TW202016142A - 用於治療癌症之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抑制可溶性人類CD39之酶活性的抗原結合化合物。本發明亦關於產生此類化合物之細胞；製造此類化合物及其抗體、片段、變異體及衍生物之方法；包含此類化合物之醫藥組合物；使用該等化合物診斷、治療或預防疾病(例如癌症)之方法。

Description

用於治療癌症之組合物及方法
本發明係關於一種抑制可溶性人類CD39之酶活性的抗原結合化合物(例如抗體)。本發明亦關於一種產生此類化合物之細胞；製造此類化合物及其抗體、片段、變異體及衍生物之方法；包含此類化合物之醫藥組合物；使用該等化合物診斷、治療或預防疾病(例如癌症)之方法。
八種不同ENTPD基因編碼NTPD酶蛋白家庭之成員。個別NTPD酶亞型在細胞位置及功能特性方面有所不同。質膜結合的核苷三磷酸二磷酸水解酶藉由水解核苷酸之c及b磷酸酯來控制在細胞表面處之核苷酸含量。
NTPD酶1 (胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1) (亦稱為CD39/ENTPD1或血管CD39)與另一酶(CD73 (胞外-5'-核苷酸酶))一同起作用，從而水解細胞外三磷酸腺苷(ATP)及二磷酸腺苷(ADP)，產生腺苷，該腺苷結合至腺苷受體及抑制T細胞及自然殺手(NK)細胞反應，由此抑制免疫系統。經由CD73/CD39路徑之腺苷產生被認可為調節T細胞(Treg)免疫抑制功能之主要機制。在一些人類癌症中CD39+ Treg之數目增加，且已使用若干活體內模型證明CD39+ Treg在促進腫瘤生長及癌轉移中之重要性。然而，CD39亦由腫瘤細胞表現且CD39+ 腫瘤細胞可經由腺苷路徑介導免疫抑制。癌細胞中之CD39呈現ATP酶活性，且與CD73一起產生腺苷。CD73+ CD39+ 癌細胞以CD39依賴性及腺苷依賴性方式抑制CD4及CD8 T細胞之增殖及細胞毒素效應CD8 T細胞(CTL)之產生。已報導CD39在若干實體腫瘤(結腸直腸癌、頭頸癌、胰臟癌)以及慢性淋巴球性白血病中增加。結合及抑制CD39表現細胞中之CD39的抗體揭示於WO2009/095478中。抗體「A1」 (eBiosciences, Inc.)用於染色應用且不展現中和細胞中CD39活性之能力。Hayes 等人 (2015) Am. J. Transl. Res. 7(6):1181-1188利用了抗CD39，其結合FcγR且具有效應功能，但據陳述其亦阻斷。CD39在不同細胞類型(包括白血球及腫瘤細胞)上表現以及使用實際上不阻斷CD39或並非純阻斷劑之抗體，形成了對於評價抗體之基礎活性而言複雜的環境。迄今為止，CD39活性位點之唯一經報導的抑制劑仍為藉由ARL67156例示之小分子非可水解ATP類似物，表明需要活性位點之直接抑制。然而，ARL67156並不對CD39具有特異性，且亦抑制諸如NTPD酶1、NTPD酶3、NPP1或小鼠NTPD酶8之其他NTPD酶，且此外僅作為弱競爭性抑制劑(Levesque 等人 (2007) Br. J. Pharmacol. 152:141-150)。
CD39具有兩個靠近N端末端及C端末端之跨膜域、短細胞質N端及C端區段及含有活性位點之大細胞外域。然而，雖然CD39通常藉由在分子之兩末端處之兩個跨膜域錨定至膜，但近年來亦已報導CD39之可溶性催化活性形式可見於人類及小鼠中之循環中(Yegutkin 等人, (2012) FASEB J. 26(9): 3875-3883)。儘管有所描述之各種抗CD39抗體，但尚未報導過能夠抑制可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的抗體。
發明人已獲得抑制可溶性(細胞外域)人類CD39蛋白之酶(ATP酶活性)活性之抗體。抗體額外結合存在於表現在細胞(包括腫瘤細胞)之表面處的人類CD39蛋白上之抗原決定基，及強力抑制細胞膜結合CD39酶(CD39表現在細胞之表面處)之酶(ATP酶活性)活性。抗體可有利地用於藉由中和膜結合及可溶性CD39蛋白(包括自腫瘤細胞釋放或脫落之可溶性CD39)來達成個體中之CD39活性之較強中和，由此減少免疫抑制，例如用於治療癌症及/或傳染病。儘管先前已描述抑制膜結合CD39酶之酶(ATP酶活性)活性的其他抗CD39抗體，但彼等抗體不抑制不結合至細胞膜之可溶性CD39蛋白。
在一個實施例中，提供抗CD39抗原結合域，或包含此類之蛋白(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，該抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含具有展示於SEQ ID NO: 8、9及10中之各別胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因(例如IGHV1-3*01)之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況來自人類IGHJ1基因(例如IGHJ1*01)的另外構架4 (FR4)胺基酸序列)；及具有展示於SEQ ID NO: 11、12及13中之各別胺基酸序列的輕鏈可變區(VL) CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV4-1 (例如IGK4-1*01)基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列，及視情況來自人類IGKJ4 (例如IGKJ4*01)基因之另外構架4 (FR4)胺基酸序列。在一個實施例中，VH進一步包含在選自由48、67、71及76組成之群的Kabat位置處，存在於人類構架序列中之殘基藉由不同殘基(例如存在於非人類構架中之殘基)的一個或多個胺基酸取代。在一個實施例中，VH包含一個或多個在重鏈CDR2 (例如在Kabat位置60及/或64處)中之胺基酸取代。視情況，位置60處之殘基為絲胺酸(例如CDR2包含N60S取代)。視情況，存在於Kabat位置64之殘基為麩醯胺酸(例如CDR2包含K64Q取代)。在一個實施例中，存在於VL中在Kabat位置24處之殘基為離胺酸(例如CDR1包含R24K取代)。視情況，其中苯丙胺酸在Kabat位置36處存在於VL中。
在一個實施例中，提供抗CD39抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，抗原結合域或包含此類抗原結合域之蛋白包含重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO: 27至34中之任一者之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且視情況進一步包含在選自由48、67、71及76組成之群的Kabat位置處，存在於人類構架序列中之殘基藉由不同殘基(例如存在於非人類框架中之殘基)的一個或多個胺基酸取代；及輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO: 35至37中之任一者之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，視情況，其中苯丙胺酸存在於Kabat位置36處。在一個實施例中，VH進一步包含在Kabat位置60及/或64處的在重鏈CDR2中之一個或多個胺基酸取代。視情況，存在於Kabat位置60之重鏈中之殘基為絲胺酸殘基。視情況，存在於Kabat位置64之重鏈中之殘基為麩醯胺酸殘基。在一個實施例中，VL進一步包含在Kabat輕鏈位置24處的在輕鏈CDR2中之胺基酸取代，視情況另外其中存在於位置24處在輕鏈中之殘基為離胺酸殘基。
視情況，在Kabat重鏈位置48處之胺基酸為異白胺酸。視情況，在Kabat重鏈位置67處之胺基酸為丙胺酸。視情況，在Kabat重鏈位置71處之胺基酸為纈胺酸。視情況，在Kabat重鏈位置76處之胺基酸為精胺酸。
在一個實施例中，VH在Kabat位置67處包含丙胺酸殘基及在位置71處包含纈胺酸。
在一個實施例中，VH在Kabat位置48處包含異白胺酸殘基，在Kabat位置67處包含丙胺酸殘基，在Kabat位置71處包含纈胺酸及在Kabat位置76處包含精胺酸。
在一個實施例中，VL在Kabat位置36 (FR2)處包含苯丙胺酸。在一個實施例中，VL在Kabat位置24 (CDR1)處包含離胺酸。
在任何實施例中，抗CD39抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白(例如單株抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)的特徵可為 包含重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，提供抗CD39抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白(例如單株抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，抗原結合域包含重鏈可變區(VH)，其包含具有展示於SEQ ID NO: 8、9及10中之各別胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及人類構架(例如人源性FR1、FR2、FR3及FR4)；及包含展示於SEQ ID NO: 11 (或17或18)、12及13中之各別胺基酸序列的輕鏈可變區(VL) CDR1、CDR2及CDR3，及人類構架(例如人源性FR1、FR2、FR3及FR4)，其中(VH)包含與SEQ ID NO: 31或6之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)包含與SEQ ID NO: 36或37之任一者之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在任何實施例中，VH的特徵可為包含在Kabat位置48、67、71及76中之一者、兩者、三者或全部處之取代。在一個實施例中，在位置48處之殘基為異白胺酸(例如M48I取代)。在一個實施例中，在位置67處之殘基為丙胺酸(例如V67A取代)。在一個實施例中，在位置71處之殘基為纈胺酸(例如R71V取代)。在一個實施例中，在位置76處之殘基為精胺酸(例如S76R取代)。在任何實施例中，VL的特徵可為包含在Kabat位置36處之取代。在一個實施例中，在位置36處之殘基為苯丙胺酸(例如Y36F取代)。
在一個實施例中，VH包含人類VH構架胺基酸序列且VL包含人類VL構架胺基酸序列。在一個實施例中，VH人類受體構架之VH區段係來自人類IGHV1-3基因區段，視情況另外其中J區段係來自人類IGHJ1基因區段。在一個實施例中，VH人類構架係來自人類IGHV1-3*01基因區段。在一個實施例中，VL域人類受體構架係來自人類IGKV4-1基因區段，視情況另外其中J區段係來自人類IGKJ4基因區段。
在一個實施例中，提供抗CD39抗原結合域，或包含抗原結合域之蛋白(例如單株抗體、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，抗原結合域選自由以下組成之群：  (a)抗體結合域，其包含有包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列的重鏈可變區；及  (b)抗體結合域，其包含有包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的輕鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列的重鏈可變區。
在任何實施例中，抗體重鏈包含人類CH1恆定域及(視情況人類IgG1同型之)人類Fc域，其視情況進一步包含SEQ ID NO: 23、24、25或26中之任一者之胺基酸序列。在任何實施例中，抗體輕鏈包含人類輕鏈恆定域，視情況其中恆定域為人類κ域。
在一個實施例中，提供包含重鏈及輕鏈之抗CD39抗體，該重鏈包含與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含重鏈及輕鏈之抗CD39抗體，該重鏈包含與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，提供抗CD39抗體或抗體片段，其包含有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的輕鏈。
在一個實施例中，提供抗CD39抗體或抗體片段，其包含有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的輕鏈。
在任何實施例中，抗原結合域或包含此類之蛋白(視情況抗體或抗體片段)的特徵可結合至及抑制或中和可溶性CD39蛋白(sCD39)之ATP酶活性。在一個實施例中，sCD39蛋白不具有存在於膜結合CD39中之兩種跨膜域(亦即靠近N端末端及C端末端之跨膜域)。在一個實施例中，sCD39為在循環中(例如在人類個體中)發現之非膜結合sCD39蛋白。在一個實施例中，sCD39包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或由其組成，視情況進一步包含C端標籤或另一非CD39衍生之胺基酸序列；視情況其中SEQ ID NO: 43之胺基酸序列在其N端殘基1至37處進一步不具有SEQ ID NO: 1之序列。sCD39蛋白之特徵為包含CD39之Thr38-Val478片段或由其組成。具有C端His標籤之Thr38-Val478蛋白可購自R&D Systems, Inc. (產品編號4397-EN)。在一個實施例中，蛋白、抗體或抗體片段在與呈溶液形式之sCD39一起培育時抑制sCD39之ATP酶活性，例如根據在不存在如本文所揭示的細胞之情況下進行的方法或分析法(參見例如實例、方法)，例如在腫瘤細胞上澄液中。在一個實施例中，呈可溶性(細胞外域蛋白)及呈膜結合形式的蛋白、抗體或抗體片段均特異性結合人類CD39蛋白。
不希望受理論所束縛，一些抗體可藉由抑制膜結合CD39 (memCD39)之域運動來中和膜結合CD39，然而不類似地影響可溶性CD39蛋白(sCD39)之活性。據報導，memCD39作為均多聚體存在，而sCD39為單體，且此外memCD39中之跨膜域經歷動態運動，其為與活性位點之功能關係的基礎。因此，不同於sCD39，memCD39可提供使抗體介導之中和成為可能之背景。一種可能性為功能中和需要使用同步結合至兩種memCD39分子(例如在memCD39均多聚物內)之二價抗體。
除用作二價結合子以外，中和sCD39 (及memCD39)之活性的本發明抗體作為單價結合子亦可有效，無論其除sCD39以外是否靶向memCD39。因此，在一個實施例中，提供單價結合至人類CD39蛋白(sCD39及/或memCD39)且中和其酶(ATP酶)活性之抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可視情況指定為結合至單一CD39蛋白及/或攜帶能夠結合至CD39蛋白之單一抗原結合域。在一個實施例中，提供抗體片段(視情況F(ab)片段、單鏈抗體、scFv、多特異性抗體)，其單價結合至人類CD39蛋白(sCD39及/或memCD39)且中和其酶(ATP酶)活性。在一個實施例中，單價結合至人類CD39蛋白之CD39中和抗原結合蛋白為多特異性抗原結合蛋白，例如多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體等。在一個實施例中，單價結合至人類CD39蛋白之CD39中和抗原結合蛋白包含結合CD39 (sCD39及/或memCD39)之第一(或單一)抗原結合域及結合除CD39以外之蛋白的第二抗原結合域。
有利地，在一個實施例中，抗體包含經修飾以具有減少之或實質上不存在與人類Fcγ受體之結合的人類Fc域，例如人類CD16、CD32a、CD32b及CD64中之一或多者(或全部)。在一個態樣中，抗體之CD39抑制活性不取決於ADCC、CDC或毒素介導之CD39表現細胞耗乏。此等抗體可用作「純」CD39阻斷劑，允許免疫調節活性。
在替代性實施例中，可產生結合分子以使得其經由其Fc域保持及/或介導效應功能。在一個實施例中，抗體包含結合至人類Fcγ受體(例如人類CD16、CD32a、CD32b及CD64中之一或多者(或全部))的人類Fc域。
在另一實施例中，Fc域可經修飾以減少Fcγ受體結合，視情況藉由保持與一或多種人類Fcγ受體之結合但減少與一或多種其他人類Fcγ受體之結合。
在一個態樣中，抗體特異性結合血管CD39，例如抗體結合具有SEQ ID NO: 1之序列的多肽但不結合所分泌之CD39同功異型物多肽，例如CD39-L2及/或-L4多肽。視情況，抗CD39抗體特異性結合血管CD39，例如抗體結合具有SEQ ID NO: 1之序列的多肽但不結合膜結合CD39同功異型物，例如CD39-L1及/或-L3多肽。
本發明之抗體可抑制在細胞表面處表現的膜結合CD39蛋白之酶活性。
在一個態樣中，抗體之CD39抑制活性不取決於CD39下調。
在存在或不存在CD39內化之誘導之情況下，及在存在或不存在CD16 (FcγIII受體)之結合的情況下及/或在存在或不存在實質上將ADCC及/或CDC導向CD39表現細胞之情況下，本發明之抗體可除抑制可溶性CD39以外，還能夠抑制在細胞表面處表現之膜結合CD39蛋白的酶活性。視情況，抗體保持Fc域且保持結合至人類FcRn。
雖然藉由誘導ADCC及/或CDC起作用之抗體可甚至在不完全中和/抑制CD39之ATP酶活性的情況下有效，但只要足夠的抗體結合至CD39表現細胞以誘導ADCC，中和非耗乏性抗體可需要ATP酶之酶活性的較強抑制。在一個實施例中，非耗乏性抗體將提供至少50%、60%、70%、80%或90%的可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的降低(例如如藉由本文所揭示之方法評估)，其視情況進一步在與向人類投與抗體相容之濃度下。在一個實施例中，非耗乏性抗體將提供至少70%、80%、90%之CD39表現細胞之ATP酶活性的降低(例如如藉由本文所揭示之方法所量測，藉由諸如B細胞、拉莫斯(Ramos)細胞之CD39+細胞之AMP生產的降低來評估)，其視情況進一步在與向人類投與抗體相容之濃度下。
如由一系列細胞(例如癌細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、經轉染細胞)表現之結合於抗體的CD39上之抗原決定基存在於CD39多肽上，且如藉由流式細胞測量術所測定以高親和力結合。
抗體之特徵可視情況在於結合至在其表面處表現CD39多肽之細胞的EC50 ，其如藉由流式細胞測量術所測定不超過2 µg/ml、不超過1 µg/ml、不超過0.5 µg/ml、不超過0.1 µg/ml或不超過0.05 µg/ml。在一個實施例中，細胞為以在其表面表現CD39而製得之細胞。在一個實施例中，細胞為在其表面處內源性表現CD39之細胞，例如調節T (TReg)細胞、B細胞、癌細胞、淋巴瘤細胞(例如拉莫斯細胞)、白血病細胞、膀胱癌細胞、神經膠瘤細胞、神經膠母細胞瘤細胞、卵巢癌細胞、黑素瘤細胞、前列腺癌細胞、甲狀腺癌細胞、食道癌細胞或乳癌細胞。
在一個態樣中，抗CD39抗體能夠：(a)抑制在細胞表面處表現的膜結合CD39蛋白(例如包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列)之酶活性，及(b)抑制可溶性CD39蛋白之酶活性。在一個實施例中，抗體不實質上結合(例如經由其Fc域)至人類Fcγ受體(例如CD16、CD32a、CD32b、CD64)及/或C1q，及/或不實質上將ADCC及/或CDC導向CD39表現細胞。視情況，抗體保持Fc域且保持結合至人類FcRn。
在一個實施例中，以可有效中和sCD39及/或memCD39之酶活性持續所要時段(例如1週、2週、一個月)直至下一次連續投與抗CD39抗體的量投與抗體。
在一個實施例中，以提供至少等於抑制sCD39蛋白之ATP酶活性的EC50 、EC70 或EC100 的抗體血液濃度之劑量及/或頻率投與抗體，視情況其中維持濃度至少1週、2週、一個月或直至抗CD39抗體之下一次連續投藥。
在一個態樣中，抗體結合CD39上之抗原決定基，該CD39包含選自由R138、M139及E142 (參見SEQ ID NO: 1)組成之群的胺基酸殘基(例如殘基之一者、兩者或三者)。
在一個態樣中，相較於野生型CD39多肽(SEQ ID NO: 1之CD39多肽)，抗CD39抗體展現與在選自由以下組成之群之殘基中之一者、兩者或三者處具有突變的CD39多肽的減少之結合(例如實質上結合之完全損失)：R138、M139及E142 (參見SEQ ID NO: 1)；視情況，突變型CD39多肽具有突變：R138A、M139A及E142K。在一個視情況存在之態樣中，除突變體19以外，抗體不具有與表1之突變型CD39多肽中之任一者之結合的損失。
在一個實施例中，CD39中和抗體之特徵可在於能夠以純化形式引起在無細胞分析法(例如來自腫瘤細胞培養物上澄液之sCD39)中的sCD39蛋白之ATP酶活性降低，視情況引起由sCD39產生之AMP減少至少70%、80%或90%；視情況引起存在之ATP增加(與陰性對照相比)，例如如在本文揭示之分析法中所評估。舉例而言，可藉由在與抗CD39抗體一起培育之後，定量與存在之ATP之量成比例的發光單位來評估sCD39抑制。在一個實施例中，CD39中和抗體之特徵可在於抑制sCD39蛋白之ATP酶活性的EC50 ，其不超過1 µg/ml，視情況不超過0.5 µg/ml，視情況不超過0.1 µg/ml。
視情況，在無細胞型式之分析法中，藉由使用Cell Titer GloTM (Promega)定量發光單位來測定對sCD39蛋白之ATP酶活性之抑制，在該分析法中將劑量範圍之測試抗體與實例、方法中所述之可溶性重組人類CD39蛋白一起在37℃下培育1小時，其中在添加Cell Titer GloTM (CTG)試劑之前在37℃下向盤添加20 µM ATP持續額外30分鐘，且在暗處培育5分鐘之後使用Enspire™光度計定量所發射的光(參見例如實例、方法)。
在一個實施例中，sCD39蛋白為發現於或獲自人類腫瘤細胞培養物上澄液中，視情況來自以高水平表現CD39之腫瘤細胞株，視情況來自拉莫斯腫瘤細胞之脫落sCD39蛋白。
視情況，CD39中和抗體之特徵可進一步在於能夠以純化形式引起細胞之CD39之ATP酶活性降低，視情況引起由CD39表現細胞產生之AMP降低至少70%、80%或90%。在一個實施例中，CD39中和抗體之特徵可在於抑制由細胞表現之CD39之ATP酶活性的EC50 (例如抑制CD39表現細胞之AMP產生之EC50 )，其不超過1 µg/ml，視情況不超過0.5 µg/ml，視情況不超過0.1 µg/ml。
視情況，藉由定量由ATP之水解產生之AMP評估拉莫斯細胞中ATP酶活性之中和，來測定由細胞表現之CD39之ATP酶活性的抑制(參見例如實例、方法)。
在一個態樣中，藉由以下方法測定藉由CD39表現細胞之ATP酶活性之中和：使CD39表現細胞(例如如本文所用之拉莫斯淋巴瘤細胞，可供用於來自ATCC之實例，ATCC參考編號CRL-1596)接觸抗體，且評估AMP之產生，例如藉由質譜法，其中所產生之AMP的減少指示ATP酶活性之中和。視情況，在此分析法中，抗體使所產生之AMP減少至少70%、80%或90%。視情況，抗體藉由B細胞使細胞外ATP酶活性減少至少70%、80%或90%。
