JP7371019B2 - 疾病の予後と管理のための方法 - Google Patents

Description

本開示は一般に筋萎縮性側索硬化症（ALS）の予後と管理のための方法、並びにそれに関連する組成物、キット、固体支持体および使用に関する。
関連出願

本出願は、2018年５月10日に出願された「疾病の予後と管理のための方法」という発明の名称の米国仮出願第62/669,915号に対する優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれる。

本出願は、電子形式での配列表と共に提出される。配列表は2019年５月７日に作成された35524033 Implict ALS PCT_ST25.TXTというファイル名のファイルとして提供され、そのファイルのサイズは15,144バイトである。配列表の電子形式での情報は、その全内容が参照により組み込まれる。
発明の背景

筋委縮性側索硬化症（ALS）はロイ・ゲーリッヒ病としても知られ、上行および下行運動ニューロンを選択的に破壊する、最も一般的で破壊的で常に致死的な成人の変性性運動ニューロン疾患である。ALS患者の約10％が、優性遺伝形質として通常受け継がれる疾患の陽性家族歴を有し、残りの90％は、遺伝的罹患性と環境との複雑な相互作用を反映した家族歴を持たない散発性疾患である。ALS「症候群」は臨床的に不均質な発現の仕方と経過を有し、生存期間は数か月から数十年までの間であるが、典型的には病気の症状の発生から３～５年である。生存率は臨床的表現型、発病の年齢、性別、呼吸不全の初期提示、および体重減少といった幾つかの因子と関連付けられる（Lunetta C.他、JAMA Neurol. 2017; 74(6): 660-667）。ALSの病理学的プロセスは現在、運動系を超えて広がると認識されており、認識障害並びに制御不能な中心免疫系と末梢免疫系を包含する。不運にも、現在この疾患の病理生物学を改変するために利用できるのは最小有効の治療法である；それらの患者の管理に必須の構成要素は、苦痛緩和ケアと対症療法である。

ALSは発症の地域、進行速度、病気の蔓延のパターン、上行運動ニューロン（UMN）と下行運動ニューロン（LMN）の相対負荷（burden）、並びに認知病理学における不均一性（多様性）により特徴づけられる。ALSにおけるこの表現型多様性は、病気の進行の測定を複雑にする。ALSのターゲット療法の新時代の幕開けとともに、病気の負担や進行速度の正確な測定は、効率的な臨床試験計画を容易にし、かつALSの治療薬の開発のための病因論への更なる洞察を可能にする、重要な優先性を保持している。

被験者におけるALSの進行速度を理解することは、被験者の別の生活面を計画するために被験者により有用であることの他に、適切な管理または治療計画を開発するのに役立つことができる。大部分の病気に関しては、より急速な進行速度は、薬物対理学療法または栄養上のサポートによる、より積極的な治療の必要性；より有力な薬物の必要性；またはおそらく同じ薬物がより高用量でもしくはより短い投薬サイクル間隔で送達されることを意味する。幾つかの場合、ある特定の治療法は、緩徐進行性に対比して急速進行性疾患においてより効果的であるだろう。従って、サンプリングの時点で進行速度を予測する予後予測の欠如が、個々の患者に対してアウトカムを最適化するALS／MND治療レジメンの個別化に対する障害である。従って、被験者の進行速度を正確に予測するまたは決定する方法、例えばALSをもつ被験者が緩徐進行性疾患または急速進行性疾患を有するかどうかを決定する方法を同定する必要性が依然として残っている。
開示の要約

本開示は、少なくとも一部は、被験者におけるALSの進行速度と相関するALS進行のバイオマーカーの同定に基づいている。本明細書に証明されるように、急速進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルは、緩徐進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、そして健常被験者のものに比較して、典型的には増加する（または上昇する）。反対に、緩徐進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプルにおける１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルは、急速進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、典型的には減少する（または低減する）。従って、ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルを決定することは、ALSの進行速度の決定に用いることができる。特定の実施形態では、被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルは、該被験者が緩徐進行性ALSまたは急速進行性ALSのいずれを有する可能性があるかを決定するのに用いられる。そのようなALS進行バイオマーカーの例は可溶性CD14（sCD14）およびリポ多糖結合タンパク質（LBP）である。

ALS患者が急速または緩徐のいずれの病気進行を有すると考えられるかを早期に理解することは（本開示がそれを実現する手段を提供する）、明らかなベネフィットおよび利点を有する。ALSと診断された被験者の場合、急速または緩徐のいずれの病気進行を有する可能性があるかを知ることは、適切な生活スタイルと財務決定を行うのに役立つことができよう。更に、起こり得る病気の進行速度を理解することは、治療レジメンに影響を与えうる。例えば、呼吸機能は、生存力を決定づける主な要因の１つであり、急速進行のマーカーを持つことは、非侵襲的換気（NIV）の早期使用を促進できる。呼吸機能と同様、栄養管の挿入の時期が重要であり、平均余命に影響を与える因子である。ALS患者は、いったんその呼吸機能が有意に悪化している段階にまで進行してしまうと、麻酔医が手術を補助するのをためらう場合がある。結果として、急速進行について何らかの懸念事項があるならば栄養管を早期に挿入することができるように、被験者が自身の病気進行を知ることが望ましい。別の例では、急速進行性ALSを有する被験者を同定し、そして新たな治療法の効果を評価する臨床試験に含めるために選択することができる。臨床試験にそのような被験者を含めることは、病気進行の期間がより短く、より迅速にエビデンスを得ることができるため、望ましい。

従って、一態様では、被験者においてALSの進行速度を評価する方法が提供され、該方法は、(a) ALSを有する被験者から得られた生物学的サンプルにおいてバイオマーカーのレベルを決定し、ここで前記バイオマーカーは可溶性CD14（sCD14）またはリポ多糖結合タンパク質（LBP）であり；そして(b) 生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて、例えば適切な参照レベルと比較して、前記被験者におけるALSの進行の推定速度を決定することを含む。特定の実施形態では、ALSの進行速度の測定は、ALSをもつ被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかの決定を容易にする。そのような場合、該方法は(a) ALSを有する被験者から得られた生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定し、ここで前記バイオマーカーは可溶性CD14（sCD14）またはリポ多糖結合タンパク質（LBP）であり；そして(b) 適切な参照レベルに比較して生物学的サンプル中の該バイオマーカーのレベルに基づいて、該被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定することを含む。

よって、ALSを有する被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定するための方法が提供され、該方法は(a) ALSを有する被験者から得られた生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定し、ここで該バイオマーカーは可溶性CD14（sCD14）またはリポ多糖結合タンパク質（LBP）であり；そして(b) 適当な参照レベルに比較して、生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定することを含む。例えば、参照レベルが健常被験者および／または緩徐進行性ALSを有することが分かっている被験者を表し、その参照レベルに対比したバイオマーカーのレベルの増加が、該被験者が急速進行性ALSを有する可能性があることを示し得る。更なる例では、参照レベルが健常被験者および／または緩徐進行性ALSを有することが分かっている被験者を表し、その参照レベルに対比したバイオマーカーのレベルの減少が、該被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があることを示し得る。特定の実施形態では、参照レベルは、それより上では被験者が急速進行性ALSを有する可能性があり、それより下では被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があるという閾値レベルである。

上記および本明細書中に記載の方法の特定例では、該方法は、sCD14とLBPの両方のレベルを決定することを含む。典型的には、生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、尿および脳脊髄液（CSF）からなる群より選択される。幾つかの実施形態では、該方法は更に、生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定することを含む。一例として、少なくとも１つの別のバイオマーカーは、CRP、MIF、sTNFRIおよび／またはsTNFRIIからなる群より選択される。例えば、健常被験者または緩徐進行性ALSを有する被験者を表す参照レベルに対比した、CRP、sTNFRIおよび／またはsTNFRIIのレベルの増加は、該被験者が急速進行性ALSを有することを示しうる。

本開示の方法の幾つかの実施形態では、バイオマーカーのレベルを測定する前に、生物学的サンプルを取得する追加のステップが実施される。別の実施形態では、該方法は、ALSを治療するための治療レジメンを被験者に受けてもらうことを含む。

ALSを有する被験者においてバイオマーカーのレベルを測定するためのキットも提供され、該キットは、生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定可能にするバイオマーカーに特異的な抗原結合分子を含み、ここで該バイオマーカーはsCD14またはLBPである。幾つかの実施形態では、キットはsCD14に特異的な抗原結合分子およびLBPに特異的な抗原結合分子を含み、それらは生物学的サンプル中のsCD14とLBPのレベルの測定を可能にする。更なる実施形態では、キットはCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、およびmiR-374b-5pの中から選択された少なくとも１つのバイオマーカーに特異的な抗原結合分子も含む。該キットは、１つ以上の検出試薬、および／またはバイオマーカーのレベルを測定するための教材を含んでもよい。

別の態様では、本開示は、バイオマーカーに特異的な抗原結合分子を含む固体支持体を提供し、ここでバイオマーカーはsCD14またはLBPである。幾つかの例では、支持体はsCD14に特異的な抗原結合分子とLBPに特異的な抗原結合分子とを含む。更なる例では、固体支持体は、CRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5pの中から選択された少なくとも１つのバイオマーカーに特異的な抗原結合分子も更に含む。幾つかの実施形態では、固体支持体はマルチウェルプレート、スライド、チップまたは複数のビーズの中から選択される。

更なる態様では、ALSのための治療に被験者を層別化する方法が提供され、該方法は、(a) 上記および本明細書に記載の方法に従って、被験者が急速または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定し、または被験者におけるALSの進行速度を評価し；そして(b) 被験者が急速または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかに基づいて、または被験者におけるALSの進行速度に基づいて、被験者にとって適当な最適化された治療レジメンを決定することを含む。被験者を層別化するためのそのような方法は、最適化された治療レジメンに該被験者をさらすことを更に含んでもよい。

本開示は、急速進行性ALSを有する可能性がある被験者を治療する方法を提供し、該方法は、(a) 被験者の生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて、急速進行性ALSを有する可能性がある被験者を選択し、ここでバイオマーカーはsCD14またはLBPであり；そして(b) 急速進行性ALSを治療するために最適化された治療レジメンに被験者をさらすことを含む。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、尿またはCSFであってよい。幾つかの実施形態では、ステップ(a)は、被験者の生物学的サンプル中のsCD14とLBPのレベルに基づいて、急速進行性ALSを有する可能性がある被験者を選択することを含む。この治療方法の更なる実施形態では、被験者を選択する前に、該方法は上記および本明細書に記載の方法に従って、被験者が急速進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定することを含む。

幾つかの実施形態では、治療レジメンは、抗神経変性薬、例えば、リルゾール、エダラボン、CD14アンタゴニスト、GM604、マシチニブ、補体活性化経路阻害剤（例えばC5a阻害剤、例えばPMX205またはエクリズマブ）、またはCD40とCD40リガンドとの間の相互作用を遮断する物質（例えばCD40および／またはCD40リガンドに特異的に結合する抗体）の投与を含む。特定の実施形態では、CD14アンタゴニストはCD14アンタゴニスト抗体、例えば下記から選択されるものである：
(1) 配列：
QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ［配列番号１］を含む、それから成る、または本質的にそれからなるVLドメイン（3C10 VL）；および
配列：
LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS［配列番号２］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（3C10 VH）
を含む抗体；
(2) 配列：
QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQS GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK［配列番号３］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVLドメイン（28C5 VL）；および
配列：
LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA［配列番号４］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（28C5 VH）
を含む抗体；
(3) 配列：
QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK［配列番号５］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVLドメイン（18E12 VL）；および
配列：
LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS［配列番号６］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（18E12 VH）
を含む抗体。

更なる実施形態では、治療レジメンは、非侵襲的換気、例えば１回平均換気量保証サポート（AVAPS）、持続的気道内陽圧呼吸（CPAP）、および／またはバイレベル気道陽圧呼吸（BiPAP）に被験者を暴露することを含む。

本開示は、緩徐進行性ALSを有する可能性のある被験者を治療する方法も提供し、該方法は、(a) 被験者の生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて、緩徐進行性ALSを有する可能性がある被験者を選択し、ここでバイオマーカーはsCD14またはLBPであり；そして(b) 緩徐進行性ALSを治療するために最適化された治療レジメンに被験者をさらすことを含む。生物学的サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、尿またはCSFであってよい。幾つかの実施形態では、ステップ(a)は、被験者の生物学的サンプル中のsCD14とLBPのレベルに基づいて、緩徐進行性ALSを有する可能性がある被験者を選択することを含む。緩徐進行性ALSを有する可能性のある被験者を治療するための方法の特定の実施形態では、該方法は、被験者を選択する前に、上記および本明細書に記載の方法に従って、被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定することを含む。

幾つかの例では、治療レジメンは抗神経変性薬の投与を含まないが、別の例では、治療レジメンは抗神経変性薬、例えば、リルゾール、エダラボン、CD14アンタゴニスト、GM604、マシチニブ、補体経路阻害剤（例えばC5a阻害剤、例えばPMX205またはエクリズマブ）、またはCD40とCD40リガンドとの間の相互作用を遮断する剤（例えばCD40および／またはCD40リガンドに特異的に結合する抗体、例えばAT-1502抗体）の投与を含む。特定の実施形態では、CD14アンタゴニストはCD14アンタゴニスト抗体、例えば下記から選択されるものである：
(1) 配列：
QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ［配列番号１］を含む、それから成る、または本質的にそれからなるVLドメイン（３C10 VL）；および
配列：
LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS［配列番号２］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（３C10 VH）
を含む抗体；
(2) 配列：
QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQS GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK［配列番号３］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVLドメイン（28C5 VL）；および
配列：
LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA［配列番号４］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（28C5 VH）
を含む抗体；
(3) 配列：
QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK［配列番号５］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVLドメイン（18E12 VL）；および
配列：
LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS［配列番号６］を含む、それから成る、または本質的にそれから成るVHドメイン（18E12 VH）
を含む抗体。

ALSを有する被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定するためのキットの調製における、バイオマーカーに特異的な抗原結合分子の使用も期待され、ここでバイオマーカーはsCD14またはLBPである。幾つかの例では、前記使用は、ALSを有する被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する可能性があるかどうかを決定するためのキットの調製における、sCD14に特異的な抗原結合分子とLBPに特異的な抗原結合分子との組み合わせの使用である。更なる実施形態では、少なくとも１つの別のバイオマーカー（例えばCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、またはmiR-374b-5p）も、キットの調製において使用される。

図１は、ALSを有する被験者（急速進行性ALSと緩徐進行性ALSに分類）および健常志願者（対照またはNC）からの末梢血単核細胞（PBMC）および単離された全単球のフローサイトメトリー分析の結果を示す。細胞を抗ヒトCD14-V450抗体と抗ヒトCD16-FITCで染色し、そして単球集団を評価するためフローサイトメトリーに供した。次のグラフ的描写において、バーはCD14+/CD16-単球であり；灰色のバーはCD14+/CD16+単球であり；そして黒色のバーはCD14low/CD16+単球である。（Ａ）PBMC中の単球部分集団；（Ｂ）単離された全単球中の単球部分集団；（Ｃ）PBMC中の単球部分集団上のCD14発現；および（Ｄ）単離された全単球中の単球部分集団上のCD14発現。 （同上）

図２は、CD14^-/low/CD16+単球と（Ａ）病気の負担または（Ｂ）病気の進行との間の相関関係を示すグラフを提供する。

図３は、ALSを有する被験者（急速進行性と緩徐進行性ALSに分類）および健常志願者（NC）からの末梢PBMCおよび単離された全単球のサイトメトリー分析の結果を示す。細胞を抗ヒトCD14-V450抗体、抗ヒトCD16-FITCおよび抗ヒトTIM3-PEで染色し、そしてフローサイトメトリーに供して単球母集団を評価した。（Ａ）PBMC中の単球部分集団；（Ｂ）単離された全単球中の単球部分集団；（Ｃ）CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球と病気進行速度との相関関係；および（Ｄ）CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3+単球と病気進行速度との相関関係。 （同上）

図４は、健常志願者（健常対照）とALSを有する被験者からの生物学的サンプル中の、ELISAにより測定されたsCD14レベルを提供する。（Ａ）健常対照とALS患者における血清sCD14レベル；（Ｂ）緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者と健常対照における血清sCD14レベル；（Ｃ）健常志願者とALS患者のCSF中のsCD14；（Ｄ）健常対照と緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者のCSF中のsCD14；（Ｅ）血清sCD14レベルとCSF sCD14レベルとの相関関係；（Ｆ）健常対照とALS患者の尿中のsCD14；（Ｇ）緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者と健常対照の尿中のsCD14。 （同上） （同上） （同上）

図５は、健常志願者（健常対照）とALSを有する被験者における、PBMCから単離されたmRNAのqRT-PCRにより測定された、CD14 mRNAレベルを提供する。（Ａ）健常対照とALS患者のPBMC中のCD14 mRNA；（Ｂ）健常対照と緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者のPBMC中のCD14 mRNA。 （同上）

図６は、健常志願者（健常対照または対照）、ALSを有する被験者、および別の神経学的病態を有する被験者からの生物学的サンプルにおける、ELISAにより測定されたsCD14レベル。（Ａ）健常対照、緩徐または急速進行性疾患を有する患者および認知症患者における、血清sCD14レベル；（Ｂ）健常対照、軽度アルツハイマー病患者（軽度ＡＤ；ｎ＝10）、進行アルツハイマー病（Adv AD）患者、および前頭側頭型認知症（FTD）患者における血清sCD14レベル；（Ｃ）健常対照および慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIDP）患者における血清sCD14レベル；（Ｄ）健常対照、緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者、およびCIDP患者における血清sCD14レベル。 （同上）

図７は、ALS患者における血清sCD14と病気の負担または病気進行のマーカーとの間の相関関係を示す。（Ａ）ALS患者における血清sCD14とAALSスコアとの相関関係；（Ｂ）血清sCD14とALS Tregsの抑制能力との相関関係；および（Ｃ）血清sCD14レベルを使った、緩徐(S)対急速(F)進行性疾患を予測するためのROC曲線。 （同上）

