibidas abaixo foram clonadas em vetores que contêm os domínios constantes huIgG1 (que abrigam as substituições L234A/L235E/G237A/A330S/P331S) e o domínio constante huCk, respectivamente. Os dois vetores obtidos foram cotransfectados na linhagem de células de CHO de forma combinatória, para gerar combinações de VH e VL. O conjunto estabelecido de células foi utilizado para produzir o anticorpo no meio de CHO. O anticorpo foi purificado em seguida utilizando proteína A.

[00303] Além de um anticorpo humanizado enxertado com CDR parental (mAb1), foram construídas 23 variantes humanizadas adicionais de anticorpos que continham as diferentes substituições de aminoácidos em comparação com a versão enxertada em CDR parental. Todas as variantes de anticorpos foram produzidas com sucesso em células de CHO como anticorpos IgG1 humanos. VH e VL dos anticorpos mAbs1 a mAbs24 resultantes são exibidas na Tabela B.

TABELA B Referência de mAb VH VL H0 L0 mAb1 H0L0 (SEQ ID N° 27) (SEQ ID N° 35) H0 L1 mAb2 H0L1 (SEQ ID N° 27) (SEQ ID N° 36) H0 L1* mAb3 H0L1* (SEQ ID N° 27) (SEQ ID N° 37) H1 L0 mAb4 H1L0 (SEQ ID N° 28) (SEQ ID N° 35) H1 L1 mAb5 H1L1 (SEQ ID N° 28) (SEQ ID N° 36) H1 L1* mAb6 H1L1* (SEQ ID N° 28) (SEQ ID N° 37) H2 L0 mAb7 H2L0 (SEQ ID N° 29) (SEQ ID N° 35) H2 L1 mAb8 H2L1 (SEQ ID N° 29) (SEQ ID N° 36) H2 L1* mAb9 H2L1* (SEQ ID N° 29) (SEQ ID N° 37) H2* L0 mAb10 H2*L0 (SEQ ID N° 32) (SEQ ID N° 35) H2* L1 mAb11 H2*L1 (SEQ ID N° 32) (SEQ ID N° 36) H2* L1* mAb12 H2*L1* (SEQ ID N° 32) (SEQ ID N° 37) H3 L0 mAb13 H3L0 (SEQ ID N° 30) (SEQ ID N° 35) H3 L1 mAb14 H3L1 (SEQ ID N° 30) (SEQ ID N° 36) H3 L1* mAb15 H3L1* (SEQ ID N° 30) (SEQ ID N° 37) H3* L0 mAb16 H3*L0 (SEQ ID N° 33) (SEQ ID N° 35) H3* L1 mAb17 H3*L1 (SEQ ID N° 33) (SEQ ID N° 36)

Referência de mAb VH VL H3* L1* mAb18 H3*L1* (SEQ ID N° 33) (SEQ ID N° 37) H4 L0 mAb19 H4L0 (SEQ ID N° 31) (SEQ ID N° 35) H4 L1 mAb20 H4L1 (SEQ ID N° 31) (SEQ ID N° 36) H4 L1* mAb21 H4L1* (SEQ ID N° 31) (SEQ ID N° 37) H4* L0 mAb22 H4*L0 (SEQ ID N° 34) (SEQ ID N° 35) H4* L1 mAb23 H4*L1 (SEQ ID N° 34) (SEQ ID N° 36) H4* L1* mAb24 H4*L1* (SEQ ID N° 34) (SEQ ID N° 37)

[00304] Anticorpos mAb1-21 foram determinados para ligação a CD39 por meio de citometria de fluxo conforme descrito no Exemplo 7, utilizando células de CHO que expressam células de CHO e CD39 humanas que expressam CD39 de cynomolgus (Macaca fascicularis). Todos os mAbs exibiram ligação comparável ao anticorpo I-394 parental sobre linhagens de células de CHO CD39 humanas e de cynomolgus.