在一個態樣中，中和抗CD39抗體結合存在於表現在細胞表面處之sCD39及CD39 (memCD39)上的抗原決定子。
在一態樣中，中和抗CD39抗體競爭結合至結合於抗體mAb20、mAb21 (或其親代I-394抗體)的CD39上之抗原決定基，(例如與具有mAb20、mAb21或I-394之任一者之重鏈及輕鏈CDR或可變區的抗體競爭結合至CD39多肽上之抗原決定基)。
在本文實施例中之任一者的一個態樣中，抗原結合化合物結合相同抗原決定基及/或與單株抗體mAb20、mAb21 (或其親代I-394抗體)競爭結合至CD39多肽(例如結合相同抗原決定基及/或與具有mAb20、mAb21 (或I-394)之重鏈及輕鏈CDR或可變區之抗體競爭結合至CD39多肽)。在一個實施例中，抗原結合化合物結合相同抗原決定基及/或與分別具有SEQ ID NO: 38及39之VH及VL區的抗體競爭結合至CD39多肽。
在一個實施例中，抗CD39抗體結合包含一種、兩種或三種選自由以下組成之群的胺基酸殘基之抗原決定基：結合於mAb20、mAb21 (或I-394)的CD39上之胺基酸殘基。
在任何實施例中，結合分子(例如抗體或抗體片段)包含有包含抗體I-394之重鏈CDR1、2及3 (例如如本文所描述)的可變重鏈域(VH )，及包含各別I-394抗體之輕鏈CDR1、2及3 (例如如本文所描述)的可變輕鏈域(VL )，或胺基酸序列，其中CDR (或重鏈及/或輕鏈CDR之集)與該CDR (或該重鏈及/或輕鏈CDR之集)具有至少70%、80%、90%或95%胺基酸一致性，其中VH及VL各自包含人源性構架域(例如VH及VL不同於SEQ ID NO: 6及7之各別VH及VL)。視情況，CDR係根據Kabat或IMGT編號流程測定。
在一個態樣中，包含蛋白之抗體或抗體片段包含經修飾(與同型之野生型Fc域相比)之Fc域，該Fc域經修飾以減少Fc域及人類CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64多肽之間的結合，其中抗體包含：(i)包含SEQ ID NO: 31之重鏈可變區之CDR 1、2及3的重鏈，及(ii)包含SEQ ID NO: 36或37之輕鏈可變區之CDR 1、2及3的輕鏈。在一個態樣中，Fc域經修飾(與同型之野生型Fc域相比)以減少Fc域及人類C1q多肽之間的結合。在一個實施例中，抗體在選自由以下組成之群的殘基之任一者、兩者、三者、四者、五者或更多者處在重鏈恆定區中包含胺基酸取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330及331 (Kabat EU編號)。在一個實施例中，抗體在選自由以下組成之群的殘基之任三者、四者、五者或更多者處在重鏈恆定區中具有胺基酸取代：234、235、237、322、330及331。
在一個實施例中，以足以中和在腫瘤微環境及/或循環中之sCD39活性的量及頻率向患有癌症之個體投與抗體。在一個實施例中，以足以降低在腫瘤微環境中之腺苷的產生及/或濃度之量及頻率投與抗體。在一個實施例中，以足以降低在腫瘤微環境中之AMP的產生及/或濃度之量及頻率投與抗體。在一個實施例中，以足以中和由腫瘤細胞表現之CD39之活性的量及頻率投與抗體。在一個實施例中，以足以中和由白血球或淋巴細胞(例如CD4 T細胞、CD8 T細胞、TReg細胞及/或B細胞)表現之CD39之活性的量及頻率投與抗體。
抗體將適用於抑制CD39介導之ATP水解，例如由此引起腫瘤微環境及/或循環中腺苷之濃度的降低。因此，此等抗體將適用於逆轉CD39及/或腺苷對T細胞、B細胞及表現腺苷受體(A2A受體)之其他細胞的免疫抑制作用，例如在治療癌症中。在一個實施例中，抗CD39抗體中和T細胞中之增殖、細胞介素產生、細胞毒性及/或NFκB活性的腺苷介導抑制。
在另一態樣中，提供用於治療個體之方法，該方法包含向個體(例如患有疾病、腫瘤等之個體)投與治療活性量之本文所述之抗CD39抗原結合化合物中之任一者。
抗體將適用於抑制至腫瘤微環境中及/或在循環中之腺苷產生、量及/或濃度，包括(但不限於)特徵在於以下之腫瘤：可偵測、顯著、增加或提昇之腺苷產生、ATP分解代謝或CD39/CD73軸線之分解代謝活性(例如與參考值相比)。此外，在增加的濃度下，中和可溶性CD39之抗體提供對CD39/CD73軸線之分解代謝活性的實質上完全抑制。在一個實施例中，在其特徵在於CD73蛋白之存在的腫瘤(例如具有可溶性CD73及/或CD73表現細胞之腫瘤；CD73陽性腫瘤)中，抗體將適用於抑制至腫瘤微環境中之腺苷產生、量及/或濃度。
在一個實施例中，中和可溶性CD39蛋白之本發明抗體可有利地與CD73阻斷組合使用，例如可向患有癌症之個體組合投與本發明抗體與抑制CD73活性之試劑。
在一個態樣中提供用於治療個體之方法，該方法包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：向個體(例如患有疾病、腫瘤等之個體)投與治療活性量之本發明抗原結合化合物，其抑制CD39多肽。在一個實施例中，向個體組合投與抗CD39抗原結合化合物(例如抗體)與第二治療劑。在一個實施例中，第二治療劑為中和人類CD73之5'-外核苷酸酶活性的試劑(例如抗體)。在一個實施例中，第二治療劑為中和人類PD-1之抑制活性的試劑(例如抗體)，視情況抗-PD-1抗體，視情況抗-PD-L1抗體。在一個實施例中，第二治療劑包含誘導自腫瘤細胞之ATP細胞外釋放及/或誘導腫瘤細胞死亡的試劑或治療劑(例如化學治療劑、紫杉烷(taxane)、蒽環黴素(anthracycline)、喜樹鹼(camptothecin)、埃博黴素(epothilone)、絲裂黴素(mytomycin)、考布他汀(combretastatin)、長春花屬生物鹼(vinca alkaloid)、氮芥、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamycin)、多卡黴素(duocarmycin)、妥布賴森(tubulysin)、海兔毒素(dolastatin)或奧瑞他汀(auristatin)、烯二炔、毒傘毒素(amatoxin)、吡咯并苯并二氮呯、伸乙基亞胺、放射性同位素、治療蛋白或肽、或毒素)。
在一個實施例中，向患有癌症之個體及反應較差或對反應的預後較差的個體投與抗CD39抗原結合化合物(例如抗體)，以用中和人類PD-1之抑制活性的試劑進行治療。在一個實施例中，抗體在細胞分析法中抑制CD39多肽。在一個實施例中，化合物為非耗乏性抗體(不耗乏其結合至之細胞的抗體，例如Fc沉默抗體)。視情況，化合物以二價方式結合至CD39多肽。視情況，抗體為嵌合、人類化或人類抗體。視情況，抗體包含經修飾以消除與人類Fcγ受體(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64)之結合的IgG (例如IgG1)同型之重鏈恆定區。
在一個態樣中，提供用於減少藉由CD39表現細胞(例如個體中之白血球及/或腫瘤細胞)之ATP水解的方法，或用於中和細胞CD39之酶活性的方法，該方法包含：使CD39表現細胞與抑制CD39之本發明抗原結合化合物(例如抗體或抗體片段)接觸。在一個實施例中，使CD39表現細胞與本發明之抗原結合化合物接觸的步驟包含向個體投與治療活性量之抑制CD39之抗原結合化合物。在一個實施例中，個體患有癌症。
在一個態樣中，提供減少存在於腫瘤環境(例如個體中)中之腺苷的方法，該方法包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：向個體投與治療活性量的抑制CD39多肽之本發明抗原結合化合物(例如抗體或抗體片段)。在一個實施例中，個體患有癌症。
在一個實施例中，抑制CD39多肽之抗體的活性量為可有效地實現及/或維持(例如直至抗原結合化合物之後續投藥)血液濃度之量，該血液濃度至少為抑制個體中CD39介導之ATP向AMP的分解代謝之EC50 ，視情況EC70 ，視情況實質上EC100 。在一個實施例中，抑制CD39多肽之抗原結合化合物之活性量為可有效達成用於抑制在個體之血管外組織中ATP向AMP的CD39介導分解代謝的EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 的量。在一個實施例中，抑制CD39多肽之抗原結合化合物的活性量為可有效達成用於抑制在個體中ATP向AMP的CD39介導分解代謝的EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 的量。在一個實施例中，抑制CD39多肽之抗原結合化合物的活性量在每公斤體重1與20 mg之間。在一個實施例中，每週、每兩週、每月或每兩個月向個體投與活性量。
視情況，個體為患有癌症或易患癌症之人類。視情況，個體為患有癌症或易患癌症之人類，其特徵在於表現CD39之惡性細胞及/或可溶性CD39蛋白之存在(分泌或脫落)。視情況，個體為患有癌症或易患癌症之人類，且其具有可偵測含量之循環可溶性細胞外CD39蛋白或表現CD39之腫瘤浸潤白血球。
抗體之特徵視情況在於對人類CD39多肽之結合親和力(KD )，其小於(優於) 10-9 M，較佳小於10-10 M，或較佳小於10-11 M，及/或在於以低於(結合優於) 1 µg/ml之EC50 結合人類CD39，較佳其中抗體具有結合至在細胞表面表現人類CD39的細胞(例如腫瘤細胞)的EC50 ，其不超過0.5 µg/ml，視情況不超過0.2 µg/ml，視情況不超過0.1 µg/ml。
抗體視情況為嵌合、人類或人類化抗體。
抗體之特徵視情況在於中和CD39表現細胞(例如拉莫斯腫瘤細胞)中之CD39酶活性的EC50 ，其小於(優於) 1 µg/ml，視情況小於0.5 µg/ml。
在一個實施例中，抗體為保留結合特異性及中和CD39酶活性之能力的單株抗體或其片段。在一個實施例中，抗體為IgG1抗體。舉例而言，抗體可為包含經修飾以減少Fc域與Fcγ受體(例如CD16)之間的結合的人類IgG1同型之Fc域的抗體。在一個實施例中，抗體或片段不具有Fc域或包含不誘導抗體介導之細胞毒性(ADCC)及/或CDC的Fc域；視情況抗體或其片段包含不結合至FcRIIIA (CD16)多肽之Fc域。在一個實施例中，Fc域(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型之Fc域)與野生型Fc域相比包含胺基酸修飾(例如取代)，其中取代降低Fc域(或含有其之抗體)結合至Fcγ受體(例如CD16)及/或結合互補序列之能力。在一個實施例中，抗體或其片段不連接至毒性部分。
亦提供編碼具有前述特性中之任一者之人類化抗體或抗體片段的核酸、包含此類核酸之載體、包含此類載體之細胞及產生人類抗CD39抗體之方法，其包含在適用於表現抗CD39抗體之條件下培養此類細胞，且視情況復原或純化所產生的抗體。本發明亦關於組合物，諸如醫藥學上可接受之組合物及套組，其包含此類蛋白質、核酸、載體及/或細胞及通常一或多種額外成分，其可為促進調配、遞送、穩定性或組合物之其他特徵的活性成分或非活性成分(例如各種載劑)。本發明進一步關於各種新穎且適用的方法，其製備及諸如在調節CD39介導之生物活性中，例如在治療與其相關之疾病(尤其癌症)中，使用此類抗體、核酸、載體、細胞、生物體及/或組合物。
本發明亦提供一種增強有需要之個體中之淋巴細胞(例如T細胞)活性或用於恢復淋巴細胞(例如T細胞)之活性的方法，或緩解腺苷介導之淋巴細胞(例如T細胞)抑制的方法，該方法包含向個體投與有效量之前述組合物中之任一者。在一個實施例中，個體為罹患癌症之患者。舉例而言，患者可罹患實體腫瘤，例如結腸直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳癌或惡性黑素瘤。或者，患者可罹患造血癌症，例如急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、多發性骨髓瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)。
本發明亦提供一種用於治療個體之疾病的方法，該治療包含向個體投與中和CD39酶活性的抗CD39抗體持續至少一個投藥循環，其中投與抗CD39抗體至少一次，視情況至少兩次，其中抗CD39抗體之量可有效達成，及/或在兩次連續抗CD39抗體投藥之間維持，血液(血清)或血管外組織(例如腫瘤環境)中之濃度，該濃度至少對應於中和CD39酶活性之EC50 (例如介於0.01與0.5 µg/ml之間的EC50 )，視情況EC70 或視情況EC100 (例如介於0.05與1 µg/ml之間、介於0.1與1 µg/ml之間的EC100 )。抗體可例如如下投與：以在循環中或在血管外組織(例如腫瘤環境)中達成及/或維持至少約0.1 µg/ml、0.5 µg/ml、1 µg/ml或2 µg/ml之濃度的量。舉例而言，為達成在血管外組織中的濃度在0.05與1 µg/ml之間或0.1與1 µg/ml之間，抗CD39抗體係以可有效達成抗CD39抗體在循環中的濃度在0.5及10 µg/ml之間或在1及10 µg/ml之間的量投與。視情況，投與抗CD39抗體至少兩次，且以以下量投與：其在兩次連續抗CD39抗體投藥之間及/或整個投藥循環期間，可有效維持抗CD39抗體之濃度至少為前述濃度，持續至少1週、2週、3週、4週。
本發明亦提供一種用於治療個體之疾病的方法，該治療包含向個體投與中和CD39酶活性的抗CD39抗體持續至少一個投藥循環，其中投與抗CD39抗體至少一次，視情況至少兩次，其中抗CD39抗體之量可有效達成，及/或在兩次連續抗CD39抗體投藥之間維持，至少1 µg/ml、視情況至少10 µg/ml、視情況在1及100 µg/ml之間的血液或組織抗CD39抗體濃度。視情況，投與抗CD39抗體至少兩次，且以以下量投與：其在兩次連續抗CD39抗體投藥之間及/或整個投藥循環期間，可有效維持抗CD39抗體之持續血液或組織濃度為至少1 µg/ml、視情況至少10 µg/ml、視情況在1及100 µg/ml之間，持續至少1週、2週、3週、4週。
此等態樣更充分地描述於本文中所提供之實施方式中，且額外態樣、特性及優點將自本文中所提供之實施方式而顯而易見。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2018年6月18日申請之美國臨時申請案第62/686,165號之權利；該申請案以全文引用之方式併入本文中；包括任何圖式。
序列表之參考 本申請案與電子格式之序列表一起提交。序列表以題為「CD39-9_ST25」之文件形式提供，創建於2019年5月27日，其大小為72 KB。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。
定義  當使用「包含」時，此可視情況由「基本上由……組成」或由「由……組成」置換。
人類CD39展現ATP酶活性，人類CD39亦稱為「血管」CD39、NTP酶1、ENTPD1、ATPD酶及血管ATP二磷水解酶。CD39將細胞外ATP及ADP水解為AMP，其藉由另一種酶(即5-核苷酸酶)進一步轉化為腺苷。「血管」人類CD39成熟多肽鏈之胺基酸序列在寄存編號P49961下展示於Genbank中，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中，且如下：
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。
在本文中之上下文中，在指代CD39多肽(例如「中和CD39」、「中和CD39之活性」或「中和CD39之酶活性」)時，「中和(neutralize)」或「中和(neutralizing)」係指其中抑制CD39之ATP水解(ATP酶)活性的過程。此尤其包含抑制CD39介導之AMP及/或ADP的產生，亦即抑制CD39介導之ATP向AMP及/或ADP的分解代謝。對於膜結合CD39，此可例如在細胞分析法中量測，該細胞分析法直接或間接地量測測試化合物抑制ATP向AMP及/或ADP轉化的能力。對於可溶性CD39，此可藉由將如本文所述之重組可溶性CD39與測試化合物一起培育，且直接或間接地量測ATP向AMP及/或ADP之轉化率來量測。舉例而言，如本文所述，可例如藉由定量與存在之ATP之量成比例的發光單位來評估ATP之消失及/或AMP之產生。在一個實施例中，參考例如本文所述之分析法(例如ATP之消失及/或AMP之產生)，抗體製劑引起ATP向AMP之轉化降低至少60%，ATP向AMP之轉化降低至少70%，或ATP向AMP之轉化降低至少80%或90%。
每當關於抗CD39結合劑(例如抗體)提及「治療癌症」或其類似物時，此可包括：(a)治療癌症之方法，該方法包含以下步驟：以允許治療癌症之劑量(治療有效量)，較佳以如本文所指定之劑量(量)，向需要此類治療之個體、哺乳動物、尤其人類投與(持續至少一次治療)抗CD39結合劑(較佳在醫藥學上可接受之載劑材料中)；(b)抗CD39結合劑用於治療癌症之用途，或抗CD39結合劑供該治療(尤其在人類中)之用；(c)抗CD39結合劑用於製造用於治療癌症之醫藥製劑之用途，使用抗CD39結合劑用於製造用於治療癌症之醫藥製劑之方法，視情況包含摻合抗CD39結合劑與醫藥學上可接受之載劑，或包含適於治療癌症之抗CD39結合劑之有效劑量的醫藥製劑；或(d)根據在申請案所申請之國家中申請專利所允許的標的物，a)、b)及c)之任何組合。
如本文所用，術語「抗原結合域」係指包含能夠免疫特異性結合至抗原決定基之三維結構的域。因此，在一個實施例中，該域可包含高變區，視情況抗體鏈之VH及/或VL域，視情況至少VH域。在另一實施例中，結合域可包含抗體鏈之至少一個互補決定區(CDR)。在另一實施例中，結合域可包含來自非免疫球蛋白骨架之多肽域。
如本文所用，術語「抗體」可包括多株及單株抗體。取決於重鏈中恆定域的類型，將抗體分配至以下五個主要類別中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。將此等中之若干者進一步分成子類或同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其類似物。例示性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚物。各四聚物由兩對相同之多肽鏈構成，各對具有一條「輕」 (約25 kDa)及一條「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之N端限定具有約100至110種或更多種主要引起抗原識別之胺基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL )及可變重鏈(VH )分別指此等輕及重鏈。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為「α」、「δ」、「ε」、「γ」及「μ」。不同類別之免疫球蛋白的子單元結構及三維組態為已熟知的。IgG為本文所用抗體之例示性類別，因為其為生理情況下最常見之抗體且因為其最易於在實驗室環境中製備。視情況抗體為單株抗體。抗體之特定實例為人類化、嵌合、人類或其他情況下人類適合之抗體。「抗體」亦包括本文所述之抗體中之任一者的任何片段或衍生物。
如使用蛋白質之重組形式、其中之抗原決定基或存在於經分離目標細胞表面上之天然蛋白質來評估，術語「特異性結合至」意謂抗體可在競爭性結合分析法中較佳結合至結合搭配物，例如CD39。在下文中進一步描述用於測定特異性結合之競爭性結合分析法及其他方法且其為此項技術中所熟知的。
當抗體稱為與特定單株抗體(例如抗體I-394) 「競爭」時，其意謂抗體在使用重組CD39分子或表面表現CD39分子之結合分析法中與單株抗體競爭。舉例而言，若測試抗體在結合分析法中降低參考抗體與CD39多肽或CD39表現細胞之結合，則抗體稱為分別與參考抗體「競爭」。
如本文所用，術語「親和力」意謂抗體與抗原決定基結合之強度。藉由解離常數Kd給出抗體之親和力，Kd定義為[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]為抗體-抗原複合物之莫耳濃度，[Ab]為未結合抗體之莫耳濃度，且[Ag]為未結合抗原之莫耳濃度。親和力常數Ka 由1/Kd定義。用於測定mAb親和力之方法可見於Harlow, 等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan 等人, 編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。此項技術中熟知用於測定mAb親和力之一種標準方法為使用表面電漿子共振(SPR)篩選(諸如藉由用BIAcore™ SPR分析裝置分析)。
在本文中之上下文內，「決定子」表示多肽上之相互作用或結合位點。
術語「抗原決定基」係指抗原決定子，且係抗原上抗體結合至之面積或區域。蛋白抗原決定基可包含直接涉及結合之胺基酸殘基以及由特定抗原結合抗體或肽實際上阻斷之胺基酸殘基，亦即在抗體之「足跡」內的胺基酸殘基。其為可與例如抗體或受體組合之複合抗原分子上之最簡單形式或最小結構面積。抗原決定基可為線性的或構形/結構性的。術語「線性抗原決定基」定義為由在線性胺基酸序列上連續之胺基酸殘基構成的抗原決定基(一級結構)。術語「構形或結構性抗原決定基」定義為由不全部連續之胺基酸殘基構成的抗原決定基，且該等胺基酸殘基因此表示藉由分子摺疊而接近彼此的線性胺基酸序列之分開部分(二級、三級及/或四級結構)。構形抗原決定基依賴於3維結構。因此，術語「構形」通常可與「結構性」互換使用。
術語「內化」可與「細胞內內化」互換使用，其係指與將分子自細胞外細胞表面易位至細胞內細胞表面之過程相關的分子、生物化學及細胞事件。造成分子之細胞內內化的過程為熟知的，且可涉及尤其以下之內化：細胞外分子(諸如激素、抗體及有機小分子)；膜相關分子(諸如細胞表面受體)；及結合至細胞外分子(例如結合至跨膜受體之配位體或結合至膜相關分子之抗體)之膜相關分子之複合物。因此，「誘導及/或增加內化」包含其中起始細胞內內化及/或增加細胞內內化之速率及/或程度的事件。
術語「試劑」在本文中用以表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。術語「治療劑」係指具有生物活性之試劑。
出於本文之目的，「人類化」抗體係指其中一或多種人類免疫球蛋白之恆定及可變構架區與動物免疫球蛋白之結合區(例如CDR)融合的抗體。此類抗體經設計以維持結合區所衍生自之非人類抗體的結合特異性，但避免針對非人類抗體之免疫反應。
當在本文中使用時，術語「高變區」係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區一般包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)，及重鏈可變域中之31-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；Kabat等人1991)及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)及重鏈可變域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)，或用於測定負責抗原結合之基本胺基酸的類似系統。通常，此區域中之胺基酸殘基之編號係藉由同前Kabat等人文獻中所描述之方法來執行。本文中諸如「Kabat位置」、「如Kabat中之可變域殘基編號」及「根據Kabat」之片語係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外之對應於可變域之FR或CDR之縮短或其中之插入的胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在CDR H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於給定抗體，可藉由在抗體序列之同源區處與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。