図８は、2.73μg/mLの血清sCD14のROCスコアカットオフを用いた、ALS患者における血清sCD14レベルと臨床アウトカムとの相関関係を示す。（Ａ）2.73μg/mLを上回るsCD14レベルを有する、死亡したまたは生存しているALS患者の割合（％）；（Ｂ）2.73μg/mLより上または下のsCD14レベルを有するALS患者についての診断からAALSスコア100点までの時間；（Ｃ）2.73μg/mLより上または下のsCD14レベルを有するALS患者についての診断から死亡までの時間；（Ｄ）個々のALS患者における血清sCD14と、診断からAALSスコア100点に達するまでの時間との相関関係；（Ｅ）個々のALS患者における血清sCD14と、診断から死亡までの時間との相関関係。 （同上）

図９は、健常志願者（対照）とALS患者の血清中のリポ多糖結合タンパク質（LBP）のレベル、および病気の負担との相関関係を示す。（Ａ）対象およびALS患者におけるLBPの血清レベル；（Ｂ）対照および緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者におけるLBPの血清レベル；（Ｃ）LBPの血清レベルとAALSスコアとの相関関係；（Ｄ）LBPの血清レベルとsCD14の血清レベルとの相関関係。 （同上）

図１０は、健常志願者（健常対照）とALS患者の血清中のＣ反応性タンパク質（CRP）のレベルを示す。（Ａ）健常対照およびALS患者におけるCRPの血清レベル；（Ｂ）健常対照および緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者におけるCRPの血清レベル。

図１１は、健常志願者（健常対照）とALS患者の血清中のマクロファージ遊走阻止因子（MIF）のレベルを示す。（Ａ）健常対照とALS患者におけるMIFの血清レベル；（Ｂ）健常対照と緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者におけるMIFの血清レベル。

図１２は、健常志願者（健常対照）とALS患者の血清における可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩおよびII（sTNFRIおよびsTNFRII）のレベルを示す。（Ａ）健常対照とALS患者におけるsTNFRIの血清レベル；（Ｂ）HVおよびALS患者におけるsTNFRIIの血清レベル；（Ｃ）健常対照と緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者におけるTNFRIの血清レベル；（Ｄ）健常対照と緩徐進行性または急速進行性疾患を有するALS患者におけるTNFRIIの血清レベル；および（Ｅ）ALS患者におけるTNFRIとTNFRIIの血清レベルとの相関関係。 （同上）

図１３は、健常志願者（健常対照または対照（C））とALSを有する被験者からの血清サンプル中のsCD14のレベルを提供する（第二の研究）。（Ａ）第一または第二研究からのALS患者または健常対照における血清sCD14；（Ｂ）第一と第二の研究からのコホートを比較した、緩徐進行性もしくは急速進行性ALS患者または健常対照における血清sCD14レベル。（Ｃ）第二の研究における、ALS患者の血清sCD14と病気の進行速度との相関関係。（Ｄ）血清sCD14レベルを使った迅速（急速）進行性または緩徐進行性対対照を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー（Mann Whitney）検定によりP＜0.0001；感度0.767；特異度0.710）。（Ｅ）血清sCD14レベルを使った迅速（急速）進行性対緩徐進行性を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.942；特異度0.958）。（Ｆ）血清sCD14レベルを使った迅速（急速）進行性対対照を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.950；特異度0.958）。（Ｇ）血清sCD14レベルを使った緩徐進行性対対照を予測するためのROC曲線（マンホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.633；特異度0.654）。 （同上） （同上）

図１４は、健常志願者（健常対照または対照（C））およびALS患者からの血清サンプル中のLBPレベルを提供する（第二の研究）。（Ａ）第一または第二研究からのALS患者または健常対照における血清LBPレベル；（Ｂ）第一と第二の研究からのコホートを比較した、緩徐進行性もしくは急速進行性ALS患者または健常対照における血清LBPレベル。（Ｃ）第二の研究における、ALS患者からの血清sCD14と病気の進行速度との相関関係。（Ｄ）血清LBPレベルを使った迅速（急速）進行性または緩徐進行性対対照を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー（Mann Whitney）検定によりP＜0.0001；感度0.817；特異度0.920）。（Ｅ）血清LBPレベルを使った迅速（急速）進行性対緩徐進行性を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.923；特異度0.938）。（Ｆ）血清LBPレベルを使った迅速（急速）進行性対対照を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.967；特異度1）。（Ｇ）血清LBPレベルを使った緩徐進行性対対照を予測するためのROC曲線（マンホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.783；特異度0.865）。 （同上） （同上）

図１５は、緩徐進行性および急速進行性ALS患者におけるsCD14とLBPとの相関関係を示す。

図１６は、血清sCD14と血清LBPの組み合わせを使った病気進行を予測するためのROC曲線を示す。（Ａ）血清sCD14レベルとLBPレベルを使った、迅速（急速；F）または緩徐（S）進行性対対照を予測するためのROC曲線。（Ｂ）血清sCD14レベルとLBPレベルを使った、迅速（急速；F）対緩徐（S）進行性を予測するためのROC曲線。（Ｃ）血清sCD14とLBPレベルを使った、迅速（急速；F）進行性対対照を予測するためのROC曲線。（Ｄ）血清sCD14とLBPレベルを使った、緩徐（S）進行性対対照（C）を予測するためのROC曲線。（Ｅ）スケール調整した（scaled）血清sCD14レベルとLBPレベルを使った、迅速（急速；F）または緩徐（S）進行性対対照（C）を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.783；特異度0.950）。（Ｆ）目盛り付けした血清sCD14とLBPレベルを使った、迅速（急速；F）対緩徐（S）進行性を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.942；特異度0.958）。（G）目盛り付けした血清sCD14と目盛り付けしたLBPレベルを使った、迅速（急速；F）進行型対対照（C）を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度１；特異度１）。（H）目盛り付けした血清sCD14と目盛り付けしたLBPレベルを使った、緩徐（S）進行型対対照（C）を予測するためのROC曲線（マン・ホイットニー検定によりP＜0.0001；感度0.800；特異度0.808）。 （同上）

〔開示の詳細な説明〕
１．定義
異なって定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語と科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法と材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法と材料が記載される。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。

本明細書では、冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「あるバイオマーカー」は、１つのバイオマーカーまたは２つ以上のバイオマーカーを意味する。

本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の1つ以上のあらゆる可能な組み合わせの他に、選択肢（または）で解釈された場合には組合せの欠如を指し、それらを包含する。

「ALS」および「ルー・ゲーリック（Leu Gehrig）病」という用語は、同状態を指すために、本明細書中で互換的に使用され得る。家族性ALSと孤発性ALSの両方とも、対象方法によって治療することができ、またはその発生もしくは進行を判定することができる。本明細書では、ALSの全ての形態が考慮される。ALSを有する被験者は、当技術分野で周知である用語の迅速進行性ALS（本明細書では急速進行性ALSと互換的に用いられる用語)、または緩徐進行性ALSを有する場合がある。当業者であれば、緩徐および急速進行性被験者の正確なカテゴリー化は、疾患および病気の進行を評価するために用いられるスコア付け法に依存するだろう。例示的なスコア付け法としては、例えば、検査をベースにしたAppel ALS（AALS）スコアおよび質問票をベースにしたALS機能評価尺度法（ALSFRS）スコアが挙げられる。ALSFRSスコアは、４種の領域（細かい運動能力、粗大運動能力、延髄機能、および呼吸機能）にグループ化された10個の質問に基づいて付与され、40点（正常）から０（最低機能）までの範囲である（Cedarbaum他、J. Neurol Sci 1997；152(suppl l)：Sl-9）。AALSスコアは、５つのカテゴリ(延髄機能、呼吸機能、腕と脚の機能、および筋肉強度)における客観的試験に基づいており、30（正常）から164（最大障害）までの範囲にわたる（Appel他、Ann Neurol 1987；22：328-333；Haverkamp他、Brain. 1995；118：707-19）。特定例では、AALSスコア付け法が使用され、閾値は緩徐進行性ALSから急速進行性ALSを区別する。閾値は、例えば、約1.0～約2.0 AALS点数（ポイント）／月、例えば、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0 AALS点数／月であってよく、ここで急速進行性ALSを有する被験者は閾値以上の速度で進行する者であり、緩徐進行性ALSを有する被験者は閾値未満の速度で進行する者である。他の例では、急速進行性ALS被験者は閾値よりも大きい速度で進行する者であり、緩徐進行性ALSを有する被験者は、閾値以下の速度で進行する者である。特定の実施形態では、急速進行性AALSを緩徐進行性ALSから区別するための閾値は、1.5 AALS点数／月であり、急速進行性ALSを有する被験者は、1.5 AALS点数／月以上の速度で進行する者であり、緩徐進行性ALSを有する被験者は1.5 AALS点数／月よりも少ない速度で進行する者である（Henkel他、EMBO Mol Med 5：64-79）。

バイオマーカーの「量」または「レベル」は、試料中の検出可能レベルであり、絶対量もしくはレベルであるかまたは相対量もしくはレベルを表すことができる。これらは当業者に既知の方法によって測定することができ、その典型例は本明細書に開示される。

本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の1つ以上のあらゆる可能な組み合わせを指し包含するだけでなく、選択肢（または）で解釈された場合には組合せの欠如を指し包含する。

「抗原結合分子」とは、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、抗原結合活性を示す免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント（断片）および非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶことが理解されるであろう。本発明の実施に有用な代表的な抗原結合分子は、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。

本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、および所望の生物活性を示す限り単一可変ドメイン抗体を包含する。「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互に連結された２本の重（H）鎖と２本の軽（L）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらのマルチマー（例えばIgM）を含む。各重鎖は重鎖可変領域（HCVRまたはV_Hと略すことがある）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちCH₁、CH₂およびCH₃を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（LCVRまたはV_Lと略すことがある）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン(C_L1)を含む。V_H領域およびV_L領域は、さらに相補性決定領域(CDR)と称される超可変領域に細分することができ、それはフレームワーク領域（FR）と呼ばれる更に高度に保存された領域を介在させることができる。各V_HとV_Lは、３つのCDRと４つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端方向に次の順序で配置される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本発明の異なる態様では、抗体(またはその抗原結合部分)のFRは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってよく、または天然であるか人工的に改変されていてもよい。アミノ酸共通配列は、２つ以上のCDRのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。用語「抗体」の範囲内には、IgG、IgA、またはIgM (またはそのサブクラス)のような任意クラスの抗体が含まれ、抗体はいずれか特定のクラスである必要はない。重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、異なるクラスに免疫グロブリンを割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要クラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlおよびIgA2に更に分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体構造は周知である。

「抗原結合フラグメント」は、非抗体タンパク質足場上の１つ以上のCDRの配列により提供されてよい。本明細書で使用される「タンパク質足場」は、免疫グロブリン（Ig）足場、例えばIgG足場を含むがそれに限定されず、この足場は、４本鎖または２本鎖抗体であるか、あるいは抗体のFc領域のみを含むか、あるいは抗体からの１つ以上の定常領域を含んでよく、ここで定常領域はヒト起源もしくは霊長類起源のものであることができ、またはヒト定常領域と霊長類定常領域の人工キメラであってよい。タンパク質足場は、Ig足場、例えばIgGまたはIgA足場であってよい。IgG足場は、抗体の一部または全部のドメインを含みうる(すなわち、CH1、CH2、CH3、V_H、V_L)。抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG4PEから選択されたIgG足場を含むことができる。例えば、足場はIgG1であってよい。足場は、抗体のFc領域からなるかそれを含んでよく、またはその一部であってもよい。抗原結合フラグメントの非限定的例としては、(i) Fabフラグメント；(ii)F(ab')2フラグメント：(iii)Fdフラグメント；(iv)Fvフラグメント；(v)一本鎖Fv(scFv)分子；(vi)dAbフラグメント；および(vii)抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、CDR3ペプチドのような単離された相補性決定領域(CDR))、または制約条件のあるFR3-CDR3-FR4ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、ダイアボディ、トリアボデイ、テトラボデイ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、１価のナノボデイ、２価のナノボデイ等)、小型モジュール免疫製剤（SMIP）およびサメ可変IgNARドメインなどの他の遺伝子工作された分子も、本明細書中で用いられる「抗原結合フラグメント」という表現の中に含まれる。抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたはそのフレームワーク配列の枠内にある少なくとも１つのCDRを含む。V_Lドメインと結合したV_Hドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、V_HドメインとV_Lドメインは、任意の適切な配列において互いに相対的に配置され得る。例えば、可変領域は二量体であってよく、V_H-V_H、V_H-V_LまたはV_L-V_L二量体を含むことができる。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のV_HまたはV_Lドメインを含むことができる。特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含むことができる。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出され得る可変ドメインと定常ドメインの非限定的な例示的構成は、以下のものを含む：(i)V_H-C_H1、（ii）V_H-C_H2、(iii)V_H-C_H3、(iv)V_H-C_H1-C_H2、(V)V_H-C_H1-C_H2-C_H3、(vi)V_H-C_H2-C_H3、(vii)V_H-C_L、(viii)V_L-C_H1、(ix)V_L-C_H2、(X)V_L-C_H3、(xi)V_L-C_H1-C_H2、(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3、(xiii)V_L-C_H2-C_H3、および(xiv)V_L-C_L。上記に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインのいずれの立体配置においても、可変ドメインと定常ドメインは、互いに直接連結されてよく、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域を介して連結されてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内の隣接可変ドメインおよび／または定常ドメイン間にフレキシブル結合またはセミフレキシブル結合をもたらす、少なくとも２つ（例えば、5、10、15、20、40、60以上）のアミノ酸から成ることができる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに非共有結合的会合および／または１以上の単量体V_HまたはV_Lドメイン（例えば、ジスルフィド結合によって）非共有結合的会合した、上記に列挙した可変ドメインと定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異的または多重特異的（例えば、二重特異的）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、その各可変ドメインは、別々の抗原に特異的に結合することができ、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗原結合分子フォーマットを含む、任意の多重特異性抗原結合分子フォーマットは、当該技術分野で利用可能な常用技術を利用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連での使用に合わせて改変することが可能である。

用語「～に結合する」、「～に特異的に結合する」、「～に特異的である」、および関連する文法的変形は、典型的には、共有結合的もしくは非共有結合的な相互作用によりまたは共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用との組み合わせにより媒介され得る、そのような対になる分子種（例えば、抗体と抗原）間に起こる結合を指す。２つの種の相互作用が非共有結合的に結合した複合体を生成する場合、発生する結合は典型的には静電的結合、水素結合、または親油性相互作用の結果である。従って、「特異的結合」は、抗体／抗原または酵素／基質相互作用の特性を有する結合複合体を生成する、２つの分子間に相互作用が存在する対になった種の間で起こる。具体的には、特異的結合は、一対のうちの１つのメンバーの特定種への結合と、結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物のファミリー内の別の種への非結合（結合の欠如）によって特徴づけられる。

本明細書で使用する場合、「バイオマーカー」という用語は、特定の疾患、表現型、生物学的活性または機能（例えば、ALSの存在、その症状、ALSの重症度、および病気の進行速度）と定量的または定性的に関連付けることができる分子を指す。適切なバイオマーカーの例示的な例は、タンパク質、ポリペプチド、およびポリペプチドまたはタンパク質のフラグメント；炭水化物、および／または糖脂質ベースの分子マーカー；ポリヌクレオチド、例えば遺伝子産物、RNAまたはRNAフラグメント、ポリヌクレオチドコピー数改変（例えば、DNAコピー数)；ポリヌクレオチドまたはポリペプチド修飾体（例えば、翻訳後修飾、リン酸化、DNAメチル化、アセチル化、および他のクロマチン修飾、グリコシル化など)を包含する。特定の実施形態では、「バイオマーカー」は、別のサンプルまたは適当な対照／参照（比較対象）中の別のマーカーに対して測定／比較した時に、サンプル中で差次的に存在する（すなわち、増加／アップレギュレートまたは減少／ダウンレギュレートされる）分子／化合物を意味する。他の態様において、バイオマーカーは、同一または別のサンプル中の他のマーカーまたは適切な対照／参照と比較して、サンプル中に差次的に存在することができる。更なる実施形態では、バイオマーカーは、同一または別のサンプル中の他のマーカーに対して測定／比較したとき、および別のサンプルもしくは適切な対照／参照中の同一マーカーに対して測定／比較したとき、サンプル中に差次的に存在することができる。さらに別の実施形態では、バイオマーカーは、第２の表現型を有する被験者または被験者の群（例えば疾患もしくは状態を持たないかまたは重症度の低いバージョンの疾患もしくは状態を有する）に比較した時、第１の表現型を有する被験者または被験者の群（例えば疾病または状態を有する）からのサンプル中に差次的に存在することができる。「ALS進行バイオマーカー」は、ALS進行速度に関連がある分子を指す。

本明細書全体を通して、文脈が他のものを要求しない限り、用語「含む（comprise, comprises, comprising）」は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を包含することを意味するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外するものではないことが理解されるだろう。従って、用語「含む」などの使用は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であることを示すが、他の要素は任意であって、存在してもしなくてもよいことを示す。「～からなる」とは、「～からなる」という語句の後に続くものは全て含み、それに限定されることを意味する。従って、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であることを示し、その他の要素が何も存在しないことを示す。「本質的に～からなる」という用語は、その語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、そして列挙された要素の開示において特定される活性もしくは作用に干渉しないかまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「本質的に～からなる」という語句は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であることを示すが、他の要素は任意であり、それらが列挙された要素の活性もしくは作用に影響を及ぼすか否かに依存して、存在してもしなくてもよいことを示す。

「有効量」とは、状態（病態）の治療との関連で、単回投与または連続投与の一部として、そのような治療または予防を必要とする個体への一定量の薬剤または組成物の投与を意味し、その量は、その病態の症状発生の予防、そのような症状の継続検査に、および／または既存の症状の治療に効果的である量である。有効量は、治療を受ける個体の年齢、健康状態、体調、病気の症状が明らかであるかどうか、治療する個体の分類群、組成物の処方、医学的状況の評価、およびその他の関連する要因によって異なるだろう。最適な投与スケジュールは、被験者の体内への薬物蓄積の測定値から算出することができる。最適な投与量は、個々の被験者の相対的効力に応じて変化する可能性があり、一般に、in vitroおよびin vivo動物モデルで有効であると認められるEC50値に基づいて推定することができる。当業者は、最適投与量、投与方法、および繰り返し率を容易に決定することが可能である。その量は、常用試験を通して決定できる比較的広範囲の中に収まると予想される。