EXEMPLO 14 ATIVIDADE DE VARIANTES HUMANIZADAS DE ANTICORPO I-394

[00305] Os mAbs1-24 foram adicionalmente determinados para ligação e inibição de CD39 por meio de diversos testes, incluindo a ligação a CD39 presente sobre linhagens de células de tumores de Ramos que se concluiu expressarem níveis particularmente altos de CD39, inibição da atividade enzimática de sCD39 produzido de forma recombinante, bem como inibição da atividade enzimática de proteína sCD39 expelida em sobrenadantes do cultivo celular de células de CHO que expressam CD39 humano e de células de tumores de Ramos.

[00306] Anticorpos foram titulados sobre células de linfoma de Ramos por meio de citometria de fluxo de acordo com os métodos descritos no Exemplo 7. Os resultados demonstraram que todas as variantes L0 ligam-se com menos força sobre a linhagem de células de Ramos em comparação com o anticorpo I-394 parental, enquanto anticorpos H2L1, H2L1*, H4L1 e H4L1* (mAbs8, 9, 20 e 21, respectivamente) demonstraram melhor ligação e foram todos similares ao anticorpo I-394 parental. Vide a Figura 13.

[00307] Os anticorpos foram testados para determinar a capacidade de inibição da atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel, utilizando os testes empregados para inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel conforme descrito acima (Métodos). Todos os anticorpos exibiram boa atividade, com H3L1, H3L1*, H4L1 e H4L1* (mAbs14, 15, 20 e 21, respectivamente), em que todos são comparáveis ao anticorpo I-394 parental, enquanto outros anticorpos apresentaram potência levemente mais baixa. Os anticorpos foram também testados para determinar a capacidade de inibição da atividade de ATPase de proteína CD39 solúvel liberada em sobrenadante de cultivo celular de células de CHO que expressam CD39 humano, utilizando os testes empregados para inibição da atividade enzimática de CD39 solúvel conforme descrito acima (Métodos). Todos os anticorpos exibiram boa atividade, com H4L1 e H4L1* (mAb20 e mAb21), em que ambos são comparáveis ao anticorpo I-394 parental, enquanto os outros anticorpos possuíam potência levemente mais baixa.

[00308] Anticorpos foram testados para determinar a sua eficácia na redução da supressão de células T no teste descrito no Exemplo

12. Para testar o efeito da ativação de DC mediada por ATP sobre a ativação de células T CD4, DCs ativadas por ATP foram lavadas e incubadas em seguida com células T CD4 alogênicas (razão de 1 MoDC/4 células T) para uma reação de linfócitos misturados (MLR) durante cinco dias. A ativação e a proliferação de células T foram analisadas por meio da expressão de CD25 e diluição de Violeta de Traço Celular por meio de citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que todos os anticorpos com as cadeias pesadas H2,

H3 ou H4 combinadas com cadeias leves L1 foram tão eficientes quanto o anticorpo I-394 parental, enquanto anticorpos com as cadeias leves L0 foram menos eficientes.

[00309] Anticorpos foram testados para determinar a potência de inibição da atividade de ATPase em linhagens celulares que expressam CD39 ligado a membrana. A inibição pelos anticorpos da atividade de ATPase de CD39 em células que expressam CD39 foi avaliada utilizando-se o teste empregado para inibição da atividade enzimática de CD39 celular conforme descrito acima (Métodos). Anticorpos foram avaliados em primeiro lugar sobre células de CHO que expressam CD39 humano; neste ambiente, nenhuma diferença substancial foi observada entre as variantes mAb1-24 e anticorpo I-394 parental sobre linhagens de células transfectadas de CHO.