如本文所用，「構架」或「FR」殘基意謂排除定義為CDR之彼等區域之抗體可變域區域。各抗體可變域構架可進一步再分為藉由CDR分隔開之連續區域(FR1、FR2、FR3及FR4)。
術語「Fc域」、「Fc部分」及「Fc區」係指抗體重鏈之C端片段，例如人類(γ)重鏈之約胺基酸(aa) 230至約aa 450或其在其他類型之抗體重鏈中之對應序列(例如人類抗體之α、δ、ε及μ)或其天然存在之異型。除非另外說明，否則在整個本發明中使用免疫球蛋白之通常接受之Kabat胺基酸編號(參見Kabat等人(1991)免疫相關之蛋白質之序列，第5版，美國公共衛生處，美國國立衛生研究院，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州(MD))。
術語「分離的」、「純化的」或「生物學純的」係指物質實質上或基本上不含如天然狀態下所發現的通常伴隨其之組分。純度及均質性通常使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來確定。實質上純化作為製劑中存在之主要物質的蛋白質。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質/蛋白」在本文中可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。
在用於指代例如細胞或核酸、蛋白或載體時，術語「重組」指示細胞、核酸、蛋白或向量已藉由引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白經修飾，或細胞係衍生自如此修飾之細胞。因此，舉例而言，重組細胞表現不在細胞之天然(非重組)形式內發現之基因或表現在其他情況下異常表現、表現不足或完全不表現之原生基因。
在本文之上下文內，術語「結合」多肽或抗原決定基之抗體表示以特異性及/或親和力結合該決定子之抗體。
當用於兩個或兩個以上多肽之序列之間的關係中時，術語術語「一致性」或「一致」係指多肽之間的序列相關性程度，如藉由兩個或兩個以上胺基酸殘基之串之間的匹配數目所確定。「一致性」用間隙比對(若存在)量測兩個或兩個以上序列之較小者之間的一致匹配的百分比，該等間隙比對係藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「算法」)處理。相關多肽之一致性可藉由已知方法容易地計算。此類方法包括(但不限於)描述於以下文獻中之彼等方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., 版, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., 版, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., 編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., 編, M. Stockton Press, New York, 1991；及Carillo等人, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。
測定一致性之較佳方法經設計以在所測試序列之間產生最大匹配。測定一致性之方法描述於可為公眾獲得之電腦程式中。用於測定兩個序列之間的一致性的較佳電腦程式方法包括GCG程式包，包括GAP (Devereux等人, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程式公開地可購自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)及其他來源(BLAST手冊, Altschul等人NCB/NLM/NIH 貝塞斯達, 馬里蘭州(Md.) 20894；前述Altschul等人)。亦可使用熟知之史密斯沃特曼演算法(Smith Waterman algorithm)以確定一致性。
抗體之產生 抗CD39抗原結合域或包含此類域之蛋白質(例如抗體或抗體片段)結合及中和可溶性人類CD39多肽，例如不具有在膜結合CD39中發現之靠近N及C端末端之兩種跨膜域的人類CD39多肽。在一個實施例中，試劑抑制CD39之ATP酶活性。在一個實施例中，抗體抑制CD39介導之腺苷產生。在一個實施例中，抗體抑制CD39介導之ATP向AMP分解代謝。在一個實施例中，抗體抑制腺苷介導之對淋巴細胞活性(例如T細胞)之抑制。在一個態樣中，抗體係選自全長抗體、抗體片段及合成或半合成抗體衍生分子。
在一個實施例中，強力抑制可溶性(及視情況膜結合) CD39蛋白之酶(ATP酶活性)活性的抗體可固定或限制呈其一種構形的可溶性(及視情況膜結合) CD39蛋白之域運動，由此預防其水解其基質。抗體可藉由同時結合至可溶性(及視情況膜結合) CD39之C及N端域兩者來實現此。
在一個實施例中，抗CD39抗原結合域或包含抗原結合域之抗原結合蛋白(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)包含互補決定區(CDR)及構架區(FR)。抗原結合域可經設計或經修飾以提供所要及/或改良特性。
在一個實施例中，抗CD39抗原結合蛋白能夠結合至且抑制人類CD39多肽之活性，抗原結合蛋白包含VH及VL，其各自包含構架(例如具有人源性胺基酸序列之構架)及CDR1、CDR2及CDR3。在一個實施例中，當結合至CD39時，抗原結合蛋白限制CD39之域運動。視情況，VH及/或VL構架(例如FR1、FR2、FR3及/或FR4)具有人源性。
在某一實施例中，結合分子及域可衍生自免疫球蛋白可變域，例如呈存在於兩條多肽鏈上之相關VL 及VH 域或單鏈抗原結合域(諸如scFv、VH 域、VL 域、dAb、V-NAR域或VH H域)形式。
在一個態樣中，CD39結合劑為選自完全人類抗體、人類化抗體及嵌合抗體之抗體。
在一個態樣中，試劑為抗體之片段，其包含衍生自人類IgG1恆定或Fc域之恆定或Fc域，其例如如本文進一步揭示經修飾。
在一個態樣中，試劑包含選自以下之抗體片段：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重鏈Ig (駱馬或駱駝Ig)、VHH 片段、單一域FV及單鏈抗體片段。在一個態樣中，試劑包含合成或半合成抗體衍生分子，其選自scFV、dsFV、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、κ抗體、IgNAR；及多特異性(例如雙特異性)抗體。試劑可視情況進一步包含Fc域。
在一個態樣中，抗體呈至少部分純化形式。
在一個態樣中，抗體呈基本上經分離之形式。
可藉由此項技術中已知之多種技術產生抗體。在一個實施例中，藉由自抗體庫(例如自噬菌體展示庫產生)選擇來產生本發明之抗體。在另一實施例中，藉由用包含CD39多肽(較佳可溶性人類CD39細胞外域多肽)的免疫原免疫接種非人類動物(較佳小鼠)來產生抗體。CD39多肽可視情況為或包含全長CD39多肽之片段或衍生物，通常免疫原性片段，亦即包含暴露於表現CD39多肽之細胞表面上的抗原決定基之多肽的部分。此類片段通常含有至少約7個成熟多肽序列之連續胺基酸，甚至更佳其至少約10個連續胺基酸。片段通常基本上衍生自受體之細胞外域。在一個實施例中，免疫原在脂膜中，通常在細胞表面包含野生型人類CD39多肽。在一特定實施例中，免疫原包含視情況經處理或經溶解之完好細胞，尤其完好人類細胞。在另一實施例中，多肽為重組CD39多肽。
用抗原使非人類哺乳動物免疫之步驟可以此項技術中熟知之用於刺激小鼠中之抗體產生的任何方式進行(參見例如E. Harlow及D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中)。分離產生抗體之融合瘤為熟知的且可以此項技術中熟知之任何方式進行。
抗體亦可藉由選擇免疫球蛋白之組合庫來產生，如例如在(Ward等人 Nature, 341 (1989) 第544頁，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中)中所揭示。
可容易地使用其中可評估抗體競爭之多種免疫篩選分析法中之任一者來測定一或多種結合至CD39 (尤其與單株抗體mAb20或mAb21同樣結合在CD39上實質上或基本上相同之區域)之抗體的識別。許多此類分析法為常規實踐的且為此項技術中所熟知的(參見例如1997年8月26日發證之美國專利案第5,660,827號，其特定地以引用的方式併入本文中)。
舉例而言，在待檢驗之測試抗體係獲自不同來源動物或甚至為不同Ig同型之情況下，可採用簡單競爭分析法，其中摻合(或預吸附)對照(例如mAb20或mAb21)及測試抗體且施加至含有CD39多肽之樣品，例如如PCT公開案第WO2018/167267號所揭示，其揭示內容以引用之方式併入本文中。基於西方墨點法之協定及BIACORE分析之使用適用於此類競爭研究。
對抗體是否在抗原決定基區內結合的測定可以熟習此項技術者已知的方式進行。作為此類定位/表徵方法之一個實例，可藉由使用CD39蛋白中之暴露胺/羧基的化學修飾之抗原決定基「足跡法」來測定抗CD39抗體之抗原決定基區。此類足跡法技術之一個具體實例為使用HXMS (由質譜法所偵測之氫-氘交換)，其中出現受體與配體蛋白醯胺質子之氫/氘交換、結合及換回，其中參與蛋白結合的主鏈醯胺基團經保護免於換回且因此將保持氘化。相關區域此時可藉由胃蛋白酶蛋白水解、快速微孔高效液相層析分離及/或電噴霧電離質譜法來識別。參見例如Ehring H, Analytical Biochemistry, 第267卷(2)第252-259頁(1999) Engen, J. R.及Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A。合適的抗原決定基識別技術之另一實例為核磁共振抗原決定基定位(NMR)，其中通常將游離抗原及與抗原結合肽(諸如抗體)複合之抗原在二維NMR光譜中信號之位置進行比較。抗原通常選擇性地經15N同位素標記，使得在NMR-光譜中僅對應於抗原之信號可見且來自抗原結合肽之信號不可見。與游離抗原之光譜比較，來源於涉及與抗原結合肽之相互作用之胺基酸的抗原信號在複合物光譜中通常會位置偏移，且可以該方式識別涉及結合之胺基酸。參見例如Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67；Huang等人, Journal of Molecular Biology, 第281卷(1)第61-67頁(1998)；及Saito及Patterson, Methods. 1996年6月; 9 (3): 516-24。
抗原決定基定位/表徵亦可使用質譜法進行。參見例如Downard, J Mass Spectrom. 2000年4月; 35 (4): 493-503及Kiselar與Downard, Anal Chem. 1999年5月1日; 71 (9): 1792-1801。蛋白酶消化技術亦可用於抗原決定基定位及識別之上下文。抗原決定子相關區域/序列可藉由蛋白酶消化測定，例如藉由使用胰蛋白酶與CD39之比率大約1:50的胰蛋白酶或在pH 7-8下的o/n消化，繼之以用於肽識別的質譜(MS)分析。藉由抗CD39結合劑保護免於胰蛋白酶裂解的肽可隨後藉由比較經歷胰蛋白酶消化之樣品和與抗體一起培育且隨後經歷例如胰蛋白酶之消化的樣品(由此揭露結合劑之足跡)來識別。其他酶，如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，亦可用於或可替代地用於相似抗原決定基表徵方法。此外，酶消化可提供一種快速方法，其用於分析潛在抗原決定子序列是否在並非表面暴露的CD39多肽之區內，且相應地在免疫原性/抗原性方面最可能不相關。
定點突變誘發為適用於闡明結合抗原決定基之另一種技術。舉例而言，在「丙胺酸篩選」中，用丙胺酸殘基再置放蛋白質區段內之各殘基且量測結合親和力之結果。若突變引起結合親和力顯著降低，則其最可能涉及結合。可使用對結構性抗原決定基具有特異性之單株抗體(亦即不結合未摺疊蛋白之抗體)驗證丙胺酸置換不影響蛋白之總體摺疊。參見例如Clackson及Wells, Science 1995; 267:383-386；及Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6。
電子顯微法亦可用於抗原決定基「足跡法」。舉例而言，Wang等人, Nature 1992; 355:275-278使用低溫電子顯微法、三維影像重建及X射線結晶學之協調應用以測定Fab片段在天然豇豆嵌紋病毒(cowpea mosaic virus)之衣殼表面上的實體足跡。
用於抗原決定基評價的「無標記」分析法之其他形式包括表面電漿子共振(SPR，BIACORE)及反射量測術干擾光譜學(RifS)。參見例如Fägerstam等人, Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14；Nice等人, J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168；Leipert等人, Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311；Kröger等人, Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944。
通常，本文所提供之抗CD39抗體對CD39多肽(例如如本文實例中製備之單體CD39多肽)之親和力在約104 至約1011 M-1 (例如約108 至約1010 M-1 )範圍內。舉例而言，抗CD39抗體關於CD39可具有小於1×10-9 M之平均解離常數(KD )，如藉由例如表面電漿子共振(SPR)篩選(諸如藉由用BIAcore™ SPR析裝置分析)所測定。在一更特定例示性態樣中，本發明提供抗CD39抗體，其對於CD39具有約1×10-8 M至約1×10-10 M或約1×10-9 M至約1×10-11 M之KD。
抗體之特徵可例如在於不超過約(亦即親和力好於) 100、60、10、5或1奈莫耳，較佳次奈莫耳，或視情況不超過約500、200、100或10皮莫耳之平均KD 。可例如例如藉由將以重組方式產生之人類CD39蛋白固定於薄片表面上，接著在溶液中施加待測試抗體來測定KD 。在一個實施例中，該方法進一步包含步驟(d)，其選定來自(b)的能夠與抗體I-394競爭結合至CD39之抗體，或例如mAb 1-24中之任一者。
編碼本發明之單株抗體(例如抗體mAb20或mAb21)之DNA可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及定序。在一個態樣中，提供編碼本文任何實施例之抗CD39抗體之重鏈或輕鏈的核酸。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，隨後轉染至原本不產生免疫球蛋白的宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成所要單株抗體之合成。如本說明書中其他地方所描述，此類DNA序列可出於許多目的中之任一者經修飾，例如用於使抗體人類化、產生片段或衍生物，或用於例如在抗原結合位點修飾抗體序列以便最優化抗體之結合特異性。在一個實施例中，提供編碼抗體(例如mAb20或mAb21)之輕鏈及/或重鏈的經分離之核酸序列，以及包含(例如在其基因組中)此類核酸之重組宿主細胞。編碼抗體之DNA之細菌中的重組表現為此項技術中所熟知的(參見例如Skerra等人, Curr. Opinion in Immunol., 5, 第256頁 (1993)；及Pluckthun, Immunol. 130, 第151頁 (1992))。
一旦識別能夠結合sCD39及/或memCD39及/或具有其他所要特性之抗體，則其亦通常將使用諸如本文所述之彼等方法評估其結合至其他多肽(包括不相關多肽)之能力。理想地，抗體僅以實質親和力結合至CD39，且不以顯著水平結合至不相關多肽，或NTPD酶家族之其他多肽，尤其CD39-L1、L2、L3及L4或NTPD酶8。然而，應瞭解，只要對CD39之親和力實質上比對其他無關多肽更大(例如10倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或更大)，則抗體適用於本發明方法中。
在一個實施例中，抗CD39抗體可經製備使得其不具有與人類Fcγ受體之實質性特異性結合，人類Fcγ受體例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64中之任何一或多者。此類抗體可包含已知不具有或具有與Fcγ受體之較低結合的各種重鏈之恆定區。或者，可使用不包含(或包含一部分)恆定區之抗體片段(諸如F(ab')2片段)避免Fc受體結合。可根據此項技術中已知之方法評估Fc受體結合，此項技術中已知之方法包括例如在BIACORE分析法中測試抗體與Fc受體蛋白之結合。此外，一般可使用任何抗體IgG同型，其中Fc部分經修飾(例如藉由引入1、2、3、4、5個或更多個胺基酸取代)以最小化或消除與Fc受體之結合(參見例如WO 03/101485，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。用於評估Fc受體結合之諸如基於細胞的分析法之分析法為此項技術中所熟知的，且描述於例如WO 03/101485中。
在一個實施例中，抗體可在Fc區中包含一或多種特定突變，其產生與效應細胞具有最小相互作用之「Fc沉默」抗體。沉默效應功能可藉由在抗體之Fc區中的突變得到且已描述於此項技術中：N297A突變、LALA突變(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 第20卷(6):685-691)；及D265A (Baudino等人, 2008, J. Immunol. 181: 6664-69)亦參見Heusser等人, WO2012/065950，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，抗體在鉸鏈區中包含一個、兩個、三個或三個以上胺基酸取代。在一個實施例中，抗體為IgG1或IgG2且在殘基233-236，視情況233-238 (EU編號)處包含一個、兩個或三個取代。在一個實施例中，抗體為IgG4且在殘基327、330及/或331 (EU編號)處包含一個、兩個或三個取代。沉默Fc lgG1抗體之實例為lgG1 Fc胺基酸序列中包含L234A及L235A突變的LALA突變體。Fc沉默突變之另一實例為在殘基D265處或在D265及P329處的突變，例如如在lgG1抗體中作為DAPA (D265A，P329A)突變(US 6,737,056)所用。另一沉默lgG1抗體在殘基N297處包含突變(例如N297A、N297S突變)，其產生去糖基化/非糖基化抗體。其他沉默突變包括：殘基L234及G237處之取代(L234A/G237A)；殘基S228、L235及R409處之取代(S228P/L235E/R409K、T、M、L)；殘基H268、V309、A330及A331處之取代(H268Q/V309L/A330S/A331S)；殘基C220、C226、C229及P238處之取代(C220S/C226S/C229S/P238S)；殘基C226、C229、E233、L234及L235處之取代(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)；殘基K322、L235及L235處之取代(K322A/L234A/L235A)；殘基L234、L235及P331處之取代(L234F/L235E/P331S)；殘基234、235及297處之取代；殘基E318、K320及K322處之取代(L235E/E318A/K320A/K322A)；殘基處之取代(V234A、G237A、P238S)；殘基243及264處之取代；殘基297及299處之取代；使得由EU編號系統定義殘基233、234、235、237及238，包含選自PAAAP、PAAAS及SAAAS之序列(參見WO2011/066501)的取代。
在一個實施例中，抗體在Fc區中可包含一或多種特定突變。舉例而言，此類抗體可包含人類lgG1來源之Fc域，在Kabat殘基234、235、237、330及/或331處包含突變。此類Fc域之一個實例包含在Kabat殘基L234、L235及P331處之取代(例如L234A/L235E/P331S或(L234F/L235E/P331S)。此類Fc域之另一實例包含在Kabat殘基L234、L235、G237及P331處之取代(例如L234A/L235E/G237A/P331S)。此類Fc域之另一實例包含在Kabat殘基L234、L235、G237、A330及P331處之取代(例如L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)。在一個實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X1 取代、L235X2 取代及P331X3 取代，其中X1 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X2 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸殘基；視情況其中X1 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X2 為麩胺酸或其保守性取代；視情況其中X3 為絲胺酸或其保守性取代。在另一實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X1 取代、L235X2 取代、G237X4 取代及P331X4 取代，其中X1 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X2 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X3 為除甘胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X4 為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基；視情況其中X1 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X2 為麩胺酸或其保守性取代；視情況X3 為丙胺酸或其保守性取代；視情況X4 為絲胺酸或其保守性取代。在另一實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X1 取代、L235X2 取代、G237X4 取代、G330X4 取代及P331X5 取代，其中X1 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X2 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X3 為除甘胺酸以外之任何胺基酸殘基，X4 為除丙胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X5 為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基；視情況其中X1 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X2 為麩胺酸或其保守性取代；視情況X3 為丙胺酸或其保守性取代；視情況X4 為絲胺酸或其保守性取代；視情況X5 為絲胺酸或其保守性取代。在本文所用之簡寫表示法中，格式為：野生型殘基：多肽中之位置：突變型殘基，其中殘基位置係根據Kabat根據EU編號指示。