「上昇したレベル」等の用語は、適当な参照レベル、例えばサンプリング時点でALSを持つことが知られている被験者からまたはALSを持たないことが知られている健常被験者から得られたサンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、増加したレベルまたは量を指す。

「減少したレベル」等の用語は、適当な参照レベル、例えばサンプリング時点でALSを持つことが知られている被験者からまたはALSを持たないことが知られている健常被験者から得られたサンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、減少したレベルまたは量を指す。

本明細書中で用いる場合、適当な参照レベルに関して「同じまたは類似」であるサンプル中のバイオマーカーのレベルへの言及は、サンプル中のそのバイオマーカーのレベルと参照レベルとの間の任意の相違が、それらを互いに区別するのに不十分であること、またはそれらが表す状態もしくは表現型（例えば、健常、緩徐進行性ALS、または急速進行性ALS）を識別するのに不十分であることを意味する。理解されるように、これは、数学モデルおよび／または統計分析を利用して決定することができる。特定例では、「同じまたは類似」とは、多くて5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、50 ％、60％、70％、80％、90％、100％以上のレベルの相違を意味する。

本明細書で使用されるとき、「教材」は、本開示の組成物および方法の有用性を伝えるために利用できる刊行物、記録、図面、または他の任意の表現媒体を含む。本開示のキットの教材は、例えば、本開示の核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器に固定するか、または該核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器と一緒に発送することができる。あるいは、教材は、本発明を含む容器とは別々に発送することができ、受領者によって教材および化合物が協同して使用される。

本明細書中で用いる場合、「単球」という用語は免疫系の白血球細胞の１つのタイプを指す。単球は、典型的にはCD14の発現により典型的に特徴づけられる。単球は、次の細胞表面マーカーの１つ以上を発現することもできる：125I-WVH-1、63D3、アジポフィリン、CB12、CD11a、CD11b、CD15、CD54、Cd163、シチジンデアミナーゼ、Flt-1等。用語「単球」は、限定されないが、ヒト血液中に存在する古典型単球と非古典型炎症誘発性単球の両方を包含する。「古典的単球」とは、高レベルの細胞表面CD14発現を特徴とする単球の１つの型（CD14++ 単球）を意味し、一方で「非古典的炎症誘発性単球」という用語は、通常、低レベルの細胞表面CD14発現を有し、場合により細胞表面CD16受容体の追加の同時発現を伴う単球（CD14+CD16+単球）を意味する。

用語「患者」および「被験者」は、本明細書において互換的に使用され、そして広義には任意の脊椎動物を指す。適切な脊椎動物は当業者によく知られており、その代表的例としては、霊長類（例えばヒト、サルおよび類人猿）を含む、脊索動物亜門のメンバーが挙げられる。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。幾つかの実施形態では、被験者は、急速進行性ALSまたは緩徐進行性ALSのようなALSを有する。

用語「ポリヌクレオチド」、「遺伝物質」、「遺伝形態」、「核酸」および「ヌクレオチド配列」という用語には、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む、RNA 、cDNA、ゲノムDNA、合成形態および混合ポリマーが含まれ、それらは、当業者により容易に理解されるように、化学的にもしくは生化学的に修飾されていてよく、または非天然型のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでよい。

用語「予後」およびその文法的変形は、一般に、個体におけるALSのような疾病または状態の起こり得る進行または重症度に関する情報を提供する、参照バイオマーカー（１または複数）、バイオマーカープロファイルまたは方法を指す。いくつかの実施形態において、予後は被験者の疾患または状態について、治療または他の治療レジメンに対して陽性または陰性の応答を示す能力を指す。いくつかの実施形態において、予後は、疾患／状態に関連する症状の存在または減退を予測する能力を指す。予後因子または予後方法は、被験者または被験者から得られたサンプルを複数カテゴリーの１つに分類することを含み、ここで、カテゴリーは、被験者が特定のアウトカムを経験するであろう様々な尤度と相関する。例えば、カテゴリーは低リスクと高リスクであることができ、低リスクのカテゴリーに入る被験者は、高リスクカテゴリーに入る被験者よりも、良くないアウトカムを経験する尤度が低い（例えば５年または10年のような一定期間の中で）。良くないアウトカムは、例えば、病気の進行、病気の再発、または病気が原因である死亡でありうる。「尤度」とは、特定のバイオマーカーレベルを有する被験者が実際に、特定の数学モデルに基づいて急速または緩徐進行性ALSを有するかどうかの尺度を意味する。例えば、増加した尤度は、相対または絶対であることができ、定量的にまたは定性的に表すことができる。例えば、増加した尤度は、先行する母集団調査に基づいて、バイオマーカーのレベルを測定しそして被験者を「増加した尤度」のカテゴリーに入れることにより、簡単に決定することができる。「尤度」という用語は、本明細書中では「確率」という用語と互換的にも用いられる。

本明細書で使用される場合、ALSの進行速度は、疾病の重症度が増加するのにかかる時間の評価である。疾病の重症度は、患者が呈する病状の数および／または任意の１つ以上の症状の重症度を測定することによって評価することができる。検査をベースにしたAppel ALS（AALS）スコアおよび質問票をベースにしたALS機能評価尺度（ALSFRS）スコア（上述）をはじめとする、さまざまなスコア付け法を使用して、病気の重症度を評価することができる。このような状況での進行速度は、時間経過に伴うスコアの変化、例えば１箇月あたりのAALSスコアの変化を計算することによって決定することができる。本明細書に記載されるように、sCD14および／またはLBPなどのバイオマーカーは、病気の進行速度と強力な相関関係があり、従ってそのようなバイオマーカーのレベルを使用してALSの進行速度を評価することもできる。

用語「サンプル（検体）」は、本明細書で使用される場合、被験者から抽出し、処置せず、または処置し、希釈し、または濃縮することができる、本明細書に記載の生物学的マーカーを含む任意の生物学的標本を包含する。サンプルは、１つの生物学的マーカー（例えばsCD14）または生物学的マーカーの集団を含み得る。本開示に従った使用が期待される生物学的サンプルの例示的な例としては、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（CSF）および唾液が挙げられる。

本明細書に開示の方法は、サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを「参照レベル」（この用語は、「参照」、「適当な対照（コントロール）」、「対照（コントロール）」等と互換的に呼称される）と比較することを含むステップを含んでよい。「参照レベル」は、健常状態、急速進行性ALSまたは緩徐進行性ALSといった、表現型または状態を表す値、レベル、または値もしくはレベルの範囲である。幾つかの実施形態では、参照値は、急速進行性ALSを有する１以上の被験者、緩徐進行性ALSを有する１以上の被験者、ALSを持たない１以上の被験者、例えば１以上の健常個体から採取した１以上の生物学的サンプルから決定される。別の実施形態では、「参照値」は、例えば健常被験者、急速進行性ALSを有する被験者または緩徐進行性ALSを有する被験者を反映するものとして確立されている、予め決められたもしくは予め定義された値もしくはレベル（例えば、特定のバイオマーカープロファイルに相関するバイオマーカーレベル）である。よって、幾つかの実施形態では、参照レベルは、本明細書中に開示される方法を実行する前に決定されている。参照レベルまたは値は、生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定するために用いられる特定の技術（例えばELISA、LC-MS、GC-MS、PCR等）に合うように調整することも可能である。ここでバイオマーカーのレベルは使用される特定の技術によって異なり得る。特定の実施形態では、参照レベルは、閾値レベルまたは閾値であり、それより上または下の値が急速進行性ALSか緩徐進行性ALSであることを示す。

本明細書で使用する用語「固体支持体」は、核酸および／またはポリペプチドのような分子種を固定化することができる固体の不活性表面または本体を指す。固体支持体の非限定例には、ガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、およびシリコンウエハーが含まれる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、膜、スライド、チップ、粒子（ビーズを含む）、およびマルチウェルプレートの形態である。支持体は、それぞれが異なる付着分子種を有する複数の粒子またはビーズを含むことができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、分子への共有結合を可能にする反応性基を含む中間材料の層またはコーティングを適用すること等によって「機能化」されている、不活性支持体またはマトリックスを含み得る。分子は中間材料に直接共有結合により付着できるが、中間材料それ自体は支持体またはマトリックスに非共有結合で付着することができる。

本明細書で用いる場合、ALS疾患の「症状」への言及は、ALS疾患を示すと見なされる身体的または精神的特徴である。非限定的なALS媒介疾患の症状としては、進行性の筋委縮、麻痺、痙縮、反射亢進、並びに他の症状、例えば嚥下障害、脚弱、不明瞭な発語、歩行障害、顔面麻痺、呼吸変化、筋肉のけいれんなどが挙げられる。典型的には、被験者は、疾病の重症度、疾病の臨床病期、および個々の被験者に依存して、１または複数の症状を呈示するだろう。どの症状がALS疾患だと見なされるかの決定は、当業者の技術の十分範囲内であろう。

本明細書中で用いる場合、「治療（処置）」、「治療（処置）する」等は、治療の必要な被験者、すなわち、ALSを持つかまたはALSを持っていると診断される被験者、またはALSを発症するリスクのある被験者において、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。「治療」とは、次のことを意味する：
（a）ALSの発症および／または進行を遅らせること；
（b）ALSの症状を軽減すること；
（c）ALSまたはその症状を抑制すること；および／または
（d）生活の質（QOL）を改善または延長すること。

「治療」、「治療する」または「治療すること」への言及は、必ずしも被験者を治癒させること、または病気の進行を永久に防止することを意味するわけではない。被験者は、最終的に神経変性疾患により死亡するかもしれないが、しかし、疾患または病態の進展が遅くなるため、治療しない場合よりも生活の質がより長期間延長される。

好結果の「治療」の指標には、患者により忍容性の記憶もしくは状態の減衰；緩解；病気の変性速度または疾患の減退もしくは悪化速度の減速；悪化の最終点の衰弱を小さくすること；または被験者の身体的もしくは精神的な健全性の改善といった、任意の客観的または主観的パラメータを包含する。症状の治療または軽減は、客観的または主観的パラメータに基づくことができ；身体検査、神経学的検査、および／または精神医学的評価の結果を含む。

本明細書に記載の各実施形態は、特に断らない限り、変更すべきところは変更して、それぞれの実施形態に適用すべきである。

２. ALSの進行速度を評価するための方法
本開示は、ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカー（例えばALS進行バイオマーカー）のレベルが該被験者のALS進行速度と相関することの決定に少なくとも部分的に基づいている。例えば、本明細書中に実証される通り、急速進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、緩徐進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、および健常被験者に比較して、典型的に増加（または上昇）する。反対に、緩徐進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、急速進行性ALSを有する被験者の生物学的サンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して典型的には減少（または低下）する。評価すべき生物学的サンプルに応じて、そして本明細書に教示されるように、緩徐進行性ALSを有する被験者の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、健常被験者の生物学的サンプル中の同バイオマーカーのレベルに比較して、同一または類似であるか、減少しうる。従って、本開示の方法は、被験者のALSの進行速度を評価するための方法であって、生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルを測定し、そして該生物学的サンプル中の１つ以上のALSバイオマーカーのレベル、例えば参照レベル（ここで参照レベルは特定の進行速度の指標であるかまたは表す）に基づいて進行速度を決定することを含む。本開示の方法はまた、急速または緩徐進行性ALSを有する被験者の尤度を決定する方法であって、生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルを測定し、そして参照レベルに比較した生物学的サンプル中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルに基づいて、被験者が急速または緩徐進行性ALSを有するかどうかを決定することによる方法も包含する。典型的には、被験者はALSを有すると既に診断されているかまたは同時にALSと診断され、例えば、本明細書に記載のALS診断バイオマーカーの評価を、ALSの診断を確かめるための別の評価と同時に行うことができる。更なる実施形態では、被験者はALSの治療を受けており、そしてALSの進行速度の評価を用いて治療の効果が評価される。

本明細書に記載の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、増加または上昇したレベルは、参照レベルに比較した時に、本明細書に記載のものなどの標準的な当業界で既知の方法により検出されるバイオマーカーのレベルに関して、少なくともまたは約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全増分を指す。幾つかの実施形態では、増加または上昇したレベルとは、サンプル中のバイオマーカーのレベル／量の増加を指し、ここでその増加は、参照レベルの少なくともまたは約1.5×（倍）、1.75×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、25×、50×、75×、または100×のいずれかである。

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、減少または低下したレベルは、参照レベルに比較した時、標準技術で既知の方法により検出される、バイオマーカーのレベルの少なくともまたは約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上のいずれかの全体的減少を指す。幾つかの実施形態では、減少または低下したレベルは、サンプル中のバイオマーカーのレベル／量の減少を指し、ここでその減少は参照レベルの少なくともまたは約0.9×、0.8×、0.7×、0.6×、0.5×、0.4×、0.3×、0.2×、0.1×、0.05×、または0.01×のいずれかである。

バイオマーカー
ALSの進行速度の予測因子であるALS進行バイオマーカーの例は、可溶性CD14（sCD14）である。グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）に固定された膜糖タンパク質であるCD14は、主に単球／マクロファージによって優先的に発現される骨髄分化マーカーであるが、好中球においても低レベルの発現が見られる。Toll様受容体4とMD-2と協働して、CD14はLPSの共受容体（コレセプター）として機能する。単球が活性化すると、膜CD14（mCD14）が細胞表面から切断され、sCD14が放出される。mCD14の単球活性化依存性脱落が、sCD14の大部分を産生する。

本明細書に示されるように、ALSを有する被験者からの生物学的サンプル中のsCD14のレベルは、ALSの進行速度を評価するために使用でき、その被験者が急速進行性または緩徐進行性ALSを有する尤度を決定するために使用できる。sCD14のレベルは病気の進行と強い相関関係があり、sCD14のレベルが低いほど進行が緩徐であり、sCD14のレベルが高いほど進行が急速である。従って、急速進行性ALSを有する被験者は、緩徐進行性ALSを有する被験者や健常被験者に比較して、典型的には増加した（または上昇した）sCD14レベルを有する。緩徐進行性ALSを有する被験者は、典型的には急速進行性ALSを有する被験者に比較して減少した（または低下した）sCD14レベルを有する。生物学的サンプルは、例えば、血液、血清、血漿、尿またはCSFでありうる。

生物学的サンプルが血液、血清、血漿またはCSFである場合、緩徐進行性ALSを有する被験者は、健常被験者に比較して同じまたは類似したsCD14レベルを有し、あるいは健常被験者に比較して増加したsCD14レベルを有する。生物学的サンプルが尿である場合、緩徐進行性ALSを有する被験者は、典型的には、急速進行性ALSを有する被験者において観察されたレベルほど多くは増加しないが、健常被験者に比較して増加した（または上昇した）sCD14レベルを有する（すなわち、緩徐進行性ALSを有する被験者の尿中のsCD14レベルは、典型的には健常個体に比較して増加するが、急速進行性ALSを有する被験者に比較すると減少する）。

よって、ALSを有する被験者からの生物学的サンプル中のsCD14レベルの測定は、被験者においてALSの進行速度を評価するためおよび／または該被験者が急速進行性ALSもしくは緩徐進行性ALSを有する尤度を決定するために使用することができる。

リポ多糖結合タンパク質（LBP、sLBPとも称される）は、ALSの進行速度に関する予後予測値を有する別のALS進行バイオマーカーである。リポ多糖結合タンパク質は、LPSに結合する可溶性急性期タンパク質である。CD14はLPSのコレセプターであるが、LBPの存在下でのみLPSに結合できる。LBPは肝細胞と腸上皮細胞により合成され、シグナル伝達にはLPSとLBPの複合体をCD14に結合させる必要がある。

LBPのレベルはまた、病気進行と強力な相関関係があり、低いLBPレベルは緩やかな進行と関連があり、高いLBPレベルは急速な進行と関連がある。通常、LBPレベルは、緩徐進行性ALSを有する被験者または健常被験者のいずれかに比較した時、急速進行性ALSを有する被験者では典型的には増加（または上昇）する。緩徐進行性ALSを有する被験者は、急速進行性ALSを有する被験者に比較して減少した（または低下した）LBPレベルを有し、そして健常被験者と同じもしくは類似したLBPレベルを有し、または健常被験者に比較して増加したLBPレベルを有する。よって、ALSを有する被験者からの生物学的サンプル中のLBPレベルの測定は、被験者のALSの進行速度を評価するためおよび／または急速進行性ALSもしくは緩徐進行性ALSを有する被験者の尤度を決定するために用いることができる。

ALS進行についての予後予測値を有する更なる例示的なバイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（CRP）である。CRPは肝臓により生産され、炎症の存在下で増加する。急速進行性ALSを有する被験者は、典型的には、緩徐進行性ALSを有する被験者および健常被験者に比較して増加した（または上昇した）CRPレベルを有する。緩徐進行性ALSを有する被験者は、典型的には、急速進行性ALSを有する被験者に比較して、生物学的サンプル中のCRPレベルが減少（または低下）し、そして健常被験者と同じまたは類似のCRPレベルを有する。よって、ALS被験者からの生物学的サンプル中のCRPレベルの測定を用いて、その被験者が急速進行性ALSまたは緩徐進行性ALSを有する尤度を求めることができる。

可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ（sTNFR1）および可溶性腫瘍壊死因子受容体II（sTNFRII）も、ALS進行の予後予測バイオマーカーとして本開示に従って使用することができる。TNFRIとTNFRIIはTNFに結合する細胞表面受容体である。両受容体は遍在的に発現し、構造的に類似した細胞外ドメインを提示するが、異なる細胞内領域を通してシグナル伝達を行い、TNFRIはTNFRIIには存在しない死ドメインを含む。この２つのTNFRは、それらの細胞外ドメインのタンパク質開裂により、エキソソーム中で、または膜貫通ドメインと細胞質ドメインの欠失をもたらすmRNA転写物の選択的スプライシングを通して、可溶性タンパク質として放出される。