Quando os anticorpos foram avaliados sobre linhagens de células de tumores de Ramos e Mino, entretanto, anticorpos H4L1 e H4L1* (mAb20 e mAb21) foram mais potentes no bloqueio da atividade enzimática de CD39 em comparação com todos os outros anticorpos. A Figura 14 exibe resultados em células Mino. As diferenças observadas entre testes em transfectantes e em células de tumores podem surgir da expressão de CD39 particularmente alta encontrada nessas linhagens de células de tumores em comparação com células de CHO, o que permite a revelação de diferenças de potência entre os anticorpos. Anticorpos que possuem a cadeia pesada H4* e as cadeias leves L1 ou L1* foram também testadas sobre células de tumor de Ramos; neste ambiente, os anticorpos H4* mAb23 e mAb24 possuíam potência levemente inferior a mAb20 e mAb21. Em resumo, os inibidores mais potentes de sCD39 derivado de células de tumores (por exemplo, em células de tumores que expressam altos níveis de CD39) foram os anticorpos que possuem as cadeias pesadas H4, seguidas por anticorpos que possuem a cadeia pesada H2, seguida por anticorpos com a cadeia pesada H3, em cada caso com a cadeia leve L1. Uma possível explicação é a existência de contramutação (BM) prejudicial na variante H3 que as torna menos potente que as variantes H2, mas que, por sua vez, é equilibrada pela substituição nas variantes de cadeias pesadas H4, que restaura a atividade ao nível do I-394 parental. Os anticorpos mais potentes entre todas as variantes humanizadas foram, portanto, o anticorpo H4L1 (que possui a VH de SEQ ID N° 31 e a VL de SEQ ID N° 36) e o anticorpo H4L1* (que possui a VH de SEQ ID N° 31 e a VL de SEQ ID N° 37).

mAb20 possui as CDRs de cadeia leve e pesada correspondentes exibidas em SEQ ID N° 8-13, com cadeias principais de cadeia pesada (FR1, FR2, FR3) do gene IGHV1-3 humano em conjunto com o gene IGHJ1*01 (FR4) e as substituições a seguir (numeração de Kabat): M48I (FR2), V68A (FR3), R72V (FR3) e S77R (FR3); e cadeias principais de cadeia leve (FR1, FR2, FR3) do subgrupo humano IGKV4-1, em conjunto com IGKJ4*01 (FR4) e uma substituição Y40F (FR2). mAb21 possui adicionalmente uma substituição na CDR1 de cadeia leve no resíduo Kabat 24 (substituição R24K).

[00310] A cadeia pesada total do anticorpo H4L1 (mAb20) com substituições L234A/L235E/G237A/A330S/P331S é exibida abaixo:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPG QRLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATITVDTSARTAYMELSSLRSEDTAVYY CARGGTRFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N° 38).

[00311] A cadeia leve total do anticorpo H4L1 (mAb20) é exibida abaixo:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNFGVSFMYWFQQK PGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQT KEVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 39).

[00312] A cadeia leve total do anticorpo H4L1* (mAb21) é exibida abaixo:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDNFGVSFMYWFQQK PGQPPKLLIYGASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQT KEVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 40).

EXEMPLO 15 ESTABILIDADE DE VARIANTES HUMANIZADAS DE ANTICORPO I-394

[00313] Os anticorpos mAb1-24 e o anticorpo anti-CD39 BY40, todos produzidos na forma de isótipos IgG1 humanos com substituições L234A/L235E/G237A/A330S/P331S foram testados para determinar a estabilidade na formulação de referência a seguir em concentração de cerca de 7 mg/ml: pH 6,0; tampão de histidina (10 mM); sacarose (200 mM); NaCl (50 mM); e polissorbato 80 (PS80) (0,2 g/l). A estabilidade das formulações foi monitorada em duas condições de armazenagem (a +5 °C ± 3 °C e a +40 ± 3 °C). Para cada estudo, três momentos foram realizados: T0, T15D (15 dias) e T1M (um mês). Congelamento e descongelamento (F/T) e teste de estabilidade de comutação térmica (TSSA) foram conduzidos para comparação formal. Para realizar ciclos F/T, as amostras foram congeladas por pelo menos duas horas a -20 °C e descongeladas por pelo menos uma hora à temperatura ambiente, o ciclo F/T é repetido por três vezes e as amostras são testadas por 24 horas após o último ciclo de congelamento/descongelamento. Em cada momento,

foram realizados os testes a seguir: - material particulado (MFI); - inspeção visual (aparência); - impurezas (HPLC SE); - turvação (400 nm); e - concentração de proteína (280 nm) (realizada com Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, Inc.).