在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235及331 (帶下劃線的)處胺基酸殘基的胺基酸序列：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
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在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235及331 (帶下劃線的)處胺基酸殘基的胺基酸序列：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
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在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235、237、330及331 (帶下劃線的)處胺基酸殘基的胺基酸序列：
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
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在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235、237及331 (帶下劃線的)處胺基酸殘基的序列：
Figure 02_image019
Figure 02_image021
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Fc沉默抗體不介導或介導低ADCC活性，其意謂Fc沉默抗體展現低於50%特異性細胞分解的ADCC活性。較佳地，抗體實質上不具有ADCC活性，例如Fc靜默抗體展現低於5%或低於1%之ADCC活性(特異性細胞分解)。Fc沉默抗體亦可引起在CD39表現細胞表面之CD39之FcγR介導交聯之缺失。
在一個實施例中，抗體在重鏈恆定區中在選自由以下組成之群的殘基中之任一者、兩者、三者、四者、五者或多於五者處具有取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331及409 (在重鏈恆定區中的殘基之編號係根據Kabat根據EU編號)。在一個實施例中，抗體在殘基234、235及322處包含取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235及331處具有取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235、237及331處具有取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235、237、330及331處具有取代。在一個實施例中，Fc域為人類IgG1亞型。根據Kabat根據EU編號指示胺基酸殘基。
在一個實施例中，抗體包含Fc域，該Fc域包含增加與人類FcRn多肽之結合以便增加抗體之活體內半衰期的胺基酸取代。例示性突變描述於Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 第20卷(6):685-691中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。人類IgG1同型之抗體中所用之取代之實例為在Kabat殘基M252、S254及T256處之取代；在殘基T250及M428處之取代；在殘基N434處之取代；在殘基H433及N434處之取代；在殘基T307、E380及N434處之取代；在殘基T307、E380及N434處之取代；在殘基M252、S254、T256、H433、N434及436處之取代；在殘基I253處之取代；在殘基P257、N434、D376及N434處之取代。
在一個實施例中，抗體包含Fc域，該Fc域包含賦予對蛋白酶之裂解減低的敏感性之胺基酸取代。基質金屬蛋白酶(MMP)表示與腫瘤形成相關之最顯著的蛋白酶家族。儘管癌細胞可表現MMP，但大多數細胞外MMP係藉由不同類型的基質細胞提供，該等基質細胞浸潤腫瘤且各自產生特定的一組蛋白酶及蛋白酶抑制劑，其釋放至細胞外空間且尤其改變腫瘤周圍之環境。存在於腫瘤微環境中之MMP可裂解鉸鏈區內之抗體且可由此引起經設計以在腫瘤位點內起作用之治療性抗體之不活化。在一個實施例中，包含胺基酸取代之Fc域對藉由選自由以下組成之群的蛋白酶中之任一者、兩者、三者或三者以上(或全部)之裂解具有降低的敏感性：GluV8、IdeS、明膠酶A (MMP2)、明膠酶B (MMP-9)、基質金屬蛋白酶-7 (MMP-7)、基質溶素(MMP-3)及巨噬細胞彈性蛋白酶(MMP-12)。在一個實施例中，降低對裂解敏感性的抗體包含在殘基E233-L234及/或L235處包含胺基酸取代之Fc域。在一個實施例中，抗體包含在殘基E233、L234、L235及G236處包含胺基酸取代之Fc域。在一個實施例中，抗體包含在一或多個殘基233-238處包含胺基酸取代的Fc域，例如以使得E233-L234-L235-G236序列經P233-V234-A235 (G236經刪除)置換。參見例如WO99/58572及WO2012087746，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
可在任何所要階段評估抗原結合化合物之以下能力：抑制CD39之酶活性，尤其阻斷sCD39之ATP酶活性及減少藉由可溶性CD39蛋白及視情況進一步藉由CD39表現細胞的ADP及AMP (及連同CD73、腺苷)之產生，且繼而恢復淋巴細胞的活性及/或緩解淋巴細胞之腺苷介導之抑制。
可例如在偵測ATP之消失(水解)及/或AMP之產生的分析法中評估抗體之抑制活性(例如免疫增強潛能)。
可藉由在將測試抗體與可溶性CD39蛋白一起培育之後偵測ATP來測試抗體抑制可溶性重組人類CD39蛋白之能力。簡言之，可使用Cell Titer GloTM (Promega)在分析法中定量ATP，在該分析法中在37℃下將劑量範圍之測試抗體與描述於實例1中之可溶性重組人類CD39蛋白一起培育1小時。在添加CTG試劑之前，在37℃下向盤添加20 µM ATP持續額外30分鐘。在暗處5 min短暫培育期之後使用Enspire™光度計定量所發射的光。
可藉由在將測試抗體與細胞(例如拉莫斯細胞、經CD39轉染之細胞等)一起培育之後偵測ATP來測試抗體抑制表現CD39蛋白之細胞的能力。參見例如實例、方法。細胞可在37℃下與測試抗體一起培育1小時。隨後將細胞與20 µM ATP一起在37℃下培育額外1小時。盤在400 g下離心2分鐘且在發光微盤(白色孔)中轉移細胞上澄液。向上澄液添加CTG且在暗處培育5分鐘之後使用Enspire™光度計定量所發射的光。藉由比較在抗體及單獨ATP (最大發光)及ATP與細胞(最小發光)之存在下所發射的光來測定抗CD39抗體功效。
在抗體存在下，ATP向AMP水解之減少及/或ATP之增加及/或AMP產生之減少指示抗體抑制CD39。在一個實施例中，例如如實例、方法中，如藉由在將表現CD39多肽之細胞(例如拉莫斯細胞)與測試抗體一起培育之後使用Cell Titer GloTM (Promega)偵測ATP所評估，抗體製劑能夠引起由細胞表現的CD39多肽之酶活性降低至少60%，較佳抗體引起在細胞中之CD39多肽之酶活性降低至少70%、80%或90%。
在一個實施例中，例如如實例、方法中，如藉由在將可溶性重組CD39多肽與測試抗體一起培育之後使用Cell Titer GloTM (Promega)偵測ATP所評估，抗體製劑能夠引起可溶性重組CD39多肽(例如在不存在細胞之情況下)之酶活性降低至少60%，較佳可溶性重組CD39多肽之酶活性降低至少70%、80%或90%。
關於其調節免疫細胞(例如腺苷受體-表現免疫細胞；A2A-受體表現細胞)活性(例如以緩解淋巴細胞活性之腺苷介導抑制或以使得淋巴細胞活性活化)之能力，亦可在間接分析法中量測抗體之活性。此可例如使用細胞介素釋放分析法處理。在另一實例中，可在間接分析法中評價抗體調節淋巴細胞增殖之能力。
CD39上之抗原決定基  在一個態樣中，抗體結合存在於在細胞表面表現之CD39上的抗原決定子。
在一個態樣中，抗體結合與具有mAb1-24 (或I-394)之VH及VL之抗體實質上相同的抗原決定基。在一個實施例中，抗體結合至CD39之抗原決定基，其至少部分與結合於抗體mAb1-24 (或I-394)的抗原決定基重疊或包括其中至少一個殘基。結合於抗體的殘基可指定為存在於CD39多肽之表面上，例如在表現於細胞表面上之CD39多肽中。
可量測抗CD39抗體與經CD39突變體轉染之細胞的結合且與抗CD39抗體結合野生型CD39多肽(例如SEQ ID NO: 1)之能力相比較。抗CD39抗體與突變型CD39多肽(例如表1之突變體)之間的結合減少意謂結合親和力降低(例如，如藉由諸如表現特定突變體之細胞之FACS測試的已知方法所量測，或藉由結合至突變型多肽之Biacore測試所量測)及/或抗CD39抗體之總結合能力降低(例如，如藉由抗CD39抗體濃度對比多肽濃度之曲線圖中Bmax之降低所證明)。結合之顯著減少指示突變殘基直接涉及與抗CD39抗體之結合或在抗CD39抗體結合至CD39時貼近結合蛋白。
在一些實施例中，結合顯著減少意謂相對於抗體與野生型CD39之間的結合，抗CD39抗體與突變型CD39多肽之間的結合親和力及/或能力降低大於40%、大於50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%或大於95%。在某些實施例中，結合降低至低於可偵測極限。在一些實施例中，在抗CD39抗體與突變型CD39多肽之結合小於在抗CD39抗體與野生型CD39多肽之間所觀測到的結合之50% (例如小於45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)時，證明結合顯著減少。
在一些實施例中提供抗CD39抗體，其相較於與不包含下文所述取代之野生型CD39多肽(例如SEQ ID NO: 1之多肽)的結合，對突變型CD39多肽展現顯著較低結合，在該突變型CD39多肽中包含結合於抗體mAb1-24 (或I-394)的胺基酸殘基之區段中之殘基經不同胺基酸取代。
在一個實施例中，在各情況下相對於在抗體與包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的野生型CD39多肽之間的結合，抗體對突變型CD39多肽的結合減少，該突變型CD39多肽在選自由R138、M139及E142 (參見SEQ ID NO: 1)組成之群的一或多個(或所有之)殘基處包含突變。
例示性抗體可變區序列 本發明抗體之實例包括包含抗體mAb1至mAb24中任一者之VH域及VL域的抗體。抗CD39抗體mAb1至mAb24之VH及VL序列提供於表A及B中(實例13)。
一個根據本發明之例示性高效抗CD39 VH及VL對為抗體mAb20之VH及VL對，其重鏈可變區之胺基酸序列列於下文(SEQ ID NO: 31)，及其輕鏈可變區之胺基酸序列列於下文(SEQ ID NO: 36)。此類抗體可例如具有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的輕鏈。
另一根據本發明之例示性高效抗CD39 VH及VL對為抗體mAb21之VH及VL對，其重鏈可變區之胺基酸序列列於下文(SEQ ID NO: 31)，及其輕鏈可變區之胺基酸序列列於下文(SEQ ID NO: 37)。此類抗體可例如具有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的輕鏈。
在任何態樣中，結合人類CD39多肽之經分離之抗體可指定為包含人源性VH及VL構架(例如FR1、FR2、FR3及FR4)。在一個態樣中，抗體包含：HCDR1，其包含胺基酸序列：DYNMH (SEQ ID NO: 8)，或其至少4個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；HCDR2，其包含胺基酸序列：YIVPLNGGSTFNQKFKG (SEQ ID NO: 9)，或其至少4、5、6、7、8、9或10個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代，視情況其中Kabat位置61之天冬醯胺經取代，視情況其中Kabat位置65之離胺酸經取代；HCDR3，其包含胺基酸序列：GGTRFAY (SEQ ID NO: 10)，或其至少4、5或6個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；LCDR1，其包含胺基酸序列：RASESVDNFGVSFMY (SEQ ID NO: 11)，或其至少4、5、6、7、8、9或10個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代，視情況其中Kabat位置24處之精胺酸經取代；LCDR2區，其包含胺基酸序列：GASNQGS (SEQ ID NO: 12)或其至少4、5或6個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；及/或LCDR3區，其包含胺基酸序列：QQTKEVPYT (SEQ ID NO: 13)，或其至少4、5、6、7或8個連續胺基酸之序列，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經刪除或經不同胺基酸取代。CDR位置可根據Kabat編號。
在一個實施例中，HCDR2包含式I之胺基酸序列：  Y - I - V - P - L - N - G - G - S - T - F - Xaa1 - Q - K - F - Xaa2 - G (SEQ ID NO: 14)或其子序列，其中Xaa1 可為任何胺基酸殘基，視情況其中Xaa1 為天冬醯胺或絲胺酸；其中Xaa2 可為任何胺基酸殘基，視情況其中Xaa2 為離胺酸或麩醯胺酸。在一個實施例中，HCDR2包含胺基酸序列：YIVPLNGGSTFSQKFKG (SEQ ID NO: 15)。在一個實施例中，HCDR2包含胺基酸序列：YIVPLNGGSTFSQKFQG (SEQ ID NO: 16)。
在一個實施例中，LCDR1包含式II之胺基酸序列：  Xaa3 - A - S - E - S - V - D - N - F - G - V - S - F - M - Y (SEQ ID NO: 17)，其中Xaa3 可為任何胺基酸殘基，視情況其中Xaa3 為離胺酸或精胺酸。在一個實施例中，LCDR1包含胺基酸序列：KASESVDNFGVSFMY (SEQ ID NO: 18)。
在一個實施例中，抗體包含來自人類子群IGHV1-3 (視情況連同IGHJ1)之重鏈構架，視情況IGHV1-3為IGHV1-3*01。在一個實施例中，人類化抗體包含來自人類子群IGKV4-1 (視情況連同IGKJ4)之輕鏈構架。
在一個態樣中，本發明提供結合人類CD39多肽之抗原結合域或抗體，其包含：  (a)     包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的CDR-H1；  (b)     包含SEQ ID NO: 9、14、15或16之胺基酸序列的CDR-H2；  (c)     包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的CDR-H3；  (d)     包含SEQ ID NO: 11、17或18之胺基酸序列的CDR-L1；  (e)     包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的CDR-L2；  (f)     包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的CDR-L3；及  (g)     人類重鏈及輕鏈構架序列。
抗體可進一步包含人類重鏈及/或輕鏈構架中之一個、兩個、三個、四個、五個或超過五個胺基酸取代，以例如增強抗體之親和力、穩定性或其他特性。視情況，取代引入存在於非人類哺乳動物(例如小鼠或大鼠)中特定位置之殘基。
在本文中之VH序列之任一實施例中，在Kabat重鏈位置67處之胺基酸可為丙胺酸。
在本文中之VH序列之任一實施例中，在Kabat重鏈位置71處之胺基酸為纈胺酸。
在本文中之VH序列之任一實施例中，在Kabat重鏈位置76處之胺基酸為精胺酸。
在本文中之VH序列之一些實施例中，在Kabat重鏈位置48處之胺基酸可為異白胺酸。在本文中之VH序列之其他實施例中，在Kabat重鏈位置48處之胺基酸可為甲硫胺酸。
在一個實施例中，VH在Kabat位置67處包含丙胺酸殘基及在位置71處包含纈胺酸。
在一個實施例中，VH在Kabat位置48處包含異白胺酸殘基，在Kabat位置67處包含丙胺酸殘基，在Kabat位置71處包含纈胺酸及在Kabat位置76處包含精胺酸。
在本文中之VL序列之任一實施例中，VL在Kabat位置36 (FR2)處包含苯丙胺酸。在一個實施例中，VL在Kabat位置24 (CDR1)處包含離胺酸。
本文中VH及VL域中之位置係使用Kabat編號系統描述(Kabat等人(1991)免疫相關之蛋白質之序列，第5版，美國公共衛生處，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州)。
在一個態樣中，抗CD39抗體包含重鏈，其與具有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%的序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%、99%或更大的一致性)。
在一個態樣中，抗CD39抗體包含輕鏈，其與具有SEQ ID NO: 39或40之胺基酸序列的輕鏈具有至少約80%的序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%、99%或更大的一致性)。
在任何態樣中，指定重鏈、輕鏈、可變區、FR及/或CDR序列可包含一或多個序列修飾，例如取代(1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個序列修飾)。在一個實施例中，取代為保守性修飾。
本發明之另一目標亦涵蓋本文所揭示之抗體之功能保守性變異體。「功能保守性變異體」係其中在不改變多肽之總體構形及功能的情況下，變化蛋白質或酶中之給定胺基酸殘基的該等變異體，包括(但不限於)用具有類似特性(諸如極性、氫鍵結潛能、酸性、鹼性、疏水性、芳族性及其類似物)之一者置換胺基酸。除指示為保守胺基酸外之胺基酸的蛋白質可不同，以使得如根據比對方案(諸如藉由叢集法(Cluster Method))所測定，具有類似功能之任何兩種蛋白質之間的蛋白質或胺基酸序列相似性百分比可為例如70%至99%且可在其範圍內變化，其中相似性係基於MEGALIGN演算法。「功能保守性變異體」亦包括多肽，其如藉由BLAST或FASTA演算法所測定具有至少60% (較佳至少75%、更佳至少85%、仍較佳至少90%且甚至更佳至少95%)胺基酸一致性，且與其進行比較之天然或母體蛋白質具有相同或實質上類似特性或功能。
在任何實施例中，抗體或抗體片段可視情況指定為除抗體I-394以外之抗體(例如分別具有SEQ ID NO: 6及7中所示之VH及VL胺基酸序列)。在任何實施例中，抗體或抗體片段可視情況指定為除抗體I-395、I-396、I-397、I-398或I-399以外之抗體(例如具有2018年3月16日申請之PCT專利申請案第PCT/EP2018/056661號中所揭示之VH及VL胺基酸序列，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。在任何實施例中，抗體或抗體片段可視情況指定為除美國專利公開案US 2016/0137747A1中所揭示之抗體By40、Ba54g或BY12以外之抗體(例如具有By40、Ba54g或BY12之VH及VL胺基酸序列)；除由產生此類抗體的融合瘤細胞株產生的抗體BY40以外的抗體。
可藉由本領域中已知的技術製備抗體之片段及衍生物(除非另行說明或與上下文明顯矛盾，如本申請案中所使用，其由術語「抗體(antibody)」或「抗體(antibodies)」涵蓋)。「片段」包含完好抗體之一部分，一般抗原結合位點或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；其為具有由一個連續胺基酸殘基之不間斷序列組成的一級結構之多肽的任何抗體片段(在本文中稱為「單鏈抗體片段」或「單鏈多肽」)，包括(但不限於)(1)單鏈Fv分子(2)單鏈多肽，其僅含有一個輕鏈可變域，或含有輕鏈可變域之三個CDR的其片段，不含有相關重鏈部分及(3)單鏈多肽，其僅含有一個重鏈可變區，或含有重鏈可變區之三個CDR的其片段，不含有相關輕鏈部分；及由抗體片段形成之多特異性(例如雙特異性)抗體。尤其包括奈米抗體、域抗體、單域抗體或「dAb」。
抗CD39抗體可併入於包含1 mg/ml至500 mg/ml濃度之醫藥調配物中，其中該調配物具有2.0至10.0之pH值。調配物可進一步包含緩衝劑系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、安定劑及界面活性劑。在一個實施例中，醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配物。此類調配物通常為溶液或懸浮液。在另一實施例中，醫藥調配物為水性溶液。術語「水性調配物」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣地，術語「水性溶液」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。
在另一實施例中，醫藥調配物為凍乾調配物，醫師或患者在使用之前向其添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一實施例中，醫藥調配物為無需任何預先溶解的即用型乾燥調配物(例如凍乾或噴乾)。
在另一態樣中，醫藥調配物包含此類抗體之水性溶液及緩衝劑，其中抗體以1 mg/ml或更高之濃度存在，且其中該調配物之pH值為約2.0至約10.0。
在另一實施例中，調配物之pH值在選自由以下組成之列表的範圍內：約2.0至約10.0、約3.0至約9.0、約4.0至約8.5、約5.0至約8.0及約5.5至約7.5。
在另一實施例中，緩衝劑選自由以下組成之群：乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及參(羥基甲基)-胺基甲烷、二甘胺酸、麥黃酮、蘋果酸、丁二酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物。此等特定緩衝劑中之各者構成替代實施例。