本明細書中で証明される通り、sTNFRIとsTNFRIIのレベルは、緩徐進行性ALSを有する被験者または健常被験者のいずれかと比較した場合、急速進行性ALSを有する被験者において典型的には増加（または上昇）する。緩徐進行性ALSを有する被験者は、急速進行性ALSを有する被験者に比較して減少（または縮小）したsTNFRIとsTNFRIIレベルを有し、健常被験者と同じまたは類似したレベルを有する。よって、ALSを有する被験者からの生物学的サンプル中のTNFRIおよび／またはTNFRIIレベルの測定を用いて、その被験者が急速進行性ALSまたは緩徐進行性ALSを有する尤度を求めることができる。

特定の実施形態では、本開示の方法は、生物学的サンプル中の少なくともsCD14のレベルを決定することを含む。別の実施形態では、本開示の方法は、生物学的サンプル中の少なくともLBPのレベルを決定することを含む。特定の実施形態では、sCD14とLBPの両方のレベルが測定される。場合により、そのような方法は、少なくとも１つの別のバイオマーカー、例えばCRP、TNFRI、TNFRIIのうちの１つまたは複数のレベルを決定することを更に含み得る。別の実施形態では、本開示の方法は、場合によりsCD14、LBPおよびCRPの１つまたは複数と一緒に、少なくともTNFRIまたはTNFRIIのレベルを測定することを含む。

本開示の方法で評価することができる他のバイオマーカーとしては、例えば、炎症誘発性サイトカインMIF（本明細書中で証明される通り、これは健常被験者に比較した場合、急速進行性ALSを有する被験者と緩徐進行性ALSを有する被験者の両方において典型的に上昇する）、ニューロフィラメント軽鎖（NFL; Tortelli他、Eur J Neurol 2012; 19(12)：1561-7; Gaiani他、JAMA Neurol 2017、74(5)：525 -532）、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5p（Waller他、Neurobiol Aging 2017、55：123-131）、リン酸化ニューロフィラメント重鎖（pNfH）（Boylan他、J Neurochem 2009; 111(5)：1182-91; Steinacker他、J Neurolsurg Psychiatry. 2016、87(1)：12-20）、および／またはP75ニューロトロフィン受容体の細胞外ドメイン（p75NTR^ECD ;Shepheard他、Neurology 2017、88(12)：1137-1143）が挙げられる。これらの追加のバイオマーカーは、本明細書および以前に記載されているように、病気の負担および／または進行速度に関してさらに明らかにすることができる。

生物学的サンプル
生物学的サンプルには、被験者から抽出され、未処理の、処理された、希釈された、または濃縮されたサンプルが含まれる。本開示の１つ以上のバイオマーカーの評価に適した生物学的サンプルとしては、血液、血清、血漿、尿およびCSFが挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態では、血清中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルが評価される。他の例示的な実施形態では、尿中の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルが評価される。生物学的サンプルを取得するための方法は、当技術分野で周知である。

２つ以上のバイオマーカーが評価される場合、その２つ以上のバイオマーカーが同じ生物学的サンプルまたは同じ被験者からの異なる生物学的サンプルにおいて評価できることは理解される。これには、異なる時間に採取された同じタイプの生物学的サンプル（例えば異なる時間に採取された２つの血清サンプルであるが、典型的には互いに数分以内または数時間以内に採取したサンプル）、および異なるタイプの生物学的サンプル（例えば血清サンプルと尿サンプル）が含まれる。

バイオマーカーレベルの評価
本開示に従って１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することは、例えば、データベースから、コンピューターから、または技術者もしくは研究室からの伝達もしくは報告から、予め測定されたレベルの１つ以上のバイオマーカーを取得することを含む。本開示に従って１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することは、１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することも含む。よって、本開示の特定の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するために生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーのレベルが測定される。

１つ以上のバイオマーカーのレベルは、当業者に既知の任意の適切な技術または手段を利用して測定または評価することができる。特定の実施形態では、sCD14、LBP、CRP、MIF、sTNFRIおよび／またはsTNFRIIのようなバイオマーカーのレベルは、抗体ベースの技術を用いて評価される。そのような技術の非限定的例としては、例えば、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（酵素免疫吸着測定法；ELISA）およびラジオイムノアッセイ（放射標識免疫測定法；RIA）が挙げられる。そのようなアッセイ形式を使用する広範囲のイムノアッセイ技術が利用可能であり、例えば米国特許第4,016,043号、同第4,424,279号および同第4,018,653号明細書を参照されたい。それらは、非競合型の単一部位および２部位、いわゆる「サンドイッチ」アッセイ、の両方に加えて、従来の競合型結合アッセイを包含する。これらのアッセイには、標識抗体の標的バイオマーカーへの直接結合も含まれる。sCD14、LBP、CRP、MIF、sTNFRIおよび／またはsTNFRIIのレベルを測定するためのELISAは市販されており、そして／またはsCD14、LBP、CRP、MIF、sTNFRIおよび／またはsTNFRIIに特異的な既知抗体を使用して当業者により容易に開発することができる。

特定の実施形態において、２つ以上のバイオマーカーのレベルが評価される場合、マルチプレックス（多重）イムノアッセイ（例えば、マルチプレックスELISA）などのマルチプレックスアッセイを使用することができる。マルチプレックスアッセイには、空間的にアドレス指定された抗原結合分子（通常、抗体アレイと呼ばれる）を含むアレイが含まれる。このアレイは、多数のタンパク質の広範な平行分析を容易にする。抗体アレイは、特異性と許容可能なバックグラウンドの必要な特性を有することが示されている。抗体アレイの調製のための様々な方法は報告されている（例えばLopez他、2003 J. Chromatogr B 787：19-27；Cahill, 2000 Trends in Biotechnology 7:47-51; 米国特許出願公開第2002/0055186号公報；米国特許出願第2003/0003599号公報；国際公開WO 03/062444号パンフレット；PCT公開WO 03/077851号パンフレット；PCT公開WO 02/59601号パンフレット；PCT公開WO 02/39120号パンフレット；PCT公開WO 01/79849号パンフレット；PCT公開WO99/39210号パンフレットを参照のこと）。

個々の空間個別的なタンパク質捕捉剤は、典型的には、一般に平面状のまたは輪郭のある支持体表面に付着している。一般的な物理的支持体には、スライドガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロースまたはPVDF膜、並びに磁気ビーズおよびその他のマイクロビーズが含まれる。

懸濁液中の粒子は、それらが識別用にコード化されていれば、マルチプレックスアッセイやアレイの基盤（basis）として使用することもできる。システムは、マイクロビーズ用のカラーコーディング（例えばLuminex社、Bio-Rad社およびNanomics Biosystems社より入手可能）、および半導体ナノ結晶（例えばQuantum Dots社より入手可能なQDots^TM（商標））、ビーズ用バーコード（Smartbeads社より入手可能なUltraPlex^TM（商標））および多金属マイクロロッド（Surromed社より入手可能なNanobarcodes^TM（商標）粒子）を含む。ビーズは、半導体チップ上で平面アレイに修正することもできる（例えばLEAPS TechnologyおよびBioArray Solutions社から入手可能）。粒子を使用する場合、個々のタンパク質捕捉剤は、アレイの空間的定義または空間的隔離を提供するように個々の粒子に付着される。次に、その粒子を、別々にしかし並行して、区分化された方法で、例えばマイクロタイタープレートのウェル中でまたは別々の試験管中でアッセイすることができる。

タンパク質捕捉アレイの１つの代表的な例は、ビーズをベースにしたマルチプレックスアッセイ（多重検定）であるLuminex（登録商標）ベースのマルチプレックスアッセイであり、この場合、ビーズは特定のスペクトルアドレスを生成するように蛍光色素で分子内的に染色されている。バイオ分子（例えば抗体）は、目的のバイオマーカーを捕捉するためにビーズの表面に接合することができる。次いで、当業者に既知のフローサイトメトリーまたは他の適当なイメージング技術を利用して、ビーズの特徴付けとバイオマーカーの検出および定量を行うことができる。

タンパク質バイオマーカーを検出し定量するための別法には、限定されないが、質量分析（MS）法、例えば液体クロマトグラフィー－質量分析（LC-MS）、リアルタイム質量分析での直接分析（DART MS）、SELDI-TOFおよびMALDI-TOFが含まれる。

ALSの進行の評価
本開示の方法は、被験者におけるALSの進行の推測速度を評価するために用いることができ、ALSをもつ被験者が緩徐または急速進行性ALSを有する可能性があるかどうかを判定するために用いることができる。これは、上述のおよび本項目に記載の１つ以上のALS進行バイオマーカーのレベルを決定し、所望によりそのレベルを適当な参照レベルに比較することにより実行される。適当であるならば、参照レベルに比較してバイオマーカーの増加（または上昇）、減少（または低下）、または同じもしくは類似したレベルが、該被験者が緩徐進行性ALSまたは急速進行性ALSを有する可能性があるかどうかを示し、あるいは被験者が呈するどれ程の進行速度が、この評価に用いられる参照レベルに依存するのかを示す。

参照レベルは健常対照、緩徐進行性ALSを有する被験者、急速進行性ALSを有する被験者、または特定の進行速度を有する被験者を表すことができる（例えばAALS点数／月により測定した時）。よって、参照レベルに比較したバイオマーカーレベルの増加、減少または無変化が、該被験者が緩徐進行性ALSまたは急速進行性ALSまたは特定の進行速度を有する傾向があることを示すかどうかは、その参照レベルが健常被験者、緩徐進行性ALSを有する被験者、急速進行性ALSを有する被験者または特定の進行速度を表すかどうかに依存するだろう。例えば、上記およびここに記載される通り、急速進行性ALSを有する被験者は、典型的には、緩徐進行性ALSを有する被験者に比較してそして健常被験者に比較して、生物学的サンプル（例えば血液、血清、血漿、CSFまたは尿）中で、sCD14および／またはLBPの増加した（または上昇した）レベルを有する。本明細書で証明される通り、sCD14とLBPのレベルは、ALSの進行速度と強力な相関関係があり、ここで低レベルのsCD14および／またはLBPは、高レベルのsCD14および／またはLBPが示すよりも、低い進行速度と相関関係がある（例えば１か月あたりのAALS点数で測定した場合）。

進行速度の評価が１つ以上のALSバイオマーカーのレベルを測定することによって行われる場合、バイオマーカーのレベルと特定の進行速度を表す参照レベルとの直接比較（例えば既知の進行速度を有するALS患者のコホートからの検量線により作出される）を行うことができ、それにより該バイオマーカーのレベルが参照レベルと同じまたは類似であるならば、その被験者のALSの進行速度はその参照レベルにより表される進行速度と同じまたは類似であると評価される。

別の例では、健常被験者を表す参照レベルに比較して、ALSを有する被験者からの生物学的サンプル中のsCD14レベルの増加は、そのALS患者が急速進行性ALSを有する可能性があることを示しうる。参照レベルが急速進行性ALSを有する被験者を表すならば、参照レベルと同じまたは類似であるsCD14のレベルは、被験者が急速進行性ALSを有することを示すだろう。逆に、本明細書に記載の通り、緩徐進行性ALSを有する被験者は、典型的には、急速進行性ALSを有する被験者に比較して、減少（または低下）したsCD14レベルを有する。よって、急速進行性ALSを有する被験者を表す参照レベルと比較した場合、ALS患者からの生物学的試料中のsCD14レベルの減少は、該被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があることを示す。参照レベルが健常被験者または緩徐進行性ALSを有する被験者を表す場合、その参照レベルと同じまたは類似である生物学的サンプル中のsCD14レベルは、該被験者が緩徐進行性ALSを有することを示しうる。

同様に、健常被験者または緩徐進行性ALSを有する被験者を表す参照レベルに比較した時、ALS被験者からの生物学的サンプル中のLBPのレベルの増加は、その被験者が急速進行性ALSを有すると見られることを示す。参照レベルが急速進行性ALSを有する被験者を表す場合、その参照レベルと同じまたは類似であるLBPレベルは、その被験者が急速進行性ALSを有することを示す。逆に、本明細書に記載の通り、緩徐進行性ALSを有する被験者は、典型的には、急速進行性ALSを有する被験者に比較して、減少した（または低下した）LBPレベルを有する。参照レベルが健常被験者または緩徐進行性ALSを有する被験者を表す場合、その参照レベルと同じまたは類似である生物学的サンプル中のLBPレベルは、該被験者が緩徐進行性ALSを有することを示しうる。

特定の実施形態では、参照レベルは、それより上または下のレベルが急速進行性ALSまたは緩徐進行性ALSを有する被験者を示すという閾値である。例えば、参照レベルは、その参照レベルに等しいまたは上回るサンプル中のバイオマーカーのレベルが、該被験者が急速進行性ALSを有する可能性があることを示し、そしてその参照レベルを下回るサンプル中のバイオマーカーのレベルが、該被験者が緩徐進行性ALSを有すると見られることを示すという閾値であってよい。別の例では、参照レベルは、その参照レベルを上回るサンプル中のバイオマーカーのレベルが、該被験者が急速進行性ALSを有する可能性があることを示し、そしてその参照レベルに等しいまたは下回るサンプル中のバイオマーカーのレベルが、該被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があることを示す。

閾値に関しては、緩徐または急速進行性ALSを有する被験者の尤度を予測する許容可能な能力を提供するものが選択される。例示的な例には、２つの母集団において変数（例えばバイオマーカーレベル）対その相対頻度をプロットすることにより、受信者動作特性（ROC）曲線が計算され、ここで第一の母集団は急速進行性ALSを有するらしいと見なされ、そして第二の母集団は緩徐進行性ALSを有するらしいと見なされる。

任意の特定のバイオマーカーについて、特定のALS進行速度を有する被験者、急速進行性を有するまたは有する可能性がある被験者、および緩徐進行性ALSを有するまたは有する可能性がある被験者についてのバイオマーカーレベルの分布は、重複する場合がある。そのような条件下では、試験は、絶対的（すなわち100％）精度で、特定の進行速度を有する被験者を、別の進行速度を有する被験者から、また、急速進行性ALSを有する被験者を、緩徐進行性ALSを有する可能性がある被験者から、絶対的に区別しないかもしれないが、その重複領域は、その試験が２名の被験者を区別することができない場所を示す。閾値は、それより上では（またはバイオマーカーがリスクと共にどのように変化するかに依存して、それより下では）その試験が「陽性」であると見なされ、それより下ではその試験が「陰性」であると見なされるものを選択することができる。PCR曲線下の面積（AUC）は、判断される測定値が、ある状態の正確な同定を可能にするであろう確率の尺度である、Ｃ統計量を提供する（例えば、Hanley他、Radiology 143: 29-36 (1982)）。当業者は、本開示の方法に従って使用される閾値を含む適当な参照レベルを、容易に決定することができる。

３．キット、固体支持体および組成物
本発明は、１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するためのキットにも拡張する。従って、それらのキットは、被験者においてALSの進行速度を評価するため、またはALSを有する被験者が緩徐進行性または急速進行性ALSを有する尤度を決定するために用いることができる。そのようなタンパク質ベースの検出キットは、上記および本項目に記載の１つ以上のバイオマーカー、および場合により陽性対照（ポジティブコントロール）として使用することができる少なくとも１つのバイオマーカー、に特異的に結合する１つ以上の抗原結合分子（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）を含み得る。従って、幾つかの実施形態では、キットは、sCD14に特異的な抗原結合分子および／またはLBPに特異的な抗原結合分子を含む。更なる実施形態では、キットは、少なくとも１つのバイオマーカー、例えばCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5pに特異的な抗原結合分子を含む。よって、被験者におけるALSの進行速度を評価するためのキットの調製のための、または緩徐もしくは急速進行性ALSを有する被験者の尤度を決定するための、sCD14に特異的な抗原結合分子の使用および／またはLBPに特異的な抗原結合分子の使用も考慮される。幾つかの例では、その使用は、別のバイオマーカー、例えばCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5pに特異的な少なくとも１つの別の抗原結合分子の使用も包含する。sCD14または別のバイオマーカーに特異的である抗原結合分子、例えば抗体およびその抗原結合フラグメントは、当業界で周知であり、そして本明細書に記載のキットおよび使用（用途）において用いることができる。

キットは、適当な検出試薬、例えば検出を促進するコンジュゲートおよび基質（例えばストレプトアビジン、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ等で標識された抗体）を含んでもよい。キットは、様々な装置および追加の試薬および／または緩衝液、並びに／またはキットを使って１つ以上のバイオマーカーのレベルを定量するための印刷された教材も特色とすることができる。本明細書に記載のキット試薬は、任意に検出可能な標識と結合していてもよく、それはサンプル中のバイオマーカーレベルの測定のための本明細書に記載の技術での使用に適合した、複数のビーズ、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、スライド、マイクロ流体光学カード、またはチップの形式で提供することができる。

キットの成分を充填するのに適当な材料は、結晶、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等）、ボトル、バイアル、紙、エンベロープ等を含み得る。更に、本開示のキットは、キット中に含まれる種々の成分の同時使用、連続使用または個別使用のための教材を含むことができる。教材は、それらが被験者により解読できるような印刷された教材の形または教示を保存することができる電子基板の形、例えば電子記憶媒体（磁気ディスク、テープ等）、光学媒体（CD-ROM、DVD）であることができる。あるいはまたはそれに加えて、媒体は教材を提供するインターネットアドレスを含むことができる。

被験者のALSの進行速度を評価するためまたは１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するための方法において用いられる、固体支持体および組成物も提供され、それらは上記および本段落に記載の１つ以上のバイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の抗原結合分子（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。特定の実施形態では、固体支持体および／または組成物は、sCD14に特異的な抗原結合分子および／またはLBPに特異的な抗原結合分子を含む。固体支持体と組成物は、場合により少なくとも１つのバイオマーカー、例えばCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5pに特異的な抗原結合分子を含むこともできる。固体支持体の例としては、限定されないが、マルチウェルプレート、スライドおよびチップが挙げられる。別の実施形態では、固体支持体は、複数のビーズである。上述したように、それらの固体支持体は、生物学的サンプル中の２以上のバイオマーカーのレベル、例えばsCD14 および／またはLBPのレベル、並びに場合によりCRP、MIF、sTNFRI、sTNFRII、NFL、pNfH、p75NTR^ECD、miR-206、miR-143-3p、および／またはmiR-374b-5pのうちの１つ以上のレベルを決定するためのマルチプレックス（多重化）イムノアッセイにおいて使用することができる。