[00314] Todos os anticorpos resultantes H2L1 (mAb8), H2L1* (mAb9), H4L1 (mAb20) e H4L1* (mAb21) exibiram boa estabilidade físico-química. A temperatura de agregação (TAgr) é exibida na Figura 15A para o anticorpo I-394 parental em comparação com anticorpo BY40 e, na Figura 15B, para anticorpos que possuem as combinações de cadeias H2L1, H2L1*, H4L1 ou H4L1*. Cada um dos anticorpos I-394 e H2L1, H2L1*, H4L1 e H4L1* exibiu TAgr de cerca de 70 °C. Em comparação com o anticorpo BY40 que possui TAgr de cerca de 60 °C, os anticorpos H2L1, H2L1*, H4L1 e H4L1* exibem vantagem de estabilidade significativa. Uma possível razão para a estabilidade inerente relativamente baixa de anticorpo BY40 são os diversos resíduos de aminoácidos aromáticos na superfície do mAb, localizada nas CDRs, particularmente em CDR3 de cadeia pesada, que fornecem hidrofobicidade prevista relativamente alta ao anticorpo BY40.

[00315] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, mencionadas no presente são integralmente incorporadas ao presente até o mesmo ponto como se cada referência fosse específica e individualmente indicada como incorporada por referência e descrita integralmente no presente (até a extensão máxima permitida por lei), independentemente de qualquer incorporação fornecida separadamente de documentos específicos realizada em outros pontos do presente.

[00316] O uso dos termos “um”, “uma", "o/a" e referências similares deve ser interpretado como cobrindo singular e plural, a menos que indicado em contrário no presente ou em clara contradição pelo contexto.

[00317] A menos que indicado em contrário, todos os valores exatos fornecidos no presente são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os exemplos de valores exatos fornecidos com relação a um fator ou medição específica podem ser considerados como também fornecendo medição aproximada correspondente, modificada por “cerca de”, quando apropriado).

[00318] A descrição no presente de qualquer aspecto ou realização do presente, utilizando expressões como “que compreende”, “que possui”, “que inclui” ou “que contém”, com referência a um ou mais elementos, destina-se a fornecer apoio para um aspecto ou realização similar no presente que “consiste de”, “consiste essencialmente de” ou “compreende substancialmente” aquele(s) elemento(s) específico(s), a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto (por exemplo, uma composição descrita no presente como compreendendo um elemento específico deverá ser compreendida como também descrevendo uma composição que consiste daquele elemento, a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto).

[00319] O uso de todo e qualquer exemplo ou expressão de exemplo (por exemplo, “tal como”) fornecido no presente destina-se meramente a melhor ilustrar a presente invenção e não impõe limitação sobre o escopo da presente invenção, a menos que reivindicado em contrário. Nenhuma expressão do presente relatório descritivo deverá ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo que liga um polipeptídeo CD39 humano e que é capaz de inibir a atividade de ATPase de um polipeptídeo CD39 humano de domínio extracelular solúvel, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

2. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 39 ou 40.

3. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender sequências de aminoácidos de cadeia principal de cadeia pesada FR1, FR2 e FR3 do gene IGHV1-3 humano; e sequências de aminoácidos de cadeia principal de cadeia leve FR1, FR2 e FR3 do gene IGKV4-1 humano.

4. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo que liga um polipeptídeo CD39 humano e é capaz de ligar e inibir a atividade de ATPase de uma proteína CD39 humana de domínio extracelular solúvel, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que possuem as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 8, 9 e 10 e sequências de aminoácidos de cadeia principal FR1, FR2 e FR3 do gene

IGHV1-3 humano; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 que possui as sequências de aminoácidos correspondentes exibidas em SEQ ID N° 17, 12 e 13 e sequências de aminoácidos de cadeia principal FR1, FR2 e FR3 do gene IGKV4-1 humano.

5. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 36 e 37.

6. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36.

7. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 39.

8. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 37.

9. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 38 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 40.

10. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 29 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

11. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 30 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

12. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 31 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

13. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 32 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

14. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 33 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

15. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 34 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36 ou 37.

16. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de inibir a atividade de ATPase de proteína CD39 humana com domínio extracelular solúvel produzida por células de tumores humanos.

17. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de inibir a atividade de ATPase de proteína sCD39 expelida em sobrenadantes de cultivo celular de células de tumores que expressam CD39 humanos.

18. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelas células de tumores serem células de tumores de Ramos.

19. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo inibir a atividade de ATPase da proteína CD39 na presença de ATP adicionado de forma exógena, opcionalmente em que ATP adicionado de forma exógena é fornecido em concentração de 20 µM.

20. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de ligar proteína CD39 humana na superfície de uma célula e é capaz de inibir a atividade de ATPase da mencionada proteína CD39 na superfície de uma célula.

21. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de causar redução da atividade de ATPase de proteína sCD39 expelida em sobrenadantes de cultivo celular de células de tumores que expressam CD39 humanas em mais de 50%, opcionalmente mais de 70%, opcionalmente mais de 80%.

22. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de causar redução da atividade de ATPase extracelular por uma célula que expressa CD39 em pelo menos 80%.

23. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por EC50 para inibição da atividade de ATPase de CD39 de não mais de 1 µg/ml, em que a inibição da atividade enzimática de CD39 é determinada pela avaliação da neutralização da atividade de ATPase em células de Ramos por meio da quantificação de ATP.

24. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por EC50, conforme determinado por meio de citometria de fluxo, de não mais de 2 µg/ml, opcionalmente não mais de 1 µg/ml, não mais de 0,5 µg/ml, não mais de 0,1 µg/ml, para ligação a células de Ramos.

25. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo concorrer pela ligação a um polipeptídeo CD39 de SEQ ID N° 1 com um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos de região variável de cadeia leve e pesada de SEQ ID N° 31 e 36 correspondentes.

26. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de aumentar a ativação de células dendríticas na presença de ATP.

27. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de causar aumento da expressão de um marcador da superfície celular de ativação em células dendríticas derivadas de monócitos, quando essas moDCs são incubadas in vitro com o anticorpo e ATP.

28. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 26 ou 27, caracterizado pelo ATP adicionado de forma exógena ser fornecido a 0,125 mM, 0,25 mM ou 0,5 mM.

29. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo aumento da expressão de um marcador da superfície celular de ativação ser determinado pela incubação de moDC na presença de ATP por 24 horas e análise da expressão da superfície celular de CD80, CD83 e/ou HLA-DR sobre moDC por meio de citometria de fluxo.

30. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo aumento da expressão de um marcador da superfície celular ser de pelo menos 40%, 50%, 75% ou 80%, em comparação com controle negativo (por exemplo, meio).

31. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser capaz de aumentar a proliferação de células T, quando as células T forem cocultivadas in vitro com células DC que expressam CD39, na presença de ATP.

32. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo possuir ligação reduzida a um polipeptídeo CD39 mutante que compreende as mutações R138A, M139A e E142K (com referência a SEQ ID N° 1), em cada caso com relação à ligação entre o anticorpo e um polipeptídeo CD39 do tipo selvagem que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1.

33. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo bruto, opcionalmente um anticorpo não ligado a um agente citotóxico.

34. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo, opcionalmente um fragmento de anticorpo que não contém domínio Fc.

35. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo que possui domínio Fc humano que é modificado para reduzir a ligação entre o domínio Fc e um receptor de Fcγ humano.

36. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo substancialmente não possuir ligação a polipeptídeos CD16, CD32a, CD32b e/ou CD64 humanos.

37. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo compreender um domínio Fc, opcionalmente em que o domínio Fc compreende uma modificação de aminoácido em comparação com domínio Fc do tipo selvagem, que reduziu ou eliminou a ligação a um ou mais, ou todos os receptores Fcγ humanos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64.

38. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo com comprimento total.