在另一實施例中，調配物進一步包含醫藥學上可接受之防腐劑。在另一實施例中，調配物進一步包含等張劑。在另一實施例中，調配物亦包含螯合劑。在另一實施例中，調配物進一步包含安定劑。在另一實施例中，調配物進一步包含界面活性劑。為方便起見，參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy , 第19版, 1995。
其他成分有可能可存在於肽醫藥調配物中。此類額外成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、增積劑、張力改質劑、螯合劑、金屬離子、油性媒劑、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質)及兩性離子(例如胺基酸，諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸)。當然，此類額外成分不應不利地影響醫藥調配物之整體穩定性。
可在若干位點向需要此類治療之患者投與含有抗體的醫藥組合物，例如在局部位點，例如皮膚及黏膜位點；在繞過吸收之位點，例如在動脈中、靜脈中、心臟中投與；及在涉及吸收之位點，例如在皮膚中、皮膚下、肌肉中或腹部中投與。醫藥組合物之投藥可經由若干投藥途徑，例如皮下、肌肉內、腹膜內、靜脈內、經舌、舌下、經頰、口中、經口、胃及腸中、經鼻、經肺(例如經由細支氣管及肺泡或其組合)、表皮、真皮、經皮、經陰道、經直腸、經眼(例如經由結膜)、經輸尿管及非經腸向需要此類治療之患者投與。
亦可藉由檢驗用其他已發展之治療性單株抗體的經歷來測定適合抗體調配物。若干單株抗體已顯示在臨床情況下有效，諸如利妥仙(Rituxan) (利妥昔單抗(Rituximab))、賀癌平(Herceptin) (曲妥珠單抗(Trastuzumab)) 夏羅爾(Xolair) (奧馬珠單抗(Omalizumab))、百克沙(Bexxar) (托西莫單抗(Tositumomab))、坎帕斯(Campath) (阿妥珠單抗(Alemtuzumab))、澤瓦林(Zevalin)、奧科立姆(Oncolym)及可與抗體一起使用之類似調配物。舉例而言，單株抗體可以10 mg/mL之濃度在100 mg (10 mL)或500 mg (50 mL)單次用小瓶中供應，其以9.0 mg/mL氯化鈉、7.35 mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7 mg/mL聚山梨醇酯80及注射用無菌水經調配用於IV投藥。將pH值調節至6.5。在另一實施例中，以包含約20 mM檸檬酸鈉、約150 mM NaCl、pH值為約6.0之調配物形式供應抗體。
疾病之診斷及治療 亦提供使用本發明之抗CD39試劑治療個體、尤其人類個體之方法。在一個實施例中，本發明提供在用於投與人類患者的醫藥組合物之製備中，如本文所描述的抗體或抗體片段之用途。通常，個體罹患癌症或傳染病(例如病毒感染、細菌感染)或處於其風險下。在一個實施例中，個體在循環中及/或在組織樣品(例如腫瘤或腫瘤鄰近組織樣品)中具有可偵測之可溶性(細胞外) CD39蛋白。
舉例而言，在一個態樣中，提供恢復或增強有需要之個體中淋巴細胞之活性的方法，其包含向該個體投與本發明之中和抗CD39抗體或抗體片段的步驟。在一個實施例中，方法係針對增加患有疾病的個體中之淋巴細胞(例如T細胞)之活性，在該疾病中增加之淋巴細胞活性係有益的，或其係由免疫抑制、免疫抑制細胞或例如由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞產生之腺苷引起或表徵。該等方法將尤其適用於例如治療患有實體腫瘤之個體，在該實體腫瘤中懷疑腫瘤微環境(及其中CD39介導腺苷之產生)可造成免疫系統識別之缺失(免疫逃脫)。腫瘤環境(腫瘤組織或腫瘤鄰近組織)之特徵可例如在於CD39表現免疫細胞(例如CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞)之存在。
更特定言之，採用方法及組合物用於治療多種癌症及其他增生性疾病及傳染病。因為此等方法藉由減少抑制淋巴細胞之抗目標細胞(例如抗腫瘤)活性的腺苷，及可能額外藉由增加可增加淋巴細胞之抗腫瘤活性的ATP來起作用，其適用於極廣泛範圍之癌症及傳染病。在一個實施例中，抗CD39組合物適用於治療個體中之癌症，該等個體為對用中和人類PD-1之抑制活性(例如抑制PD-1與PD-L1之間的相互作用)之試劑治療的不良反應者(或對其不敏感)。可治療之癌症之代表性實例包括尤其實體腫瘤，其中腫瘤微環境中之腺苷可在抑制抗腫瘤免疫反應中起較強作用。在一個實施例中，用抗CD39抗體治療之人類患者患有肝癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、去勢抗性前列腺癌(CRPC)、黑素瘤、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘導之癌症(包括由石棉誘導之彼等癌症)、血液科惡性疾病，包含例如多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)/原發性縱隔B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、免疫胚細胞大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴胚細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病、蕈樣黴菌病、多形性大細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤及前驅體T淋巴胚細胞性淋巴瘤以及該等癌症之任何組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症。可在治療之前、治療期間或治療之後針對上述臨床特質中之一或多者測試或選擇患者。
在一個實施例中，使用抗CD39抗體或抗體片段治療特徵在於(例如在循環中及/或在組織中，例如在腫瘤或腫瘤鄰近組織中)可偵測及/或升高含量之可溶性(細胞外) CD39蛋白的癌症。
在一個實施例中，使用抗CD39抗體或抗體片段治療特徵在於表現CD39之惡性細胞的癌症。
在一個實施例中，以以下量投與抗CD39抗體或抗體片段：其在個體中可有效達成及/或維持(例如持續1、2、3、4週及/或直至抗原結合化合物之後續投藥)中和CD39、視情況sCD39、視情況memCD39之酶活性的至少EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 之血液濃度。在一個實施例中，抗CD39抗體之活性量為以下量：在個體之血管外組織中，可有效達成中和CD39、視情況sCD39、視情況memCD39之酶活性的EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 。在一個實施例中，抗CD39抗體之活性量為以下量：在個體中可有效達成(或維持)抑制中和CD39、視情況sCD39、視情況memCD39之酶活性的EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 。
視情況，在一個實施例中，相比於針對藉由ADCC (其例如可在相同於或實質上低於提供受體飽和的彼濃度之濃度下提供全部功效)的CD39表現腫瘤細胞之耗乏的一些抗體，抗CD39抗體不表現實質Fcγ受體介導之活性及以以下量投與：其可有效中和視情況進一步CD39之酶活性，不實質上引起CD39表現之下調，持續所要時段，例如1週、2週、一個月，直至抗CD39抗體之隨後連續投藥。
在一個實施例中，抗CD39抗體或抗體片段以以下量投與：其在個體中可有效達成及/或維持(例如持續1、2、3、4週及/或直至抗CD39抗體之後續投藥)抑制CD39介導之ATP向AMP分解代謝(例如藉由評估sCD39之ATP酶活性之中和；藉由評估可溶性(細胞外) CD39蛋白之ATP酶活性之中和，參見實例、方法)的至少EC50 、視情況EC70 、視情況實質上EC100 之血液濃度。
在一個實施例中，提供治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含以以下量向患有疾病之個體投與抗CD39抗體或抗體片段：其達成或維持循環(視情況在所關注之血管外組織(例如腫瘤或腫瘤環境)中)中之濃度，持續指定時段，該濃度高於在循環中50%、70%或完全(例如90%)受體飽和CD39表現細胞所需之濃度(例如如在PBMC中評估)。視情況，所達成之濃度比指定受體飽和所需之濃度高至少20%、50%或100%。
在一個實施例中，提供治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含以以下量向個體投與抗CD39抗體或抗體片段：其達成或維持循環(視情況在所關注之血管外組織(例如腫瘤或腫瘤環境)中)中之濃度，持續指定時段，該濃度高於結合至CD39表現細胞(例如如在實例、方法中，如藉由流式細胞測量術、藉由在CD39表現細胞(例如拉莫斯細胞)上滴定抗CD39抗體來評估)之EC50 、視情況EC70 或視情況EC100 。視情況，所達成之濃度比結合至CD39表現細胞的EC50 、視情況EC70 或視情況EC100 高至少20%、50%或100%。
如本文實例中所示，關於CD39酶活性之中和，例如B細胞中ATP酶活性之中和，可例如在細胞分析法中藉由定量ATP向AMP (或ATP向下游腺苷)之水解評估EC50 、EC70 或EC100 ，參見實例、方法。關於CD39酶活性之中和的「EC50 」係指關於酶活性之中和，其產生50%其最大反應或作用的抗CD39抗體之有效濃度。關於CD39酶活性之中和的「EC70 」係指其產生70%其最大反應或作用的抗CD39抗體之有效濃度。關於CD39酶活性之中和的「EC100 」係指關於此類酶活性之中和，其產生其實質上最大反應或作用的抗CD39抗體之有效濃度。
在一些實施例中，尤其對於治療實體腫瘤，所達成之濃度經設計以得到組織(在血管結構外部，例如在腫瘤或腫瘤環境中)中之濃度，其至少對應於中和酶活性的EC50 或EC70 ，視情況為約或至少約EC100 。
在一個實施例中，抗CD39抗體之量在每公斤體重1與20 mg之間。在一個實施例中，每週、每兩週、每月或每兩個月向個體投與該量。
在一個實施例中，提供治療患有癌症之人類個體的方法，其包含向個體投與有效量之本發明之抗CD39抗體，持續至少一個投藥循環(視情況至少2、3、4或更多個投藥循環)，其中循環為八週或八週以下之時段，其中對於至少一個循環中之每一者，以每公斤體重1-20 mg之劑量投與一、二、三或四個劑量之抗CD39抗體。在一個實施例中，藉由靜脈內輸注投與抗CD39抗體。
用於治療人類之適合治療方案包括例如向患者投與如本文所揭示之抗CD39抗體之量，其中該方法包含至少一個投藥循環，其中投與至少一個劑量之抗CD39抗體。視情況，投與至少2、3、4、5、6、7或8個劑量之抗CD39抗體。在一個實施例中，投藥循環在2週與8週之間。
在一個實施例中，提供用於治療或預防個體之疾病(例如癌症、實體腫瘤、血液腫瘤)之方法，該方法包含向患有疾病(例如癌症、實體腫瘤、血液腫瘤)之個體投與中和CD39酶活性之抗CD39抗體持續至少一個投藥循環，投藥循環包含抗CD39抗體之至少第一及第二(及視情況第3、第4、第5、第6、第7及/或第8或更多)次投藥，其中以以下量投與抗CD39抗體：其可有效在兩次連續投藥之間達成或維持抗CD39抗體之血液(血清)濃度，其為至少0.1 µg/ml、視情況至少0.2 µg/ml、視情況至少1 µg/ml、或視情況至少2 µg/ml (例如用於治療血液腫瘤)，或視情況至少約1 µg/ml、2 µg/ml、10 µg/ml或20 µg/ml，例如在1-100 µg/ml、1-50 µg/ml、1-20 µg/ml或1-10 µg/ml之間(例如用於治療實體腫瘤，用於治療血液腫瘤)。在一個實施例中，維持指定持續血液濃度，其中血液濃度不下降至實質上低於指定血液濃度，持續指定時間段之持續時間(例如在抗體之兩次投藥之間、週數、1週、2週、3週、4週)，亦即儘管血液濃度可在指定時間段期間變化，但所維持之指定血液濃度表示最低或「谷值」濃度。在一個實施例中，抗CD39抗體之治療活性量為此類抗體之量，其能夠提供(至少)在血液及/或在組織中之中和CD39之酶活性的EC50 濃度、視情況EC70 濃度視情況EC100 濃度，在投與抗體後持續至少約1週、約2週或約一個月之時段。
在用本發明之抗CD39抗體治療過程之前或期間，可在患者之腫瘤內及/或鄰近患者之腫瘤評估可溶性(細胞外) CD39蛋白、CD39表現細胞之存在或含量、腺苷、ATP、ADP及/或AMP含量，以評估患者是否適合於治療(例如以預測患者是否有可能對治療起反應)。可溶性(細胞外) CD39、CD39表現細胞之存在或含量、腺苷、ATP、ADP及/或AMP之含量的增加可指示個體適於(例如可能受益於)用本發明之抗CD39抗體(包括但不限於抑制基質結合CD39之抗體)治療。
在用本發明之抗CD39抗體治療過程之前或期間，可視情況亦在患者之腫瘤內及/或鄰近患者之腫瘤評估腺苷、ADP及/或AMP含量，以評估患者是否受益於用抗CD39抗體治療。與在治療(或抗體之給藥)之前的含量相比，在投藥(或抗體之給藥)之後比較之腺苷、ATP、ADP及/或AMP之含量的減少可指示個體受益於用本發明之抗CD39抗體(包括但不限於抑制基質結合CD39之抗體)治療。視情況，若患者受益於使用抗CD39抗體治療，則方法可進一步包含向患者投與另一劑量之抗CD39抗體(例如繼續治療)。
在一個實施例中，評估在患者之腫瘤內及/或鄰近患者之腫瘤的腺苷、ADP及/或AMP含量，組織樣品包含獲自患者之選自由以下組成之群的人類組織生物樣品：來自癌症患者之組織，例如癌症組織，靠近或在癌症邊緣之組織、癌症鄰近組織、鄰近 非腫瘤性組織 或正常鄰近組織，且在組織內偵測腺苷、ATP、ADP及/或AMP含量。可將來自患者之含量與例如對應於健康個體之參考含量相比。
在一個實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要之個體之癌症的方法，該方法包含： a)在循環中或在腫瘤環境中、視情況在腫瘤及/或鄰近組織內偵測可溶性(細胞外) CD39蛋白及/或CD39表現細胞，及 b)在確定可溶性(細胞外) CD39蛋白及/或CD39表現細胞包含於循環或腫瘤環境中之後，視情況呈與參考含量(例如在健康組織中觀測到之含量；視情況對應於健康個體或未自抗CD39抗體得到實質性益處之個體的含量)相比增加之含量，向個體投與抗CD39抗體。CD39表現細胞可包含腫瘤細胞或白血球，例如循環或腫瘤浸潤性細胞，例如CD4 T細胞、CD8 T細胞、TReg細胞、B細胞。
在一個實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要之個體之癌症的方法，該方法包含： a)評估視情況在循環中、視情況在腫瘤內及/或在鄰近組織內，個體是否具有可偵測之可溶性(細胞外) CD39，及 b)在偵測到可溶性(細胞外) CD39後，視情況呈與參考含量(例如對應於健康個體或未自本發明之抗CD39抗體得到實質性益處的個體)相比增加之含量，向個體投與本發明之抗CD39抗體。
視情況，在任一方法中，在包含獲自個體的包含癌症組織及/或靠近或在癌症邊緣之組織(例如癌症鄰近組織、鄰近非腫瘤性組織或正常鄰近組織)的生物樣品之腫瘤環境內，偵測可溶性CD39蛋白及/或CD39表現細胞(或腺苷、ATP、ADP及/或AMP)，及偵測sCD39蛋白、CD39表現細胞(或腺苷、ATP、ADP及/或AMP)之含量。CD39表現細胞可包含例如腫瘤細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、TReg細胞、B細胞。
可在具有或不具有預先偵測步驟之情況下用抗CD39抗體治療患有癌症之個體，該預先偵測步驟評估sCD39之存在及/或CD39在循環細胞或在腫瘤微環境中之細胞(例如在腫瘤細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、TReg細胞、B細胞上)上之表現。視情況，治療方法可包含偵測來自血液的或來自個體的腫瘤之生物樣品(例如在癌症組織，靠近或在癌症邊緣之組織、癌症鄰近組織、鄰近非腫瘤性組織或正常鄰近組織中)中的CD39核酸或多肽之步驟。確定生物樣品包含表現CD39 (例如顯著表現；以高水平表現CD39，與參考物(例如健康組織)相比，抗CD39抗體具有較高強度之染色)的細胞指示患者患有可較大受益於用抑制CD39之試劑治療的癌症。在一個實施例中，該方法包含測定生物樣品中CD39核酸或多肽之表現水平，及將該水平與對應於健康個體(例如健康組織)之參考水平相比較。確定與參考含量相比，生物樣品包含sCD39蛋白及/或表現CD39核酸或多肽之細胞的含量增加指示患者患有可有利地用本發明之抗CD39抗體治療的癌症。在一個實施例中，偵測生物樣品中之CD39多肽包含偵測可溶性細胞外CD39蛋白。在一個實施例中，偵測生物樣品中之CD39多肽包含偵測表現於惡性細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、TReg細胞、B細胞表面上之CD39多肽。在一個實施例中，確定生物樣品包含顯著表現CD39核酸或多肽之細胞指示患者患有可有利地用本發明之抗CD39抗體治療之癌症。在提及CD39多肽時，「顯著表現」意謂CD39多肽在大量取自給定患者之細胞中表現。雖然術語「顯著表現」之定義不受精確百分比值束縛，但在一些實例中，稱為「顯著表現」之受體將存在於取自患者之腫瘤細胞中之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多上。
測定個體是否患有以表現CD39多肽之細胞為特徵之癌症可例如包含自個體獲得包含來自癌症環境(例如腫瘤或腫瘤鄰近組織)之細胞的生物樣品(例如藉由進行切片檢查)，使該等細胞與結合CD39多肽之抗體接觸，及偵測細胞是否在其表面上表現CD39。視情況，測定個體是否具有表現CD39之細胞包含進行免疫組織化學分析法。
在一個實施例中，本文所述之抗CD39抗體可有利地用於治療CD73陽性之癌症。已在一系列腫瘤細胞中報導CD73表現，該等腫瘤細胞尤其包括白血病、膀胱癌、神經膠瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌及乳癌。CD73表現亦已與黑素瘤及乳癌中之促轉移表型相關。
因此，提供治療或預防患有CD73陽性癌症之個體之癌症或傳染病的方法，該方法包含向該個體投與本發明之抗CD39抗體或抗體片段。在一個實施例中，本發明提供一種用於治療或預防個體之CD73陽性癌症的方法，該方法包含：向個體投與本發明抗體，其結合及抑制可溶性人類CD39蛋白之活性。在一個實施例中，CD73陽性癌症為已知一般特徵為在腫瘤或腫瘤環境中存在CD73表現細胞的癌症。
可在具有或不具有預先偵測步驟之情況下用抗CD39抗體治療患有癌症之患者，該預先偵測步驟評估CD73在腫瘤微環境中之細胞(例如在腫瘤細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞上)上之表現。視情況，治療方法可包含偵測來自個體的腫瘤之生物樣品(例如在癌症組織，靠近或在癌症邊緣之組織、癌症鄰近組織、鄰近非腫瘤性組織或正常鄰近組織中)中的CD73核酸或多肽之步驟。確定生物樣品包含表現CD73 (例如顯著表現；以高水平表現CD73，與參考物(例如健康組織)相比，抗CD73抗體具有較高強度之染色)的細胞指示患者患有可較大受益於用抑制sCD39之試劑(視情況進一步與抑制CD73之試劑組合)治療的癌症。在一個實施例中，該方法包含測定生物樣品中CD73核酸或多肽之表現水平，及將該水平與對應於健康個體(例如健康組織)之參考水平相比較。確定與參考含量相比，生物樣品包含表現CD73核酸或多肽的細胞的含量增加指示患者患有可用抗CD39抗體治療的癌症。視情況，偵測生物樣品中之CD73多肽包含偵測表現於惡性細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞表面上之CD73多肽。在一個實施例中，測定生物樣品包含表現CD73核酸或多肽之細胞指示患者患有可尤其受益於用抗CD39抗體治療之癌症。CD73多肽可例如在大量取自給定患者之細胞中表現，例如可在至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多取自患者之腫瘤細胞上偵測到CD73。
測定個體是否患有以表現CD73多肽之細胞為特徵之癌症可例如包含自個體獲得包含來自癌症環境(例如腫瘤或腫瘤鄰近組織)之細胞的生物樣品(例如藉由進行切片檢查)，使該等細胞與結合CD73多肽之抗體接觸，及偵測細胞是否在其表面上表現CD73。視情況，測定或偵測個體是否具有表現CD73之細胞包含進行免疫組織化學分析法。
在一個實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要之個體之癌症的方法，該方法包含： a)在腫瘤環境中、視情況在腫瘤及/或鄰近組織內偵測CD73表現細胞，及 b)在確定腫瘤環境包含CD73表現細胞後，視情況呈與參考含量(例如健康組織所觀測到之含量)相比增加之含量，向個體投與本發明抗體，其結合及抑制可溶性人類CD39蛋白之活性。視情況，在包含獲自個體的包含癌症組織及/或靠近或在癌症邊緣之組織(例如癌症鄰近組織、鄰近非腫瘤性組織或正常鄰近組織)的生物樣品之腫瘤環境內，偵測CD73表現細胞，及偵測CD73表現細胞之含量(例如藉由進行免疫組織化學分析法)。CD73表現細胞可包含例如腫瘤細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞。
本發明之抗CD39抗體組合物可作為單藥療法使用或用於與一或多種其他治療劑之組合治療，該等其他治療劑包括通常用於投與抗體之特定治療目的的試劑。額外治療劑通常將以通常試劑在用於所治療的特定疾病或病狀的單藥療法中所用之量及治療方案投與。
在一個實施例中，本發明之抗CD39抗體組合物可用於與能夠引起ATP自腫瘤細胞之細胞外釋放的化學治療劑之組合治療中。
在一個實施例中，抗CD39中和抗體不存在與人類CD16之結合，但增強CD16表現效應細胞(例如NK或效應T細胞)之活性。因此，在一個實施例中，第二或額外第二治療劑為能夠誘導ADCC朝向其結合至(例如經由NK細胞表現之CD16)之細胞的抗體或其他含Fc域之蛋白。通常，此類第二試劑抗體或其他蛋白質將包含結合至相關抗原(例如存在於腫瘤細胞上之抗原(腫瘤抗原))之域及Fc域或其部分，且將展現經由抗原結合域結合至抗原且經由Fc域結合至Fcγ受體(例如CD16)。在一個實施例中，其ADCC活性將至少部分由CD16介導。在一個實施例中，額外治療劑為具有天然或經修飾之人類Fc域(例如來自人類IgG1或IgG3抗體之Fc域)的抗體。術語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」為此項技術中充分理解之術語，且係指細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞識別目標細胞上之結合抗體且隨後引起目標細胞之分解。介導ADCC之非特異性細胞毒性細胞包括自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性白血球及嗜伊紅白血球。術語「ADCC誘導抗體」係指展現ADCC之抗體，如藉由熟習此項技術者已知之分析法所量測。此類活性之特徵通常在於Fc區與各種FcR之結合。不受任何特定機制限制，熟習此項技術者將認識到抗體展現ADCC之能力可例如憑藉其子類別(諸如lgG1或lgG3)、藉由引入至Fc區中之突變或憑藉對抗體Fc區中之碳水化合物模式的修飾來達成。誘導ADCC之抗體之實例包括利妥昔單抗(用於治療淋巴瘤、CLL、曲妥珠單抗(用於治療乳癌)、阿妥珠單抗(用於治療慢性淋巴球性白血病)及西妥昔單抗(cetuximab) (用於治療結腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌)。ADCC增強之抗體之實例包括(但不限於)：GA-101 (低岩藻糖基化抗CD20)、馬妥昔單抗(margetuximab) (Fc增強之抗HER2)、美泊利單抗(mepolizumab)、MEDI-551 (Fc改造之抗CD19)、奧比珠單抗(obinutuzumab) (糖基改造/低岩藻糖基化抗CD20)、奧卡珠單抗(ocaratuzumab) (Fc改造之抗CD20)、XmAb® 5574/MOR208 (Fc改造之抗CD19)。