４．被験者の層別化および治療薬の投与
本開示は、例えば臨床試験のためまたは疾患のマネージメントもしくは疾患の治療のための、被験者の層別化に拡張する。例えば、急速進行性ALSを有する被験者は、新規治療法の効果を評価するための臨床試験に包含するために同定され選択され得る。臨床試験へのそのような被験者の包含は、病気進行の期間が短いほど治療法の効果のエビデンスをより迅速に得ることが可能なため、望ましい。別の実施形態では、適当なまたは最適化された治療レジメンは、被験者が緩徐進行性または急速進行性ALSを有する可能性があると同定されるかどうかに基づいて導き出すことができる。

ALSの治療に有用であると記載された治療レジメンは、１つ以上の抗神経変性剤の投与を含むものが挙げられる。それらの剤としては、限定されないが、リルゾール（Rilutek（登録商標）／Teglutik（登録商標）、エダラボン（Radicava（登録商標）／Radicut（登録商標））、CD14アンタゴニスト（例えばCD14アンタゴニスト抗体）、抗炎症薬、例えば補体経路の遮断薬、例えばC5a受容体アゴニスト（例えばPMX205またはエクリズマブ (Lee J.D.他 (2017) British Journal of Pharmacology, 174(8))、CD40とCD40リガンドとの相互作用を阻止する剤（CD40および／またはCD40リガンドに特異的に結合する抗体（例えばAT-1502）を含む）、GM604およびマシチニブが挙げられる。

一実施形態では、治療レジメンとしては、CD14アンタゴニスト抗体の全身（例えば静脈内）投与などの投与を含む。CD14アンタゴニスト抗体はCD14（例えばmCD14またはsCD14）に結合してCD14へのDAMPまたはPAMPの結合を遮断し、そして／またはCD14に結合してCD14アゴニスト媒介応答を阻害または減少させ、炎症誘発性メディエーターの産生、例えば炎症誘発性サイトカインの産生をもたらすことができる。幾つかの実施形態では、CD14アンタゴニスト抗体は、CD14へのCD14アゴニストの結合、適切にはDMAPまたはPAMPの結合を阻害し、それによって炎症誘発性サイトカインの産生を阻害または減少させる。このタイプの例示的例では、CD14アンタゴニスト抗体は、ヒトCD14の７番目のアミノ酸から14番目のアミノ酸までの領域の少なくとも一部分中に含まれるエピトープに結合する、3C10抗体 (van Voohris他、1983. J. Exp. Med. 158: 126-145; Juan他、1995. J. Biol. Chem. 270(29): 17237-17242）、CD14の57番目のアミノ酸から64番目のアミノ酸までの領域の少なくとも１部分に含まれるエピトープに結合する、MEM-18抗体（Bazil他、1986. Eur. J. Immunol. 16(12):1583-1589; Juan他、1995. J. Biol. Chem. 270(10): 5219-5224）、4C1抗体（Adachi他、1999. J. Endotoxin Res. 5: 139-146; Tasaka他、2003. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.; 2003. 29(2):252-258）、並びに、LPSの結合を部分的に阻害しかつ炎症誘発性サイトカインの生産を抑制する28C5および23G4抗体、およびLPSの結合を部分的に阻害しかつ炎症誘発性サイトカインの生産を抑制する18E12抗体（米国特許第5,820,858号、同第6,444,206号および同第7,326,569号）である。幾つかの実施形態では、本開示のCD14アンタゴニスト抗体は、TLR4のようなTLRへのCD14の結合を阻害し、それによってCD14アゴニスト媒介性応答を阻止する。その例示的な例としては、国際公開WO 2002/42333号パンフレット中に開示されているF1024抗体が挙げられる。CD14アンタゴニスト抗体は、全長免疫グロブリン抗体または完全抗体の抗原結合フラグメントであり、その典型的例としては、Fabフラグメント、F(ab’)2 フラグメント、VHドメインとCH1ドメインから成るFdフラグメント、抗体の単一アームのVLドメインとVHドメインから成るFvフラグメント、VHドメインから成る単一ドメイン抗体（dAb)フラグメント（Ward他、1989. Nature 341:544-546）；並びに単離されたCDRが挙げられる。適当には、CD14アンタゴニスト抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。

幾つかの実施形態では、CD14アンタゴニスト抗体は、米国特許第5,820,858号明細書に開示される抗体から選択される：
(1) VLドメインであって、配列
QSPASLAVSLGQRATISC RASESVDSFGNSFMH WYQQKAGQPPKSSIY RAANLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFC QQSYEDPWT FGGGTKLGNQ [配列番号１]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVLドメイン（3C10 VL）；および
VHドメインであって、配列
LVKPGGSLKLSCVASGFTFS SYAMS WVRQTPEKRLEWVA SISSGGTTYYPDNVKG RFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAR GYYDYHY WGQGTTLTVSS [配列番号２]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVHドメイン（3C10 VH）
を含む抗体；
(2) VLドメインであって、配列
QSPASLAVSLGQRATISC RASESVDSYVNSFLH WYQQKPGQPPKLLIY RASNLQS GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCC QQSNEDPTT FGGGTKLEIK [配列番号３]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVLドメイン（28C5 VL）；および
VHドメインであって、配列
LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDSAWN WIRQFPGNRLEWMG YISYSGSTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVR GLRFAY WGQGTLVTVSA [配列番号４]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVHドメイン（28C5 VH）
を含む抗体；および
(3) VLドメインであって、配列
QTPSSLSASLGDRVTISC RASQDIKNYLN WYQQPGGTVKVLIY YTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFC QRGDTLPWT FGGGTKLEIK [配列番号５]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVLドメイン（18E12 VL）；および
VHドメインであって、配列
LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT NYDIS WIRQPPGKGLEWLG VIWTSGGTNYNSAFMS RLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVR GDGNFYLYNFDY WGQGTTLTVSS [配列番号６]を含む、それから成るまたは本質的にそれから成るVHドメイン（18E12 VH）
を含む抗体。

上記抗体のVLおよびVH CDR配列を含む抗体も意図され、その代表的な実施形態としては以下のものが挙げられる：
(1) a) L-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含む抗体VLドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでL-CDR1は配列RASESVDSFGNSFMH [配列番号７] (3C10 L-CDR1)を含み; L-CDR2は配列RAANLES [配列番号８] (3C10 L-CDR2)を含み；そしてL-CDR3は配列QQSYEDPWT [配列番号９] (3C10 L-CDR3)を含む、抗体VLドメインまたはその抗原結合フラグメント；および
b) H-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含む抗体VHドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでH-CDR1は配列SYAMS [配列番号10] (3C10 H-CDR1)を含み；H-CDR2は配列SISSGGTTYYPDNVKG [配列番号11] (3C10 H-CDR2)を含み；そしてH-CDR3は配列GYYDYHY [配列番号12] (3C10 H-CDR3)を含む、抗体VHドメインまたはその抗原結合フラグメント
を含む抗体；
(2) a) L-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含む抗体VLドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでL-CDR1は配列RASESVDSYVNSFLH [配列番号13] (28C5 L-CDR1)を含み；L-CDR2は配列RASNLQS [配列番号14] (28C5 L-CDR2)を含み；そしてL-CDR3は配列QQSNEDPTT [配列番号15] (28C5 L-CDR3)を含むVLドメインまたはその抗原結合フラグメント；および
b) H-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含む抗体VHドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでH-CDR1は配列SDSAWN [配列番号16] (28C5 H-CDR1)を含み；H-CDR2は配列YISYSGSTSYNPSLKS [配列番号17] (28C5 H-CDR2)を含み；そしてH-CDR3は配列GLRFAY [配列番号18] (28C5 H-CDR3)を含む、抗体VHドメインまたはその抗原結合フラグメント
を含む抗体；および
(3) a) L-CDR1、L-CDR2 およびL-CDR3を含む抗体VLドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでL-CDR1は配列RASQDIKNYLN [配列番号19] (18E12 L-CDR1)を含み； L-CDR2は配列YTSRLHS [配列番号20] (18E12 L-CDR2)を含み；そしてL-CDR3 は配列QRGDTLPWT [配列番号21] (18E12 L-CDR3)を含む、抗体VLドメインまたはその抗原結合フラグメント；および
b) H-CDR1、H-CDR2 およびH-CDR3を含む抗体VHドメインまたはその抗原結合フラグメントであって、ここでH-CDR1は配列NYDIS [配列番号22] (18E12 H-CDR1)を含み； H-CDR2は配列VIWTSGGTNYNSAFMS [配列番号23] (18E12 H-CDR2)を含み；そしてH-CDR3 は配列GDGNFYLYNFDY [配列番号24] (18E12 H-CDR3)を含むVHドメインまたはその抗原結合フラグメント
を含む抗体。

幾つかの実施形態では、CD14アンタゴニスト抗体はヒト化される。このタイプの幾つかの例示的例では、ヒト化CD14アンタゴニスト抗体は、適切には、CD14アンタゴニスト抗体に相当するドナー（供与体）CDRセット（例えば、上述したCD14アンタゴニスト抗体の１つ）とヒト受容体フレームワークを含む。ヒト受容体フレームワークは、ヒト生殖細胞系列受容体フレームワークに比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことが可能であり、その置換は以下から成る群より選択された重要な残基の所に存在する：CDRに隣接した残基；グリコシル化部位の残基；稀な残基；標準残基；重鎖可変領域と軽鎖可変領域との接触点の残基；バーニア（Vernier）ゾーンの中の残基；およびChothiaにより定義されたVH CDR1とKabatにより定義された最初の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の中の残基。ヒト化mAbを作製する技術は当業界で周知である（例えば、Jones他、1986. Nature 321: 522-525; Riechmann他、1988. Nature 332:323-329; Verhoeyen他、1988. Science 239: 1534-1536; Carter他、1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289; Sandhu, JS., 1992. Crit. Rev. Biotech. 12: 437-462 およびSinger他、1993. J. Immunol. 150: 2844-2857を参照のこと）。キメラまたはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖と軽可変鎖からのマウスCDRを、ヒト抗体の対応する可変ドメイン中に移入することによりヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（FR）も同様にヒトFR配列で置き換えられる。マウスCDRをヒトFR中に単純に移入させた場合、しばしば抗体の親和力の減少または喪失さえも生じるので、マウス抗体の元の親和性を回復するために追加の改変が必要となる場合がある。これは、FR領域中の１つ以上のヒト残基を、それらのマウス相当物により置換し、そのエピトープに対して高い結合親和性を有する抗体を得ることにより達成することができる。例えば、Tempest他 (1991. Biotechnology 9:266-271) およびVerhoeyen他 (1988 前掲)を参照のこと。一般に、それらのマウス相当物とは異なっており、かつ１つ以上のCDRアミノ酸残基に近接したまたは隣接しているヒトFRアミノ酸残基は、置換の候補であろう。

一実施形態では、CD14アンタゴニスト抗体は、IC14抗体（Axtelle他、2001. J. Endotoxin Res. 7: 310-314; および米国特許出願第2006/0121574号、これらは全内容が参照により本明細書中に組み込まれる）またはその抗原結合フラグメントである。IC14抗体は、ヒトCD14に特異的に結合するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。この抗体のマウス親株は、上述した28C5（Leturcqへの米国特許第5,820,858号、同第6,444,206号および同第7,326,569号、並びにLeturcq他、1996. J. Clin. Invest. 98: 1533-1538参照）である。IC14抗体は、V_LドメインとV_Hドメインとを含み、ここで
V_Lドメインはアミノ酸配列：
METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ［配列番号25］を有し；そして
V_Hドメインはアミノ酸配列：
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ［配列番号26］を有する。

２以上の抗神経変性剤を、それらの相加作用のために、ある場合には、それらの相乗的効果のために、組み合わせて使用可能である。併用療法が所望される場合、それらの剤は別々に、同時に、または連続的に投与することができる。幾つかの実施形態では、これは、それらの剤の各々を含む単一組成物または薬理学的製剤を投与することにより、または２以上の別々の組成物もしくは製剤（各々が１以上の剤を含む）を同時に投与することにより達成することができる。別の実施形態では、１つの剤での処置が、数分から数日に及ぶ間隔だけ、別の剤での処置に先行してまたは後続して起こることができる。

２以上の剤が被験者に「併用して」または「同時に」投与される場合、それらは単一組成物中で同時に、または別々の組成物中で同時に、または別々の組成物中で時を隔てて投与することができる。

治療レジメンは更に、またはあるいは、別の介入を含むこともできる。それらには、医学的介入および／または栄養学的介入、例えば食品、錠剤、経口液、パッチ、または静注もしくは他の非経口投与形態が含まれる。別の例では、介入は機械的であり、例えば呼吸困難を容易にするために使用される非侵襲的な換気装置である。非侵襲的換気法には、例えば、陰圧換気法（Negative Pressure Ventilation (NPV)）および／または非侵襲性陽圧換気法（Noninvasive Positive Pressure Ventilation (NIPPV)）が含まれ、後者の例は、持続的気道内陽圧呼吸（Continuous Positive Airway Pressure (CPAP)）、バイレベル気道陽圧呼吸（Bilevel Positive Airway Pressure (BiPAP)）および平均換気量保証サポート（Volume Assured Pressure Support (AVAPS)）が含まれる。本方法は、別の治療法と組み合わせて実施することができ、その例として限定されないが、物理療法、言語療法、精神療法および作業療法が挙げられる。

抗神経変性剤は、被験者に意図する目的を果たすため、例えばALSに付随する症状の緩和を果たすために、「有効量」で投与することができる。.患者に投与される剤の用量は、一定時間に渡り被験者に有益な応答、例えば神経変性疾患に関連する少なくとも１つの症状の軽減を達成するのに十分であるべきである。幾つかの実施形態では、進行性筋委縮、麻痺、痙縮、反射亢進、並びに他の症状、例えば嚥下障害、脚弱、不明瞭な発語、歩行障害、顔面麻痺、呼吸変化、筋肉のけいれんなどから選択された少なくとも１つの症状の軽減が果たされる。

投与すべき剤の量または投与頻度は、年齢、性別、体重および一般的健康状態、病気の負担、および病気の進行速度を包含する、処置すべき被検者に依存する。これに関して、剤の正確な投与量は、医療実施者の判断に依存するだろう。当業者は、日常的な実験により、本明細書に記載の抗神経変性剤の有効量を決定し、所望の治療アウトカムのために医薬組成物中に含めることが可能であろう。

特定の実施形態では、被験者が暴露される治療レジメンは、１つ以上の抗神経変性剤の投与を含まない。そのような治療レジメンは、代わりに、栄養サプリメントの投与および／または適当な食事療法、非侵襲的換気法、物理療法、言語療法、精神療法および／または作業療法の開発を含みうる。例えば、被験者が緩徐進行性ALSを有する可能性があると決定される場合、１つ以上の神経変性剤の投与を含まないか、または少なくとも特定の期間の間、例えば６、12、18、24、30、36か月以上の期間は１つ以上の神経変性剤の投与を含まない治療レジメンが実施される。別の例では、被験者が急速進行性ALSを有する可能性があると決定される場合、被験者は緩徐進行性ALSを有する被験者よりも早期に、非侵襲性換気法に供され得る。

本発明を容易に理解し実際の効果を利用できるために、特定の好ましい実施形態を下記の非限定的例によって説明することにする。

実施例１
研究対象
標準プロトコルの承認、登録および患者の同意。これは、ヒューストン・メソディスト病院（Houston Methodist Hospital）内のMDA/ALSA ALSクリニックのALS患者と健常志願者（HV；健常対照、対照（コントロール）またはNCとも称される）から血清サンプルを採取する予測コホート研究であった。Houston Methodist Hospital内の施設内倫理委員会（Institutional Review Board；IRB）からの倫理上の承認後、全ての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。ALS患者（2011年１月から2016年11月にかけて募集した）を専門家のALS神経学者（SHA）により改正EI Escorial基準とAppel ALS（AALS）スコアに従って診断した（レンジ：30－164、Haverkamp他、1995 Brain 118:707-719; Voustianiouk他、2008 Muscle Nerve. 37(5):668-72）。ALS患者のいずれも感染症を発生していなかった。HV（2008年６月から2015年２月にかけて募集）は、典型的には患者の配偶者と友人であり、除外基準には、神経学的症状、自己免疫疾患または感染症を含めた。臨床情報は、症状の発症と診断からベースライン評価とサンプル収集に至るまで、研究実施者により収集した。ALS患者と志願者の人口統計学は同様であった。

バイオマーカーの定量化
ELISAによりsCD14, LBP, CRP, MIF, sTNFRIおよびsTNFRIIを定量した。

単球の単離
ヒト単球は、ALS患者と正常な対照の末梢血から新たに単離した。ヒト全単球単離キット(Miltenyi Biotec社、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて、製造業者の指示書に従ってネガティブ選択により高純度な全単球を得た。

フローサイトメトリー
単離された全単球を、非特異的結合を回避するためFcブロッカーにより染色した。単離した単球と新鮮な血液サンプルの両方を抗ヒトCD14-V450抗体(eBioscience, San Diego, CA, USA) 、抗ヒトCD16-FITC (eBioscience社、米国カリフォルニア州サンディエゴ)、抗ヒトHLA-DR-PerCP Cy5.5 (eBioscience社、米国カリフォルニア州サンディエゴ)、抗ヒトTIM3-PE (eBioscience社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）と共にインキュベートした。末梢血サンプルについては、赤血球を除去するため追加の１回の溶血工程を実施した。LIVE/DEAD（登録商標） Fixable Blue Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes社製、米国オンタリオ州 Eugene)を使って死細胞を染色した。355、488、405、561および633レーザー用に設定されたan LSR II^TM（商標）13 カラーフローサイトメーターを使って、細胞を即座に分析した。