39. ANTICORPO ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender um domínio Fc de IgG1 humano modificado que compreende glicosilação N-ligada no resíduo Kabat N297 e compreende uma substituição de aminoácido em(nos) resíduo(s) de Kabat 234 e 235, opcionalmente ainda no resíduo de Kabat 331, opcionalmente nos resíduos de Kabat 234, 235 e 237 e nos resíduos de Kabat 330 e/ou 331, opcionalmente em que o domínio Fc compreende substituições L234A/L235E/P331S, substituições L234F/L235E/P331S, substituições L234A/L235E/G237A/P331S ou substituições L234A/L235E/G237A/A330S/P331S.

40. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.

41. KIT caracterizado por compreender o anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores, que compreende ainda opcionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo secundário marcado que reconhece especificamente o anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores.

42. ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39.

43. CÉLULA HOSPEDEIRA recombinante caracterizada por produzir o anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39.

44. MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE CÂNCER em indivíduos dele necessitados, caracterizado pelo método compreender a administração ao indivíduo de quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 ou composição conforme definido na reivindicação 40.

45. MÉTODO DE REDUÇÃO DA ATIVIDADE de ATPase de proteína CD39 solúvel m indivíduos, caracterizado pelo método compreender a administração ao mencionado paciente de quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 ou composição conforme definido na reivindicação 40.

46. MÉTODO de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo indivíduo ser portador de câncer.

47. MÉTODO DE AUMENTO DA ATIVIDADE de células T, NK e/ou B em pacientes portadores de câncer e/ou de liberação da inibição mediada por adenosina da atividade de células T, NK e/ou B em pacientes portadores de câncer, caracterizado pleo método compreender a administração ao mencionado paciente de quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 ou uma composição conforme definido na reivindicação 40.

48. MÉTODO DE AUMENTO DA ATIVAÇÃO de células dendríticas em pacientes portadores de câncer e/ou de restauração da ativação mediada por ATP de células DC em pacientes portadores de câncer, caracterizado pelo método compreender a administração ao mencionado paciente de quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 ou uma composição conforme definido na reivindicação 40.

49. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 44 a 48, caracterizado pelo indivíduo possuir proteína CD39 solúvel detectável.

50. MÉTODO de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo indivíduo possuir proteína CD39 solúvel detectável em circulação, em tecido de tumor e/ou em tecido adjacente a tumor.

51. MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE CÂNCER em indivíduos dele necessitados, caracterizado pelo método compreender: a. detecção de proteína CD39 solúvel em circulação e/ou no ambiente do tumor; e b. mediante determinação de que proteína CD39 solúvel é compreendida em circulação e/ou no ambiente do tumor, opcionalmente em nível mais alto em comparação com nível de referência, administração ao indivíduo de um anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 ou composição conforme definido na reivindicação 40.

52. MÉTODO de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela detecção de proteína CD39 solúvel compreender a obtenção do indivíduo de uma amostra biológica, colocação da mencionada amostra em contato com um anticorpo que liga proteína CD39 solúvel e detecção de anticorpo ligado a proteína CD39 solúvel.

53. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 44 a 52, caracterizado pelo anticorpo anti-CD39 ser administrado pelo menos uma vez em quantidade eficaz para atingir concentração em sangue (soro) e/ou tecido de tumor que corresponde pelo menos ao EC50 para neutralização da atividade enzimática de proteína CD39 solúvel.

54. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pela neutralização da atividade enzimática de proteína CD39 solúvel ser determinada por meio de determinação da neutralização da atividade de ATPase de uma proteína de domínio extracelular

CD39 em solução, por quantificação da redução de ATP hidrolisado quando a proteína CD39 é incubada com um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti- CD39.

55. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 44 a 51, caracterizado pelo tumor ou câncer ser tumor sólido.

56. MÉTODO de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo tumor ou câncer ser carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, câncer da bexiga, câncer do ovário, carcinoma colorretal, melanoma, câncer do estômago, câncer do esôfago ou câncer de mama.