在一個實施例中，抗CD39中和抗體增強中和人類PD-1之抑制活性(例如抑制PD-1與PD-L1之間的相互作用)之試劑之功效，尤其在對用中和人類PD-1之抑制活性之試劑治療為不良反應者(或對其不敏感)之個體中。因此，在一個實施例中，第二或額外第二治療劑為中和人類PD-1之抑制活性的抗體或其他試劑。
計劃性死亡1 (PD-1) (亦稱為「計劃性細胞死亡1」)為受體之CD28家族之抑制成員。完整人類PD-1序列可見於GenBank寄存編號U64863。抑制或中和PD-1之抑制活性可涉及使用防止PD-L1誘導之PD-1信號傳導之多肽試劑(例如抗體、與Fc域融合之多肽、免疫黏附素等)。目前存在至少六種阻斷PD-1/PD-L1路徑之市售或在臨床評價中之試劑。一種試劑為BMS-936558 (納武單抗(Nivolumab)/ONO-4538，Bristol-Myers Squibb；先前為MDX-1106)。納武單抗(商標Opdivo®)為FDA審批通過之完全人類IgG4 抗PD-L1 mAb，其抑制PD-L1配位體與PD-1及CD80之結合，且在WO 2006/121168中描述為抗體5C4，其揭示內容以引用之方式併入本文中。對於黑素瘤患者，在3 mg/kg之劑量下觀測到最顯著OR，而對於其他癌症類型其係在10 mg/kg下。納武單抗一般每3週以10 mg/kg給藥直至癌症發展。術語「降低人類PD-1之抑制活性」、「中和PD-1」或「中和人類PD-1之抑制活性」係指其中抑制PD-1之產生於PD-1與其結合搭配物(諸如PD-L1或PD-L2)中之一或多者的相互作用之信號轉導能力的過程。中和PD-1之抑制活性的試劑降低、阻斷、抑制、消除或干擾產生於PD-1與其結合搭配物(諸如PD-L1、PD-L2)中之一或多者的相互作用之信號轉導。此類試劑可由此減少藉由或經由表現於T淋巴細胞上之細胞表面蛋白介導的負共刺激信號，以便增強T細胞效應功能，諸如增殖、細胞介素產生及/或細胞毒性。
MK-3475 (來自Merck之人類IgG4 抗PD1 mAb)，亦稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)或派立珠單抗(pembrolizumab) (商標Keytruda®)，已由FDA批准用於治療黑素瘤且在其他癌症中進行測試。每2或3週以2 mg/kg或10 mg/kg測試派立珠單抗直至疾病發展。MK-3475，亦稱為Merck 3745或SCH-900475，亦描述於WO2009/114335中。
MPDL3280A/RG7446 (阿特珠單抗(atezolizumab)，商標Tecentriq™，來自Roche/Genentech之抗PD-L1)為含有經改造之Fc域的人類抗PD-L1 mAb，該經改造之Fc域經設計以藉由最小化FcγR結合及隨之發生的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來最優化功效及安全性。每3週投與≤1、10、15及25 mg/kg MPDL3280A之劑量，持續至多1年。在3期試驗中，在NSCLC中每三週藉由靜脈內輸注以1200 mg投與MPDL3280A。
AMP-224 (Amplimmune及GSK)為包含與Fc域融合之PD-L2細胞外域的免疫黏附素。中和PD-1之試劑之其他實例可包括結合PD-L2 (抗PD-L2抗體)且阻斷PD-1與PD-L2之間的相互作用之抗體。
帕利珠單抗(Pidlizumab) (CT-011；CureTech) (來自CureTech/Teva之人類化IgG1抗PD1 mAb)、帕利珠單抗(CT-011；CureTech) (參見例如WO2009/101611)為另一實例；在三十名具有利妥昔單抗敏感之復發FL的患者中測試試劑，該等患者每4週用3 mg/kg靜脈內CT-011治療，持續4次輸注，組合自CT-011之首次輸注之後2週開始每週以375 mg/m2給藥的利妥昔單抗，持續4週。
另外已知PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括AMP-224 (授權給GSK之B7-DC/IgG1融合蛋白質)；描述於WO 2012/145493中之AMP-514；描述於WO2011/066389及US2013/034559中之抗體MEDI-4736 (德瓦魯單抗(durvalumab)，商標Imfinzi™，由AstraZeneca/Medimmune所研發之抗PD-L1)；描述於WO2010/077634中之抗體YW243.55.S70 (抗PD-L1)；MDX-1105，亦稱為BMS-936559，為描述於WO2007/005874中的由Bristol-Myers Squibb研發之抗-PD-L1抗體；及描述於WO2006/121168、WO2009/014708、WO2009/114335及WO2013/019906中之抗體及抑制劑，其揭示內容以引用之方式併入本文中。抗PD1抗體之其他實例揭示於WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.)中，例如分別具有SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及/或SEQ ID NO: 8之輕鏈可變域CDR1、2及3的抗體，及分別具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之抗體重鏈可變域CDR1、2及3的抗體，其中SEQ ID NO參考編號為根據WO2015/085847之編號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。亦可使用與此等抗體中之任一者競爭結合至PD-1或PD-L1的抗體。
在一些實施例中，PD-1中和劑為抑制PD-L1與PD-1之結合的抗PD-L1 mAb。在一些實施例中，PD-1中和劑為抑制PD-1與PD-L1之結合的抗PD1 mAb。在一些實施例中，PD-1中和劑為免疫黏附素(例如包含融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)的PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。
在治療方法中，可分開、一起或依序或呈混合物投與抗CD39抗體及第二治療劑。在一些實施例中，在投與第二治療劑之前投與抗原結合化合物。舉例而言，可在投與第二治療劑之前大致0至30天投與抗CD39抗體。在一些實施例中，在投與第二治療劑之前約30分鐘至約2週、約30分鐘至約1週、約1小時至約2小時、約2小時至約4小時、約4小時至約6小時、約6小時至約8小時、約8小時至1天或約1至5天投與抗CD39抗體。在一些實施例中，與投與第二治療劑同時投與抗CD39抗體。在一些實施例中，在投與第二治療劑之後投與抗CD39抗體。舉例而言，可在投與第二治療劑之後約0至30天投與抗CD39抗體。在一些實施例中，在投與第二治療劑之後約30分鐘至約2週、約30分鐘至約1週、約1小時至約2小時、約2小時至約4小時、約4小時至約6小時、約6小時至約8小時、約8小時至1天或約1至5天投與抗CD39抗體。
實例 方法 CD39 突變體之產生 藉由PCR來產生CD39突變體。在瓊脂糖凝膠上操作經擴增的序列，且使用Macherey Nagel PCR清除凝膠提取套組(Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extraction kit) (參考編號740609)純化。隨後用ClonTech InFusion系統將針對各突變體產生之經純化的PCR產物接合至表現載體中。含有突變序列的載體係作為小規模純化(Miniprep)製備且定序的。在定序之後，含有突變序列之載體係使用Promega PureYield™質體中等規模純化系統(Promega PureYield™ Plasmid Midiprep System)作為中等規模純化製備的。在測試轉基因表現之前，HEK293T細胞在DMEM培養基(Invitrogen)中生長，使用Invitrogen之脂染胺2000用載體轉染且在CO2 培育箱中在37℃下培育48小時。如下表中所示，在Hek-293T細胞中轉染突變體。使用SEQ ID NO: 1之編號展示下表1中之靶向胺基酸突變。 表1
Figure 108120819-A0304-0001
可溶性 huCD39 之選殖、產生及純化 分子生物學 使用以下引子自人類PBMC cDNA選殖huCD39蛋白：TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC (SEQ ID NO: 41) (正向)及CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATC GTCATCTTTGTAATCGACATAGGTGGAGTGGGAGAG (SEQ ID NO: 42) (反向)。隨後使用InFusion選殖系統將經純化之PCR產物選殖至表現載體中。在蛋白之C端部分處添加M2標籤(FLAG標籤，在SEQ ID NO: 44中帶下劃線)用於純化步驟；應瞭解，(例如SEQ ID NO: 44之) CD39細胞外域蛋白可在任何實施例中視情況指定為不具有M2標籤。
huCD39 蛋白之表現及純化 在驗證所選殖之序列之後，CHO細胞經核轉染且隨後次選殖產生池以獲得產生huCD39蛋白之細胞純系。收集來自生長於輥中之huCD39純系之上澄液且使用M2層析管柱純化且使用M2肽溶離。隨後將經純化之蛋白裝載至S200尺寸排阻層析管柱上。在TBS PH7.5緩衝劑中調配對應於單體之經純化蛋白。不具有M2標籤之CD39-M2細胞外域重組蛋白之胺基酸序列如下：
Figure 02_image023
(SEQ ID NO: 43)。
具有M2標籤之CD39-M2細胞外域重組蛋白之最終胺基酸序列如下：
Figure 02_image025
(SEQ ID NO: 44)。
可溶性 CD39 酶活性之抑制 使用Cell Titer GloTM (Promega，參考編號G7571)評價抗體對所產生之可溶性CD39蛋白之酶活性的抑制，該細胞Cell Titer GloTM 允許經由使用產生與所存在之ATP的量成比例之發光信號的試劑來評估ATP水解。以此方式，可評估可溶性CD39介導之ATP水解的抑制。簡言之，將100 µg/ml至6x10-3 µg/ml之劑量範圍之抗CD39抗體與400 ng/ml具有方法部分中所描述之胺基酸序列(SEQ ID NO: 44)的可溶性重組人類CD39蛋白一起在37℃下培育1 h。在添加CTG (Cell Titer Glo)試劑之前，在37℃下向盤添加20 µM ATP持續30額外分鐘。在暗處的5分鐘短暫培育期之後使用Enspire™光度計定量所發射的光。藉由比較在抗體及單獨ATP (最大發光)及ATP與可溶性CD39蛋白(最小發光)之存在下所發射的光來測定抗CD39抗體功效。
細胞 CD39 酶活性之抑制 使用Cell Titer GloTM (Promega，參考編號G7571)評價抗體對CD39表現細胞中CD39酶活性的抑制，該細胞Cell Titer GloTM 允許經由使用產生與所存在之ATP的量成比例之發光信號的試劑來評估ATP水解。因此，分析法經設計以准許評估細胞培養上澄液中CD39對水解之ATP的抑制。簡言之，將5x104 個拉莫斯人類淋巴瘤細胞、5x103 個體類CD39、食蟹獼猴CD39及小鼠CD39表現CHO細胞與30 µg/ml至5×10-4 µg/ml之抗CD39抗體一起在37℃下培育1小時。隨後將細胞與20 µM ATP一起在37℃下培育額外1小時。盤在400 g下離心2分鐘且在發光微盤(白色孔)中轉移50 µl細胞上澄液。向上澄液添加50 µl CellTiter-Glo™試劑(CTG)，且在暗處培育5分鐘之後使用Enspire™光度計定量所發射的光。藉由比較在抗體及單獨ATP (最大發光)及ATP與細胞(最小發光)之存在下所發射的光來測定抗CD39抗體功效。
抗體之產生：小鼠中之免疫接種及篩選 為獲得抗人類CD39抗體，用上述重組人類CD39-M2細胞外域重組蛋白對Balb/c小鼠進行免疫接種。小鼠腹膜內接受一次使用50 µg CD39蛋白之乳液及完全弗氏佐劑(Freund Adjuvant)的第一免疫接種，腹膜內接受使用50 µg CD39蛋白之乳液及不完全弗氏佐劑的第2免疫接種，及最後靜脈內接受使用10 µg CD39蛋白的增強免疫。免疫脾細胞在用X63.Ag8.653永生化B細胞增強免疫之後3天融合，且在經照射之脾細胞存在下培養。將融合瘤接種在半固體含甲基纖維素培養基中，且使用Clonepix™ 2裝置(Molecular Devices Corp.)挑取生長純系。
實例 1 ： 已知中和 CD39 mAb 之抗原決定基定位 為了進一步理解抗體如何能夠抑制細胞CD39之酶(ATP酶)活性，吾人研究結合於已報導在細胞分析法中抑制CD39之ATP酶活性的抗體之抗原決定基：揭示於PCT公開案第WO2009/095478號中之BY40。
為定義抗CD39抗體之抗原決定基，吾人設計了由在CD39之表面上的分子表面處所暴露之胺基酸之取代定義的CD39突變體。如在表1中使用SEQ ID NO: 1之編號所示，在Hek-293T細胞中轉染突變體。
藉由流式細胞測量術在20種所產生之突變體上測試劑量範圍之I-394 (10-2.5-0.625-0.1563-0.0391-0.0098-0.0024-0.0006 µg/ml)。BY40抗體二者均完全損失與表現CD39之突變體5之細胞的結合，而不損失與任何其他突變體之結合。突變體5在殘基Q96、N99、E143及R147處含有胺基酸取代。突變體5在CD39表面上之位置展示於圖 3A 中。
實例 2 ： 已知中和 CD39 mAb 不能抑制重組可溶性 CD39 蛋白之 ATP 酶活性 評估已報導在細胞分析法中抑制CD39之ATP酶活性的兩種抗體(BY40及BY12)以確定是否能夠抑制重組可溶性CD39蛋白之ATP酶活性。使用Cell Titer GloTM (Promega，參考編號G7571)評價如上所述產生之可溶性CD39蛋白之酶活性藉由抗體的抑制。如上文所指示評價細胞CD39蛋白之酶活性藉由抗體的抑制。
如所預期，BY40抑制細胞中CD39蛋白之ATP酶活性。然而，BY40不能抑制可溶性CD39蛋白之酶活性。圖 2B 展示BY40與本文所識別之新抗體的比較。
實例 3 ：篩選阻斷 sCD39 活性之新 mAb 進行一系列免疫接種以便尋找中和sCD39之ATP酶活性之抗體。為獲得抗人類CD39抗體，用上述重組人類CD39-M2細胞外域重組蛋白對動物進行免疫接種。總計，該系列免疫接種包括不同方案且在不同動物中，該等動物包括不同小鼠品系、大鼠及兔。
在初始免疫接種方案中，主要篩選涉及使用野生型CHO及表現huCD39細胞株之CHO藉由流式細胞測量術測試生長純系之上澄液(SN)。細胞分別用0.1 µM及0.005 µM CFSE染色。對於流式細胞測量術篩選，將所有細胞同等混合且藉由標記有APC的山羊抗小鼠多株抗體(pAb)來揭示在上澄液中反應抗體之存在。對於結合huCD39之抗體，隨後使用上文(方法)所發展與描述的篩選分析法針對可溶性CD39之酶活性之抑制篩選上澄液。
結果展示儘管可獲得許多特異性CD39結合抗體，但來自此等免疫接種中之任一者的抗體中無一者展示對可溶性CD39酶活性之任何抑制。一個可能性為CD39上之主要抗原決定基不包括任何適合安置於或靠近CD39之催化位點的抗原決定基。鑒於幾乎沒有可獲得的抑制細胞CD39之抗體及使用抗體抑制酶之催化位點的已知困難，不存在中和sCD39之抗體可指示不可能獲得抑制可溶性(細胞外域) CD39之抗體。其他可能性係關於非功能性篩選分析法及/或不恰當地摺疊或運作之可溶性CD39蛋白，尤其因為缺失可抑制可溶性CD39的任何抗體妨礙對sCD39阻斷分析法之驗證。
鑒於不存在能夠抑制可溶性CD39之抗體，用篩選方案進行另一免疫接種，該篩選方案經設計以有利於產生結合如由抗體BY40之抗原決定基識別的CD39之活性位點的抗體。簡言之，如在前述免疫接種中，主要篩選涉及使用野生型CHO及表現huCD39細胞株之CHO藉由流式細胞測量術測試生長純系之上澄液(SN)，隨後針對與野生型CD39相比，結合表現CD39突變體5之Hek-293T細胞之損失進行篩選，如表1中所示。突變體5在殘基Q96、N99、E143及R147處具有取代。然而，結果在此顯示，儘管可獲得展示與突變體5之結合損失的許多特異性CD39結合抗體，但來自初始免疫接種中之任一者之抗體中無一者展示對可溶性CD39酶活性之任何抑制。
實例 4 ：識別 I- 394 抗體 吾人試圖識別不結合Q96、N99、E143及R147區之抗CD39抗體(由突變體5定義)以便具有不與BY40樣抗體競爭之抗體。不必具有阻斷CD39之ATP酶活性之任何能力的此類抗體可適用於抑制結合至BY40結合位點之細胞CD39的抗體之藥理學研究，例如在抑制細胞CD39的BY40或BY40樣抗體之存在下偵測及定量細胞上之游離CD39蛋白。
自實例3 (其中針對與CD39突變體5之結合的損失來篩選融合瘤)之免疫接種結果開始，選擇不在展示與CD39突變體5之結合的損失之彼等融合瘤當中的融合瘤。此融合瘤(I-394)在較廣池當中，此係由於不確定資料，其指示與突變體5之結合的可能之部分降低，但未失去與突變體5之結合且從而最初未保留。
在來自針對可溶性CD39酶活性之抑制的進一步免疫接種之上澄液的進行中篩選之上下文中，包括經選殖及產生之抗體I-394作為對照。意外地，儘管抗體I-394不在抗原決定基導向篩選中保留之純系當中，但此抗體在上文(方法)所描述之分析法中展示對可溶性CD39酶活性之強效抑制。
I-394係與IgG1同型之人類恆定區、具有突變L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (Kabat EU編號)之經修飾Fc域一起產生，其使得缺失與人類Fcγ受體CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64之結合，簡言之，I-394抗體之VH及Vk序列(分別展示於SEQ ID NO: 6及7中之VH及Vk可變區)係選殖至含有huIgG1恆定域(其分別含有前述突變及huCk恆定域)的表現載體中。將兩種所得載體共轉染至CHO細胞株中。使用所建立之細胞池在CHO培養基中產生抗體。隨後使用蛋白質A純化抗體。I-394之各別重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序列展示於下文中(Kabat CDR加下劃線)。
I-394重鏈可變域序列：
Figure 02_image027
Figure 02_image029
。
I-394輕鏈可變域序列：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
。
隨後測試抗體I-394與CD39突變體之結合的損失，該等CD39突變體由在CD39之表面上的分子表面處所暴露之胺基酸之取代定義。如在表1中使用SEQ ID NO: 1之編號所示，在Hek-293T細胞中轉染突變體。藉由流式細胞測量術在20種突變體上測試劑量範圍之抗體I-394。如圖 3B 中所示，I-394展示與表現CD39之突變體19之細胞的結合之完全損失。突變體19在殘基R138、M139及E142處包括取代。因此，I-394之核抗原決定基包括一或多個(或所有之)殘基R138、M139及E142。
不同於失去與突變體5之結合且具有抑制細胞CD39但不具有抑制可溶性CD39之能力的先前抗體BY40，抗體I-394失去與鄰近突變體19之結合，以及與突變體5很大程度上減少之結合(但具有與突變體5之一些殘餘結合)。有趣的是，突變體19之殘基貼近或鄰近於殘基5之彼等殘基，以使得I-394可表示抗原決定基與BY40相比之變化。抗體I-394由此為抗CD39抗體提供有價值的新抗原決定基，其准許抑制可溶性CD39蛋白之ATP酶活性。其亦提供特異性陽性對照，其准許驗證及測試用於偵測中和可溶性CD39蛋白之ATP酶活性之其他抗體的篩選分析法。
實例 5 ： 用於 sCD39 中和 mAb 之非抗原決定基導向篩選 基於指示可溶性CD39之抗體介導之抑制為可能的實例4之結果，重新討論來自使用來自實例3之不同方案之不同免疫接種的融合，以便尋找中和sCD39之ATP酶活性的抗體。
隨後評價針對ATP酶抑制之不同篩選方法。在一個實驗中，使用I-394抗體補充來自實例3之免疫接種之融合瘤的上澄液，發現其抑制可溶性CD39之ATP酶活性之能力呈陰性。此向上澄液添加I-394並未恢復陰性上澄液抑制CD39之ATP酶活性之能力。隨後使用塗佈蛋白質A之珠粒自陰性上澄液純化抗體I-394，且吾人觀測到經純化之I-394經恢復，再次能夠抑制ATP酶活性。
鑒於前述結果，研發出新免疫接種及篩選方案，其中使用野生型CHO及CHO表現huCD39細胞株藉由流式細胞測量術篩選來自新及過去免疫接種之生長純系，不評估可溶性CD39或細胞CD39 ATP酶活性之抑制，及無針對抗原決定基之篩選傾向。雖然關於與突變體5或19之結合損失的資料可供用於一些融合瘤，但此類資料不用於純系選擇，而是僅出於在ATP酶阻斷分析法中出現陰性結果之情況下拯救用於選殖的融合瘤之目的而保留。選擇且選殖結合CD39之融合瘤，且隨後根據以下方案使用蛋白質A純化： - 向300 µl之融合瘤上澄液添加10 µl之蛋白質A珠粒 -  添加NaCl以使得最終濃度為1,5M -  在4℃下轉動管3至4 h -  在1500 rpm下離心1分鐘 -  消除上澄液且用1 ml TBS進行三次洗滌 -  在第三次洗滌之後消除所有TBS -  添加50 µl檸檬酸酯0,1M pH3，均質化且在室溫下培育5分鐘 -  在1500 rpm下離心珠粒1分鐘 -  收集50 µl之溶離物且快速添加450 µl TBS，且在4℃下儲存
隨後針對與I-394類似程度之抑制CD39之ATP酶活性的能力，在比較分析法中篩選所獲得之抗體。用於抑制可溶性及細胞CD39之酶活性的分析法如上文(方法)所描述。意外地，在以此方式產生之例示性抗體中，若干展示可溶性CD39之抑制(以及細胞CD39之抑制)。圖 1 展示代表性篩選結果，其展示與陽性對照I-394抗體相比之抗體I-397、I-398及I-399。類似地，來自不同免疫接種之抗體I-395及I-396抑制可溶性CD39蛋白之酶活性。圖 2A 及圖 2B 展示抗體I-395及I-396的結果，對於抗體I-395及I-396，更大數量之抗體可供用於可溶性及細胞CD39中和之額外實驗。圖 2A 顯示與BY40及I-394抗體相比，抗體I-395及I-396均抑制細胞膜結合CD39，其中I-394及I-395與BY40相比均展示更大的效價及最大細胞CD39抑制。圖 2B 展示與BY40及I-394抗體相比，抗體I-395及I-396均抑制可溶性CD39。儘管BY40不在任何濃度下抑制可溶性CD39，但I-394、I-395及I-396全部抑制可溶性CD39，其中I-394展示最大效價，其次I-395，接著I-396具有較低效價。