統計学
２より多くの群についてANOVAを使い、または２つの群についてスチューデントのｔ検定を使って比較研究を行った。SigmaStatソフトウェアにおいてSpearmanの順位相関を使って相関を行った。ROC曲線分析はＲ統計ソフトウェアパッケージ（Vienna、オーストリア；V.3.0.2）を使って実施した。データを平均±SEとして表し、0.05未満のｐ値を有意とみなした。

結果
ALS患者とHVから単離された全単球上およびPBMC上のCD14およびCD16表面マーカー
CD14とCD16は、単球／マクロファージにより優先的に発現される。それらの細胞表面発現に基づいて、ヒト単球を３つの別個のサブセット: CD14+/CD16-、CD14+/CD16+およびCD14-/low/CD16+ 単球に分類した。フローサイトメトリーを使って、ALS患者および年齢の一致したHVのコホートからのPBMC上においてCD14およびCD16単球表面マーカーを定量した（図１Ａ）。CD14-/low/CD16+ 単球の頻度は、HVに比較して全ALS患者の総PBMCサンプルにおいて減少した（p＝0.04）。次いで、ALS患者を、1.5 Appel ALS（AALSスコア付け方法；Haverkamp他、Brain 1995; 118:707-719）点数（ポイント）／月以上の速度で進行しているものとして定義される急速進行性患者と、1.5 AALS点数／月（Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5:64-79)未満の速度で進行するものとして定義される、緩徐進行性患者に分類した。急速進行性患者は、それらのPBMC中のCD14-/low/CD16+ 単球数の減少を有した（p＝0.016）。CD14+/CD16- およびCD14+/CD16+ 集団の頻度には全く差異は観察されなかった。

ALS患者および年齢が一致したHVの第二のコホートにおいて、起こり得る単球活性化を避けるため、ネガティブ選択を使ってPBMCから全単球を単離・精製し、フローサイトメトリー分析にかけた。ポジティブ選択または冗長的なグラジェント分離は、単球を活性化しうる。精製された単球のCD14-/low/CD16+サブセットの頻度は、緩徐進行性患者（p＜0.001) とHV（p＜0.001）と比較して、再び急速進行性患者において減少した（図１Ｂ）。

膜結合型CD14（mCD14）の細胞表面発現が実際に減少したことを確かめるため、CD14メジアン蛍光強度（MFI）をPBMCサンプル上で測定した。結果は、急速進行性（p＜0.01）および緩徐進行性（p＜0.01）ALS患者が、HVのよりも減少したCD14+/CD16- 単球の表面上のCD14タンパク質シグナルを有することを証明した（図１Ｃ）。単離・精製された全単球データを解析した時、細胞表面CD14 MFIが、緩徐進行性のALS患者（p＜0.01）およびHV（p＜0.01）と比較して急速進行性のALS患者からのCD14+/CD16-およびCD14+/CD16+単球上で減少していた（図１Ｄ）。これらのデータは、CD14-/low/CD16+単球の頻度およびCD14の細胞表面発現が、細胞表面からCD14を活発に脱落することにより、または単球細胞表面上での減少したCD14生産とその後の発現のいずれかにより、両患者からの単球において、減少することを示唆している。

CD14-/low/CD16+単球とALSの病気の負担または進行速度との相関関係
CD14-/low/CD16+単球の頻度が急速進行性患者において減少すると証明されたため、この単球の部分集団の頻度が、ALS患者における病気の負担または病気進行速度のいずれかと関連するかどうかを決定するために、スピアマン（Speaman）相関係数解析を実施した。ALS患者では、CD14-/low/CD16+単球の割合（％）は、AALSスコア付け法に基づいた病気の負担と負の相関関係が認められた（p ＜0.0001、R＝0.584) （図２Ａ）；病気の負担が大きくなると、それらの単球の頻度が減少した。加えて、CD14-/low/CD16+単球の割合（％）は、AALSスコア付け法に基づくと病気進行速度と負の相関関係が認められた（p＜0.0001、R＝0.638) (図２Ｂ)；病気進行速度が急速になるほど、それらの単球の減少率が大きくなった。

ALS患者とHVからのPBMCおよび単離された単球における、CD14-/low/CD16+細胞中のCD14-/low/CD16+/TIM-3+部分母集団
末梢免疫活性化は今やALS病理学でよく認識されている構成成分であり、そしてTIM-3は先天性免疫細胞により発現されると炎症誘発性応答を促進することが示されている（Anderson他、Science 2007; 318(5853):1141-1143; Han他、Front Immunol 2013; 4:449）ため、TIM-3発現を、ALS患者に由来する単球の炎症誘発能力のバイオマーカーとして使用した。CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 単球の頻度は、緩徐進行性患者（p＜0.001）およびHV（p＜0.001）からのCD14-/low/CD16+/TIM-3+単球の頻度と比較して、急速進行性ALS患者のPBMCにおいて増加した（図３Ａ）。単離・精製された全単球を、CD14-/low/CD16+上のTIM-3発現について分析すると、CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 単球の頻度は、緩徐進行性患者（p＜0.001）およびHV（p＜0.001）からのCD14-/low/CD16+/TIM-3+ 単球の頻度と比較して、急速進行性患者において再び増加した（図３Ｂ）。PBMCと全単球サンプルの両方において、CD14+CD16-またはCD14+CD16+単球上でのTIM-3発現の頻度は、緩徐もしくは急速進行性患者からまたはHVからのものとで変化がなかった。CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 単球の割合（％）もまた、ALS患者における病気進行速度および病気の負担との正の相関関係が認められた（それぞれ、p＝0.005、R＝0.385；p＝0.009、R＝0.442）（図３ＣおよびＤ）。

血清可溶性CD14
単球活性化と同時に、mCD14 は細胞表面から開裂され、可溶性CD14（sCD14）が放出される；増加した血清sCD14レベルは、単球活性化の１つのバイオマーカーと考えられる（Shive CL 他、AIDS. 201;29(10):1263-1265）。CD14-/low/CD16+単球の頻度とCD14の単球表面発現が減少したため、血清をsCD14レベルについて調査した。患者の血清sCD14レベルは、HV由来血清と比較して上昇した（p＝0.0001）（図４Ａ）。急速進行性と緩徐進行性患者に更に分別した時（n＝37）、sCD14 は緩徐進行性患者（p＜0.001）またはHV（p＜0.001）のいずれかと比較して、急速進行性患者からの血清においてのみ上昇した（図４Ｂ）。緩徐進行性患者とHVとの間には血清sCD14レベルに差異は認められなかった（p＝0.948）。

sCD14レベルは、それらの患者の部分集団の脳脊髄液（CSF）および尿中でも上昇した。CSF sCD14の絶対レベルは、それらの患者の血清で測定したものより10倍低かった。sCD14は、HVから得られたCSFと比較してALS患者のCSFにおいて上昇した（p＝0.021）（図４Ｃ）。しかしながら、患者を急速および緩徐進行性患者に分類した時、急速進行性患者からのCSFサンプルのみ、緩徐進行性患者（p＝0.033）およびHV被験者（p＝0.002）と比較してsCD14レベルが増加した。ALS緩徐進行性患者およびHVの間で全く差異は認められなかった（p＝0.154）（図４Ｄ）。さらに、sCD14のCSFレベルはsCD14の血清レベルと正の相関があった（p＝0.004、R＝0.619）（図４Ｅ）。

尿中のsCD14レベルとの関連において、sCD14はHVと比較してALS患者で上昇した（p＝0.000003）（図４Ｆ）。患者を急速進行性と緩徐進行性患者に分けた時、急速進行性患者からの尿サンプルは、HVと比較してsCD14レベルが増加し（p＝0.0000006）、そして緩徐進行性患者に比較して急速進行性患者の尿ではsCD14レベルが増加する傾向が認められた（p＝0.077）（図４Ｇ）。HVに比較して緩徐進行性ALS患者において尿中sCD14レベルに統計的に有意な増加が認められたが、この増加は、急速進行性患者に見られるものよりも顕著ではなかった（p＝0.022）（図４Ｇ）。

sCD14は、細胞表面からの開裂によるかまたは細胞内プールからの放出により生成され得る。CD14 mRNAも減少するかどうかを調べるために、患者のPBMCから単離されたmRNAに対してqRT-PCRアッセイを実施し、HVから単離されたmRNAと比較した。CD14 mRNAは、患者のPBMC中で減少していた（p＝0.003）（図５Ａ）。mRNAサンプルを急速進行性患者と緩徐進行性患者に分けた場合、CD14 mRNAは、緩徐進行性患者（p＜0.001）またはHV（p＜0.001）のいずれかと比較して、急速進行性患者においてのみ減少した（図５Ｂ）。緩徐進行性ALS患者とHVとの間でCD14 mRNAに差は認められなかった（p＝0.691）。

ALS患者の血清sCD14レベルの上昇がこの神経変性疾患に特異的であるかどうかを判断するために、別の神経変性疾患である認知症（アルツハイマー病および前頭側頭型認知症）患者の血清をsCD14濃度についてアッセイし、そして年齢を一致させた適切なHV（n＝13）と比較した。HVと比較して、認知症患者からの血清sCD14レベルに差は認められなかった（p＝0.177）（図６Ａ）。認知症の患者を軽度のアルツハイマー病（軽度AD；n＝10）、進行したアルツハイマー病患者（AD；n＝13）、前頭側頭型認知症の患者（FTD；n＝4）に分類したところ、患者の異なる個体群間（軽度のAD対AD、p＝0.689；軽度AD対FTD、p＝0.894；およびAD対FTD、p＝0.742）、および認知症患者とHVの各群間で差は認められなかった（軽度AD対HV、p＝0.569；AD対HV、p＝0.118；FTD対HV、p＝0.369）（図６Ｂ）。認知症患者／HVは、ALS患者／HVよりも高齢であったため、認知症患者とその年齢が一致するHVは、ALS患者とそれぞれの年齢が一致するHVとの直接比較を行わなかった（データは示していない）。

ALS患者の血清sCD14レベルの上昇が他の神経疾患と異なるかどうかを判断するために、自己免疫性神経障害である慢性炎症性脱髄性多発神経障害（CIDP、n＝14）の患者の血清をsCD14レベルについて評価した。そして適切な年齢を一致させたHVと比較した。血清sCD14レベルはCIDP患者とHV間で異ならなかった（p＝0.387）（図６Ｃ）。この分析では、CIDP患者とそれと年齢を一致させたHVの年齢は、ALS患者とそれぞれの年齢を一致させた対照の年齢と異ならなかったため、CIDP患者をALS患者と比較した（図６Ｄ）。さらに、HVの２つの群間の年齢に差がなかったため（p＝0.751）、２つの群間の血清sCD14レベルを比較し、差がなかったため（p＝0.555）、２つのHV群を合併して分析した（n＝34）。全てのALS患者の血清sCD14レベルは、CIDP患者の血清sCD14レベルと比較して増加した（p＝0.043）。しかしながら、ALS患者を急速進行性患者（n＝20）と緩徐進行性患者（n＝20）に分け、それらをCIDP患者と比較した場合、急速進行性のALS患者のみがCIDP患者からのものと異なっていた（p＝0.0002）; 緩徐進行性ALS患者とCIDP患者との間に差は認められなかった（p＝0.637）。さらに、CIDP患者とHVの合併群との間に差異は認められなかった（p＝0.174）。

血清sCD14とALS病気負担との相関
AALSスコア付け法に基づくと、血清sCD14レベルはALS患者（n＝28）における病気負担の増加と相関した。血清sCD14レベルは、採血時の患者のAALSスコアと正の相関が認められた（p＜0.0001、R＝0.684）（図７Ａ）。さらに、ALS Tregが機能不全であることが最近示されたため（Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5：64-79 ; Beers他、JCI Insight, 2017; 2(5): e89530）、血清sCD14レベルとALS Tregsの機能不全抑制能力との相関関係を分析したところ、患者の損傷されたTreg抑制機能と正の相関関係があることが判明した（p＝0.009、R＝0.613）（図７Ｂ）。

sCD14は現在の進行速度を予測する
sCD14と病気進行速度との相関関係は、患者の現在の臨床的に評価された病気進行速度の潜在的インジケーター（指標）としてのsCD14血清レベルの評価を促した。受信者動作特性（ROC）分析（図７Ｃ）を利用して、血清採取時の急速進行性対緩徐進行性の病気進行速度を反映する、それらの患者の血清レベルの精度を評価した（前述した２つの病気進行の両方を使用、Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5：64-79）。血清sCD14レベルは、病気進行速度の正確なインジケーター（指標）であった。対照の2.73μg/mLを超えるROCカットオフを陽性として使用した場合、血清sCD14レベルは、急速進行性患者と緩徐進行性患者とを区別するのに、90.9％の精度、88％の感度、および90％の特異度を有した。

以前の研究では、低いFOXP3 mRNAレベルの場合の0.66倍カットオフのROCスコアが不良な臨床アウトカムの予測因子であるかどうかを評価し、FOXP3レベルはこのカットオフを下回る患者の35％が人工呼吸器を装着していたか死亡したと報告し、一方でそのカットオフを上回るFOXP3レベルを有する患者のわずか13％が、人工呼吸器を装着していたか死亡したと報告した。2.73μg/mLの血清sCD14のROCスコアカットオフ値を装着した場合、そのカットオフを上回るsCD14値を持つALS患者の72％（21/29）が死亡し、一方でそのカットオフを上回るsCD14値を持つ患者の28％（8/29）のみが生き残った（図８Ａ）。ALSの病気負担の臨床スコア付け方法は、閾値より上のROCスコアを有する患者が、閾値より下のスコアを有する患者よりも早く100 AALS点数に到達することを明らかにした（図８Ｃ）。病気進行の尺度として、カットオフより上のROCスコアを有する患者は、カットオフ値より下のスコアを有する患者よりも、診断から死亡までのより短い期間生存していた。スピアマン（Spearman）の相関係数解析を利用して、病気の負担と病気進行（図８Ｂと図８Ｃ）を、患者の血清sCD14レベルと相関させた。この解析は、血清sCD14 レベルが大きいほど、患者が100 AALS点数に早く到達し（図８Ｄ）、そして診断からの患者の生存時間が短くなる（図８Ｅ）ことを証明した。

血清中可溶性LBP濃度
患者およびHVの血清中の可溶性リポ多糖結合タンパク質（LBP、sLBPとも称される）のレベルを検出するためのアッセイを行った。LBPはHVに比較して全ての患者の血清において増加した（p＜0.0001）（図９Ａ）。血清サンプルを急速進行性と緩徐進行性患者に分けた場合、LBPは緩徐進行性患者（p＜0.0001）またはHV（p＜0.0001）のいずれかと比較して、急速進行性患者においてのみ上昇した（図９Ｂ）。ALS緩徐進行性患者とHVとの間で血清中LBPに全く差は認められなかった（p＝0.208）。興味深いことに、血清LPS／エンドトキシンはALS患者において上昇傾向があったが、そのレベルはHVからの血清中レベルと比較した場合に有意差に達しなかった（データは示していない）。

それらの患者のサブセット（n＝28）では、血清LBPは患者の病気の負担と正の相関関係があった（p＝0.001、R＝0.587）（図９Ｃ）；LBPが増加すると、増加したAALSスコアにより判定されるように、患者の健康状態が悪化した。血清sCD14は病気の負担と正の相関関係が認められるので、それらの患者ではLBPとsCD14の間に正の相関関係が存在した（p＝0.001、R＝0.584）（図９Ｄ）。よって、LBPが増加すると、sCD14に付随の増加が認められた。

Ｃ反応性タンパク質
患者およびHVの血清においてCRPを測定した。CRPはHVと比較して全ての患者の血清で上昇した（p＝0.003）（図１０Ａ）。しかし、緩徐進行性患者（p＜0.048）またはHV（p＝0.0008）のいずれかと比較して、急速進行性患者においてのみ上昇した（図１０Ｂ）。ALS緩徐進行性患者とHVとの間には血清CRPに全く差が認められなかった（p＝0.072）。

血清MIF
マクロファージ遊走阻害因子（MIF）を患者の血清で測定した。MIFはHVに比較して全ての患者の血清において上昇した（p＜0.0001）（図１１Ａ）。血清サンプルを急速進行性患者と緩徐進行性患者とに分けた場合、MIFは急速進行性患者（p＜0.0001）と緩徐進行性患者（p＜0.0001）の両方において、HVと比較して上昇した（図１１Ｂ）；ただし急速進行性ALS患者と緩徐進行性ALS患者との間には全く差が認められなかった（p＜0.102）。

血清可溶性TNFR1およびTNFR2
腫瘍壊死因子（TNF）は単球／マクロファージ並びに他の細胞によって産生され、それは、通常は細胞表面に結合している２つの細胞表面受容体TNFRIとTNFRIIを介してその多面的な活性を媒介する炎症誘発性サイトカインである。可溶性TNFRIとTNFRIIを患者の血清において測定した。それらの受容体の血清レベルはHVと比較してALS患者において増加した（TNFRI、p＝0.008; TNFRII、p＝0.003)（図１２ＡおよびＢ）。急速進行性と緩徐進行性患者に分けた場合、可溶性TNFRIおよびTNFRIIレベルは、緩徐進行性患者（TNFRI、p＜0.0001；TNFRII、p＜0.0001）またはHV（TNFRI、p＜0.0001；TNFRII、p＜0.0001）と比較して、急速進行性患者においてのみ上昇した（図１２ＣおよびＤ）。緩徐進行性患者とHVとの間には、血清可溶性TNFRIおよびTNFRIIレベルには全く差が認められなかった (TNFRI、p＝0.373；TNFRII、p＝0.668）。

可溶性TNFRIおよびTNFRIIレベルの両方が患者血清において上昇し、そして可溶性TNFRIおよびTNFRIIレベルは急速進行性ALS患者においてのみ上昇したため、それらの２つのレセプターの血清レベル間に関連があるかどうかを調べる目的で、スピアマン相関係数解析を利用した。この解析は、それらの患者において血清中の可溶性TNFRIおよびTNFRII間に正の相関関係があることを証明した（p＜0.0001、R＝0.851）。よって、可溶性TNFRIレベルが増加すると、可溶性TNFRIIレベルも増加した。しかしながら、HVの血清中のTNFRIとTNFRIIレベル間には全く関係は認められなかった（p＝0.98、R＝0.01）。