所獲得之結果提高以下可能性：在細胞培養物及可溶性CD39分析法中融合瘤上澄液中之因子快速水解ATP，使得在使用習知方法篩選抗體中未偵測到ATP之信號。可溶性因子可為CD39或一些其他酶，其例如由融合搭配物產生。
隨後選殖抗體，伴隨使其具有帶有突變L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (Kabat EU編號)的IgG1 Fc域之人類恆定區的修飾，其使得以與本文針對I-394所示相同之方式，缺失與人類Fcγ受體CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64之結合。隨後可對所得抗體進行滴定，及隨後進行如實例7至實例9 (滴定，抑制ATP酶活性)中所示之更詳細的活性評估，以評估EC50 及IC50 測定以根據效價對抗體進行評級。
實例 6 ： sCD39 中和 mAb 之抗原決定基定位 如實例4中所示，I-394展示與表現CD39之突變體19的細胞完全損失之結合，但不失去與突變體5之結合。為了定義實例5之其他抗CD39抗體之抗原決定基，測試其與如實例1及表1中所述之CD39突變體組的結合之損失。如在表1中使用SEQ ID NO: 1之編號所示，在Hek-293T細胞中轉染突變體。藉由流式細胞測量術在20種所產生之突變體上測試劑量範圍之測試抗體(10-2.5-0.625-0.1563-0.0391-0.0098-0.0024-0.0006 µg/ml)。
結果展示，在實例5中針對抑制可溶性CD39之能力選擇的抗體呈現若干不同抗原決定基。在實例5中展示對可溶性細胞外CD39之抑制的抗體中，抗體I-395為抗體之實例，該抗體展現與在殘基Q96、N99、E143及R147處具有取代之突變體5之結合的損失，及亦在殘基R138、M139及E142處具有取代之突變體19之結合的損失。突變體19在殘基R138、M139及E142處包括取代。因此，I-395之CD39上的核抗原決定基包含殘基Q96、N99、E143及R147中之一者、兩者、三者或四者，以及殘基R138、M139及E142中之一者、兩者或三者。
另一方面，抗體I-398為抗體之實例，該抗體展現與在殘基R138、M139及E142處具有取代之突變體19之結合的損失，但不具有與在殘基Q96、N99、E143及R147處具有取代之突變體5減少或損失的結合。
在實例5中展示對可溶性細胞外CD39之抑制的其他抗體具有極不同之抗原決定基，且不展示與突變體5或19中之任一者之結合的損失，表明亦可藉由結合至sCD39上之其他位點來抑制可溶性CD39。對於一些抗體，與表1之20種突變體中之一者的結合之損失准許定位CD39上之結合位點，而對於其他抗體，仍待確定結合位點，因為其未失去與20種突變體中之任一者的結合。在實例5中展示抑制可溶性CD39之ATP酶活性的抗體當中，抗體I-396展示與具有取代K87A、E100A及D107A之突變體15之結合的損失，而不損失與其他20種突變體中之任一者的結合。因此，此抗體之CD39上之核抗原決定基包含殘基K87、E100及D107中之一或多者(或全部)。抗體I-399展示與具有以下之突變體11之結合的損失：取代N371K、L372K、E375A、K376G、V377A及在K376與V377之間的纈胺酸之插入(在表1中稱為「插入377V」)，而不損失與其他20種突變體中之任一者之結合。因此，此抗體之CD39上之核抗原決定基包含殘基N371、L372、E375、K376及V377中之一或多者(或全部)。圖 3A 展示CD39蛋白之表面上突變於突變體5 (M5)、15 (M15)及19 (M19)中之殘基的位置。圖 3B 展示關於不同抗體的結合至突變體5、15及19之結果。
因此，結果展示可針對不同抗原決定基獲得抑制可溶性CD39之抗體。抗原決定基包括：由突變體19之一或多個殘基定義的抗原決定基，其位置鄰近於BY40或BY40樣抗體之結合位點，該等BY40或BY40樣抗體僅抑制細胞CD39但不抑制可溶性CD39 (其失去與突變體5之結合)；由突變體19之一或多個殘基且亦部分由突變體5定義之抗原決定基，該定義指示與BY40或BY40樣抗體相比可能較小之移位；由突變體19之一或多個殘基且不由突變體5之殘基定義的抗原決定基；以及其他抗原決定基，諸如由以下各者定義之彼等抗原決定基：突變體11之一或多個殘基或突變體15之一或多個殘基，或進一步由不具有與突變體5、15或19中任一者之任何減少之結合的其他抗體，其中仍待測定抗原決定基之定位。
實例 7 ： 藉由流式細胞測量術在 CD39 表現細胞上之抗體滴定 在兩個重複實驗中測試抗體I-394與以下之結合：表現人類CD39之CHO細胞、表現食蟹獼猴(長尾獼猴(macaca fascicularis)) CD39之CHO細胞、表現鼠類CD39之CHO細胞及人類拉莫斯淋巴瘤細胞(ATCC™，參考編號CRL-1596)。在4℃下將細胞與30 µg/ml至5x10-4 µg/ml之各種濃度之未標記抗CD39抗體一起培育30分鐘。洗滌之後，在4℃下將細胞與山羊抗小鼠H+L標記之二級抗體一起培育30分鐘。
結果展示於圖 4 中。抗體I-394結合至表現人類CD39之細胞(CHO-huCD39)、表現食蟹獼猴CD39之細胞(CHO-cyCD39)及結合至拉莫斯淋巴瘤細胞，但不結合至表現鼠類CD39之細胞(CHO-moCD39)。在各別第一及第二組實驗中，I-394結合至EC50 值為0.16 µg/ml及0.19 µg/ml之拉莫斯細胞。若干其他抗CD39抗體展示與拉莫斯細胞之結合的相當EC50 值。
實例 8 ： 用於細胞 ATP 酶活性之抑制的 IC50 測定 使用如上文(方法)所描述之用於抑制細胞CD39酶活性之分析法，評價抗體I-394對CD39表現細胞中CD39之ATP酶活性的抑制。
結果展示於圖 5 中。I-394在阻斷腫瘤(拉莫斯)細胞中之CD39酶活性上非常強效，其與所測試之所有其他抗體相比效價更大。I-394亦阻斷表現人類CD39之細胞(CHO-huCD39)及表現食蟹獼猴CD39之細胞(CHO-cyCD39)中之CD39酶活性。表現鼠類CD39之細胞(CHO-moCD39)展示為陰性對照。所計算之IC50 (抑制由50,000個拉莫斯細胞所表現之CD39酶活性之50%)為0.05 µg/ml。最大抑制為81.6%。同型對照不具有作用。
實例 9 ： 用於重組可溶性 CD39 蛋白之 ATP 酶活性之抑制的 IC50 測定 使用如上文(方法)所描述之用於抑制可溶性CD39酶活性之分析法，評價抗體I-394對可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的抑制。結果展示於圖 6 中。I-394抑制可溶性CD39蛋白之酶活性。相比之下，抗體BY40不抑制可溶性CD39蛋白之酶活性。所計算之IC50 為0.003 µg/ml。最大抑制為74.9%。
實例 10 ： CD39-L1 、 L2 、 L3 、 L4 同功異型物上之 ELISA 滴定 測試抗體I-394與具有下文所示之胺基酸序列之重組人類CD39同功異型物(Rec-huCD39同功異型物)之結合，其在4℃下在500 ng/ml或1 µg/ml下在PBS 1X中塗佈在96孔盤中隔夜。在TBS Tween 20中洗滌孔，且在室溫下在TBS阻斷緩衝液中進一步飽和2小時。在室溫下在TBS阻斷緩衝液中培育劑量範圍濃度之初級抗體2小時。在TBS Tween 20中洗滌孔。在室溫下培育二級抗體(在TBS阻斷緩衝液中之GAM-HRP或GAH-HRP) 1小時，且用TMB揭露。在OD=450下在Enspire™上量測光學密度。
經選殖 huCD39 ( 血管同功異型物 ) 之胺基酸序列： 人類CD39-L1，亦稱為NTPD酶2或ENTPD2：
Figure 02_image035
(SEQ ID NO: 2)。
人類CD39-L2，亦稱為NTPD酶6或ENTPD6：
Figure 02_image037
(SEQ ID NO: 3)。
人類CD39-L3，亦稱為NTPD酶3或ENTPD3：
Figure 02_image039
Figure 02_image041
(SEQ ID NO: 4)。
人類CD39-L4，亦稱為NTPD酶5或ENTPD5：
Figure 02_image043
(SEQ ID NO: 5)。
I-394結合至CD39，但不結合至同功異型物CD39-L1、L2、-L3或-L4中之任一者。同型對照抗體(IC)不結合至任何CD39或CD39-L分子。結果展示於圖 7 中。
實例 11 ：樹突狀細胞之活化 儘管ATP具有促炎性活性，但咸信ATP之CD39介導分解代謝能夠減損樹突狀細胞(DC)活化，繼而改變針對腫瘤抗原之更廣泛應變性免疫反應。為了評估使用抗CD39抗體之CD39阻斷是否可克服在ATP存在下之樹突狀細胞(DC)活化的CD39介導之改變，吾人在ATP存在下用抗CD39抗體培育單核球衍生之DC (moDC)。
簡言之，在6天期間在GM-CSF及IL-4之存在下自人類健康血液純化人類單核球且分化成MoDC。隨後在24小時期間在ATP (Sigma，0.25-1 mM)存在下活化MoDC且藉由用流式細胞測量術分析CD80、CD83及HLA-DR表現來評估DC活化。在一些情況下，在CD39抑制劑：ARL6716 (Tocris, 250 µM)、CD73抑制劑：APCP (Tocris 50 µM)、抗CD39阻斷抗體I-394或BY40 (關於BY40，參見WO2009/095478)或抗CD73阻斷抗體之存在下預培育MoDC 1小時。使用LPS (Invivogen，10 ng/ml)作為陽性對照。為評估ATP介導DC活化在CD4 T細胞活化上產生之作用，洗滌ATP活化DC，隨後與同種異體CD4 T細胞(比率1個MoDC/4個T細胞)一起培育，以在第5天期間達成混合淋巴細胞反應(MLR)。藉由流式細胞測量術經由CD25表現及Cell Trace紫色稀釋分析T細胞活化及增殖(圖 8 )。
結果展示於圖 9 、圖 10 及圖 11 中。在陰性對照(培養基)存在下，在1 mM ATP存在下觀測到moDC活化，然而在0.125 mM、0.25 mM或0.5 mM下之ATP不准許moDC活化。添加CD39之化學抑制劑，咸信其藉由結合至活性位點完全阻斷CD39酶活性，引起在0.125 mM、0.25 mM或0.5 mM中之每一者下的moDC活化。然而，諸如BY40或抗CD73抗體之抗CD39抗體不能促進樹突狀細胞(DC)之ATP誘導活化，表明抗體不能充分阻斷酶活性以避免ATP分解代謝。意外地，抗CD39阻斷抗體I-394 (在圖中以濃度10 µg/ml展示)，其實質上完全阻斷CD39之ATP酶活性且因此可准許ATP積累，如藉由HLA-DR或CD83表現所評估在0.125 mM、0.25 mM或0.5 mM中之每一者下准許moDC活化(圖 9 及圖 10 )。有趣的是，在ATP存在下活化之MoDC能夠在MLR分析法中誘導較好之T細胞活化及增殖。此外，藉由抗CD39阻斷抗體I-394增強ATP介導之MoDC活化產生較高T細胞增殖及活化(圖 11 )。
在ATP存在下評估CD39抑制劑活化DC之能力提供識別及評價能夠達成CD39之高度抑制之抗CD39抗體的方法。此外，使用抗CD39抗體緩解由CD39施加在DC上之免疫抑制作用的可能性提供對抗原(尤其在腫瘤細胞上)之應變性免疫反應的增強。此外，當用於增強化學治療劑之免疫原性作用時，此類抗CD39抗體可尤其相關。引起腫瘤細胞之壞死之許多化學治療劑能夠誘導ATP；組合使用此類試劑與抗CD39抗體可尤其適用於增強抗腫瘤反應。
實例 12 ： 抑制重組可溶性 CD39 蛋白之 ATP 酶活性的抗體在 ATP 存在下有力地增強 CD73 阻斷。 T 細胞 增殖分析法 來自健康供體之末梢血液係獲自EFS，且在Ficoll™梯度上分離單核細胞。藉由收集細胞集結粒在52% Percoll™梯度上進一步濃化淋巴細胞，且遵循由製造商提供之TDS用Cell Trace染料(Thermofisher)染色。將5x104至1x105之經染色細胞分佈於96圓底盤中，在37℃下與抗huCD73抗體(描述於WO2016/131950中之抗體6E1)及/或抗huCD39 Ab (本文所述之I-394)一起培育1小時，且藉由添加塗佈抗CD3/抗CD28之珠粒(珠粒:細胞=1:4；Life Technologies)活化3至5天。藉由添加ATP (200 µM)來達成T細胞增殖之抑制。藉由流式細胞測量術藉由定量增殖T細胞子集中之染料稀釋來評估T細胞增殖及Ab阻斷AMP之免疫抑制作用的能力。
使用GraphPad Prism™軟體將增殖T細胞對比抗CD73 Ab濃度之百分比標繪於曲線圖中。
結果 測試抗體在添加之ATP (意欲表示如可在腫瘤環境中發現之條件)存在下恢復CD4或CD8 T細胞增殖之能力。在3種不同劑量之抗CD73或抗CD39抗體中之另一者的劑量範圍內測試抗CD73及CD39中之每一者。抗CD39抗體I-394強烈增強抗CD73抗體在恢復CD4或CD8 T細胞增殖中之作用，使得當與抗CD39抗體組合使用時，甚至低濃度之抗CD73抗體(例如低於0.01 µg/ml、低於0.001 µg/ml及甚至低於0.001 µg/ml)強烈增強CD4或CD8 T細胞增殖。此外，當單獨在無抗CD73的情況下在劑量範圍中測試時，抗CD39抗體I-394在0.1 µg/ml及1 µg/ml之濃度下引起CD4或CD8 T細胞增殖之顯著增強。圖 12A 展示抗CD73抗體6E1在CD4 T細胞增殖上之劑量範圍，其在3種不同抗CD39抗體I-394劑量下：0.01 µg/ml、0.1 µg/ml及1 µg/ml中之任一者。可中和可溶性及/或單體人類CD39之抗CD39抗體在恢復CD4 T細胞增殖中展示抗CD73抗體的作用之強力增強。作用在抗CD73抗體具有次佳活性之濃度下尤其強，對應於在用抗CD73抗體治療過程期間可在腫瘤組織中觀測到的濃度範圍。在0.01 µg/ml之濃度下，抗CD39抗體提供抗CD73抗體之效價的大致1-log增加，且在0.1 µg/ml之濃度下，抗CD39抗體提供抗CD73抗體之效價的大致4-log增加。抗CD39抗體可因此適用於增強抗CD73抗體(尤其在腫瘤組織中，例如在攜帶CD73表現細胞之腫瘤中)之活性。此外，雖然所測試之抗CD73抗體(其能夠中和可溶性CD73蛋白)具有恢復CD4 T細胞增殖之較強能力，但具有較低效價(例如如在酶抑制分析法中、在T細胞增殖分析法中或其他適合分析法中所評估)之其他抗體且可甚至更加受益於與抗sCD39抗體之組合。圖 12B 展示抗CD73抗體在CD8 T細胞增殖上之劑量範圍。同樣，抗CD39抗體在恢復CD8 T細胞增殖中展示與抗CD73抗體之強力協同及/或累加效應。作用在抗CD73抗體具有次佳活性之濃度下尤其強，對應於在用抗CD73抗體治療過程期間可在腫瘤組織中觀測到的濃度範圍。
實例 13 ： 抗體 I-394 之強效人類化變異體之產生 分別具有SEQ ID NO: 6及7之VH及VL胺基酸序列的親代抗體I-394經修飾，其藉由向VH引入來自人類子群IGHV1-3 (FR1、FR2、FR3)以及IGHJ1*01 (FR4)之重鏈構架，及向VL引入來自人類子群IGKV4-1 (FR1、FR2、FR3)以及IGKJ4*01 (FR4)之輕鏈構架。
重疊基於不同人類VH及VL基因區段之三維模型且逐一仔細檢查所有胺基酸之差異。使用親代嵌合(HPLP)及人類化(H0L0)抗體之3D模型攻擊電腦模擬之分子設計。使用Discovery Studio之模型抗體方案(Model Antibody protocol) (DS版本4.5)建構Fab片段之3D模型。
用於對具有人類IgG1恆定區、包括包含N297S取代(不具有N297連接糖基化)或L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代(保有N297連接糖基化)]的Fc域之I-394的嵌合Fab型式進行建模的重鏈及輕鏈序列如下： I-394-LP (親代Fab輕鏈)：
Figure 02_image045
Figure 02_image047
。
I-394-HP (親代Fab重鏈)：
Figure 02_image049
Figure 02_image051
。
重鏈及輕鏈範本結構經識別，且蛋白質資料庫(PDB)參考編號4M7K、1I7Z及3D85分別用於VH/VL介面、LC及HC建模。所使用之PDB資料庫為來自由RCSB成員Rutgers及UCSD/SDSC所管理之結構性生物資訊研究合作組織(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics)的RCSB PDB，參見www.rcsb.org及H.M. Berman, 等人 (2000) The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242。PDB條目4M7K之參考文獻：Teplyakov, A., 等人 (2014) Proteins 82: 1563-1582。PDB條目1I7Z之參考文獻：Larsen, N.A., 等人, (2001) J.Mol.Biol. 311: 9-15。PDB條目3D85之參考文獻：Beyer, B.M., 等人 (2008) J.Mol.Biol. 382: 942-955。
用於對I-394之人類化Fab型式進行建模之重鏈及輕鏈序列如下。
I-394 Fab L0輕鏈：
Figure 02_image053
Figure 02_image055
。
I-394 Fab H0重鏈：
Figure 02_image057
Figure 02_image059
。
對於I-394之人類化Fab型式，PDB參考編號4NWT、4I77及4JPI分別用於VH/VL介面、LC及HC建模。PDB條目4NWT之參考文獻：Bowers, P.M., 等人,   (2014) J.Biol.Chem. 289: 33557-33567。PDB條目4I77之參考文獻：Ultsch, M., 等人, (2013) J.Mol.Biol. 425: 1330-1339。PDB條目4JPI之參考文獻：Jardine, J., 等人, (2013) Science 340: 711-716。
對於輕鏈及重鏈人類化變異體之中間選擇，重疊HPLP及H0L0 3D模型且逐一仔細檢查所有胺基酸之差異。亦評估殘基之間的鏈內及鏈外連接，以便不藉由在給定鏈中引入回復突變而打斷任何重要低能鍵。另外，對於輕鏈及重鏈人類化變異體，在HPLP及H0L0 3D模型重疊中尤其仔細檢查受到在Kabat及IMGT CDR編號流程之間的不符之影響的胺基酸；研究結果提示VH變異體(藉由*指示，如H2*、H3*及H4*)之設計，其保持在VH中Kabat殘基50 (Kabat而非IGMT CDR2殘基)處存在之親代殘基(酪胺酸)，但不保持在位置60及64 (均為Kabat CDR2殘基)處之親代殘基。類似地，產生不保持在位置24處之親代殘基(Kabat CDR1殘基)之VL變異體L1*。
將胺基酸修飾引入至親代序列中。抗CD39抗體VH及VL序列提供於下文表A中。與SEQ ID NO: 27之親代H0 VH相比，H1含有R72V取代(FR3)；H2含有V68A (FR3)及R72V (FR3)取代；H2*含有V68A (FR3)及R72V (FR3)取代以及N61S (CDR2)取代；H3含有M48I (FR2)、V68A (FR3)及R72V (FR3)取代；H3含有M48I (FR2)、V68A (FR3)及R72V (FR3)取代以及CDR2中之N61S及K65Q取代；H4含有M48I (FR2)、V68A (FR3)、R72V (FR3)及S77R FR3)取代；且H4*含有M48I (FR2)、V68A (FR3)、R72V (FR3)及S77R (FR3)取代，以及CDR2中之N61S及K65Q取代。與SEQ ID NO: 35之親代L0鏈VL相比，L1含有Y40F取代(FR2)且L1*含有Y40F取代(FR2)及R24K取代(CDR1)。 表A
Figure 108120819-A0304-0002
具有VH及VL可變區之抗體產生為Fc沉默重組嵌合人類IgG1抗體，其具有重鏈取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (Kabat EU編號)突變，其引起與人類Fcγ受體CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64之結合的損失。
簡言之，將以下展示之VH及Vk序列分別選殖至含有huIgG1恆定域(攜帶L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代)及huCk恆定域之載體中。將兩種所得載體以組合方式共轉染至CHO細胞株中以便產生VH與VL之組合。使用所建立之細胞池在CHO培養基中產生抗體。隨後使用蛋白質A純化抗體。
除親代CDR移植人類化抗體(mAb1)以外，建構抗體之23種其他人類化變異體，其與親代CDR移植型式相比含有不同胺基酸取代。所有抗體變異體在CHO細胞中作為人類IgG1抗體成功產生。所得抗體mAb1至mAb24之VH及VL展示於表B中。 表B
Figure 108120819-A0304-0003
使用表現人類CD39之CHO細胞及表現食蟹獼猴(長尾獼猴) CD39之CHO細胞，藉由如實例7中所述之流式細胞測量術評估抗體mAb1-21與CD39之結合。所有mAb在人類及食蟹獼猴CD39 CHO細胞株上展現與親代I-394抗體相當之結合。
實例 14 ： 抗體 I-394 之人類化變異體之活性 藉由各種分析法進一步評估mAb1-24對CD39之結合及抑制，包括結合至存在於拉莫斯腫瘤細胞株上之CD39 (發現其表現尤其高水平之CD39)、抑制以重組方式產生之sCD39之酶活性以及抑制來自表現人類CD39的CHO細胞及來自拉莫斯腫瘤細胞的細胞培養物上澄液中之sCD39蛋白脫落物之酶活性。
藉由流式細胞測量術根據實例7中所描述之方法在拉莫斯淋巴瘤細胞上滴定抗體。結果顯示相較於親代I-394抗體，所有L0變異體在拉莫斯細胞株上結合較弱，而H2L1、H2L1*、H4L1及H4L1*抗體(分別mAb8、9、20及21)展示最佳結合，且均類似於親代I-394抗體。參見圖 13 。
使用如上文(方法)所描述之用於抑制可溶性CD39酶活性之分析法，測試抗體抑制可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的能力。所有抗體均展現良好活性，其中H3L1、H3L1*、H4L1及H4L1* (分別mAb14、15、20及21)均與親代I-394抗體相當，而其他抗體之效價略低。使用如上文(方法)所描述之用於抑制可溶性CD39酶活性之分析法，亦測試抗體抑制自表現人類CD39之CHO細胞釋放的在細胞培養物上澄液中之可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的能力。所有抗體均展現良好活性，其中H4L1及H4L1* (mAb20及mAb21)均與親代I-394抗體相當，而其他抗體之效價略低。
測試抗體以評估其在實例12中所述之分析法中減少T細胞抑制之功效。為測試ATP介導DC活化在CD4 T細胞活化上之作用，洗滌ATP活化DC，隨後與同種異體CD4 T細胞(比率1個MoDC/4個T細胞)一起培育，以在第5天期間達成混合淋巴細胞反應(MLR)。藉由流式細胞測量術經由CD25表現及Cell Trace紫色稀釋分析T細胞活化及增殖。結果顯示，具有與L1輕鏈組合之重鏈H2、H3或H4鏈之抗體全部與親代I-394抗體同樣有效，而具有L0輕鏈之抗體功效較低。
測試抗體在抑制表現膜結合CD39之細胞株中之ATP酶活性中的效價。使用如上文(方法)所描述之用於抑制細胞CD39酶活性之分析法，評價抗體對CD39表現細胞中CD39之ATP酶活性的抑制。首先在表現人類CD39之CHO細胞上評價抗體；在此情況下，在經CHO轉染之細胞株上之變異體mAb1-24與親代I-394抗體之間未觀測到實質性差異。然而，當在腫瘤細胞株拉莫斯及米諾上評價抗體時，相較於所有其他抗體，H4L1及H4L1*抗體(mAb20及mAb21)在阻斷CD39酶活性方面更有效。圖 14 展示米諾細胞中之結果。在轉染物中及在腫瘤細胞中之分析法之間觀測到的差異可產生於與CHO細胞相比在此等腫瘤細胞株中發現之尤其高的CD39表現，允許揭示抗體當中之效價差異。亦在拉莫斯腫瘤細胞上測試具有H4*重鏈及L1或L1*輕鏈之抗體；在此情況下，H4*抗體mAb23及mAb24之效價略低於mAb20及mAb21。總之，腫瘤細胞衍生之sCD39 (例如在表現高水平CD39之腫瘤細胞中)的最有效抑制劑為具有H4重鏈之抗體，其次具有H2重鏈之抗體，其次具有H3重鏈之抗體，在各情況下具有L1輕鏈。一種可能的解釋為H3變異體中存在不利的回復突變(BM)，使其比H2變異體功效更低，但其繼而由H4重鏈變異體中之取代平衡，該取代將活性恢復至親代I-394之水平。因此，在人類化變異體當中總體上最有效之抗體為H4L1抗體(具有SEQ ID NO: 31之VH及SEQ ID NO: 36之VL)及H4L1*抗體(具有SEQ ID NO: 31之VH及SEQ ID NO: 37之VL)。mAb20具有SEQ ID NO: 8至13中所示之各別重鏈及輕鏈CDR，以及來自人類IGHV1-3基因(FR1、FR2、FR3)以及IGHJ1*01基因(FR4)之重鏈構架，及以下取代(Kabat編號)：M48I (FR2)、V68A (FR3)、R72V (FR3)及S77R (FR3)；及來自人類子群IGKV4-1 (FR1、FR2、FR3)以及IGKJ4*01 (FR4)之輕鏈構架及Y40F取代(FR2)。mAb21額外在Kabat殘基24處在輕鏈CDR1中帶有取代(R24K取代)。
具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之H4L1抗體(mAb20)之完整重鏈展示如下：
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。
H4L1抗體(mAb20)之完整輕鏈展示如下：
Figure 02_image065
Figure 02_image067
。
H4L1*抗體(mAb21)之完整輕鏈展示如下：
Figure 02_image069
(SEQ ID NO: 40)。
實例 15 ：抗體 I- 394 之人類化變異體之穩定性 將所有抗體mAb1-24及先前技術抗CD39抗體BY40製備為具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之人類IgG1同型，在以下參考調配物中在約7 mg/mL之濃度下測試其穩定性：pH 6.0；組胺酸緩衝劑(10 mM)；蔗糖(200 mM)；NaCl (50 mM)；聚山梨醇酯80 (PS80) (0.2 g/L)。在兩種儲存條件下(在+5℃±3℃下及在+40±3℃下)監測調配物之穩定性。對於各研究，進行3個時間點：T0、T15D (15天)及T1M (1個月)。進行凍融(F/T)及熱變換穩定性分析法(TSSA)以用於格式比較。為進行F/T循環，將樣品在-20℃下冷凍至少2小時且在室溫下解凍至少1小時，重複F/T循環三次且在最後一次冷凍/解凍循環之後24小時測試樣品。在各時間點進行以下測試： ● 粒狀物質(MFI) ● 目視檢查(外觀) ● 雜質(SE-HPLC) ● 濁度(400 nm) ● 蛋白質濃度(280 nm) (用Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.)進行)
所得抗體H2L1 (mAb 8)、H2L1* (mAb9)、H4L1 (mAb20)及H4L1* (mAb21)均展示良好物理化學穩定性。在圖 15A 中展示親代I-394抗體相較於抗體BY40，且在圖 15B 中展示具有H2L1、H2L1*、H4L1或H4L1*鏈組合之抗體的聚集溫度(TAgg )。I-394及H2L1、H2L1*、H4L1及H4L1*抗體中之每一者展現接近70℃之TAgg 。與TAgg 較接近60℃之抗體BY40相比，H2L1、H2L1*、H4L1及H4L1*抗體展現顯著的穩定性優勢。抗體BY40之相對較低固有穩定性的一個可能原因為mAb表面處之許多芳族胺基酸殘基(其位於CDR中，尤其在重鏈CDR3中)，其賦予BY40抗體相對較高之預測疏水性。
本文所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均以全文引用之方式併入本文中，且引用程度與個別且特定地指示在本文中以引用之方式併入且全文闡述(在法律允許之最大程度上)的各參考文獻相同，無論本文中其他地方作出之特定文獻的任何單獨提供之併入。
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除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲較好地闡明本發明而不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解為暗指任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。
圖1展示代表性篩選結果，其展示與陽性對照I-394抗體相比之抗體I-397、I-398及I-399。 圖2A展示抗體BY40、I-394、I-395及I-396抑制細胞膜結合CD39，其中I-394及I-395相比於BY40均在所有濃度下展示更大效價以及更大最大細胞CD39抑制。圖2B展示與陰性對照(BY40)及陽性對照(I-394)抗體相比，抗體I-395及I-396均抑制可溶性CD39。 圖3A展示CD39蛋白之表面上突變於突變體5 (M5)、15 (M15)及19 (M19)中之殘基的位置。圖3B展示關於不同抗體的結合至突變體5、15及19之結果。 圖4展示如藉由流式細胞測量術評估之抗體I-394與表現人類CD39之細胞的結合。I-394結合表現人類CD39之細胞(CHO-huCD39)、表現食蟹獼猴(cynomolgus) CD39之細胞(CHO-cyCD39)及結合至拉莫斯淋巴瘤細胞，但不結合至表現鼠類CD39之細胞(CHO-moCD39)。 圖5展示如藉由定量與存在之ATP之量成比例的發光單位來評估，抗體I-394對阻斷在腫瘤(拉莫斯)細胞、表現人類CD39之細胞(CHO-huCD39)及表現食蟹獼猴CD39之細胞(CHO-cyCD39)中的CD39酶活性非常強效。 圖6展示如藉由定量與存在之ATP之量成比例的發光單位來評估，抗體I-394對阻斷可溶性重組人類CD39蛋白之酶活性非常強效。 圖7展示如ELISA分析法中所評估，抗體I-394結合至人類CD39但不結合至人類同功異型物CD39-L1、-L2、-L3或-L4中之任一者。 圖8展示用於評估ATP介導DC活化在CD4 T細胞活化上之作用的實驗程序，洗滌ATP活化DC，隨後與同種異體CD4 T細胞(比率1個MoDC/4個T細胞)一起培育，以在第5天期間達成混合淋巴細胞反應(MLR)。藉由流式細胞測量術經由CD25表現及Cell Trace紫色稀釋分析T細胞活化及增殖。 圖9展示在moDC上之HLA-DR表現且圖10展示在moDC上之CD83表現。此等圖式展示抗CD39阻斷抗體I-394及CD39之化學抑制劑在0.125 mM、0.25 mM或0.5 mM中之每一者下引起moDC活化。然而，抗CD39抗體BY40或抗CD73抗體不能促進樹突狀細胞(DC)之ATP誘導活化，表明抗體不能充分阻斷酶活性以避免ATP分解代謝。圖例頂部至底部對應於在圖式中之條形自左至右。 圖11展示CD25表現，展示在ATP存在下活化之MoDC能夠在MLR分析法中誘導T細胞活化及增殖；藉由抗CD39阻斷抗體I-394的ATP介導MoDC活化之增強引起較高T細胞增殖及活化。圖例頂部至底部對應於在圖式中之條形自左至右。 圖12A展示在添加ATP之存在下，抗CD73抗體在CD4 T細胞增殖上之劑量範圍，其在3種不同抗sCD39抗體劑量下：0.01 µg/ml、0.1 µg/ml及1 µg/ml中之任一者。可中和可溶性人類CD39之抗CD39抗體在恢復CD4 T細胞增殖中展示抗CD73抗體之強力增強。圖12B展示在添加ATP之存在下，抗CD73抗體在CD8 T細胞增殖上之劑量範圍，抗sCD39抗體在恢復CD8 T細胞增殖中展示抗CD73抗體之強力增強。 圖13展示藉由流式細胞測量術在拉莫斯淋巴瘤細胞上滴定的抗體。抗體H2L1、H2L1*、H4L1及H4L1*抗體(分別mAb8、9、20、及21)展示最佳結合。 圖14展示在表現膜結合CD39的拉莫斯及米諾(Mino)腫瘤細胞株中之ATP酶活性的抑制，H4L1及H4L1*抗體(mAb20及mAb21)在阻斷CD39酶活性方面最強效。 圖15A展示與抗體BY40相比，抗體I-394 (親代輕及重鏈)具有較高聚集溫度(TAgg)及改良穩定性。圖15B展示具有可變區H2L1 (mAb8)、H2L1* (mAb9)、H4L1 (mAb20)及H4L1* (mAb21)之I-394抗體人類化變異型抗體均具有較高聚集溫度(TAgg)及良好穩定性。
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Claims (57)

  1. 一種抗體或抗體片段，其結合人類CD39多肽且其能夠抑制可溶性細胞外域人類CD39多肽之ATP酶活性，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
  2. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少80%一致之胺基酸序列，該輕鏈包含與選自由SEQ ID NO: 39或40組成之群的胺基酸序列至少80%一致之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含來自人類IGHV1-3基因之重鏈構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列；及來自人類IGKV4-1基因之輕鏈構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列。
  4. 一種抗體或抗體片段，其結合人類CD39多肽且能夠結合及抑制可溶性細胞外域人類CD39蛋白之ATP酶活性，其中該抗體或抗體片段包含：重鏈可變區(VH)，其包含具有展示於SEQ ID NO: 8、9及10中之各別胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含具有展示於SEQ ID NO: 17、12及13中之各別胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV4-1基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列。
  5. 如請求項4之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區(VH)包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列，該輕鏈可變區(VL)包含與選自由SEQ ID NO: 36及37組成之群的胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。
  6. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  7. 一種抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的輕鏈。
  8. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  9. 一種抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的輕鏈。
  10. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  11. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  12. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  13. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  14. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  15. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36或37之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  16. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠抑制由人類腫瘤細胞所產生之可溶性細胞外域人類CD39蛋白之ATP酶活性。
  17. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠抑制由人類腫瘤細胞所產生之可溶性細胞外域人類CD39蛋白之ATP酶活性。
  18. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠抑制來自人類CD39表現腫瘤細胞之細胞培養物上澄液中的sCD39蛋白脫落物之ATP酶活性。
  19. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該等腫瘤細胞為拉莫斯(Ramos)腫瘤細胞。
  20. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體在外源添加之ATP之存在下抑制該CD39蛋白之ATP酶活性，視情況其中以20 µM之濃度提供外源添加之ATP。
  21. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠在細胞表面結合人類CD39蛋白且其能夠在細胞表面抑制該CD39蛋白之ATP酶活性。
  22. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠使來自人類CD39表現腫瘤細胞之細胞培養物上澄液中的sCD39蛋白脫落物之ATP酶活性降低超過50%，視情況超過70%，視情況超過80%。
  23. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠使由CD39表現細胞產生之細胞外ATP酶活性降低至少80%。
  24. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體抑制CD39之ATP酶活性之EC50 不超過1 µg/ml，其中CD39酶活性之抑制係藉由定量ATP對拉莫斯細胞中之ATP酶活性之中和進行評估來測定的。
  25. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體如藉由流式細胞測量術所測定，結合至拉莫斯細胞之EC50 不超過2 µg/ml，視情況不超過1 µg/ml、不超過0.5 µg/ml、不超過0.1 µg/ml。
  26. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體與包含SEQ ID NO: 31及36之各別重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體競爭結合至SEQ ID NO: 1之CD39多肽。
  27. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體能夠在ATP之存在下增加樹突狀細胞之活化。
  28. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中當將此類單核球衍生樹突狀細胞與該抗體及ATP一起活體外培育時，該抗體能夠使moDC中之活化之細胞表面標記物的表現增加。
  29. 如請求項27或28之抗體或抗體片段，其中以0.125 mM、0.25 mM或0.5 mM提供外源添加之ATP。
  30. 如請求項27至29之抗體或抗體片段，其中活化之細胞表面標記物表現的增加係藉由以下方式評估：在ATP之存在下培育moDC 24小時，且藉由流式細胞測量術分析moDC上之CD80、CD83及/或HLA-DR的細胞表面表現。
  31. 如請求項28至30之抗體或抗體片段，其中相較於陰性對照(例如培養基)，細胞表面標記物表現增加至少40%、50%、75%或80%。
  32. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中當T細胞與CD39表現DC細胞一起在ATP之存在下活體外共培養時，該抗體能夠增加T細胞增殖。
  33. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中在各情況下，相對於該抗體與包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的野生型CD39多肽之間的結合，該抗體與突變型CD39多肽的結合減少，該突變型CD39多肽包含突變R138A、M139A及E142K (參見SEQ ID NO: 1)。
  34. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為裸抗體，視情況不結合至細胞毒性劑之抗體。
  35. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為抗體片段，視情況不具有Fc域之抗體片段。
  36. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為具有人類Fc域之抗體，該人類Fc域經修飾以減少該Fc域與人類Fcγ受體之間的結合。
  37. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體實質上不存在與人類CD16、CD32a、CD32b及/或CD64多肽之結合。
  38. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體包含Fc域，視情況其中該Fc域相較於野生型Fc域包含胺基酸修飾，該Fc域與人類Fcγ受體CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64中之一或多者或全部之結合減少或消除。
  39. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為全長抗體。
  40. 如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含經修飾之人類IgG1 Fc域，其包含在Kabat殘基N297處之N-連接糖基化且包含在Kabat殘基234及235處、視情況另外在Kabat殘基331處、視情況在Kabat殘基234、235、237處及在Kabat殘基330及/或331處之胺基酸取代，視情況其中該Fc域包含L234A/L235E/P331S取代、L234F/L235E/P331S取代、L234A/L235E/G237A/P331S取代或L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代。
  41. 一種醫藥組合物，其包含如上述請求項中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  42. 一種套組，其包含如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，視情況進一步包含特異性識別如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段的經標記之二級抗體或抗體片段。
  43. 一種核酸，其編碼如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段之重鏈及/或輕鏈。
  44. 一種重組宿主細胞，其產生如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段。
  45. 一種用於治療或預防有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段或如請求項41之組合物。
  46. 一種用於降低個體中之可溶性CD39蛋白之ATP酶活性的方法，該方法包含向該患者投與有效量之如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段或如請求項42之組合物。
  47. 如請求項46之方法，其中該個體患有癌症。
  48. 一種用於增加患有癌症之個體中之T、NK及/或B細胞活性及/或緩解患有癌症之個體中之T、NK及/或B細胞活性之腺苷介導抑制的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段或如請求項41之組合物。
  49. 一種用於增加患有癌症之個體中之樹突狀細胞之活化及/或用於恢復患有癌症之個體中之DC細胞的ATP介導活化之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段或如請求項41之組合物。
  50. 如請求項45至49之方法，其中該個體具有可偵測之可溶性CD39蛋白。
  51. 如請求項50之方法，其中該個體在循環中、在腫瘤組織中及/或在腫瘤鄰近組織中具有可偵測之可溶性CD39蛋白。
  52. 一種用於治療或預防有需要之個體之癌症的方法，該方法包含： a)偵測在循環中及/或在腫瘤環境中之可溶性CD39蛋白，及 b)在確定可溶性CD39蛋白包含於循環及/或該腫瘤環境中之後，視情況該可溶性CD39蛋白呈與參考含量相比增加之含量，向該個體投與如請求項1至40中任一項之抗體或抗體片段或如請求項41之組合物。
  53. 如請求項52之方法，其中偵測可溶性CD39蛋白包含自該個體獲得生物樣品，使該樣品與結合可溶性CD39蛋白之抗體接觸，及偵測結合至可溶性CD39蛋白之抗體。
  54. 如請求項45至53中任一項之方法，其中該抗CD39抗體以在血液(血清)及/或腫瘤組織中有效達成一定濃度的量投與至少一次，該濃度至少對應於中和可溶性CD39蛋白之酶活性的EC50 。
  55. 如上述請求項中任一項之方法，其中可溶性CD39蛋白之酶活性的中和藉由以下方式測定：藉由對在將該CD39蛋白與抗CD39抗體或抗體片段一起培育時水解之ATP的減少進行定量，評估呈溶解狀態之CD39細胞外域蛋白之ATP酶活性之中和。
  56. 如請求項45至53中任一項之方法，其中該腫瘤或癌症為實體腫瘤。
  57. 如請求項56之方法，其中該腫瘤或癌症為頭頸部鱗狀細胞癌、膀胱癌、卵巢癌、結腸直腸癌、黑素瘤、胃癌、食道癌或乳癌。
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