考察
炎症は今やALSの病態生理学において主要な役割を果たすことが認識されている（Appel他、Trends Immunol. 2010; 31(1):7-17; Appel他、Acta Myol. 2011; 30(1):4-8）。適応免疫と先天性免疫の両免疫機構の応答は、病気の進行速度と生存率を制御する極めて重要な相互依存的な役割を果たしている。Henkel他（EMBO Mol Med 2013; 5: 64-79）は、TregがALS患者において適応免疫応答という防御的役割を果たすことを報告した。Treg数の減少とFOXP3発現の減少は、より急速な病気進行と関連付けられた。一方で、TregおよびFOXP3発現の循環レベルが低いことは、3.5年後の死亡率の増加と関連があり、一方でTregとFOXP3発現の高レベルは、同じ期間での低い死亡率と関連付けられた。ディープRNAシーケンシングおよびqRT-PCR技術を用いた別の研究は、ALS患者から単離された単球が、炎症誘発性免疫応答である先天性免疫応答に関連したユニークな遺伝子プロファイルを発現することを証明した（Zhao他、Neurol. 2017;74(6):677-685）。上位10個のアップレギュレートされた発現変動遺伝子のうちの９個が、炎症に関与していた。この研究は、CD14^-/low/CD16⁺ 単球がALS患者では減少すること、そして単球上のCD14の細胞表面発現が減少することを示す。これらの知見に従って、血清sCD14レベルが急速進行性患者で増加すること、この患者群において生存期間の減少（短縮）を正確に予測することが判明した。これは、血清sCD14レベルが病気進行のバイオマーカーとして利用できることを証明する最初の報告である。可溶性LBP、MIF、CRP並びにTNFRIおよびTNFRIもまた患者血清中で上昇した。それらの因子の集団プロファイルは、ALSに独特であり、更に病気進行速度を識別する。その上、集団プロファイルはALSの特異度と感度を増加させるようであった。よって、本研究は、ALS患者における炎症誘発性先天性免疫応答についての確証並びに追加のエビデンスを提供する；この応答は病気の負担増加および急速な病気進行に関連付けられる。この炎症誘発性の環境は、患者の悪化した臨床状態に更に寄与する。

グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）に付着した膜糖タンパク質であるCD14は、単球／マクロファージにより優先的に発現される骨髄性識別マーカーであり、好中球上には低レベルでみられるが、Toll様受容体４およびMD-2と共に、LPSのコレセプターとして作用する。CD16も単球/マクロファージにより発現され、Fc受容体として同定されている。CD14とCD16細胞表面発現に基づくと、ヒト単球は３つの異なるサブセットに分類することができる：古典型（標準型）CD14+/CD16-単球、中間型CD14⁺/CD16⁺単球、および非古典型（非標準型）CD14^-/low/CD16⁺ 単球。その３つのうち最も優勢なものは、CD14⁺/CD16^- 単球であり、それらは全単球母集団のほぼ80％を占め、残りの２つのサブセットは全単球の残余部分集団を示す。この報告は、非古典型単球であるCD14^-/low/CD16⁺ 単球がALS患者からの全PBMCにおいて減少することを証明した；この部分集団は、急速進行性患者からのPBMCと単離された全単球の両方において減少した。さらに、MFIにより示される通り、CD14の細胞表面発現は、CD14⁺/CD16^- および CD14⁺/CD16⁺ 単球部分集団においても減少する。CD14の細胞表面発現の減少は、単球活性化と関連付けられ；CD14は単球活性化によってsCD14として脱落する。よって、CD14^-/low/CD16⁺ 単球数の減少並びに CD14⁺/CD16^- およびCD14⁺/CD16⁺ 単球の細胞表面発現の減少は、それらの患者における炎症誘発性先天性免疫応答の追加のエビデンスを提供する。

免疫応答中のTIM-3の調節は、多様な適応免疫および先天性免疫機能を示唆する（Han他、Front Immunol 2013; 4：449）。他方、TIM-3は、アポトーシスを誘導することによってＴ細胞応答の負の調節因子として同定されている。TIM-3は、適応免疫応答においてTh1免疫を終結させる（Hastings他、Eur J Immunol 2009; 39(9)：2492-2501）。一方、研究によると、この同じTIM-3分子が先天性免疫細胞上にも発現し、TLRシグナル伝達経路と相乗的に作用して炎症誘発性応答を促進する。TIM3は、単球およびマクロファージの炎症誘発性マーカーであると考えられる（Anderson 他、Science 2007; 318（5853）：1141-1143）。ALS患者からの非古典型CD14の数の減少とは対照的に、CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3単球の頻度はPBMC上と急速進行性の患者からの単離された全単球において増加した。これは、それらの患者における炎症誘発性末梢免疫環境のもう１つの指標である。

mCD14の単球活性化依存性脱落（shedding）は、sCD14の大部分を生成する。その上、mCD14発現の増加またはGPI結合をバイパスする直接CD14分泌は。おそらくsCD14の変動に寄与しうる。LPSは、CD14に結合する有力な単球活性化因子であり、sCD14の細胞性放出を誘導するが、フラジェリンやCpGオリゴデオキシヌクレオチドのような別のTLRリガンドもsCD14の放出を誘導する（Marcos他、Respir Res. 2010; 11:32; Shive他、AIDS. 201;29(10):1263-1265）。近年、sCD14に集中している多くの臨床研究により、敗血症やHIVのような感染性疾患において、sCD14レベルが上昇し、そして病気の重症度または予後不良に関連することが明らかになった（Shive他、AIDS. 201;29(10):1263-1265)。現在の研究は、sCD14レベルがALS患者の血清において上昇するが、急速進行性と緩徐進行性患者に分けた場合、sCD14レベルは急速進行性患者の血清においてのみ上昇した。加えて、sCD14レベルは、患者のCSFにおいても上昇するが、同様に、異なる進行速度を有する患者に分けると、sCD14レベルは急速進行性患者のCSFにおいてのみ上昇した。よって、CD14^-/low/CD16⁺単球数の減少、およびCD14⁺/CD16^- 単球とCD14⁺/CD16⁺ 単球上のmCD14の細胞表面発現の減少が認められるというエビデンスを考慮すると、血清sCD14の上昇レベルは、単球からの活性化依存性開裂と脱落のためである可能性が高い。実質性小神経膠細胞もmCD14を発現することが知られているので、上昇したCSF sCD14レベルの考えられる発生源は、この細胞区画における活性化された単球／マクロファージからのmCD14の脱落に加えて、活性化された神経膠細胞からのmCD14の脱落によるものであり得る。従って、これらのデータは、ALS患者、特に急速進行性の疾病を有する患者における炎症誘発性単球応答の概念を裏付ける。

上述した通り、以前の研究は、単球がmCD14のタンパク質分解開裂によりsCD14を産生することを示した。しかしながら、ヒト単球はプロテアーゼ非依存性機序によりsCD14を産生することも知られている；sCD14は、CD14の細胞内プールから放出される。CD14がPBMC中で活発に産生され、それによりCD14の細胞内プールおよびそれらの細胞からのsCD14としてのCD14の可能な放出を増加させるかどうかを調べるため、CD14 mRNAレベルについてqRT-PCRによりPBMCをアッセイした。CD14 mRNAは患者からのPBMC中で減少するが、急速進行性患者と緩徐進行性患者に分けた場合、CD14 mRNAは急速進行性患者においてのみ減少した。従って、sCD14は急速進行性患者の血清において減少する一方、それらの同患者のPBMCからのCD14 mRNAは減少した。このことは、sCD14の血清レベルの増加が単球表面からの開裂によるものであり、CD14の細胞内プールからのsCD14の放出によるものでないことを示唆している。これらのデータは、以前のエビデンスと併せて考えると、同様に血清sCD14レベルの上昇は単球の活性化により媒介されることを示唆している。

これは、神経変性疾患における血清sCD14の上昇を示す最初の報告である。それ自体、血清sCD14レベルは、認知症（アルツハイマー病および前頭側頭認知症）またはCIDPを有する患者などの別の神経学的変性疾患、別の神経変性疾患、および自己免疫神経学的疾患のそれぞれにおいても、上昇した。最近、炎症の増加がAD症状の悪化に関連することが証明された。TREM2（ミエロイド細胞上に発現されるトリガー受容体２）は、小神経膠細胞、破骨細胞およびマクロファージＶ型免疫グロブリン（Ig）ドメインを含有する膜貫通タンパク質である（Colonna & Wang、Nat Rev Neurosci. 2016 Apr;17(4):201-7）。幾つかの最近の研究は、アミロイドーシスのマウスモデルにおいてTREM2依存性表現型が、AD病理学の先天性免疫応答を調節する重要な役割を果たすことを記載している。さらに、炎症過程においてTREM2を包含する可溶性TREM2断片のCSFレベルの上昇は、ニューロン損傷および臨床的認知症の発症と同時に起こる。CIDPは、神経のミエリンを破壊する炎症によって引き起こされ、そして典型的には運動神経と感覚神経の両方の機能不全を伴う。CIPDは、時折、急性炎症性の脱髄性ポリニューロパチーであるキランバレー（Guillain Barre）症候群の慢性形態として考えられている。この末梢神経炎症応答の主な細胞成分は、マクロファージ媒介性ミエリン脱屑を伴う神経上膜および神経内膜のＴリンパ球およびマクロファージである。よって、これらの神経学的疾患は共に、それらの細胞の活性化によるmCD14脱落の可能性がある単球／マクロファージ／神経膠細胞に関わる。それらの追加の患者は、その他の神経学的疾患からALSをできる限り識別するために血清sCD14レベルについて評価した。認知症またはCIPDを有する患者からのsCD14の血清レベルには全く差異は認められなかった。さらに、認知症患者を軽度AD、ADまたはFTDの患者に分類した場合、これらの３つの異なる患者群間では、血清sCD14に全く差は認められなかった。それらのデータは、ALSの先天性末梢免疫応答が、他の神経学的疾患と比較して、増加した単球活性化およびその後のmCD14の脱落と関連があることを更に示唆している。

以前の研究は、ALS患者とALSの動物モデルの両方において、病気が進行しそして病気の負担がエスカレートするにつれ、先天性免疫炎症誘発応答に付随の増加が認められることを証明した（Beers他、Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(40):15558-63；Beers他、Brain 2011; 134: 1293-1314；Beers他、Brain Behav Immun. 2011;25(5):1025-35；Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5:64-79；Beers他、JCI Insight. 2017;2(5):e89530）。ALSを有する患者と動物の両方において、CNSに炎症誘発性先天性ミクログリア応答が存在することは、数十年前から周知である。しかしながら、末梢神経系（PNS）における先天性免疫の役割は十分に定義されていない。先行研究は、変異体トランスジェニックALSマウスにおいてPNSを通じてCD169/CD68/Iba1⁺マクロファージの活性化を特徴づけた(Chiu他、Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(49):20960-5）。マクロファージ活性化は発症前に起こり、そして症状の発症後には神経束内の巣状のアレイから組織ワイドな分布にまで拡大した。この研究は、それらのマウスでの脊髄免疫活性化とは別であり異なっている末梢神経での進行性の先天的免疫応答を明らかにした。より最近の研究は、ALSトランスジェニックマウスにおける運動機能衰弱の臨床的徴候の始まりを進める早期イベントである変性末梢神経線維を取り巻く単球／マクロファージの存在を証明した（Lincecum 他、Nat Genet. 2010;42(5):392-9, Kano他、Neurology. 2012;78(11):833-5）。さらに、CD68⁺マクロファージは、発症前ALSマウスの末梢神経内に観察され、それらの炎症細胞は実証可能な除神経後にのみ浸潤した。この後期の研究も、CD68+マクロファージの出現と同時に起こるCCL2の発現増加を実証し、このことは恐らくシュワン細胞により分泌されるCCL2が、それらの末梢神経において、その炎症細胞の浸潤を調節することができることを示唆している。本研究により重要であるのは、Murdock 他（JAMA Neurol. 2017;74(12):1446-1454）が最近、急速進行性ALS患者における末梢炎症反応を評価し、そして全白血球、好中球、CD16+およびCD16-単球並びにナチュラルキラー細胞の数の増加を報告した。CD11b⁺骨髄様細胞の急激な一時的増加も観察され、免疫細胞数のこれらの早期変化は、病気の進行速度と正の相関関係を示した。現在の研究は単球の絶対数をカウントしなかったが、CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球がPBMCと急速進行性患者からの単離された全単球の両方において増加すること、そしてこのCD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球の割合（％）の増加は、病気の進行速度と正の相関関係があることを証明している。CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球の割合が大きくなるほど、病気の進行もより迅速になる。加えて、現在の研究は、CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球の割合とAALSスコアとの間の正の相関も示し；CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球の割合（％）が大きくなるほど、病気の負担の増加もより大きくなる。従って、この区画におけるCNSと免疫系との間のクロストークに加えて、クロストークは、ALS病気進行の間、PNS全体を通してPNSと先天性免疫系との間でも起こる（Henkel他、J Neuroimmune Pharmacol. 2009;4(4):389-98; Appel他、Acta Myol. 2011;30(1):4-8; Zhao他、Neurol. 2017;74(6):677-685; Hooten他、Neurotherapeutics. 2015;12(2):364-75）。

ALSトランスジェニックマウスモデルにおいて、Tregの欠如は炎症過程を悪化させ、加速された運動ニューロンの死、より急速な病気の進行、および生存期間の短縮に至る（Beers他、Brain 2011; 134: 1293-1314）。ALS患者では、Treg数およびFOXP3 mRNA発現が急速進行性患者において減少し、ALS TregsはTresp増殖を抑制するのにあまり効果的でなかった。急速進行性と緩徐進行性患者の両方とも機能不全のTregsを有したが、臨床的に評価された病気の負担が大きいほどまたは患者の病気進行が速いほど、Tregの機能不全が大きくなった（Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5:64-79; Beers他、JCI Insight. 2017;2(5):e89530）。さらに、そして既に上述した通り、以前の研究は、0.66倍カットオフのROCスコアカットオフが、低FOXP3 mRNAレベルが悪性の臨床アウトカムと関連付けられ、そしてこのカットオフより下のFOXP3レベルを有する患者の35％が、人工呼吸器を装着していたかまたは死亡し、一方でこのカットオフより上のFOXP3レベルを有する患者のわずか13％が人工呼吸器を装着したかまたは死亡したことを正確に予測した。血清の採集時点で急速または緩徐な病気進行速度を有する患者を識別するために同一のROC解析を使用すると、血清sCD14レベルは病気進行速度の正確な指標（インジケーター）であった；2.73μg/mLの対照のROCカットオフを陽性対照（ポジティブコントロール）として使用すると、血清sCD14レベルは急速進行性疾患を有する患者を緩徐進行性患者から90.9％の精度、88％の感度、および90％の特異度で正確に識別できた。さらに、以前の報告（Henkel他、EMBO Mol Med 2013; 5:64-79）と対照的に、それらのROC解析は、このカットオフより上のsCD14値を有する患者の72％が死亡し、一方でこのカットオフより上のsCD14値を有する患者のわずか28％がこの４年間の研究の終わりに生存していた。加えて、ROCカットオフを上回る血清sCD14値を有する患者の70％が死亡したのに対し、このカットオフより下のsCD14値を有する患者のわずか30％が死亡した。これらのデータは、血清中のsCD14の量が大きいほど、患者が100点のAALSスコアに早く到達し、診断から死亡までの進行が早くなった。よって、これらのデータは、CD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺ 単球の割合（％）の増加が病気の進行速度の増加および病気の負担の増大と関連があることを示唆しているだけでなく、血清sCD14レベルの増加が、病気の進行速度の増加および病気の負担の増大の直接のバイオマーカーであることも示唆している。同じく、これは、増加した血清sCD14+レベルが、先天性免疫応答増強の直接の尺度である、単球活性化mCD14脱落の指標であることも示唆している。

生理学的および病理学的状況におけるCD14の正確な役割はまだ十分には定義されていない（Bas他、J Immunol. 2004;172(7):4470-9）。血清sCD14は、単球からのmCD14の開裂と脱落により生じる。単球表面において、急性期タンパク質（APP）であるmCD14とLBPは、段階的方法でLPSと相互作用して高親和性の三分子複合体を形成し、それにより単球がLPSの存在を検出できるようになる。次いでこの複合体は、下流のシグナル伝達のためToll様受容体４（TLR4）およびMD-2と相互作用する（Zhou他、2016）。対照的に、sCD14について２つの反対の機能が記載されている。その１つは、LPS結合を目当てにmCD14と競争することにより、エンドトキシンで誘発される活性を減少させることができ、またはCD14を発現しない内皮細胞、上皮細胞および平滑筋細胞のLPS誘発性活性化を媒介することができる。もう１つは、単球からのプロテアーゼ媒介脱落とは異なり、sCD14はAPPの主な供給源を表す肝細胞により生産されるため、sCD14はAPPであると言うこともできる（Pan他、J Biol Chem. 2000;275(46):36430-5; Bas他、J Immunol. 2004;172(7):4470-9）。興味深いことに、肝細胞はLBPの主な供給源でもある。従って、LBPレベルはALS患者の血清において上昇した。LBPは全ての患者の血清で増加したが、サンプルを急速進行性患者と緩徐進行性患者に分けた場合、LBPは、sCD14について示されたのと同様に、急速進行性患者の血清においてのみ上昇した。さらに、sCD14について示されたのと同様に、血清LBPは患者の病気の負担と正の相関関係が見られた。より興味深いことに、それらの患者においてLBPとsCD14との間に正の相関関係があった；sCD14が増加すると、LBPに付随の増加が見られた。以前の報告（Zhang他、2009）とは対照的に、遊離のエンドトキシン／LPSがなぜALS患者の血清中で増加しなかったかの考えられる理由は、LPSがsCD14/LBP複合体に結合し、次いでその複合体が、内皮細胞や上皮細胞のようなmCD14を発現しない細胞の表面上のTLR4と相互作用でき、それにより炎症誘発性応答を悪化させるためである。

CRPは炎症誘発性サイトカインにより調節されそして肝細胞により分泌される典型的APPである。CRPは、数種のタイプの腫瘍、心血管疾患およびリウマチ疾患に対する予後値を有する。以前の報告は、ALS患者において広範囲のCRPレベルと臨床的に評価された身体障害（無力）との間に正の相関関係があることを結論付けた（Keizman 他、Acta Neurol Scand. 2009;119(6):383-9）。最近のALS患者のより大きなコホート研究も、血清CRPがそれらの患者において上昇し、そして高レベルのCRPを有する患者が低CRPレベルを有する患者よりも迅速に進行することを明らかにした（Lunetta他、JAMA Neurol. 2017;74(6):660-667）。ともにAPPであるsCD14とLBPは上昇し、そしてCRPは前の研究において上昇したので、CRPを本研究において評価した。CRPは全ての患者の血清において上昇したが、患者を急速進行性と緩徐進行性患者に分けた場合には、CRPは急速進行性患者においてのみ上昇した。よって、これらのデータは、２つの先行研究を確証し、そしておそらく、肝臓がこの疾患における炎症誘発性応答の十分に理解された関係者（participant）およびモジュレーターではないことを示唆している。

炎症誘発性サイトカインMIFは、先天性および適合免疫応答に必須である。MIFは全身性炎症反応の重要なメディエーターである。MIFは糖質コルチコイドの抗炎症活性の生理的カウンターレギュレーター（逆調節因子）として特徴づけられている。様々な刺激に応答して、MIFは予め形成された細胞内プールから放出される。MIFは多数の炎症誘発性成分の生産を促進し、かつ炎症組織中への正常白血球の流入に必要とされる。MIFの血清レベルの上昇は、多数の感染性および炎症性疾患において検出され、そしてsCD14について示されたのと同様、MIFレベルは敗血症において上昇する。MIFは全てのALS患者の血清において上昇することが分かったが、sCD14、LBP、およびCRPとは異なり、MIFは急速進行性患者と緩徐進行性患者の両方で上昇した。よって、これらのデータは、MIFがALSに生じる炎症誘発性応答の早期指標（インジケーター）であり得ること、および病気の進行速度が増加するとMIFレベルが増加することを示唆している。

腫瘍壊死因子α（TNF-α）は、単球／マクロファージによるだけでなく他の細胞でも生産され、そして２つの細胞表面受容体TNFRIとTNFRIIを介してその多能性活性を媒介する炎症誘発性サイトカインである。両受容体ともユビキタスに発現され、構造的に類似した細胞外ドメインを提示するが、異なる細胞内領域を通してシグナル伝達し、TNFRIはTNFRII中には存在しない死ドメインを含む。２つのTNFRは、エキソソーム中のそれらの細胞外ドメインのタンパク質開裂により、または膜貫通ドメインと細胞質ドメインの欠失をもたらすmRNA転写物の交互のスプライシングを介して、可溶性タンパク質として放出される。可溶性TNFRはTNFアンタゴニストとして作用することができ、TNF媒介の炎症誘発効果を阻害することができる。しかしながら、可溶性受容体は血中可溶性TNFを安定化し保存することができ、そのためTNFアゴニストとして機能することができる。従って、可溶性TNFRはTNF-αの生物学的活性のモジュレーターとしての役割を果たすことができる。TNFRIは炎症シグナル伝達経路を優先的に促進し、一方でTNFRIIは免疫活性調節機能を媒介し、組織の恒常性（ホメオスタシス）と再生を促進する。多発性硬化症（MS）では、罹患性と関連付けられるTNFRI多型性が存在する(Gregory他、Nature 2012, 488, 508-511）。この多型の機能は、分泌されそしてTNF-αと結合する新規のTNFRI変異体を産生することである。MS患者では、この疾病の早期に、過剰のTNF受容体の脱落が血中に認められており、TNFのバイオアベイラビリティの低さを示唆している。幾つかの研究は、TNFRIIがヒトとマウスのTregの最大抑制サブセット上に優先的に発現されること、そしてTNFRIIの活性化がTregの増殖と機能にとって重要であることを報告した（Chen他、J. Immunol. 2007, 179, 154-161; Chen他、J. Immunol. 2008, 180,6467-6471, Chen他、Curr. Dir. Autoimmun. 2010, 11, 119-134, Chen他、J. Immunol. 2013, 190, 1076-1084; Heinrich他、Antibodies 2015;4:34-47）。現在の研究において、TNFRが全てのALS患者の血清において上昇したが、患者を急速進行性患者と緩徐進行性患者に分けた場合には、本研究を通して、この受容体が急速進行性患者においてのみ上昇した。Poloni他（Neurosci Lett. 2000;287(3):211-4）は、TNF-αと可溶性受容体のレベルがALS患者の血清中で上昇することを報告した。興味深いことに、未結合の三量体分子に相当するTNF-αの生物学的活性形態は、ALS患者とHVとの間で同様であった。後の研究は、TNF-αレベルがより小さいALS患者コホートの血清において上昇することも明らかにした（Babu他、Neurochem Res 2008; 33: 1145-1149)。これらの２つの先行研究と現在の研究に関して、それらのデータは患者において対抗型（duel）免疫応答を示唆している。第一に、ALSの病理生物学と関連する既知炎症反応のため、２つの受容体はTNFアンタゴニストとして作用しかつTNF-αの炎症誘発作用を阻害するように脱落する。これらのデータと、急速進行性患者から単離されたTregが高度に機能不全であり、緩徐進行性患者からのTregではその程度がより低いという最近の報告を考慮に入れると、Tregの表面からTNFRIIを脱落し、それによってTNFRIIを通したTNF-αシグナル伝達を遮断することは、それらの細胞の抑制機能を阻害しうる（Beers他、JCI Insight. 2017;2(5):e89530）。第二に、血清TNFRの上昇は、TNF-αを結合することができ、そして将来のTNF-α放出とその後の炎症誘発性反応のためのリザーバーとして働くことができる。

ミクログリアにより指令される炎症誘発性応答がALS患者のCNS組織において認められることは十分に実証されている（Turner他、Neurobiol Dis 2004; 5: 601-609; Appel他、Acta Myol. 2011;30(1):4-8; Corcia他、PLoS One 2012; 7:e52941; Brites & Vaz, Front Cell Neurosci. 2014; 8: 117）。従って、この報告に提示されたデータは、それらの患者、特に急速に進行する疾患を持つ患者の末梢循環系中に存在する、進行中の単球で指令される炎症誘発性環境の概念を示唆している（Zhao他、Neurol. 2017;74(6):677-685）。それらのCD14^-/low/CD16⁺ 単球数の減少、CD14⁺/CD16^- および CD14⁺/CD16⁺ 単球上のmCD14の細胞表面発現の減少、並びにそれらの患者におけるCD14^-/low/CD16⁺/TIM-3⁺単球の割合の増加は、この概念と一致する。より重要なことには、血清sCD14レベルが急速進行性患者で増加すること、そしてその血清sCD14レベルが生存期間の減少を正確に予測することが判明した。可溶性LBP、MIF、CRP並びにTNFRIおよびTNFRIIが患者の血清中で上昇するという追加のエビデンスを含めると、それらの因子とsCD14は、ALSに固有である集団的免疫バイオマーカープロファイルを構成し、かつ、この疾患のバイオマーカーの特異度と感度を増加させる可能性がある。

実施例２
ALS進行速度についてのバイオマーカーとして作用するsCD14とLBPの能力に関する上記の知見を確証するために、より大きな患者コホートを使った第二の研究を実施した。この研究において、100例のALS患者と60例の健常志願者（HV）を上記と本質的に同様に評価し、血清中sCD14とLBPのレベルを決定した。

ALS患者の進行速度をAppel ALS（AALS）スコア付け法（Haverkamp他、1995 Brain 118:707-719; Voustianiouk他、2008 Muscle Nerve. 37(5):668-72）から算出した。AALSスコアは30点（HV）から164点（重症ALS）までに及んだ。進行速度を決定するために、患者の最後の来院時のAALSスコアを、それらの患者の最初の来院時のスコアから減算し、次いでその数を前記２回の来院間の月数によって除算した。1.5 AALS点（pts）／月以上のスコアは、迅速（急速）進行性患者を表し、そして1.5 AALS pts／月未満のスコアは、緩徐進行性患者を表した。

血清sCD14
このコホート内のALS患者の血清中のsCD14レベルの分析は、ALS患者のsCD14レベルがHVに比較して有意に増加したという第一の研究（実施例１）の知見を本質的に確証した（図１３Ａ）。着目されるのは、この第二の研究が、第一の研究において示されたのと同様に、急速進行性対緩徐進行性患者のsCD14レベル間の明確な差異を同定し、更に、HVに比較して緩徐進行性患者のsCD14レベルに統計上有意な増加が見られることも実証した（図１３Ｂ）。全体的に、ALS患者では血清中sCD14レベルと病気進行速度との間に明確な相関関係が認められた（図１３Ｃ）。

受信者動作特性（ROC）曲線解析を使用して、血清採集時の急速対緩徐病気進行速度を反映する、この患者コホートからのsCD14血清レベルの精度を評価した（図１３Ｄ～Ｇ）。図１３Ｅに示す通り、血清sCD14レベルは、急速対緩徐進行性患者を非常に正確に区別することができる、病気進行速度の明確な指標（インジケーター）であった（3.16μg /mLのROCカットオフ；AUC＝0.982；感度 0.942；特異度0.958）。より小さい程度であったが、血清sCD14レベルは緩徐進行性患者もHVから区別できた（図１３Ｇ）(ROCカットオフ 2.74μg/ml；AUC＝0.686；感度 0.633；特異度 0.654）。

血清LBP
本コホート内のALS患者の血清中のLBPレベルの分析は、ALS患者のLBPレベルがHVに比較して有意に増加したという以前の研究における知見も本質的に確証した（図１４Ａ）。sCD14と同様に、この第二の研究も緩徐進行性患者に比較して急速進行性患者のLBPレベルの相違を同定し（第一の研究において示されたのと同様に）、同時に、HVに対比して緩徐進行性患者のLBPレベルの統計的に有意な増加を証明した（図１４Ｂ）。全体的に、第一の研究で観察されたALS患者における血清中LBPレベルと病気の進行速度との明確な相関関係が、この第二の研究においても観察された（図１４Ｃ）。

急速対緩徐の病気進行速度を反映する、この患者コホートからの血清LBPレベルの精度を評価するためにROC解析を使用した結果、LBPが、sCD14と同様に、様々な病気進行速度を正確に区別するためのバイオマーカーとして使用できることが明らかになった（図１４Ｄ～Ｇ）。図１４Ｅに示す通り、血清LBPレベルは、緩徐進行性患者に比較して急速進行性患者を非常に正確に区別することができる、病気進行速度の優れた指標（インジケーター）であった（ROCカットオフ 40.8μg/mL；AUC＝0.966；感度 0.923；特異度 0.938）。本研究では、血清LBPレベルは、緩徐進行性患者もまたHVから区別することができた（図１３Ｇ）(ROC カットオフ 26.1μg/mL；AUC＝0.880；感度 0.783；特異度 0.865）。

血清sCD14とLBP
第一の研究において観察されたように、急速進行性ALS患者においてsCD14とLBPのレベル間に明確な相関関係が認められ、この相関は緩徐進行性ALS患者においては診られなかった（図１５Ａ）。

血清sCD14レベルと血清LBPレベルの組み合わせが、いずれか単独のバイオマーカーに比較して緩徐進行性と急速進行性ALSとをより効率的に識別するために利用できるかどうかを調べるために、ROC解析を実施した（図１６）。血清sCD14レベルと血清LBPレベルの組み合わせは、ALS患者が緩徐進行性疾患か急速進行性疾患を罹患しているかどうかを予測することにおいて特に効果的であることが証明された。これは、この解析においてsCD14およびLBPの実際の血清レベルを使用して実証され（図１６Ｂ；AUC＝0.9944）、そして血清sCD14＋LBPのスケール調整した（scaled）レベルを使用した（図１６Ｆ；ACU＝0.994）。後者の解析によれば、sCD14レベルとLBPレベルはある程度の大きさ離れているため、各タンパク質のレベルをまず標準化し、次いで両者を加算して新しい測定値を構築した：スケール調整した（sCD14）＋スケール調整した（LBP）。

本明細書で引用された全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書中への任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。

本明細書全体を通して、目的は、本開示をいずれか１つの実施形態または特定の特徴の収集物に限定することなく、本開示の好ましい実施形態を記載することであった。従って、当業者は、本開示を照らして、本開示の範囲から逸脱することなく例示された特定の実施形態に様々な修正と変更をなし得ることを理解するであろう。かような全ての修正および変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。

Claims (18)

1. 筋側索性硬化症（ＡＬＳ）を有する被験者が急速進行性ＡＬＳまたは緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるどうかを決定することを補助する方法であって、
   （ａ） ＡＬＳを有する被験者から得られた生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定し、ここで該バイオマーカーは可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）であり；そして
   （ｂ） 該被験者が、適当な参照レベルに比較した前記生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて急速進行性または緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるかどうかについての情報を提供することを含む方法。
2. （ｉ）前記参照レベルが健常被験者および／または緩徐進行性ＡＬＳを有することが分かっている被験者を表し、そしてその参照レベルに比較したバイオマーカーのレベルの増加が、該被験者が急速進行性ＡＬＳを有する可能性があることを示す；
   （ｉｉ）前記参照レベルが急速進行性ＡＬＳを有することが分かっている被験者を表し、そしてその参照レベルに比較したバイオマーカーの類似したレベルが、該被験者が急速進行性ＡＬＳを有する可能性があることを示す；
   （ｉｉｉ）前記参照レベルが健常被験者および／または緩徐進行性ＡＬＳを有することが分かっている被験者を表し、そしてその参照レベルに比較したバイオマーカーの類似したレベルが、該被験者が緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があることを示す；
   （ｉｖ）前記参照レベルが急速進行性ＡＬＳを有することが分かっている被験者を表し、そしてその参照レベルに比較したバイオマーカーのレベルの減少が、該被験者が緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があることを示す；あるいは
   （ｖ）前記参照レベルが、それより上では被験者が急速進行性ＡＬＳを有する可能性があり、それより下では被験者が緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるという閾値レベルである、
   請求項１に記載の方法。
3. 被験者においてＡＬＳの進行速度を評価することを補助する方法であって、
   （ａ） ＡＬＳを有する被験者から得られた生物学的サンプルにおいてバイオマーカーのレベルを決定し、ここで前記バイオマーカーは可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）であり；そして
   （ｂ） 生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルに基づいて、前記被験者のＡＬＳの進行速度についての情報を提供することを含む方法。
4. 前記方法がｓＣＤ１４およびＬＢＰのレベルを決定することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記生物学的サンプルが血液、血漿、血清、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）から成る群より選ばれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記生物学的サンプル中の少なくとも１つの別のバイオマーカーのレベルを測定することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つのバイオマーカーがＬＢＰ、ＣＲＰ、ＭＩＦ、ｓＴＮＦＲＩおよび／またはｓＴＮＦＲＩＩから成る群より選ばれる、請求項６に記載の方法。
8. 前記生物学的サンプルは、前記バイオマーカーのレベルを測定する前に採取される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の方法において使用するための、ＡＬＳを有する被験者においてバイオマーカーのレベルを測定するためのキットであって、生物学的サンプル中の該バイオマーカーのレベルの測定を可能にする該バイオマーカーに特異的な抗原結合分子を含み、ここで前記バイオマーカーはｓＣＤ１４であるキット。
10. バイオマーカーに特異的な抗原結合分子を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法において使用するための固体支持体であって、前記バイオマーカーがｓＣＤ１４である固体支持体。
11. 前記固体支持体がマルチウェルプレート、スライド、チップまたは複数のビーズの中から選択される、請求項１０に記載の固体支持体。
12. ｓＣＤ１４に特異的な抗原結合分子およびＬＢＰに特異的な抗原結合分子を含む、請求項９に記載のキット、あるいは請求項１０または１１に記載の固体支持体。
13. ＣＲＰ、ＭＩＦ、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＮＦＬ、ｐＮｆＨ、ｐ７５ＮＴＲ^ＥＣＤ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、および／またはｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐの中から選択された少なくとも１つの別のバイオマーカーに特異的な抗原結合分子を更に含む、請求項９または１２に記載のキット、あるいは請求項１１または１２に記載の固体支持体。
14. ＡＬＳの治療法に向けて被験者を層別化することを補助する方法であって、
    （ａ） 請求項１～８のいずれか一項の方法に従って、被験者が急速進行性または緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるか否かの情報を提供し、または被験者においてＡＬＳの進行速度についての情報を提供し；そして
    （ｂ） 前記被験者が急速進行性または緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるかどうかに基づいて、または前記被験者におけるＡＬＳの進行速度に基づいて、前記被験者に適当な最適化された治療レジメンについての情報を提供する
    ことを含む方法。
15. ＡＬＳを有する被験者が急速進行性または緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるかどうかを決定するための、または被験者におけるＡＬＳの進行速度を評価するためのキットの調製における、バイオマーカーに特異的な抗原結合分子の使用であって、前記バイオマーカーがｓＣＤ１４である使用。
16. 前記使用が、ＡＬＳを有する被験者が急速進行性または緩徐進行性ＡＬＳを有する可能性があるかどうかを決定するための、または被験者におけるＡＬＳの進行速度を評価するためのキットの調製における、ｓＣＤ１４に特異的な抗原結合分子とＬＢＰに特異的な抗原結合分子との組み合わせの使用である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記キットの調製における少なくとも１つの別のバイオマーカーに特異的な抗原結合分子の使用を更に含む、請求項１５または１６に記載の使用。
18. 前記少なくとも１つの別のバイオマーカーが、ＣＲＰ、ＭＩＦ、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＮＦＬ、ｐＮｆＨ、ｐ７５ＮＴＲ^ＥＣＤ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、およびｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐの中から選択される、請求項１７に記載の方法。